СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНЕПОДОБНОЙ СТРУКТУРЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/71 A61K35/39 A61P3/10 A61K35/545 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к биологической тканеподобной структуре, содержащей дифференцированные полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки к способу получения биологической тканеподобной структуры и к вариантам применения биологической тканеподобной структуры.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0002] Функционально дифференцированные клетки, индуцированные из плюрипотентных стволовых клеток, таких как индуцированные плюрипотентные клетки и эмбриональные стволовые клетки (ES клетки), рассматривают в качестве источника клеток в трансплантационной и регенеративной медицине. В настоящее время предпринимаются попытки получения с помощью тканевой инженерии структур, обладающих функциями, сравнимыми или подобными функциям биологических органов или тканей (далее именуемых «биологическими тканеподобными структурами») с использованием таких функционально дифференцированных клеток для трансплантационного лечения. Однако при получении толстой трехмерной структуры трудно обеспечить достаточное количество кислорода, питательных веществ и тому подобное для всех клеток, поэтому поддерживать жизнеспособность клеток в структуре непросто как in vitro, так и in vivo. Из-за таких проблем, связанных с толщиной и размером, для выполнения функций, сопоставимых или аналогичных функциям биологических органов или тканей, обычных структур часто недостаточно. В данной области все еще существует потребность в новом подходе, который позволяет простым способом получить толстую трехмерную структуру, подобную биологической ткани.

[0003] В настоящее время ведутся исследования по индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как индуцированные плюрипотентные клетки и эмбриональные стволовые клетки, в эндокринные клетки, которые секретируют гормоны, такие как β-клетки поджелудочной железы и α-клетки поджелудочной железы, и по применению полученных клеток для лечения сахарного диабета. Сообщалось о подходах к получению эндокринных клеток путем индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки-предшественники поджелудочной железы и трансплантации клеток-предшественников поджелудочной железы в живой организм и созреванию клеток-предшественников поджелудочной железы. Например, в непатентной литературе 1 описан способ получения эндокринных клеток, включая инсулин-положительные клетки и глюкагон-положительные клетки, путем трансплантации мыши клеток-предшественников поджелудочной железы, образованных путем индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, и созревания клеток-предшественников поджелудочной железы.

Однако не было получено толстой трехмерной биологической тканеподобной структуры, которая содержит эндокринные клетки, такие как инсулин-положительные клетки и глюкагон-положительные клетки, без протоков или кист.

Список цитирования

Непатентная литература

[0004] Непатентная литература 1: Robert T et al, Stem Cell Reports. 2018 Mar 13; 10(3): 739-750.

Сущность настоящего изобретения

Техническая задача

[0005] Целью настоящего изобретения является представление нового способа получения биологической тканеподобной структуры, содержащей дифференцированные клетки, индуцированные из плюрипотентных стволовых клеток.

Решение задачи

[0006] Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для достижения цели и в результате обнаружили, что за счет трансплантации в биологическую ткань композиции, содержащей полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки, диспергированно расположенные в биосовместимом материале, клетки обеспечивают выживаемость трансплантата, а их дифференцировку индуцируют вплоть до наступления зрелости, и поэтому можно сконструировать биологическую тканеподобную структуру вместе с полученными из организма хозяина кровеносными сосудами и соединительной тканью.

[0007] Настоящее изобретение основано на этих идеях и включает в себя следующие открытия.

[1] Композиция, содержащая: биосовместимый материал, подлежащий использованию в способе получения биологической тканеподобной структуры в биологической ткани животного-хозяина; и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположены в биосовместимом материале.

[2] Композиция по п. [1] в которой биосовместимым материалом является фибриновый гель.

[3] Композиция по п. [2] в которой фибриновый гель получают путем смешивания клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, с фибриногеном и тромбином для гелеобразования непосредственно перед использованием композиции.

[4] Композиция по любому из пп. [1]-[3] в которой клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, находятся в виде множества сфероидов.

[5] Композиция по любому из пп. [1]-[4] в которой доля Ki67-положительных клеток в клетках, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, составляет менее 3%.

[6] Композиция по любому из пп. [1]-[5] в которой клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека, являются продуцирующие инсулин клетки.

[7] Композиция по любому из пп. [1]-[6] причем способ включает трансплантацию композиции в биологическую ткань животного-хозяина, чтобы вызвать дифференцировку клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположенных в биосовместимом материале.

[8] Композиция по п. [7] в которой биологической тканью животного-хозяина является подкожная ткань.

[9] Композиция по любому из пп. [1]-[8] в которой биологическая тканеподобная структура содержит: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены в множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток.

[10] Композиция по п. [9] в которой дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.

[11] Биологическая тканеподобная структура, содержащая: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены в множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток.

[12] Биологическая тканеподобная структура по п. [11] в которой дифференцированные клетки представляют собой β-клетки поджелудочной железы.

[12-A] Биологическая тканеподобная структура по п. [11] в которой дифференцированные клетки представляют собой β-клетки поджелудочной железы и α-клетки поджелудочной железы.

[13] Биологическая тканеподобная структура по любому из пп. [11]-[12-A] в которой дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.

[14] Биологическая тканеподобная структура по любому из пп. [11]-[14] используемая для регулирования уровня глюкозы в крови испытуемого субъекта, причем биологическую тканеподобную структуру трансплантируют ему до нормального уровня.

[15] Способ получения биологической тканеподобной структуры, причем способ включает трансплантацию композиции, содержащей биосовместимый материал и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположены в биосовместимом материале, в биологическую ткань животного-хозяина, чтобы вызвать их дифференцировку.

[16] Способ по п. [15] в котором биосовместимым материалом является фибриновый гель.

[17] Способ по п. [16] в котором фибриновый гель получают путем смешивания клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, с фибриногеном и тромбином для гелеобразования непосредственно перед использованием композиции.

[18] Способ по любому из пп. [15]-[17] в котором клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, находятся в виде множества сфероидов.

[19] Способ по любому из пп. [15]-[18] в котором доля Ki67-положительных клеток в клетках, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, составляет менее 3%.

[20] Способ по любому из пп. [15]-[19] в котором клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека, являются продуцирующие инсулин клетки.

[21] Способ по любому из пп. [15]-[20] в котором биологической тканью животного-хозяина является подкожная ткань.

[22] Способ по любому из пп. [15]-[21] в котором биологическая тканеподобная структура содержит: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки диспергированных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно расположены в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены в множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток.

[23] Способ по любому из пп. [15]-[22] в котором дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.

[0008] Настоящее описание включает в себя содержание, изложенное в описании, и/или фигуры из заявки на выдачу патента Японии № 2019-075100, на приоритете которой основана настоящая заявка.

[0009] Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Предпочтительные результаты изобретения

[0010] Настоящее изобретение может представить новый способ получения биологической тканеподобной структуры, содержащей дифференцированные клетки, индуцированные из плюрипотентных стволовых клеток.

Краткое Описание Фигур

[0011] [Фиг. 1] На фиг. 1 представлены результаты анализа экспрессии белков с помощью проточной цитометрии для продуцирующих инсулин клеток перед трансплантацией.

[Фиг. 2] На фиг. 2 представлены результаты измерения в течение некоторого времени концентраций C-пептида человека в крови (A) и уровней глюкозы в крови (B) у иммунодефицитных мышей NOD/SCID с трансплантированным фибриновым гелем, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, причем у мышей с помощью стрептозотоцина (STZ) индуцировали сахарный диабет.

[Фиг. 3] На фиг. 3 представлены результаты анализа ответа биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, образованных в живых организмах иммунодефицитных мышей NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет для загрузки глюкозы. Показаны результаты измерения в течение некоторого времени концентраций C-пептида человека в крови (A) и концентрации глюкозы в плазме (B) после загрузки глюкозы.

[Фиг. 4] На фиг. 4 представлены фотографии биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 5] На фиг. 5 представлены окрашенные HE изображения биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 6] На фиг. 6 представлены окрашенные трихром по Массону изображения биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 7] На фиг. 7 представлено иммуногистологически окрашенное изображение биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, в отношении ядер человека (HuN) и PDX1, причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 8] На фиг. 8 представлены иммуногистологически окрашенные изображения биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, в отношении инсулина (INS) и глюкагона (GCG), причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 9] На фиг. 9 представлены иммуногистологически окрашенные изображения биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, для мышей CD31 (mCD31) и хромогранина (CHGA), причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации.

[Фиг. 10] На фиг. 10 представлены иммуногистологически окрашенные изображения биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, в отношении ядер человека (HuN) и Ki67, причем биологическая тканеподобная структура вырезана изнутри живого организма спустя 6 месяцев после трансплантации. Стрелки: Ki67-положительные клетки.

[Фиг. 11] На фиг. 11 представлено измерение в течение некоторого времени C-пептида человека и глюкагона в крови и уровней глюкозы в крови после трансплантации продуцирующих инсулин клеток, диспергированных в фибриновом геле, иммунодефицитным мышам NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет.

[Фиг. 12] На фиг. 12 представлены результаты измерения содержания инсулина и глюкагона в биологических тканеподобных структурах, полученных из продуцирующих инсулин клеток, полученных путем трансплантации продуцирующих инсулин клеток, диспергированных в фибриновом геле, иммунодефицитным мышам NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет, и мышам NOD/SCID без сахарного диабета и вырезания изнутри их живых организмов спустя 28 недель после трансплантации. На верхних графиках показаны результаты измерения содержания инсулина, на нижних графиках показаны результаты измерения содержания глюкагона, на левом графике каждого из верхнего и нижнего графиков представлены результаты измерения содержания интересующего гормона в поджелудочной железе мышей (контроль), на правом графике каждого из верхнего и нижнего графиков представлены результаты измерения содержания интересующего гормона в вырезанной биологической тканеподобной структуре, полученной из продуцирующих инсулин клеток.

[Фиг. 13] На фиг. 13 представлен глюкагон и глюкагоноподобный пептид-1, измеренные в течение некоторого времени после загрузки глюкозы, для мышей NOD/SCID, имеющих мутацию гена Akita, у которых высокий уровень сахара в крови был полностью улучшен посредством трансплантации продуцирующих инсулин клеток, диспергированных в фибриновом геле.

[Фиг. 14] На фиг. 14 представлены уровни глюкозы в крови и концентрации C-пептида человека в крови, измеренные в течение некоторого времени после лечения антагонистом MK-0893 рецептора глюкагона с последующей загрузкой глюкозы для мышей NOD/SCID с сахарным диабетом STZ, у которых высокий уровень сахара в крови был полностью улучшен посредством трансплантации продуцирующих инсулин клеток, диспергированных в фибриновом геле.

[Фиг. 15] На фиг. 15 представлены концентрации C-пептида человека в крови после приема пищи, измеренные перед и после лечения антагонистом эксендин-9 рецептора глюкагоноподобного пептида-1 в течение 3 дней, для мышей NOD/SCID с сахарным диабетом Akita, у которых высокий уровень сахара в крови был полностью улучшен посредством трансплантации продуцирующих инсулин клеток, диспергированных в фибриновом геле.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[0012] 1. Терминология

В рамках настоящего изобретения «примерно» относится к значению, которое может изменяться до плюс или минус 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от справочного значения. Предпочтительно, термин «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону от минус или плюс 15%, 10%, 5% или 1% от справочного значения.

[0013] В рамках настоящего изобретения термин «содержат (содержит)» или «содержащий» означает включение элемента (элементов) после слова без ограничения. Соответственно, он означает включение элемента (элементов) после слова, но не означает исключения любого другого элемента.

[0014] В рамках настоящего изобретения «состоят (состоит) из» или «состоящий из» означает включение всех элементов после фразы и ограничение этим. Соответственно, фраза «состоят (состоит) из» или «состоящий из» означает, что перечисленный элемент (элементы) являются обязательными или существенными и других элементов по существу не существует.

[0015] В рамках настоящего изобретения «без использования фидерной клетки (клеток)» означает в основном отсутствие фидерных клеток и не использование среды, предварительно кондиционированной путем культивирования фидерных клеток. Соответственно, среда не содержит никаких веществ, таких как фактор роста или цитокин, секретируемых фидерными клетками.

[0016] «Фидерные клетки» или «фидер» означает клетки, которые культивируют совместно с другим типом клеток, поддерживают клетки и обеспечивают окружающую среду, которая позволяет клеткам расти. Фидерные клетки могут происходить от того же вида, что и клетки, которые они поддерживают, или от разных видов. Например, в качестве фидера для клеток человека можно использовать фибробласты кожи человека или эмбриональные стволовые клетки, или можно использовать первичное культивирование эмбриональных фибробластов мыши или иммортализованных эмбриональных фибробластов мыши. Фидерные клетки можно инактивировать путем воздействия облучением или обработкой митомицином C.

[0017] В рамках настоящего изобретения «прилипшие (приставшие)» относится к клеткам, прикрепленным к контейнеру, например, клеткам, прикрепленным к чашке для культивирования клеток или колбе, сделанной из стерилизованного пластика (или пластика с покрытием), в присутствии подходящей среды. Некоторые клетки нельзя поддерживать или выращивать при культивировании без прилипания к контейнеру для культивирования клеток. Напротив, неприлипающие клетки могут сохраняться и пролиферировать при культивировании без прилипания к контейнеру.

[0018] В рамках настоящего изобретения «культивирование» относится к сохранению, выращиванию и/или дифференцировке клеток в окружающей среде in vitro. «Культивирование» означает сохранение, пролиферацию (выращивание) и/или дифференцировку клеток из ткани или живого организма, например, в чашке для культивирования клеток или колбе. Культивирование представляет собой двухмерное культивирование (плоское культивирование) и трехмерное культивирование (суспензионное культивирование).

[0019] В рамках настоящего изобретения «обогащать (обогащает)» и «обогащение» относятся к увеличению количества определенного компонента в композиции, такой как композиция клеток, а «обогащенная» при использовании относится к описанию композиции клеток, например, популяции клеток, к популяции клеток с увеличенным количеством определенного компонента по сравнению с процентным содержанием такого компонента в популяции клеток перед обогащением. Например, композиция, такая как популяция клеток, может быть обогащена в отношении какого-то типа клеток-мишеней, и, соответственно, процентное содержание этого типа клеток-мишеней увеличено по сравнению с процентным содержанием этих клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток перед обогащением. Популяция клеток может быть обогащена в отношении какого-то типа клеток-мишеней с помощью способа отбора и сортировки клеток, известного в данной области. Популяция клеток может быть обогащена с помощью определенного способа сортировки или отбора, описанного в настоящем документе. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток обогащают популяцией клеток-мишеней по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% с помощью способа обогащения популяцией клеток-мишеней.

[0020] В рамках настоящего изобретения «истощать (истощает)» и «истощение» относятся к уменьшению количества определенного компонента в клетках или композиции, такой как композиция клеток, а «истощенный» при использовании относится к описанию клеток или композиции клеток, например, популяции клеток, к популяции клеток с уменьшенным количеством определенного компонента по сравнению с процентным содержанием такого компонента в популяции клеток перед истощением. Например, композиция, такая как популяция клеток, может быть истощена в отношении какого-то типа клеток-мишеней, и, соответственно, процентное содержание этого типа клеток-мишеней уменьшено по сравнению с процентным содержанием этих клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток перед истощением. Популяция клеток может быть истощена в отношении какого-то типа клеток-мишеней с помощью способа отбора и сортировки клеток, известного в данной области. Популяция клеток может быть истощена с помощью определенного способа сортировки или отбора, описанного в настоящем документе. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток уменьшают (истощают) в отношении популяции клеток-мишеней по меньшей мере на 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% с помощью способа истощения популяции клеток-мишеней.

[0021] В рамках настоящего изобретения «очищать (очищает)» и «очистка» относятся к удалению включений в композиции, такой как композиция клеток, и приданию ей чистоты в отношении определенного компонента, а «очищенный» при использовании относится к описанию композиции клеток, например, популяции клеток, к популяции клеток, в которой количество включений уменьшено по сравнению с процентным содержанием таких компонентов в популяции клеток перед очисткой, а чистота определенного компонента повышается. Например, композиция, такая как популяция клеток, может быть очищена в отношении некоторого типа клеток-мишеней, и, соответственно, процентное содержание этого типа клеток-мишеней увеличивается по сравнению с процентным содержанием клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток перед очисткой. Популяция клеток может быть очищена в отношении некоторого типа клеток-мишеней с помощью способа отбора и сортировки клеток, известного в данной области. Популяция клеток может быть очищена с помощью определенного способа сортировки или отбора, описанного в настоящем документе. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения чистоту популяции клеток-мишеней доводят с помощью способа очистки популяции клеток-мишеней по меньшей мере до 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или до степени, в которой включения (в том числе зараженные клетки) нельзя обнаружить.

[0022] В рамках настоящего изобретения «фактор, имеющий активность ингибирования CDK8/19» означает любое вещество, обладающее ингибирующей активностью в отношении CDK8/19. CDK8, в отличие от других белков того же семейства CDK, не требуется для пролиферации клеток. Ингибирование CDK8 не имеет большого эффекта в обычных условиях. CDK19 и CDK8 похожи друг на друга. Обычно, ингибирование CDK8 также включает в себя ингибирование CDK19.

[0023] «Факторы роста» представляют собой эндогенные белки, которые способствуют дифференцировке и/или пролиферации определенных клеток. Примеры «факторов роста» включают эпидермальный фактор роста (EGF), кислотный фактор роста фибробластов (aFGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), трансформационный фактор роста бета (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), трансферрин, различные интерлейкины (например, от IL-1 до IL-18), различные колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), различные интерфероны (например, IFN-γ и тому подобное) и другие цитокины, оказывающие влияние на стволовые клетки, например, фактор стволовых клеток (SCF) и эритропоэтин (Epo).

[0024] В рамках настоящего изобретения «ингибиторы ROCK» означает вещества, которые ингибируют Rho-киназу (ROCK: Rho-ассоциированная, содержащая двойную спираль протеинкиназа) и могут представлять собой вещества, которые ингибируют либо ROCK I, либо ROCK II. Ингибиторы ROCK отдельно не ограничены при условии, что они обладают вышеуказанной функцией, и примеры включают N-(4-пиридинил)-4β-[(R)-1-аминоэтил]циклогексан-1α-карбоксамид (который также может быть указан как Y-27632), фасудил (HA1077), (2S)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил]сульфонил]гексагидро-1H-1,4-диазепин (H-1152), 4β-[(1R)-1-аминоэтил]-N-(4-пиридил)бензол-1зенкарбоксамид (Wf-536), N-(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-4-ил)-4PER(R)-1-аминоэтил]циклогексан-1α-карбоксамид (Y-30141), N-(3-{[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси}фенил)-4-{[2-(4-морфолинил)этил]-окси}бензамид (GSK269962A), N-(6-фтор-1H-индазол-5-ил)-6-метил-2-оксо-4-[4-(трифторметил)фенил]-3,4-дигидро-1H-пиридин-5-карбоксамид (GSK429286A). Ингибиторы ROCK этим не ограничены, и в качестве ингибиторов ROCK также можно использовать антисмысловые олигонуклеотиды и siRNA к мРНК ROCK, антитела, которые связываются с ROCK, и доминантно-негативные мутанты ROCK, коммерчески доступные или синтезированные согласно известному способу.

[0025] В рамках настоящего изобретения «ингибиторы GSK3β» представляют собой вещества, обладающие ингибирующей активностью в отношении GSK3β (киназа 3β гликогенсинтазы). GSK3 (киназа-3 гликогенсинтазы) представляет собой серин/треонин протеинкиназу и участвует во многих сигнальных путях, ассоциированных с выработкой гликогена, апоптозом, поддержанием стволовых клеток и так далее. GSK3 имеет 2 изоформы α и β. «Ингибиторы GSK3β», используемые в настоящем изобретении, отдельно не ограничены при условии, что они обладают активностью ингибирования GSK3β, и они могут представлять собой вещества, обладающие как активностью ингибирования GSK3α, так и активностью ингибирования GSK3β.

[0026] Примеры ингибиторов GSK3β включают CHIR98014 (2-[[2-[(5-нитро-6-аминопиридин-2-ил)амино]этил]амино]-4-(2,4-дихлорфенил)-5-(1H-имидазоl-1-ил)пиримидин), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]никотинонитрил), TDZD-8 (4-бензил-2-метил-1,2,4-тиадиазолидин-3,5-дион), SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), TWS-119 (3-[6-(3-аминофенил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-илокси]фенол), кенпауллон, 1-азакенпауллон, SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), SB415286 (3-[(3-хлор-4-гидроксифенил)амино]-4-(2-нитрофенил)-1H-пиррол-2,5-дион) и AR-AO144-18, CT99021, CT20026, BIO, BIO-ацетоксим, пиридокарбазол-рутениум циклопентадиениловый комплекс, OTDZT, альфа-4-дибромацетофенон, литий и тому подобное. GSK3β этим не ограничена, и в качестве ингибиторов GSK3β также можно использовать антисмысловые олигонуклеотиды и siRNA к мРНК GSK3β, антитела, которые связываются с GSK3β, доминантно-негативные мутанты GSK3β и тому подобное, коммерчески доступные или синтезированные согласно известному способу.

[0027] В рамках настоящего изобретения примеры «заменителя сыворотки» включают заменитель сыворотки Knockout (KSR: Invitrogen), заменитель сыворотки StemSure (Wako), добавку B-27, добавку N2, альбумин (например, богатый липидами альбумин), инсулин, трансферрин, жирные кислоты, предшественники коллагена, микроэлементы (например, цинк, селен (например, селенит натрия)), 2-меркаптоэтанол, 3'-тиолглицерин или их смеси (например, ITS-G). Предпочтительными заменителями сыворотки являются добавка B-27, KSR, заменитель сыворотки StemSure, ITS-G. Концентрация заменителя сыворотки в среде при добавлении в среду составляет 0,01-10% по массе и предпочтительно 0,1-2% по массе. В настоящем изобретении вместо сыворотки предпочтительно использован «заменитель сыворотки».

[0028] В рамках настоящего изобретения «ингибитор FGFR1» представляет собой вещество, обладающее ингибирующей активностью в отношении рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) 1. FGFR1 является членом четырехпроходного семейства трансмембранных тирозинкиназ (FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4) в качестве рецептора, имеющего высокое сродство к факторам роста FGF1-FGF17. Ингибитор FGFR1 отдельно не ограничен при условии, что ингибитор FGFR1 обладает активностью ингибирования FGFR1. Ингибитор FGFR1 может представлять собой вещество, обладающее активностью ингибирования FGFR1, а также активностью ингибирования в отношении других FGFR. В настоящем описании «ингибитор FGFR1» содержит вещество, обладающее активностью ингибирования FGFR1, даже если оно незначительно, и предпочтительно относится к веществу, которое ингибирует FGFR1 на 50% или более, более предпочтительно к веществу, имеющему 50% ингибирующую концентрацию (IC₅₀) 1 мкм или ниже, еще более предпочтительно 100 нМ или ниже против FGFR1. Способ определения активности ингибирования FGFR1 можно выбирать из известных способов. Их примеры включают способы определения с использованием набора для анализа киназы EnzyChrom (BioAssay Systems). Можно использовать традиционно известный ингибитор FGFR1, который можно найти в патентной литературе или непатентной литературе.

[0029] Более конкретно, примеры ингибитора FGFR1, который можно использовать в настоящем изобретении, включают PD-166866 (1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)-пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину: (CAS №: 192705-79-6), E-3810 (CAS №: 1058137-23-7), PD-173074 (CAS №: 219580-11-7), FGFR4-IN-1 (CAS №: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (CAS №: 1448169-71-8), FIIN-2 (CAS №: 1633044-56-0), AZD4547 (CAS №: 1035270-39-3), FIIN-3 (CAS №: 1637735-84-2), NVP-BGJ398 (CAS №: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (CAS №: 872511-34-7), CH5183284 (CAS №: 1265229-25-1), деразантиниб (CAS №: 1234356-69-4), деразантиниб рацемат, феруловую кислоту (CAS №: 1135-24-6), SSR128129E (CAS №: 848318-25-2), SSR128129E свободную кислоту (CAS №: 848463-13-8), эрдафитиниб (CAS №: 1346242-81-6), BLU9931 (CAS №: 1538604-68-0), PRN1371 (CAS №: 1802929-43-6), S49076 (CAS №: 1265965-22-7), LY2874455 (CAS №: 1254473-64-7), линситиниб (CAS №: 867160-71-2), довитиниб (CAS №: 405169-16-6), анлотиниб (CAS №: 1058156-90-3), бриваниб (CAS №: 649735-46-6), деразантиниб (CAS №: 1234356-69-4), дигидрохлорид анлотиниба (CAS №: 1360460-82-7), ACTB-1003 (CAS №: 939805-30-8), BLU-554 (CAS №: 1707289-21-1), рогаратиниб (CAS №: 1443530-05-9), эзилат BIBF 1120 (CAS №: 656247-18-6), гидрохлорид TG 100572 (CAS №: 867331-64-4), EНМD-2076 (CAS №: 934353-76-1), аланинат бриваниба (CAS №: 649735-63-7), TG 100572 (CAS №: 867334-05-2), BIBF 1120 (CAS №: 656247-17-5), EНМD-2076 тартрат (CAS №: 1291074-87-7), TSU-68 (CAS №: 252916-29-3), понатиниб (CAS №: 943319-70-8), сульфатиниб (CAS №: 1308672-74-3), LY2784544 (CAS №: 1229236-86-5), лактат довитиниба (CAS №: 692737-80-7), SU 5402 (CAS №: 215543-92-3), FGF-401 (CAS №: 1708971-55-4), тирозинкиназа-IN-1 (CAS №: 705946-27-6), PP58 (CAS №: 212391-58-7), TG 100801 гидрохлорид (CAS №: 1018069-81-2), креноланиб (CAS №: 670220-88-9), TG 100801 (CAS №: 867331-82-6), гидрохлорид пазопаниба (CAS №: 635702-64-6), пазопаниб (CAS №: 444731-52-6), PD168393 (CAS №: 194423-15-9), апатиниб (CAS №: 1218779-75-9), изетионат пальбоциклиба (CAS №: 827022-33-3), форетиниб (CAS №: 849217-64-7), ленватиниб (CAS №: 417716-92-8), тандутиниб (CAS №: 387867-13-2) и их соли (эти соединения называются соединением группы D). Каждое из этих соединений может иметь один или несколько заменителей, выбранных из описанных выше при условии, что соединение обладает активностью ингибирования FGFR1, предпочтительно 50% ингибирующей концентрацией (IC₅₀) 100 нМ или ниже против FGFR1. Субструктура (заменитель, кольцо и так далее) каждого из этих соединений может быть частично преобразована при условии, что соединение обладает активностью ингибирования FGFR1, предпочтительно 50% ингибирующей концентрацией (IC₅₀) 100 нМ или ниже против FGFR1.

[0030] В настоящем изобретении ингибитором FGFR1 предпочтительно является CAS192705-79-6 (1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)-пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевина: CAS №: 192705-79-6), E-3810 (CAS №: 1058137-23-7) или PD173074 (CAS №: 219580-11-7).

[0031] Ингибитор FGFR1 не ограничен соединениями, описанными выше, и в качестве ингибитора FGFR1 также можно использовать антисмысловой олигонуклеотид или siRNA против FGFR1 мРНК, антитело, связывающееся с FGFR1, доминантно-негативный мутант FGFR1 и тому подобное. Такой ингибитор FGFR1 является коммерчески доступным или может быть синтезирован согласно известному способу.

[0032] В рамках настоящего изобретения «маркер» означает клеточный антиген или его ген, который специфически экспрессируется в зависимости от заданного типа клеток, таких как «маркерный белок» и «маркерный ген». Предпочтительно маркер представляет собой маркер клеточной поверхности, что обеспечивает концентрирование, выделение и/или обнаружение живых клеток. Маркер может быть маркером положительного отбора или маркером отрицательного отбора.

[0033] Обнаружение маркерного белка можно проводить с помощью иммунологического анализа, например, ELISA, иммуноокрашивания или проточной цитометрии с использованием антитела, специфичного для маркерного белка. Обнаружение маркерного гена можно проводить с помощью метода амплификации и/или обнаружения нуклеиновой кислоты, известного в данной области, например, RT-PCR, микроматрицы, биочипа и тому подобное. В рамках настоящего изобретения «положительный» для маркерного белка означает обнаруживаемый как положительный с помощью проточной цитометрии, а «отрицательный» для маркерного белка означает равный или меньший нижнего предела обнаружения в проточной цитометрии. Также, «положительный» для маркерного гена означает обнаруживаемый с помощью RT-PCR и «отрицательный» для маркерного гена означает равный или меньший нижнего предела обнаружения в RT-PCR.

[0034] В рамках настоящего изобретения «экспрессия» определена как транскрипция и/или трансляция определенной нуклеотидной последовательности, управляемой внутриклеточным промотором.

[0035] В рамках настоящего изобретения «клетки» означает композицию клеток, другими словами, популяцию клеток, если не указано иное. Соответственно, «клетки» могут включать не только клетки определенного типа, но также клетки одного или нескольких других типов. Долю клеток определенного типа в «клетках» можно увеличить путем обогащения или очистки, или путем истощения клеток одного или нескольких других типов. В данном случае, предпочтительно, чтобы «клетки» были человеческими клетками.

[0036] 2. Композиция, содержащая полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки и биосовместимый материал

2-1. Клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток

В рамках настоящего изобретения «плюрипотентность» означает способность дифференцирования в ткани и клетки, имеющие множество разных форм и функций и дифференцирования в клетки любой линии из трех зародышевых листков. «Плюрипотентность» отличается от «тотипотентности», которая представляет собой способность дифференцирования в любую ткань живого организма, в том числе бластодиск, тем, что плюрипотентные клетки не могут дифференцироваться в бластодиск и, следовательно, не обладают способностью формирования отдельного элемента.

[0037] В рамках настоящего изобретения «мультипотентность» означает способность дифференцирования в разнообразные и ограниченные количества линий клеток. Например, мезенхимальные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, нервные стволовые клетки являются мультипотентными, но не плюрипотентными.

[0038] В рамках настоящего изобретения «плюрипотентные стволовые клетки» относится к эмбриональным стволовым клеткам (ES клеткам) и клеткам, потенциально, имеющим плюрипотентность, аналогичную плюрипотентности ES-клеток, то есть способность дифференцирования в различные ткани (все энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани) в живом организме. Примеры клеток, имеющих плюрипотентность, аналогичную плюрипотентности ES-клеток, включают «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» (которые в данном документе также могут называться «iPS-клетки»). В настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки предпочтительно представляют собой плюрипотентные стволовые клетки человека.

[0039] Доступные «ES-клетки» включают мышиные ES-клетки, такие как различные мышиные линии ES-клеток, созданные inGenious, RIKEN, и тому подобное, и человеческие ES-клетки, такие как различные линии ES-клеток человека, созданные NIH, RIKEN, Kyoto University, Cellartis, и тому подобное. Например, доступные линии ES-клеток включают от CHB-1 до CHB-12, RUES1, RUES2, от HUES1 до HUES28 и тому подобное от NIH; H1 и H9 от WisCell Research; и KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES-4, KhES-5, SSES1, SSES2, SSES3 и тому подобное от RIKEN.

[0040] «Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» относится к клеткам, полученным путем перепрограммирования соматических клеток млекопитающих или недифференцированных стволовых клеток путем введения определенных факторов (факторов перепрограммирования ядер). В настоящее время существуют различные «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки», и также можно использовать клетки iPS, созданные Yamanaka, et al. Путем введения 4 факторов Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в мышиные фибробласты (Takahashi K, Yamanaka S. Cell, (2006) 126: 663-676); клетки iPS, полученные из клеток человека, созданных путем введения аналогичных 4 факторов в фибробласты человека (Takahashi K, Yamanaka S. et al. Cell, (2007) 131: 861-872.); клетки Nanog-iPS, созданные путем сортировки клеток с использованием экспрессии Nanog в качестве индикатора после введения 4 факторов (Okita, K. Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); клетки iPS, полученные с помощью способа без использования c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S. et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106); и клетки iPS, созданные путем введения 6 факторов способом без вирусов (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31 (3) 458-66). Также можно использовать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, созданные путем введения 4 факторов OCT3/4, SOX2, NANOG и LIN28, полученных Thomson et al. (Yu J. Thomson JA. et al. Science (2007) 318: 1917-1920.); индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные Daley et al. (Park IH, Daley GQ.et al. Nature (2007) 451: 141-146); индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные Sakurada et al. (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии № 2008-307007) и тому подобное.

[0041] Кроме того, можно использовать любые из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, известных в данной области, описанных во всех опубликованных статьях (например, Shi Y. Ding S. et al. Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Issue 5, 568-574; Kim JB. Scholer HR. et al. Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D. Melton, DA. et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, № 7, 795-797) или патентах (например, не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии № 2008-307007, не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии № 2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007-069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009-006930, WO2009-006997, WO2009-007852).

[0042] Доступные, индуцированные плюрипотентные клеточные линии включают различные клеточные линии iPS, созданные NIH, Институт физических и химических исследований (RIKEN), Киотским университетом и тому подобное. Например, такие клеточные линии iPS человека включают клеточные линии RIKEN HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A и Nips-B2 и клеточные линии Киотского университета Ff-WJ-18, Ff-I01s01, Ff-I01s02, Ff-I01s04, Ff-I01s06, Ff-I14s03, Ff-I14s04, QHJI01s01, QHJI01s04, QHJI14s03, QHJI14s04, RWMH15s02, Ff-MH15s02, 253G1, 201B7, 409B2, 454E2, 606A1, 610B1, 648A1, клеточные линии CDI клетки iPS MyCell (21525,102,10A), клетки iPS MyCell (21526,101,10A) и тому подобное.

[0043] В рамках настоящего изобретения «клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток», означает клетки, полученные путем индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, и примеры таких клеток включают эктодермальные клетки, мезодермальные клетки и энтодермальные клетки, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток, и клетки, состоящие из любой комбинации этих клеток. Более конкретно, «клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток», означает клетки дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток и обладающие функциями, сопоставимыми или аналогичными функциям клеток, составляющих орган или ткань, например, эпидермис, нервы, головной мозг, спинной мозг, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстая кишка, мочевой пузырь, мочеиспускательный канал, легкое, щитовидная железа, поджелудочная железа, печень, мышцы, скелет, сердце, кровеносные сосуды, селезенка или почка (без ограничения) или их клетки-предшественники.

[0044] В настоящем изобретении «клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток», предпочтительно имеют форму клеточных блоков, в каждом из которых клетки скапливаются/агрегируются вместе, то есть образуют сфероиды. Сфероиды клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, можно получать с помощью традиционно известного подхода, такого как суспензионное культивирование, или можно использовать культуральный планшет для формирования сфероидов, в котором микропространства находятся на нижней поверхности культуры (например, название продукта: Elplasia (Kuraray Co. Ltd.), название продукта: EZSPHERE (AGC TECHNO GLASS Co. Ltd.), название продукта: сфероидный микропланшет Corning (Corning International K.K.)). Каждый сфероид имеет размер примерно от 10 мкм до 1000 мкм, предпочтительно примерно от 50 мкм до 500 мкм, более предпочтительно примерно от 50 мкм до 300 мкм, еще более предпочтительно примерно от 50 мкм до 200 мкм в диаметре. И/или каждый сфероид состоит из от примерно 100 до примерно 1000 клеток, предпочтительно от примерно 200 до примерно 800 клеток, более предпочтительно от примерно 300 до примерно 500 клеток.

[0045] В одном варианте осуществления настоящего изобретения «клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток», представляют собой клетки дефинитивной энтодермы, клетки трубки первичной кишки, клетки задней части передней кишки, клетки-предшественники поджелудочной железы, эндокринные клетки-предшественники или продуцирующие инсулин клетки, которые появляются в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы, и особенно предпочтительно в продуцирующие инсулин клетки.

[0046] Известно, что клетки, имеющие разные особенности в зависимости от стадий дифференцировки, появляются в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы (WO2009/012428 и WO2016/021734). Например, стадии дифференцировки можно в широком смысле классифицировать на плюрипотентные стволовые клетки, клетки дефинитивной энтодермы, клетки трубки первичной кишки, клетки задней части передней кишки, клетки-предшественники поджелудочной железы, эндокринные клетки-предшественники, продуцирующие инсулин клетки и β-клетки поджелудочной железы в порядке от относительно недифференцированных до дифференцированных форм.

[0047] «Клетки дефинитивной энтодермы» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного маркера SOX17, FОКСА2, BMP2, CER и CXCR4.

[0048] «Клетки трубки первичной кишки» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного маркера HNF1B и HNF4A.

[0049] «Клетки задней части передней кишки» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного маркера PDX-1, HNF6 и HLXB9.

[0050] «Клетки-предшественники поджелудочной железы» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного маркера PDX-1, NKX6.1, PTF-1α, GATA4 и SOX9.

[0051] «Эндокринные клетки-предшественники» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного маркера хромогранина A, NeuroD и Ngn3 и отсутствием экспрессии любого маркера для гормональной системы, ассоциированной с поджелудочной железой (такой как инсулин). Эндокринные клетки-предшественники могут представлять собой маркеры экспрессии PAX-4, NKX2-2, Islet-1, PDX-1, PTF-1α и так далее.

[0052] «Продуцирующие инсулин клетки» означает клетки, характеризующиеся экспрессией маркера инсулина. Более конкретно, «продуцирующие инсулин клетки» характеризуются охватом клеток, экспрессирующих как маркеры инсулина, так и NKX6.1 (то есть инсулин-положительных и NKX6.1-положительных клеток, далее обозначаемых как «Ins+NKX+ клетки») в пропорции примерно 30% или более и в том числе клетки, экспрессирующие только инсулин из инсулина и NKX6.1 (то есть инсулин-положительные и NKX6.1-отрицательные клетки, далее обозначаемые как «Ins+NKX- клетки») в пропорции более примерно 15%. Верхний предел доли Ins+NKX+ клеток в продуцирующих инсулин клетках отдельно не ограничен и предпочтительно может составлять примерно 50% или менее.

[0053] Доля Ins+NKX- клеток в продуцирующих инсулин клетках предпочтительно может составлять примерно 20% или более, более предпочтительно примерно 25% или более, еще более предпочтительно примерно 30% или более. Верхний предел доли Ins+NKX- клеток в продуцирующих инсулин клетках отдельно не ограничен и предпочтительно может составлять примерно 40% или менее.

[0054] Например, продуцирующие инсулин клетки включают в себя: Ins+NKX+ клетки в пропорции примерно 30% или более и примерно 50% или менее; и Ins+NKX- клетки в пропорции более примерно 15% и примерно 40% или менее, предпочтительно в пропорции примерно 20% или более и примерно 40% или менее, более предпочтительно в пропорции примерно 25% или более и примерно 40% или менее, еще более предпочтительно в пропорции примерно 30% или более и примерно 40% или менее.

[0055] В настоящем документе доля клеток определенного типа в продуцирующих инсулин клетках означает долю от общего количества клеток, содержащихся в продуцирующих инсулин клетках. Доля клеток каждого типа означает значение в продуцирующих инсулин клетках, которые должны быть подвергнуты индукции дифференцировки в панкреатические островковые клетки (то есть подвергаемые трансплантации в живой организм).

[0056] Поскольку в незрелых продуцирующих инсулин клетках (на ранней стадии дифференцировки) найдено больше Ins+NKX- клеток, более высокая доля Ins+NKX- клеток означает, что продуцирующие инсулин клетки являются более незрелыми продуцирующими инсулин клетками (на более ранней стадии дифференцировки).

[0057] Кроме того, продуцирующие инсулин клетки могут характеризоваться одним или несколькими элементами, выбранными из следующих пунктов от а до f:

a. Низкий уровень экспрессии гена MAFA или его белка,

b. Низкая доля Ki67-положительных клеток,

c. Низкая доля глюкагон-положительных и инсулин-отрицательных клеток,

d. Характеристика проявления стимулированной глюкозой реакции секреции инсулина,

e. Высокая доля хромогранин A-положительных клеток, и

f. Низкая доля положительных в отношении щелочной фосфатазы плюрипотентных стволовых клеток. В данном документе «более» означает 2, 3, 4, 5 или 6.

[0058] a. Низкий уровень экспрессии гена MAFA или продукта этого гена

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении характеризуются тем, что уровень экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, ниже уровня экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, в панкреатическом островке.

[0059] «Панкреатический островок» означает клетки на более продвинутой стадии дифференцировки, чем продуцирующие инсулин клетки, в том числе зрелые β-клетки поджелудочной железы и характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного из MAFA, UCN3 и IAPP, которые являются маркерами зрелых β-клеток поджелудочной железы. Можно использовать панкреатический островок, выделенный у здорового индивидуума.

[0060] Сравнение уровней экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, между продуцирующими инсулин клетками и панкреатическим островком можно проводить с использованием подхода, известного в данной области, например, таким образом, чтобы уровень экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, выявляемый и количественно определяемый с использованием подхода, например, RT-PCR, микроматрицы, биочипа, Вестерн блота, ELISA, иммуноокрашивания или проточной цитометрии, корректировать по уровню экспрессии внутреннего стандартного гена или белка, кодируемого внутренним стандартным геном, для получения относительного значения, которое используют для сравнения. «Внутренний стандартный ген» отдельно не ограничен, и можно использовать GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу), β-актин, β2-микроглобулин, HPRT 1 (гипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1) и так далее.

[0061] Уровень экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, в продуцирующих инсулин клетках, составляет примерно 20% или менее, предпочтительно примерно 15% или менее, более предпочтительно примерно 10% или менее, еще более предпочтительно примерно 5% или менее, особенно предпочтительно примерно 1% или менее уровня экспрессии гена MAFA или белка, кодируемого геном MAFA, в панкреатическом островке.

[0062] Поскольку ген MAFA или белок, кодируемый геном MAFA, является маркером зрелых β-клеток поджелудочной железы, настоящий признак означает, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению находятся на такой стадии дифференцировки, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению содержат очень мало зрелых β-клеток поджелудочной железы или только низкую долю зрелых β-клеток поджелудочной железы.

[0063] b. Низкая доля Ki67-положительных клеток

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении характеризуются содержанием Ki67-положительных клеток в пропорции менее 3%.

[0064] «Ki67-положительные клетки» означает высокопролиферативные клетки, сосуществующие в продуцирующих инсулин клетках, образованных за счет индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток и характеризующихся экспрессией Ki67 в качестве маркера. «Ki67» известен в качестве связанного с клеточным циклом нуклеопротеина, а также известен в качестве маркера пролиферации клеток и клеточного цикла, поскольку его экспрессия обнаружена в фазах G1, S, G2 и M пролиферирующих клеток и не обнаружена в фазе G0, стадия покоя.

[0065] Далее «Ki67-положительные» также называется «Ki67+». «Ki67-положительные клетки» также называется «Ki67+ клетки».

[0066] Доля Ki67+ клеток в продуцирующих инсулин клетках составляет примерно менее 3%, предпочтительно примерно менее 1%, более предпочтительно примерно менее 0,8%, еще более предпочтительно примерно менее 0,5%.

[0067] Настоящий признак означает, что продуцирующие инсулин клетки содержат очень мало сосуществующих или остальных Ki67+ клеток или содержат только низкую долю сосуществующих или остальных Ki67+ клеток. Ki67+ клетки могут неблагоприятно влиять на полученные в конечном итоге биологические тканеподобные структуры или влиять на выживаемость трансплантата из-за высокой пролиферативной способности, а сосуществующие или остальные Ki67+ клетки в некоторых случаях не являются предпочтительными.

[0068] c. Низкая доля глюкагон-положительных и инсулин-отрицательных клеток

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении характеризуются содержанием глюкагон-положительных и Ins- клеток в пропорции менее 3%. Далее «глюкагон-положительная» также называется «Gcg+». «Глюкагон-положительные и инсулин-отрицательные клетки» также называются «Gcg+Ins- клетки».

[0069] Доля Gcg+Ins- клеток в продуцирующих инсулин клетках составляет примерно 2,5% или менее, предпочтительно примерно 2% или менее, более предпочтительно примерно 1% или менее, еще более предпочтительно примерно 0,5% или менее.

[0070] Поскольку Gcg+Ins- является маркером зрелых α-клеток поджелудочной железы, настоящий признак означает, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению находятся на такой стадии дифференцировки, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению содержат очень мало зрелых α-клеток поджелудочной железы или только низкую долю зрелых α-клеток поджелудочной железы.

[0071] d. Характеристика проявления стимулированной глюкозой реакции секреции инсулина

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении демонстрируют ответ стимулированной глюкозой секреции инсулина (GSIS).

Ответ GSIS со стороны продуцирующих инсулин клеток можно вызывать в соответствии с общеизвестным подходом (например, заявкой на патент США № 11/773944) и можно оценивать, например, путем измерения количества C-пептида, секретируемого в среду. C-пептид представляет собой продукт разложения, образующийся в количестве молей, равном количеству молей инсулина во время созревания проинсулина. Измерение количества C-пептида можно проводить, например, с помощью ELISA с использованием моноклонального антитела против C-пептида.

[0072] e. Высокая доля хромогранин A-положительных клеток

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении характеризуются содержанием хромогранин A-положительных клеток в пропорции более примерно 45%.

[0073] Далее «положительные в отношении хромогранина A» также называются «Chga+». «Положительные в отношении хромогранина A клетки» также называются «Chga+ клетки».

[0074] Доля Chga+ клеток в продуцирующих инсулин клетках предпочтительно может составлять примерно 50% или более (например, примерно 55% или более), более предпочтительно примерно 60% или более, еще более предпочтительно примерно 70% или более, еще более предпочтительно примерно 80% или более, особенно предпочтительно примерно 90% или более. Верхний предел доли Chga+ клеток в продуцирующих инсулин клетках отдельно не ограничен и может составлять, например, примерно 99% или менее.

[0075] Chga+ клетки включают клетки, которые секретируют гормон, такой как инсулин (эндокринные клетки), и в Chga+ клетки также включены вышеуказанные Ins+NKX+ клетки и Ins+NKX- клетки. Соответственно, настоящий признак означает, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению содержат высокую долю эндокринных клеток.

[0076] f. Низкая доля положительных в отношении щелочной фосфатазы плюрипотентных стволовых клеток

Продуцирующие инсулин клетки в настоящем изобретении характеризуются содержанием положительных в отношении щелочной фосфатазы плюрипотентных стволовых клеток в пропорции менее примерно 0,01%.

[0077] Доля положительных в отношении щелочной фосфатазы плюрипотентных стволовых клеток в продуцирующих инсулин клетках предпочтительно может составлять примерно 0,008% или менее, более предпочтительно примерно 0,005% или менее, еще более предпочтительно примерно 0,001% или менее.

[0078] Поскольку щелочная фосфатаза является маркером, указывающим на недифференцированное состояние плюрипотентных стволовых клеток, настоящий признак означает, что продуцирующие инсулин клетки согласно настоящему изобретению содержат очень мало незапланированных плюрипотентных стволовых клеток, которые не подверглись индукции дифференцировки, или содержат незапланированные плюрипотентные стволовые клетки, которые не подверглись индукции дифференцировки в низкой пропорции.

[0079] Положительные в отношении щелочной фосфатазы плюрипотентные стволовые клетки могут дополнительно экспрессировать дополнительный маркер, указывающий на плюрипотентность. Для дополнительного маркера, указывающего на плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток, можно использовать по меньшей мере маркер, выбранный из NANOG, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 и так далее.

[0080] Индукция дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы, клетки трубки первичной кишки, клетки задней части передней кишки, клетки-предшественники поджелудочной железы, эндокринные клетки-предшественники и продуцирующие инсулин клетки можно проводить с использованием следующих этапов индукции дифференцировки:

Этап 1) индукция дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы;

Этап 2) индукция дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы в клетки трубки первичной кишки;

Этап 3) индукция дифференцировки клеток трубки первичной кишки в клетки задней части передней кишки;

Этап 4) индукция дифференцировки клеток задней части передней кишки в клетки-предшественники поджелудочной железы;

Этап 5) индукция дифференцировки клеток-предшественники поджелудочной железы в эндокринные клетки-предшественники; и

Этап 6) индукция дифференцировки эндокринных клеток-предшественников в продуцирующие инсулин клетки.

Далее будет описан каждый этап, хотя индукция дифференцировки в каждую клетку этими подходами не ограничена.

[0081] Этап 1) Дифференцировка в клетки дефинитивной энтодермы

Плюрипотентные стволовые клетки культивируют в среде, содержащей низкую дозу активина А для обеспечения дифференцирования в клетки дефинитивной энтодермы.

[0082] Средой, используемой на этом этапе, может быть базальная среда для использования при культивировании клеток млекопитающих, такая как среда RPMI, среда MEM, среда iMEM, среда DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), улучшенная среда MEM Zinc Option, улучшенная среда MEM/1% добавка B-27/пенициллин-стрептомицин или среда MCDB131/10 мМ глюкоза/20 мМ глюкоза/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/глутамакс/аскорбиновая кислота/пенициллин-стрептомицин.

[0083] Активин А может содержаться в среде в низкой дозе, например, 5-10 нг/мл.

В другом аспекте концентрация активина А в среде составляет примерно 0,1-100 нг/мл, предпочтительно примерно 1-50 нг/мл, более предпочтительно примерно 3-10 нг/мл.

[0084] Кроме того, среду можно дополнить ингибитором ROCK и ингибитором GSK3β.

[0085] Концентрацию ингибитора GSK3β в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого ингибитора GSK3β. Например, в случае использования CHIR99021 в качестве ингибитора GSK3β его концентрация обычно составляет 2-5 мкм, предпочтительно 2-4 мкм, особенно предпочтительно примерно 3 мкм.

[0086] Концентрация ингибитора ROCK в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого ингибитора ROCK. Например, в случае использования Y27632 в качестве ингибитора ROCK его концентрация обычно составляет 5-20 мкм, предпочтительно 5-15 мкм, особенно предпочтительно примерно 10 мкм.

[0087] Кроме того, среду можно дополнить инсулином. Инсулин может содержаться в среде в количестве 0,01-20 мкм, предпочтительно 0,1-10 мкм, более предпочтительно 0,5-5 мкм. Концентрацией инсулина в среде может быть, но без ограничения, концентрация инсулина, содержащаяся в дополнительной добавке B-27.

[0088] Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Для двухмерного культивирования количество клеток в начале культивирования отдельно не ограничено и может составлять примерно 50000-1000000 клеток/см², предпочтительно примерно 100000-800000 клеток/см², более предпочтительно примерно 100000-300000 клеток/см². Для трехмерного культивирования количество клеток в начале культивирования отдельно не ограничено и может составлять примерно 10000-1000000 клеток/мл, предпочтительно примерно 100000-800000 клеток/мл, более предпочтительно примерно 300000-600000 клеток/мл. Период культивирования составляет от 1 дня до 4 дней, предпочтительно от 1 дня до 3 дней, особенно предпочтительно 3 дней.

[0089] Температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0090] Альтернативно, в настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки можно подвергать первому культивированию в среде в условиях, которые обеспечивают действие инсулина в присутствии низкой дозы активина А, а впоследствии подвергают второму культивированию в среде в условиях, которые не обеспечивают действие инсулина для получения клеток дефинитивной энтодермы.

[0091] (1) Первое культивирование

«Условия, которые обеспечивают действие инсулина», означает условия, которые вызывают активацию инсулином пути передачи сигнала инсулина в клетках. В нормальных случаях инсулин связывается с рецептором инсулина, присутствующим на поверхностях клеточной мембраны для активации тирозинкиназы, находящейся внутри рецептора, тем самым проводя тирозиновое фосфорилирование семейства субстратных белков рецептора инсулина (IRS: IRS-1, 2, 3). В настоящем документе возникновение серии реакций, которые инициируют путем связывания инсулина с рецептором инсулина, выражают как «вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина».

[0092] Примеры условий, которые обеспечивают действие инсулина, включают случай, когда инсулин содержится в среде. Инсулин может быть любого типа, который может активировать путь передачи сигнала инсулина в плюрипотентных стволовых клетках и может представлять собой инсулин, полученный с использованием рекомбинантного метода, или инсулин, полученный посредством синтеза с использованием метода твердофазного синтеза. Например, можно использовать инсулин, полученный у человека, не являющегося человеком примата, свиньи, крупного рогатого скота, лошади, овцы, козы, ламы, собаки, кошки, кролика, мыши или морской свинки, и предпочтительным является человеческий инсулин.

[0093] В настоящем изобретении в качестве «инсулина» можно использовать любой мутантный инсулин, производное инсулина или агонист инсулина, который может вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина в плюрипотентных стволовых клетках. Примеры «мутантного инсулина» включают: мутантный инсулин, обладающий полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, образованной с помощью делеции, замены, добавления или вставки 1-20 аминокислот, предпочтительно 1-10 аминокислот, еще более предпочтительно 1-5 аминокислот, в аминокислотной последовательности инсулина, и способный вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина; и мутантный инсулин, обладающий полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательностей 80% или выше, более предпочтительно 90% или выше, еще более предпочтительно 95% или выше, наиболее предпочтительно 99% или выше с аминокислотной последовательностью инсулина, и способный вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина. Сравнение аминокислотных последовательностей можно проводить с использованием известного подхода и, например, с использованием BLAST (средства поиска основного локального выравнивания в национальном центре биологической информации), например, с настройками по умолчанию. «Производное инсулина» означает: полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, образованной с помощью химической замены (например, α-метилирования, α-гидроксилирования), делеции (например, дезаминирования) или модификации (например, N-метилирования) некоторых групп в аминокислотных остатках инсулина или мутантного инсулина и способной вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина; или вещество, которое демонстрирует такое же действие. «Агонист инсулина» означает полипептид, способный вызывать активацию пути передачи сигнала инсулина путем связывания с рецептором инсулина независимо от структуры инсулина, или вещество, которое демонстрирует такое же действие.

[0094] Инсулин может содержаться в количестве 0,01-20 мкм, предпочтительно 0,1-10 мкм, более предпочтительно 0,5-5 мкм, в среде для первого культивирования. Концентрация инсулина в среде может представлять собой, но без ограничения, концентрацию инсулина, имеющуюся в дополнительной добавке B-27.

[0095] Кроме того, среду можно дополнить ингибитором ROCK и/или ингибитором GSK3β. Концентрацию ингибитора ROCK в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого ингибитора ROCK. Например, в случае использования Y27632 в качестве ингибитора ROCK его концентрация обычно составляет 5-20 мкм, а предпочтительно может составлять 5-15 мкм, особенно предпочтительно примерно 10 мкм. Концентрацию ингибитора GSK3β в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого ингибитора GSK3β. Например, в случае использования CHIR99021 в качестве ингибитора GSK3β его концентрация обычно составляет 2-5 мкм, а предпочтительно может составлять 2-4 мкм, особенно предпочтительно примерно 3 мкм.

[0096] Кроме того, среду можно дополнить одним или несколькими веществами, выбранными из группы, состоящей из пирувата (например, соли натрия), L-аланил-L-глутамина и глюкозы. Среду можно дополнить пируватом в количестве 10-1000 мг/л, предпочтительно 30-500 мг/л, более предпочтительно 50-200 мг/л, особенно предпочтительно примерно 110 мг/л. Среду можно дополнить L-аланил-L-глутамином в количестве 50-2000 мг/л, предпочтительно 100-1500 мг/л, более предпочтительно 500-1000 мг/л, особенно предпочтительно примерно 860 мг/л. Среду можно дополнить глюкозой в количестве 15 мМ или более, предпочтительно 15-30 мМ, более предпочтительно 15-25, особенно предпочтительно примерно 25 мМ. Концентрации пирувата, L-аланил-L-глутамина и глюкозы в среде могут представлять собой, но без ограничения, концентрации пирувата, L-аланил-L-глутамина и глюкозы, содержащиеся в среде DMEM (DMEM, высокая глюкоза, GlutaMAX (TM), пируват (Thermo Fisher Scientific)) или другой среде DMEM.

[0097] Для среды можно использовать среду, полученную из любой из вышеуказанных базальных сред в качестве основы с добавлением одного или нескольких вышеуказанных компонентов. Базальной средой предпочтительно является среда DMEM, более предпочтительно среда DMEM, содержащая пируват, L-аланил-L-глутамин и глюкозу в вышеуказанных количествах.

[0098] Период культивирования при первом культивировании может быть в диапазоне, выбранном из от 6 часов до 48 часов, предпочтительно 12-24 часов. температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%. Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Для двухмерного культивирования количество клеток в начале культивирования отдельно не ограничено и может составлять примерно 50000-1000000 клеток/см², предпочтительно примерно 100000-800000 клеток/см², более предпочтительно примерно 100000-300000 клеток/см². Для трехмерного культивирования количество клеток в начале культивирования отдельно не ограничено и может составлять примерно 10000-1000000 клеток/мл, предпочтительно примерно 100000-800000 клеток/мл, более предпочтительно примерно 300000-600000 клеток/мл.

[0099] (2) Второе культивирование

«Условия, которые не обеспечивают действие инсулина», означает условия, которые не вызывают активацию инсулином пути передачи сигнала инсулина в клетках. «Не вызывают активацию пути передачи сигнала инсулина» не только означает полное отсутствие активации пути передачи сигнала инсулина, но также означает вызов только небольшой активации пути передачи сигнала инсулина в такой степени, что не обнаруживается никакой значительной разницы по сравнению с активацией пути передачи сигнала инсулина в отсутствие инсулина. Поэтому примеры «условий, которые не обеспечивают действия инсулина», включают случай, когда инсулин в среде не содержится, или даже, если инсулин содержится в среде, его количество таково, чтобы вызвать только небольшую активацию в такой степени, что не обнаруживается значительная разница. Альтернативно, «условия, которые не обеспечивают действие инсулина», означает, что даже если в среде содержится инсулин, совместное включение ингибитора сигнала инсулина не вызывает активации пути передачи сигнала инсулина. «Ингибитор сигнала инсулина» означает компонент, способный блокировать путь передачи сигнала инсулина на любой стадии. Примеры ингибитора сигнала инсулина включают полипептиды и соединения, которые связываются или конкурируют с любым элементом из инсулина, рецептора инсулина и различных белков, которые выступают в качестве передающего сигнал вещества и так далее, с ингибированием межмолекулярного взаимодействия, в котором участвуют такие факторы. Примеры такого ингибитора сигнала инсулина включают LY294002 [2-(4-морфолинил)-8-фенил-4H-1-бензoпиран-4-он] который конкурирует и ингибирует связывание ATP с каталитической субъединицей киназы PI3. Ингибитор сигнала инсулина этим не ограничен, и в качестве ингибитора сигнала инсулина также можно использовать антитела, которые связываются с любым элементом из инсулина, рецептора инсулина и различных белков, которые выступают в качестве передающего сигнал вещества, или доминантно-негативные мутанты антител и антисмысловые олигонуклеотиды, siRNA и тому подобное для мРНК для любого рецептора инсулина и различных белков, которые выступают в качестве передающего сигнал вещества. Ингибитор сигнала инсулина является коммерчески доступным или может быть синтезирован согласно известному способу.

[0100] Кроме того, среду можно дополнить ингибитором ROCK и/или ингибитором GSK3β. Количество (количества) ингибитора ROCK и/или ингибитора GSK3β в среде можно выбирать из диапазонов, описанных выше для первого культивирования, и они могут быть такими же или отличаться от количества (количеств) для использования в первом культивировании.

[0101] Кроме того, среду можно дополнить одним или несколькими веществами, выбранными из группы, состоящей из пирувата, L-аланил-L-глутамина и глюкозы. Количества пирувата, L-аланил-L-глутамина и глюкозы в среде можно выбирать из диапазонов, описанных выше для первого культивирования, и они могут быть такими же или отличаться от количеств для использования в первом культивировании.

[0102] Для среды для использования во втором культивировании можно использовать среду, полученную с базальными средами для использования в культивировании клеток млекопитающих в качестве основы с добавлением одного или нескольких вышеуказанных компонентов. Для базальной среды можно использовать среды, описанные выше для первого культивирования, и базальная среда может быть такой же или отличаться от базальной среды для использования в первом культивировании. Базальной средой предпочтительно является среда DMEM, более предпочтительно среда DMEM, содержащая пируват, L-аланил-L-глутамин и глюкозу в вышеуказанных количествах.

[0103] Период культивирования для второго культивирования составляет по меньшей мере 6 часов и может быть в диапазоне, выбранном предпочтительно из 6-72 часов, еще более предпочтительно из 24-72 часов. температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0104] Среды в первом культивировании и втором культивировании можно дополнить вышеуказанной низкой дозой активина A. Количество активина А, содержащегося в среде в первом культивировании, и количество активина А содержащегося в среде во втором культивировании, могут быть одинаковыми или разными.

[0105] Кроме того, в среды в первом культивировании и втором культивировании можно добавить диметилсульфоксид.

[0106] Долю эндокринных клеток, полученных после этапа 6), можно увеличить путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в присутствии низкой дозы активина A, или проводя первое культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде в условиях, которые обеспечивают действие инсулина, в присутствии низкой дозы активина А, и впоследствии второе культивирование в среде в условиях, которые не допускают действие инсулина.

[0107] Этап 2) Дифференцировку в клетки трубки первичной кишки

Клетки дефинитивной энтодермы, полученные на этапе 1), дальше культивируют в среде, содержащей фактор роста, чтобы вызвать их дифференцировку в клетки трубки первичной кишки. Период культивирования составляет от 2 дней до 8 дней, предпочтительно примерно 4 дней.

Температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%. Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования.

[0108] В качестве культуральной среды можно использовать любую из базальных сред для использования в культивировании клеток млекопитающих, описанных выше на этапе 1). В дополнение к фактору роста среду можно соответствующим образом дополнить заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и тому подобное.

[0109] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно EGF и/или KGF, еще более предпочтительно KGF.

[0110] Концентрацию фактора роста в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого фактора роста, и она обычно составляет примерно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, предпочтительно примерно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно примерно 5-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10 его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно 0,3-116 нМ), предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ). Например, в случае использования KGF в качестве фактора роста его концентрация обычно составляет 5-150 нг/мл, предпочтительно 30-100 нг/мл, особенно предпочтительно примерно 50 нг/мл.

[0111] Этап 3) Дифференцировка в клетки задней части передней кишки

Клетки трубки первичной кишки, полученные на этапе 2), дальше культивируют в среде, содержащей фактор роста, циклопамин, ноггин и тому подобное, чтобы вызвать их дифференцировку в клетки задней части передней кишки. Период культивирования составляет от 1 дня до 5 дней, предпочтительно примерно 2 дня. Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования.

[0112] Температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0113] В качестве культуральной среды можно использовать любую из базальных сред для использования в культивировании клеток млекопитающих, описанных выше на этапе 1). В дополнение к фактору роста среду можно соответствующим образом дополнить заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и тому подобное.

[0114] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно EGF и/или KGF, еще более предпочтительно KGF.

[0115] Концентрацию фактора роста в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого фактора роста, и она обычно составляет примерно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, предпочтительно примерно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно примерно 5-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10 его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно 0,3-116 нМ), предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ). Например, в случае использования KGF в качестве фактора роста его концентрация обычно составляет 5-150 нг/мл, предпочтительно 30-100 нг/мл, особенно предпочтительно примерно 50 нг/мл.

[0116] Концентрация циклопамина в среде отдельно не ограничена и обычно составляет 0,5-1,5 мкм, предпочтительно 0,3-1,0 мкм, особенно предпочтительно примерно 0,5 мкм.

[0117] Концентрация ноггина в среде отдельно не ограничена и обычно составляет 10-200 нг/мл, предпочтительно 50-150 нг/мл, особенно предпочтительно примерно 100 нг/мл.

Также среду можно дополнить диметилсульфоксидом.

[0118] Этап 4) Дифференцировка в клетки-предшественники поджелудочной железы

Клетки задней части передней кишки, полученные на этапе 3), можно дальше культивировать в среде, содержащей фактор, имеющий активность ингибирования CDK8/19, предпочтительно в среде, содержащей фактор, имеющий активность ингибирования CDK8/19, и фактор роста, вызывающий их дифференцировку в клетки-предшественники поджелудочной железы. Период культивирования составляет от 2 дней до 10 дней, предпочтительно примерно 5 дней. Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Для двухмерного культивирования согласно предыдущему отчету (Toyoda et al. Stem Cell Research (2015) 14, 185-197) клетки задней части передней кишки, полученные на этапе 3), обрабатывают 0,25% трипсином-EDTA и диспергируют путем пипетирования, а дисперсию подвергают центрифужному разделению для получения суспензии клеток, а затем суспензию пересаживают на свежую среду этапа 4).

[0119] Как и на этапе 1) в качестве культуральной среды можно использовать базальную среду для использования в культивировании клеток млекопитающих. В дополнение к фактору роста среду можно соответствующим образом дополнить заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и тому подобное.

[0120] В качестве фактора, обладающего активностью ингибирования CDK8/19, можно использовать каждое из упомянутых выше соединений или их соли. Количество фактора, добавляемого в среду, соответствующим образом определяют согласно используемому соединению или его соли, и обычно оно составляет примерно от 0,00001 мкм до 5 мкм, предпочтительно от 0,00001 мкм до 1 мкм. Концентрацией фактора, обладающего активностью ингибирования CDK8/19, в среде предпочтительно является концентрация, которая обеспечивает активность ингибирования CDK8/19 50% или более.

[0121] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно KGF и/или EGF, еще более предпочтительно KGF и EGF.

[0122] Концентрацию фактора роста в среде устанавливают подходящим образом в зависимости от типа используемого фактора роста, и она обычно составляет примерно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, предпочтительно примерно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно примерно 5-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10 его концентрация составляет примерно 5-2000 нг/мл (то есть примерно 0,3-116 нМ), предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно примерно 10-1000 нг/мл (то есть примерно от 0,6 до 58 нМ). Например, в случае использования KGF и EGF в качестве фактора роста, концентрация of EGF обычно составляет 5-150 нг/мл, предпочтительно 30-100 нг/мл, особенно предпочтительно примерно 50 нг/мл, а концентрация KGF обычно составляет 10-200 нг/мл, предпочтительно 50-150 нг/мл, особенно предпочтительно примерно 100 нг/мл.

[0123] Культивирование в первый день на этапе 4) можно проводить в присутствии ингибитора ROCK, а культивирование в следующие дни можно проводить в среде, не содержащей ингибитор ROCK.

[0124] Среда может также содержать активатор PKC. В качестве активатора PKC используют PdBU (активатор PKC II), TPB (активатор PKC V) и тому подобное, хотя активатор PKC этим не ограничен. Концентрация добавляемого активатора PKC составляет примерно 0,1-100 нг/мл, предпочтительно примерно 1-50 нг/мл, более предпочтительно примерно 3-10 нг/мл.

Также среду можно дополнить диметилсульфоксидом или активином (1-50 нг/мл).

[0125] На любом из этапов в дополнение к описанным выше компонентам среду можно дополнить заменителем сыворотки (например, добавкой B-27, ITS-G). Также при необходимости в нее можно добавить аминокислоту, L-глутамин, GlutaMAX (название продукта), заменимую аминокислоту, витамин, никотинамид, антибиотик (например, противогрибковый антибиотик (также в настоящем документе именуемый AA), пенициллин, стрептомицин или их смесь), противомикробное средство (например, амфотерицин B), антиоксидант, пировиноградную кислоту, буфер, неогранические соли и тому подобное. В случае добавления в среду антибиотика его концентрация в среде обычно составляет 0,01-20% по массе, предпочтительно 0,1-10% по массе.

Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0126] Этап 5) Дифференцировка в эндокринные клетки-предшественники

Клетки-предшественники поджелудочной железы, полученные на этапе 4), дальше культивируют в среде, содержащей фактор роста, чтобы вызвать их дифференцировку в эндокринные клетки-предшественники. Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Для двухмерного культивирования клетки-предшественники поджелудочной железы, полученные на этапе 4), обрабатывают 0,25% трипсином-EDTA и диспергируют путем пипетирования, а дисперсию подвергают центрифужному разделению для получения суспензии клеток, а затем суспензию пересаживают на свежую среду этапа 5). Период культивирования составляет от 2 дней до 3 дней, предпочтительно примерно 2 дня.

[0127] В качестве культуральной среды можно использовать любую из базальных сред для использования в культивировании клеток млекопитающих, описанных выше на этапе 1). В среду добавляют SANT1, ретиноевую кислоту, ингибитор II ALK5, T3 и LDN согласно предыдущему отчету (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133), и в нее, кроме того, можно соответствующим образом добавлять ингибитор Wnt, ингибитор ROCK, FGF (предпочтительно FGF2), заменитель сыворотки, витамин, антибиотик и тому подобное. также среду можно дополнить диметилсульфоксидом.

[0128] Культивирование проводят путем культивирования без прилипания без использования фидерных клеток. Для культивирования используют чашку, колбу, микропланшет, пористый планшет (Nunc) и тому подобное или биореактор. Поверхность контейнера для культивирования предпочтительно обрабатывают, чтобы уменьшить адгезию к клеткам.

Температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0129] Этап 6) Дифференцировка в продуцирующие инсулин клетки

Эндокринные клетки-предшественники, полученные на этапе 5), дальше культивируют в среде, содержащей ингибитор FGFR1, чтобы вызвать их дифференцировку в продуцирующие инсулин клетки. Период культивирования составляет от 10 дней до 30 дней, предпочтительно примерно 10-20 дней.

[0130] В качестве культуральной среды можно использовать любую из базальных сред для использования в культивировании клеток млекопитающих, описанных выше, на этапе 1). В среду добавляют ингибитор II ALK5, T3, LDN, ингибитор XX γ-секретазы, ингибитор RO γ-секретазы, N-цистеин, ингибитор AXL и аскорбиновую кислоту согласно предыдущему отчету (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133), и в нее, кроме того, можно соответствующим образом добавлять ингибитор Wnt, ингибитор ROCK, FGF (предпочтительно FGF2), заменитель сыворотки, витамин, антибиотик и тому подобное. Например, среду можно дополнить ингибитором II ALK5, T3, LDN, ингибитором RO γ-секретазы и аскорбиновой кислотой, или ее можно дополнить T3, ингибитором II ALK5, ZnSO₄, гепарином, N-ацетилцистеином, тролоксом и R428.

[0131] Культивирование можно проводить посредством любого из двухмерного культивирования и трехмерного культивирования. Культивирование проводят путем культивирования без прилипания без использования фидерных клеток. Для культивирования используют чашку, колбу, микропланшет, пористый планшет (Nunc) и тому подобное или биореактор. Поверхность контейнера для культивирования предпочтительно обрабатывают, чтобы уменьшить адгезию к клеткам.

[0132] Температура культивирования отдельно не ограничена, и культивирование проводят при 30-40°C (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет порядка, например, 5%.

[0133] Ингибитор FGFR1 может содержаться в любом количестве, способном ингибировать активность FGFR1 в среде, и может содержаться в количестве, например, 10 мкм или менее, или 5 мкм или менее, предпочтительно в количестве менее 5 мкм, менее 4 мкм, менее 3 мкм или менее 2 мкм. Нижний предел количества добавляемого ингибитора FGFR1 отдельно не ограничен и может составлять 0,1 мкм или более, предпочтительно 0,5 мкм или более. Количество добавляемого ингибитора FGFR1 предпочтительно составляет менее 5 мкм и 0,1 мкм или более, более предпочтительно менее 5 мкм и 0,5 мкм или более. Культивирование в присутствии ингибитора FGFR1 можно проводить в течение по меньшей мере 12 часов, предпочтительно 24 часов или дольше, 2 дней или дольше, 4 дней или дольше, 8 дней или дольше, 10 дней или дольше, или 15 дней или дольше. Культивирование в присутствии ингибитора FGFR1 предпочтительно проводят в течение 4 дней или дольше. Культивирование в присутствии ингибитора FGFR1 можно проводить, например, в течение примерно последних 4-15 дней, предпочтительно примерно последних 4-7 дней этапа 6). Среду можно заменять во время периода обработки ингибитором FGFR1 согласно графику культивирования и можно заменить на среду с добавленным ингибитором FGFR1, имеющим такой же или другой состав, чем был до замены.

Культивирование клеток в среде, содержащей ингибитор FGFR1, может ингибировать пролиферацию Ki67-положительных клеток в продуцирующих инсулин клетках, которые нужно получить.

[0134] Продуцирующие инсулин клетки, полученные на этапе 6), можно диссоциировать с помощью такого фермента, как трипсин, и собирать. Собранные продуцирующие инсулин клетки можно криоконсервировать до использования. Затем собранные продуцирующие инсулин клетки высевают на вышеуказанную среду в количестве примерно 500000-5000000 клеток, предпочтительно примерно 1000000-4000000 клеток, более предпочтительно примерно 2000000-3000000 клеток на сосуд для культивирования или лунку и подвергают трехмерному культивированию, и, таким образом, продуцирующие инсулин клетки можно получить в виде сфероидов. Каждый сфероид состоит из примерно 100-1000 клеток, предпочтительно от примерно 200 до примерно 800 клеток, более предпочтительно от примерно 300 до примерно 500 клеток.

[0135] 2-2. Биосовместимый материал

В рамках настоящего изобретения «биосовместимый материал» означает любой материал, который не вызывает значительного иммунного ответа или нежелательной биологической реакции (например, токсической реакции, коагуляции) после трансплантации в живом организме с последующим продолжением в течение короткого или длительного периода времени. Предпочтительно, «биосовместимый материал» способствует ангиогенезу и выработке соединительной ткани у хозяина после трансплантации. Кроме того, предпочтительно, чтобы «биосовместимый материал» был биоразлагаемым материалом. Примеры таких материалов включают полимолочную кислоту (PLA), поликапролактон (PCL), полиуретан (PU), полиэтиленгликоль (PEG), полигидроксиэтилметакрилат, полигликолевую кислоту (PGA), поли(молочную кислоту-ко-гликолевую кислоту) (PLGA), поли(3-гидроксибутират-ко-гидроксивалерат) (PHBV), поли(этилен-ко-винилацетат) (PEVA) полиакриламид, полиэтиленоксид, полиэтиленамин, полигидроксибутират, поли(N-винилпирролидон), поливиниловый спирт, полипропиленфумарат, полиакриловую кислоту, поли(ε-капролактон), полиметакриловую кислоту, поливинилидендифторид (PVDF), пектиновую кислоту, гиаулороновую кислоту, гепаринсульфат, хондроитинсульфат, гепарансульфатпротеогликан, гепарин, хитин, хитозан, ксантан, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилхитозан, альгиновую кислоту, альгинат, коллаген, целлюлозу, фиброин шелка, кератин, желатин, фибрин, пуллулан, ламинин, геллан, силикон, уретан, эластин, их модифицированные продукты и их комбинации. При необходимости, поверхность «биосовместимого материала» можно подвергнуть модификации поверхности, которая обеспечивает адгезию клеток (например, покрытие субстратом для клеточной адгезии (таким как коллаген, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, ламинин, фибронектин, матригель, витронектин)) или модифицировать с помощью функциональной группы, которая регулирует пролиферацию, дифференцировку или функции клеток (например, аминогруппы, карбоксильной группы, гидроксигруппы, группы метакриловой кислоты, группы акриловой кислоты). «Биосовместимый материал» может иметь любую форму, такую как блок, шарики, пеллета, сфера, лист и гель, и может быть сплошным или пористым. Формой «биосовместимого материала» предпочтительно является трехмерная форма, и она может представлять собой, например, сферу, многогранник, например, четырехгранник и шестигранник, цилиндр, призму, конус, усеченный конус, пирамиду, усеченную пирамиду, тор, диск, элипосид или деформированную форму любого из них и может иметь любую форму, которая обеспечивает диспергирование клеток в биосовместимом материале. размером «биосовместимого материала» может быть любой размер, который обеспечивает трансплантацию и нахождение в живом организме, и, например, самая длинная сторона (диаметр круга) может составлять примерно 0,1-3,0 см, предпочтительно примерно 0,5-2,0 см, а толщина может составлять примерно 0,1-2,0 см, предпочтительно примерно 0,3-1,5 см. Количество клеток, содержащихся в биосовместимом материале, составляет примерно 500000-5000000 клеток, предпочтительно примерно 1000000-3000000 клеток.

[0136] В другом аспекте, например, размер «биосовместимого материала» может быть таким, что самая длинная сторона (диаметр круга) составляет примерно 1-30 см, предпочтительно примерно 1-15 см, более предпочтительно примерно 2-10 см.

[0137] Можно трансплантировать и обеспечивать нахождение множество «биосовместимых материалов».

[0138] В настоящем изобретении «биосовместимый материал» предпочтительно находится в виде геля (гидрогеля). Гелеобразование биосовместимого материала можно проводить с использованием известного подхода согласно биосовместимому материалу и можно проводить, например, путем добавления сшивающего средства (например, катионов металлов, таких как ионы кальция, ионы магния, ионы стронция и ионы бария или формы их солей) в водный раствор биосовместимого материала или путем обеспечения действия фибриногена и тромбина в воде. В настоящем изобретении «биосовместимым материалом» особенно предпочтительно является фибриновый гель. гель может содержать биосовместимый материал в любом количестве примерно 0,01-10% по массе в подходящем растворителе (например, воде, физиологическом растворе, среде).

[0139] В настоящем изобретении полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки диспергированно расположены в биосовместимом материале. «Диспергированно расположены» означает, что полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки расположены в биосовместимом материале с широким распределением без локализации в определенных зонах. если полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки имеют форму, например, сфероидов, «диспергированно расположенный» означает, что любые соседние сфероиды находятся с расположенным между ними биосовместимым материалом. если полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки имеют форму, например, сфероидов, «диспергированно расположенные» означает, что любые соседние сфероиды расположены с интервалом примерно 1 мкм или более, предпочтительно примерно 5 мкм или более.

[0140] В другом аспекте, если полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки имеют форму сфероидов, «диспергированно расположенные» означает, что определенная доля или более (30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более) сфероидов в биосовместимом материале расположены без контакта друг с другом и предпочтительно означает, что 95% или более сфероидов в биосовместимом материале расположены без контакта друг с другом.

[0141] В другом аспекте, если полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки имеют форму сфероидов, «диспергированно расположенные» означает, что определенная доля или более (30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более) сфероидов в биосовместимом материале представляют собой сфероиды 50-500 мкм в диаметре (что означает, что не образуются большие сфероиды за счет контакта друг с другом) и предпочтительно означает, что 95% или более сфероидов в биосовместимом материале представляют собой сфероиды 50-500 мкм в диаметре.

[0142] В другом аспекте, если полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки имеют форму сфероидов, «диспергированно расположенные» означает, что сфероиды имеют трехмерное расположение в биосовместимом материале с рисунком в мелкую крапинку. «Трехмерное расположение с рисунком в мелкую крапинку» означает не только, что сфероиды имеют трехмерное расположение таким образом, что каждый сфероид сохраняет интервал вокруг сфероидов, но также, что сфероиды имеют трехмерное расположение таким образом, что каждый сфероид находится в контакте с любым из сфероидов вокруг. Сфероиды могут иметь одинаковый размер или разные размеры. В данном документе «диспергированно расположенные» не значит, что сфероиды расположены в биосовместимом материале, а затем агрегированы/слиты с образованием более крупных сфероидов.

[0143] Хотя «диспергированное расположение» можно обеспечивать с помощью любого подхода, его можно выполнять путем достаточного встряхивания и перемешивания раствора клеток, полученного из плюрипотентных стволовых клеток, и посева раствора на биосовместимый материал и/или путем регулирования концентрации клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, подлежащих посеву на биосовместимый материал, и/или путем добавления клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в раствор биосовместимого материала и достаточного встряхивания и перемешивания раствора. если биосовместимый материал находится в геле, например, полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки можно диспергированно расположить в биосовместимом материале таким образом, чтобы смешивать полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки в растворе биосовместимого материала перед гелеобразованием, так что количество клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, падает в пределах 1000000-6000000 клеток, предпочтительно 2000000-5000000 клеток на 50-200 мкл, и раствор встряхивают и желируют перед осаждением клеток.

[0144] В другом аспекте, если биосовместимый материал находится в геле, например, полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки можно диспергированно расположить в биосовместимом материале таким образом, чтобы смешивать полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки в растворе биосовместимого материала перед гелеобразованием, так что количество клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, падает в пределах от 1 × 10⁷ до 1 × 10¹⁰ клеток, предпочтительно от 3 × 10⁸ до 1 × 10⁹ клеток на 15-50 мл, и раствор встряхивают и желируют перед осаждением клеток.

[0145] 3. Биологическая тканеподобная структура

В данном случае «биологическая тканеподобная структура» означает структуру, обладающую функциями, сопоставимыми или аналогичными функциям биологического органа или ткани, например, эпидермиса, нервов, головного мозга, спинного мозга, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, легкого, щитовидной железы, поджелудочной железы, печени, мышц, скелета, сердца, кровеносных сосудов, селезенки или почки (без ограничения). Биологическую тканеподобную структуру можно получить путем трансплантации композиции, в которой полученные из плюрипотентных стволовых клеток клетки диспергированно размещены в биосовместимом материале, в живой организм животного для нахождения и индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.

[0146] «Животным» предпочтительно является млекопитающее. Их примеры включают людей, не являющихся людьми приматов, свиней, крупный рогатый скот, лошадей, овец, коз, лам, собак, кошек, кроликов, мышей и морских свинок. Предпочтительным является человек.

[0147] Трансплантацию предпочтительно проводят в область in vivo, где композицию можно зафиксировать в заданном положении, и ее можно проводить, например, подкожно, внутрибрюшинно, в мезотелий брюшины, в большой сальник, в жировую ткань, в мышечную ткань или под капсулой каждого органа животного, такого как поджелудочная железа или почка.

[0148] После трансплантации индуцируют дифференцирование клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в композиции в окружающей среде in vivo, с дифференцированием и созреванием, и согласно используемым «клеткам, полученным из плюрипотентных стволовых клеток», можно получить структуру, обладающую функциями, сопоставимыми или аналогичными функциям органа или ткани, например, эпидермиса, нервов, головного мозга, спинного мозга, пищевода, желудка, тонкога кишечника, толстой кишки, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, легкого, щитовидной железы, поджелудочной железы, печени, мышц, скелета, сердца, кровеносных сосудов, селезенки или почки (без ограничения).

[0149] Затем полученную биологическую тканеподобную структуру можно извлечь или обеспечить фактическое нахождение в живом организме.

[0150] Биологическая тканеподобная структура может содержат: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина.

[0151] Дифференцированные клетки, полученные путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, образуют множество кластеров и диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре. Каждый кластер имеет размер примерно от 10 мкм до 1000 мкм, предпочтительно примерно от 50 мкм до 500 мкм, более предпочтительно примерно от 50 мкм до 300 мкм в диаметре. И/или каждый кластер состоит из от примерно 100 до примерно 1000 клеток, предпочтительно от примерно 200 до примерно 800 клеток, более предпочтительно от примерно 300 до примерно 500 клеток. Примерно 50-2000 кластеров, предпочтительно примерно 100-500 кластеров диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, и это количество может меняться в зависимости от количества клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, диспергированно расположенных в биосовместимом материале. «Диспергированно находятся» означает, что кластеры дифференцированных клеток находятся в биологической тканеподобной структуре с широким распределением без локализации в определенных зонах. Кроме того, «диспергированно находятся» означает, что любые соседние кластеры находятся с соединительной тканью, полученной у животного-хозяина, взаимодействующей с ними.

[0152] «Соединительная ткань, полученная у животного-хозяина», означает межклеточную матрицу, созданную клетками, полученными у животного с трансплантированной ему композицией, и ее примеры включают эластин, фибриллин, коллаген I типа и коллаген III типа III. Соединительная ткань, полученная у животного-хозяина, расположена таким образом, чтобы соединительная ткань, полученная у животного-хозяина, окружала множество кластеров дифференцированных клеток и заполняла пространство между кластерами в биологической тканеподобной структуре.

[0153] «Кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина», означает кровеносные сосуды, образованные клетками, полученными у животного с трансплантированной ему композицией, и соединенные с кровеносными сосудами животного-хозяина за пределами биологической тканеподобной структуры. Кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, внедрены в кластеры в биологической тканеподобной структуре и пропускают кровь в кластеры, обеспечивая снабжение кислородом, питательными веществами и тому подобное и выведение продуктов жизнедеятельности.

[0154] В качестве одного варианта осуществления настоящего изобретения в случае, если в качестве клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, используют клетки дефинитивной энтодермы, клетки трубки первичной кишки, клетки задней части передней кишки, клетки-предшественники поджелудочной железы, эндокринные клетки-предшественники или продуцирующие инсулин клетки, которые появляются в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы, предпочтительно продуцирующие инсулин клетки, индуцируют дифференцирование и созревание этих клеток в описанной выше композиции, трансплантированной в живой организм, и можно получить биологическую тканеподобную структуру, содержащую дифференцированные клетки обладающие функциями, сопоставимыми или аналогичными функциям панкреатического островка (далее обозначаемого как «панкреатические островковые клетки»).

[0155] В полученной таким образом биологической тканеподобной структуре панкреатические островковые клетки могут характеризоваться одним или несколькими элементами, выбранными из следующих пунктов (a) - (g):

(a) экспрессия по меньшей мере одного маркера из MAFA, UCN3 и IAPP,

(b) высокая доля хромогранин A-положительных клеток (Chga+ клеток),

(c) низкая доля Ki67-положительных клеток (Ki67+ клеток),

(d) высокая доля глюкагон-положительных и инсулин-отрицательных клеток (Gcg+Ins- клеток),

(e) характеристика проявления действия секреции инсулина в ответ на низкий уровень сахара в крови,

(f) без содержания экзокринных клеток, и

(g) высокая доля инсулин-положительных и глюкагон-отрицательных клеток (Ins+Gcg- клеток).

В данном документе «более» означает 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

[0156] Можно проводить оценку наличия или отсутствия признаков (a) - (g) спустя 4 недели, предпочтительно 8 недель, после индукции дифференцировки продуцирующих инсулин клеток (то есть после трансплантации описанной выше композиции в живой организм). Доля клеток определенного типа в панкреатических островковых клетках означает долю клеток в общем количестве клеток из кластеров клеток, полученных из имплантата.

[0157] (a) Экспрессия по меньшей мере одного маркера из MAFA, UCN3 и IAPP

Панкреатические островковые клетки содержат β-клетки поджелудочной железы. β-клетки поджелудочной железы экспрессируют по меньшей мере один маркер из MAFA, UCN3 и IAPP, которые представляют собой маркеры созревания β-клеток поджелудочной железы. β-клетки поджелудочной железы также могут характеризоваться реакцией повышения секреции инсулина за счет стимуляции глюкозы.

[0158] (b) Высокая доля Chga+ клеток

Панкреатические островковые клетки характеризуются содержанием Chga+ клеток в пропорции примерно 50% или более. Доля Chga+ клеток в панкреатических островковых клетках предпочтительно составляет примерно 60% или более, более предпочтительно примерно 70% или более, еще более предпочтительно примерно 90% или более, особенно предпочтительно примерно 95% или более (например, примерно 97% или более, примерно 98% или более).

[0159] Chga+ клетки включают в себя клетки, которые секретируют гормон, такой как инсулин и глюкагон (эндокринные клетки), и настоящий признак означает, что панкреатические островковые клетки содержат высокую долю эндокринных клеток.

[0160] (c) Низкая доля Ki67+ клеток

Панкреатические островковые клетки характеризуются содержанием Ki67-положительных клеток в пропорции менее примерно 3%. Доля Ki67-положительных клеток в панкреатических островковых клетках предпочтительно составляет менее примерно 1%, более предпочтительно менее примерно 0,8%, еще более предпочтительно менее примерно 0,5%.

[0161] Настоящий признак означает, что панкреатические островковые клетки содержат очень мало Ki67+ клеток, сосуществование или остатки которых могут быть нежелательными, или содержат очень низкую долю Ki67+ клеток.

[0162] (d) высокая доля Gcg+Ins- клеток

Панкреатические островковые клетки характеризуются содержанием Gcg+Ins- клеток в пропорции примерно 10% или более. Доля Gcg+Ins- клеток в панкреатических островковых клетках предпочтительно составляет примерно 15% или более, более предпочтительно примерно 20% или более, еще более предпочтительно примерно 25% или более. Верхний предел доли Gcg+Ins- клеток в панкреатических островковых клетках отдельно не ограничен и может составлять, например, примерно 50% или менее, предпочтительно примерно 45% или менее, более предпочтительно примерно 40% или менее.

[0163] Поскольку Gcg+Ins- является маркером зрелых α-клеток поджелудочной железы, это означает, что панкреатические островковые клетки содержат более высокую долю зрелых α-клеток поджелудочной железы, чем продуцирующие инсулин клетки. Это означает, что панкреатические островковые клетки находятся на более зрелой стадии дифференцировки, чем продуцирующие инсулин клетки.

[0164] (e) Характеристика проявления действия секреции инсулина в ответ на низкий уровень сахара в крови

Панкреатические островковые клетки характеризуются проявлением действия секреции инсулина в ответ на низкий уровень сахара в крови. «Действие секреции инсулина в ответ на низкий уровень сахара в крови» означает, что количество секретируемого инсулина увеличивается в пределах 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов или 5 часов после возникновения низкого сахара крови. «Низкий уровень сахара в крови» означает случай, когда концентрация глюкозы в крови или в среде составляет примерно 70 мг/дл или менее. Измерение количества секретируемого инсулина можно проводить с использованием любого традиционного известного подхода, который отдельно не ограничен, и можно обеспечивать путем измерения количества C-пептида в крови или в среде.

[0165] При возникновении низкого сахара крови в живом организме в нормальных случаях повышению уровня глюкозы в крови способствует секреция глюкагона и тому подобное, и в то же время в качестве антагонизма против глюкагона секретируется инсулин, что регулирует уровень глюкозы в крови. Аналогично, панкреатические островковые клетки согласно настоящему изобретению обеспечивают регулирование уровней глюкозы в крови по сравнению с низким сахаром крови и демонстрируют действие стимулирования повышения уровня глюкозы в крови в ответ на низкий уровень сахара в крови и в то же время секретируя инсулин в качестве антагонизма против повышения уровня глюкозы в крови.

[0166] (f) Без содержания экзокринных клеток

Панкреатические островковые клетки не содержат экзокринных клеток. то есть в панкреатических островковых клетках не содержатся экзокринные клетки, которые обычно составляет большую часть (примерно 95%) панкреатического островка в живом организме животных и секретирует панкреатический сок, содержащий расщепляющие ферменты, в том числе амилазу и липазу. термин «не содержащий экзокринных клеток» может включать в себя не только случай, когда панкреатические островковые клетки вообще не содержат экзокринных клеток, но также случай, когда панкреатические островковые клетки содержат низкую долю экзокринных клеток 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее или 0,5% или менее.

[0167] (g) Высокая доля Ins+Gcg- клеток

Панкреатические островковые клетки характеризуются высокой долей Ins+Gcg- клеток. Доля Ins+Gcg- клеток в панкреатических островковых клетках предпочтительно составляет примерно 20% или более, более предпочтительно примерно 30% или более, еще более предпочтительно примерно 40% или более. Верхний предел доли Ins+Gcg- клеток в панкреатических островковых клетках отдельно не ограничен и может составлять, например, примерно 80% или менее, предпочтительно примерно 70% или менее, более предпочтительно примерно 60% или менее.

[0168] Поскольку Ins+Gcg- является маркером зрелых β-клеток поджелудочной железы, это означает, что панкреатические островковые клетки содержат более высокую долю зрелых β-клеток поджелудочной железы, чем продуцирующие инсулин клетки. Это означает, что панкреатические островковые клетки находятся на более зрелой стадии дифференцировки, чем продуцирующие инсулин клетки.

[0169] В случае, если биологическая тканеподобная структура содержит панкреатические островковые клетки, панкреатические островковые клетки могут образовать кластер, в котором инсулин-положительные клетки находятся на внутренней стороне, а глюкагон-положительные клетки находятся на внешней стороне.

[0170] 6. Варианты применения

биологическая тканеподобная структура, полученная с помощью настоящего подхода, имеет, согласно используемым «клеткам, полученным из плюрипотентных стволовых клеток», функции, сопоставимые или аналогичные функциям органа или ткани, например, эпидермиса, нервов, головного мозга, спинного мозга, пищевода, желудка, тонкога кишечника, толстой кишки, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, легкого, щитовидной железы, поджелудочной железы, печени, мышц, скелета, сердца, кровеносных сосудов, селезенки или почки (без ограничения), и ее можно использовать для усиления или сохранения функций органа или ткани или для содействия или дополнения функций органа или ткани, сниженных или потерянных по причине заболевания, расстройства и тому подобное.

В качестве одного варианта осуществления настоящего изобретения в случае, если биологическая тканеподобная структура содержит описанные выше панкреатические островковые клетки, биологическая тканеподобная структура может улучшить и/или сохранить уровень глюкозы в крови у пациента за счет действия инсулина и глюкагона, секретируемых панкреатическими островковыми клетками, и поэтому может регулировать уровень глюкозы в крови до нормального уровня.

[0171] Соответственно, биологическую тканеподобную структуру можно использовать для лечения или профилактики заболевания, расстройства или симптома, для которого необходимо улучшение и/или сохранение уровней глюкозы в крови. Примеры заболевания, расстройства или симптома включают, но без ограничения, сахарный диабет (сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа), аномальные уровни глюкозы натощак и после приема пищи и гипогликемию (например, гипогликемию за счет введения инсулина у пациента с сахарным диабетом). «Лечение» означает лечение, исцеление, предотвращение, ослабление или ремиссию заболевания, расстройства или симптома, или снижение прогрессирования скорости заболевания, расстройства или симптома. «Профилактика» означает снижение вероятности или риска наступления заболевания, расстройства или симптома, или задержку наступления заболевания, расстройства или симптома.

[0172] Пациентом является млекопитающее, (например, мышь, крыса, хомяк, кролик, кошка, собака, крупный рогатый скот, овца, обезьяна и человек), предпочтительно человек.

[0173] Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.

Примеры

[0174] Пример 1: Получение и трансплантация продуцирующих инсулин клеток и оценка их функций и формы (мыши STZ-Nod-scid)

1. Метод

(1) Получение продуцирующих инсулин клеток

Индукцию дифференцировки линии Ff-I14s04 клеток iPS в продуцирующие инсулин клетки выполняли по методу трехмерного культивирования с использованием биореактора согласно вышеуказанному этапу 1)-6) или предыдущему отчету (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133).

Конкретно, клетки iPS подвергали первому культивированию в условиях, которые обеспечивают действие инсулина, в среде (DMEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин/диметилсульфоксид), содержащей фактор индукции дифференцировки (ингибитор GSK3β, ингибитор ROCK и низкая доза активина A), а впоследствии второму культивированию в условиях, которые не обеспечивают действие инсулина в среде (DMEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин/диметилсульфоксид), содержащей фактор индукции дифференцировки (низкую дозу активина A) для получения клеток дефинитивной энтодермы.

[0175] Популяция эндокринных клеток-предшественников, полученных за счет индукции дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, культивировали в среде (улучшенной MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей фактор индукции дифференцировки (ингибитор II ALK5, T3, LDN, ингибитор RO γ-секретазы, аскорбиновая кислота) и ингибитор 1 рецептора FGF (PD-166866) в течение 8 дней. Кроме того, культивирование проводили со средой (MCDB/ITS-X/2%BSA/20 мМ глюкоза/NaHCO₃/глютамакс/пенициллин-стрептомицин), содержащей частично отличающийся фактор индукции дифференцировки (ингибитор II ALK5, T3, ZnSO₄, гепарин, N-ацетилцистеин, тролокс, R428, Y-27632) и ингибитор 1 рецептора FGF (PD-166866), в течение 4 дней для получения продуцирующих инсулин клеток в виде сфероидов.

[0176] (2) Оценка экспрессии белков продуцирующих инсулин клеток перед трансплантацией

Экспрессию белка (инсулин, NKX6.1, хромогранин, Ki67) продуцирующих инсулин клеток, полученных на этапе (1), измеряли с помощью проточной цитометрии.

[0177] (3) Дисперсия и гелеобразование продуцирующих инсулин клеток в фибриновом геле

Фибриноген (Merck Millipore, 341576-100MG) для получения фибринового геля заранее растворяли в минимальной питательной среде (MCDB) для достижения 10 мг/мл и хранили при -80°C до использования. Тромбин (Sigma-Aldrich Co. LLC, 10602400001) растворяли в PBS(-) для достижения 50 ед/мл и хранили при -80°C до использования. раствор фибриногена и раствор тромбина растворяли для использования непосредственно перед использованием.

Сфероиды продуцирующих инсулин клеток, полученных на этапе (1) (каждый имеет размер примерно 50-500 мкм в диаметре, в том числе в общей сложности 3000000 клеток) собирали в 1,5-мл пробирке и осаждали. После осаждения как можно больше извлекали культуральный раствор, в который добавляли 100 мкл раствора фибриногена, и полученный продукт тщательно встряхивали. После этого добавляли раствор тромбина в 1/2 объема (50 мкл) раствора фибриногена перед осаждением агрегатов. В течение 5 минут или дольше. После добавления раствора тромбина полученный продукт оставляли отстаиваться при комнатной температуре для гелеобразования.

[0178] (4) Трансплантация продуцирующих инсулин клеток в живой организм и оценка функций процесса образования биологической тканеподобной структуры

Фибриновый гель, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, полученный на этапе (3), подкожно трансплантировали иммунодефицитным мышам NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет (группа iPIC). После трансплантации измеряли концентрации C-пептида человека (индекс инсулина, полученного из продуцирующих инсулин клеток) в крови и уровни глюкозы в крови для оценки выживаемости трансплантата и функций продуцирующих инсулин клеток. В качестве контроля брали особей без трансплантации (группа плацебо) и мышей NOD/SCID без сахарного диабета (контрольная группа), и измеряли и оценивали индексы.

[0179] (5) Оценка ответа биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, на загрузку глюкозы

Через шесть месяцев после подкожной трансплантации фибринового геля, в котором диспергировали продуцирующие инсулин клетки, принудительно перорально вводили глюкозу для временного повышения уровней глюкозы в крови, а затем оценивали ответ продуцирующих инсулин клеток путем измерения концентрации глюкозы в плазме и концентрации C-пептида человека в крови.

[0180] (6) Общее окрашивание и оценка экспрессии белков для биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток

Биологическую тканеподобную структуру, полученную из продуцирующих инсулин клеток, вырезанную спустя 6 месяцев после трансплантации, фиксировали параформальдегидом. Из фиксированной биологической тканеподобной структуры получали парафиновые срезы и замороженные срезы. Проводили окрашивание парафиновых срезов HE и окрашивание трихромом по Массону. Экспрессию намеченных белков (ядер человека (HuN), PDX1, инсулина (INS), глюкагона (GCG), CD31 мыши (mCD31), хромогранина (CHGA), Ki67) оценивали с помощью иммуногистологического окрашивания замороженных срезов.

[0181] 2. Результаты

(1) Оценка экспрессии белков продуцирующих инсулин клеток перед трансплантацией

Для продуцирующих инсулин клеток перед трансплантацией на фиг. 1 представлены результаты измерения с помощью проточной цитометрии, а в таблице 1 представлены пропорции инсулин-положительных/NKX6.1-положительных клеток, пропорции хромогранин A-положительных клеток и пропорции Ki67-положительных клеток. Из продуцирующих инсулин клеток перед трансплантацией 95% или более были положительные в отношении хромогранина A эндокринные клетки, а продуцирующими инсулин клетками была популяция клеток, причем 42,6% из них были инсулин-положительные/NKX6.1-положительные клетки, которые должны были созреть в β-клетки после трансплантации, а 30,3% из них были инсулин-положительные/NKX6.1-отрицательный клетки, которые должны были созреть в α-клетки. Доля Ki67-положительных клеток, у которых Ki67 является маркером пролиферации, имела очень маленькое значение 0,4%.

[0182] [Таблица 1]

Этап 6 день 12 Доля инсулин-положительных/NKX6.1-положительных клеток 42,6% Доля хромогранин A-положительных клеток 97,3% Доля инсулин-положительных/NKX6.1-отрицательных клеток 30,3% Доля Ki67-положительных клеток 0,4%

[0183] (2) Оценка функций процесса образования продуцирующими инсулин клетками, трансплантированными в живой организм, биологической тканеподобной структуры

На фиг. 2 и в таблице 2 показаны результаты измерения концентраций C-пептида человека в крови и уровни глюкозы в крови после трансплантации. Для животных с трансплантированным фибриновым гелем, в котором диспергировали продуцирующие инсулин клетки, высокие концентрации C-пептида человека обнаружены в крови спустя 3 месяца после трансплантации, и это сопровождалось улучшением высокого сахара крови. Уровни глюкозы в крови сохранялись на нормальных уровнях в течение 6 месяцев. Они подтверждали, что трансплантированный фибриновый гель, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, дифференцируют и созревают в подкожной зонепри перемешивании с клетками хозяина с образованием функционирующей биологической тканеподобной структуры.

[0184] [таблица 2]

Группа Концентрация C-пептида человека в крови (пМ) Уровень глюкозы в крови (мг/дл) спустя 3 месяца после трансплантации спустя 6 месяцев При трансплантации спустя 3 месяца спустя 6 месяцев Плацебо 0±0
(N=4) 0, 0
(N=2) 448±54
(N=4) 556±30
(N=4) 483, 442
(N=2) iPIC 1884±463
(N=5) 1935±104
(N=3) 455±36
(N=5) 79±21
(N=5) 65±19
(N=3) Контроль 15±26
(N=3) 0±0
(N=3) 114±10
(N=4) 119±10
(N=3) 110±4
(N=3)

Среднее значение±стандартное отклонение для N=3 или более, индивидуальные данные для N=2

[0185] (3) Оценка ответа биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, на загрузку глюкозы

На фиг. 3 представлены концентрации C-пептида человека в крови и концентрации глюкозы в плазме после загрузки глюкозы. Биологическая тканеподобная структура, образованная путем трансплантации фибринового геля, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, продемонстрировала резкую чувствительную к глюкозе секрецию C-пептида человека в крови спустя 6 месяцев после трансплантации. Несмотря на участок трансплантации, представляющий собой подкожный участок, четкое повышение C-пептида человека в крови обнаружено через 15 минут после добавления глюкозы, и поэтому был подтвержден биологический ответ, опосредованный обильным кровотоком, очень напоминающий настоящий панкреатический островок. Кроме того, снижение уровня глюкозы в крови сопровождалось снижением уровня C-пептида человека в крови, и, соответственно, предполагается, что низкий уровень сахара в крови вызывает меньшее беспокойство.

[0186] (4) Общее окрашивание и оценка экспрессии белков для биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток

На фиг. 4 представлен общий вид биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, спустя 6 месяцев после трансплантации, на фиг. 5 представлены окрашенные HE изображения вырезанной биологической тканеподобной структуры, на фиг. 6 представлены ее изображения, окрашенные трихромом по Массону, а на фиг. 7-10 показаны результаты иммуногистологического окрашивания для экспрессии намеченных белков.

Общий вид биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток (фиг. 4), показал, что биологическая тканеподобная структура имеет размер рисового зерна без заметного набухания, и биологическую тканеподобную структуру можно легко выделить из подкожного участка. В общей сложности у четырех мышей одновременно провели иссечение, и у всех мышей был продемонстрирован упомянутый общий вид. Гистологическая оценка показала, что биологическая тканеподобная структура состояла из 1) кластеров панкреатических островковых клеток, полученных из продуцирующих инсулин клеток, каждый из которых имеет диаметр 50-500 мкм, 2) полученной из организма хозяина фиброзной ткани, расположенной вокруг них, и 3) полученной из организма хозяина сосудистой структуры (фиг. 5-10).

[0187] Полученная из организма хозяина сосудистая структура этапа 3) (= положительная-CD31 мыши, фиг. 9) внедрялась в основном в кластеры эндокринных клеток этапа 1), и в кластерах панкреатических островковых клеток этапа 1) обнаружено множество эритроцитов (фиг. 5, 6). Соответственно, это очень подтвердило, что представленная биологическая тканеподобная структура обеспечивала обильный кровоток и острую биологическую реакцию, опосредованную кровотоком, как настоящий панкреатический островок. Кроме того, физическая прочность является высокой из-за большого количества в фиброзной ткани (фиг. 6). Когда фактически была предпринята попытка расщепления биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, биологическая тканеподобная структура, полученная из продуцирующих инсулин клеток, имела прочность, подобную хрящу, и не допускала легкого расщепления.

[0188] Большинством HuN-положительных клеток, полученных из продуцирующих инсулин клеток, были панкреатические островковые клетки (фиг. 7-10), и не было обнаружено пролиферации незапланированных клеток. Кроме того, Ki67-положительные/HuN-положительные клетки, где Ki67 является маркером пролиферации, составляли всего 0,5% или менее (фиг. 10). Инсулин-положительные клетки были распределены на внутренней стороне каждого кластера панкреатических островковых клеток этапа 1), а на внешней стороне каждого кластера панкреатических островковых клеток этапа 1) были распределены глюкагон-положительные клетки; такое расположение наблюдается в поджелудочной железе плода человека до рождения или в панкреатическом островке грызунов. Следовательно, подтверждено, что представленная биологическая тканеподобная структура способна функционировать в течение периода порядка нескольких десятилетий, как панкреатический островок плода человека.

[0189] Из приведенных выше результатов было продемонстрировано, что продуцирующие инсулин клетки, диспергированные в фибриновом геле и трансплантированные в живой организм, обеспечивают долгосрочную выживаемость трансплантата в подкожной зоне, в зоне со слабым кровотоком и питательными веществами и созревают дальше при перемешивании с клетками хозяина с образованием новой биологической тканеподобной структуры. Было продемонстрировано, что образованная подкожная биологическая тканеподобная структура обладает функцией регулирования уровня глюкозы в крови, сопровождаемую физиологической и резкой регуляцией секреции инсулина, как настоящий панкреатический островок in vivo.

[0190] Пример 2: Формирование биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, в живом организме с патологическим состоянием сахарного диабета и оценка ее функций

1. Метод

Фибриновый гель, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, полученный на этапе (3) примера 1 выше, подкожно трансплантировали иммунодефицитным мышам NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет, или мышам NOD/SCID без сахарного диабета. В течение 28 недель после трансплантации измеряли уровни C-пептида человека и глюкагона в крови после приема пищи и глюкозы в крови.

У всех особей спустя 28 недель вырезали биологическую тканеподобную структуру, полученную из продуцирующих инсулин клеток. Каждый вырезанный имплантат биологической тканеподобной структуры взвешивали, измельчали и подвергали обработке кислотой и этанолом, а затем измеряли содержание инсулина и глюкагона в имплантате биологической тканеподобной структуры. В качестве контроля таким же образом брали поджелудочную железу каждой мыши с трансплантацией и поджелудочную железу каждой мыши NOD/SCID без трансплантации и без сахарного диабета, и измеряли содержание гормона.

[0191] 2. Результаты

На фиг. 11 представлен переход концентраций C-пептида человека и глюкагона в крови и уровней глюкозы в крови. В течение 28 недель после трансплантации фибринового геля, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, в крови непрерывно определяли C-пептид человека. Концентрации глюкагона в крови, также увеличенные, составляют более высокие значения, чем у мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета без трансплантации. Подтверждено, что фибриновый гель, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, обеспечивает долгосрочную выживаемость трансплантата в подкожной среде, а образованная биологическая тканеподобная структура высвобождает множество гормонов панкреатических островков. Высокий уровень сахара в крови у мышей с сахарным диабетом улучшился через 12 недель после трансплантации, а уровни глюкозы в крови в течение 28 недель сохранялись в нормальном диапазоне. Состояние высокого уровня сахара в крови перед трансплантацией полностью возвращалось после вырезания биологической тканеподобной структуры, и, следовательно, было показано, что биологическая тканеподобная структура обеспечивает непрерывное, устойчивое действие улучшения высокого уровня сахара в крови.

На фиг. 12 представлено содержание гормонов в имплантате биологической тканеподобной структуры и гормонов в поджелудочной железе. Содержание инсулина и глюкагона в зависимости от веса в имплантате биологические тканеподобные структуры (справа) были выше, чем содержание в поджелудочной железе (слева). Было показано, что имплантат биологической тканеподобной структуры содержит эндокринные клетки поджелудочной железы с высокой плотностью, как и панкреатический островок в поджелудочной железе.

[0192] Пример 3: Функция регулирования уровня сахара в крови биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток

1. Метод

иммунодефицитным мышам NOD/SCID, у которых с помощью стрептозотоцина (STZ) был индуцирован сахарный диабет, или мышам NOD/SCID, имеющим мутацию гена Akita, которая вызывает спонтанное наступление сахарного диабета, подкожно трансплантировали фибриновый гель, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, полученный на этапе (3) примера 1 выше. По истечении 14 недель после трансплантации провели следующие тесты с использованием мышей, у которых был полностью улучшен высокий уровень сахара в крови.

[0193] Тест (1): для временного повышения уровней глюкозы в крови принудительно перорально вводили глюкозу, и последующий ответ биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, оценивали путем измерения концентраций в крови C-пептида человека, глюкагона и глюкагоноподобного пептида-1. В качестве контроля использовали мышей NOD/SCID без сахарного диабета без трансплантации, и измеряли концентрации эндогенных гормонов в крови.

[0194] Тест (2): Для оценки участия глюкагона в ответе биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, перед принудительным введением глюкозы принудительно перорально вводили антагонист MK-0893 рецептора глюкагона, и тестирование проводил таким же образом, как тестирование (1). MK-0893 демонстрирует более сильную антагонистическую активность по отношению к рецептору глюкагона человека, чем к рецептору глюкагона мыши (J Med Chem. 2012 Jul 12; 55 (13):6137-48).

[0195] Тест (3): Для оценки участия глюкагонаоподобного пептида-1 в высвобождении инсулина биологической тканеподобной структурой, полученной из продуцирующих инсулин клеток, в течение 3 дней с помощью осмотической помпы непрерывно подкожно вводили антагонист эксендин-9 рецептора глюкагоноподобного пептида-1, и измеряли концентрации C-пептида человека в крови перед и после введения.

[0196] Тест (4): подкожно вводили готовую форму инсулина гларгина, индуцируя низкий уровень сахара в крови, и последующий ответ биологической тканеподобной структуры, полученной из продуцирующих инсулин клеток, оценивали путем измерения C-пептида человека в крови. В качестве контроля использовали мышей NOD/SCID без сахарного диабета без трансплантации, и измеряли концентрации в крови C-пептида мыши, полученного из эндогенного панкреатического островка.

[0197] 2. Результаты

Тест (1): на фиг. 13 представлены концентрации глюкагона и глюкагоноподобного пептида-1 в крови после загрузки глюкозы. В результате загрузки глюкозы временно повышались концентрации C-пептида человека и глюкагоноподобного пептида-1 в крови, а концентрации глюкагона в крови показали тенденцию к снижению. Концентрации глюкагоноподобного пептида-1 и глюкагона в крови у мышей с трансплантацией показали значения выше, чем значения у мышей без сахарного диабета без трансплантации, что подтверждало, что биологическая тканеподобная структура высвобождала эти гормоны.

[0198] Тест (2); на фиг. 14 представлены уровни глюкозы в крови и концентрации C-пептида человека в крови после загрузки глюкозы. Предварительная обработка MK-0893 уменьшала временное повышение уровней глюкозы в крови после загрузки глюкозы и аналогичным образом уменьшало повышение концентраций C-пептида человека в крови. Наоборот, MK-0893 не влиял на уровни глюкозы в крови и концентрации в крови эндогенного C-пептида мыши у мышей без сахарного диабета без трансплантации. Они подтверждали, что глюкагон участвует в действии биологической тканеподобной структуры по регулированию сахара в крови.

[0199] Тест (3): на фиг. 15 представлены концентрации C-пептида человека в крови после приема пищи перед и после введения эксендина-9 в течение 3 дней. Концентрации C-пептида человека в крови уменьшались при непрерывном введении эксендина-9 и возвращались к уровням перед введением при прекращении введения. Было показано, что высвобождение C-пептида человека биологической тканеподобной структурой регулирует глюкагоноподобный пептид-1.

[0200] Тест (4): концентрации C-пептида человека в крови сильно снижались, когда за счет введения гларгина индуцировали низкий уровень сахара в крови. Эти изменения были подобны переходам концентрации в крови эндогенного C-пептида мыши у мышей без сахарного диабета без трансплантации. Было показано, что биологическая тканеподобная структура демонстрирует функцию регулирования секреции инсулина, похожую на функцию эндогенного панкреатического островка при индукции низкого уровня сахара в крови.

[0201] Выше было показано, что биологическая тканеподобная структура, полученная из продуцирующих инсулин клеток, образованных путем трансплантации фибринового геля, в котором диспергированы продуцирующие инсулин клетки, выполняет функцию физиологического регулирования уровня сахара в крови, в которой участвуют множество гормонов панкреатических островков, причем функция напоминает, функцию эндогенного панкреатического островка.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к композиции, содержащей фибриновый гель и инсулин-продуцирующие клетки, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток человека, для использования в способе получения биологической тканеподобной структуры. Также раскрыты способ получения биологической тканеподобной структуры и получаемая биологическая тканеподобная структура. Изобретение эффективно для регулирования уровней глюкозы в крови. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Композиция, содержащая: биосовместимый материал; и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, для использования в способе получения биологической тканеподобной структуры в биологической ткани животного-хозяина, при этом клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположены в биосовместимом материале,

где биосовместимым материалом является фибриновый гель,

где животное-хозяин представляет собой млекопитающее,

где клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека, являются продуцирующие инсулин клетки, и

где доля Ki67-положительных клеток в продуцирующих инсулин клетках составляет менее 3%.

2. Композиция по п. 1, в которой фибриновый гель получают путем смешивания клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, с фибриногеном и тромбином для гелеобразования непосредственно перед использованием композиции.

3. Композиция по п. 1, в которой клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, находятся в виде множества сфероидов.

4. Композиция по п. 1, причем способ включает трансплантацию композиции в биологическую ткань животного-хозяина, чтобы вызвать дифференцировку клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположенных в биосовместимом материале.

5. Композиция по п. 4, в которой биологической тканью животного-хозяина является подкожная ткань.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, в которой биологическая тканеподобная структура содержит: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены во множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток.

7. Композиция по п. 6, в которой дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.

8. Биологическая тканеподобная структура, используемая для регулирования уровня глюкозы в крови испытуемого субъекта, причем биологическую тканеподобную структуру трансплантируют ему до нормального уровня, которая содержит: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены во множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток,

где животное-хозяин представляет собой млекопитающее,

где дифференцированные клетки включают β-клетки поджелудочной железы и α-клетки поджелудочной железы,

где доля Ki67-положительных клеток в дифференцированных клетках составляет менее 3%.

9. Биологическая тканеподобная структура по п. 8, в которой дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.

10. Способ получения биологической тканеподобной структуры, причем способ включает трансплантацию композиции, содержащей биосовместимый материал и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, диспергированно расположены в биосовместимом материале, в биологическую ткань животного-хозяина, чтобы вызвать дифференцировку клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, в β-клетки поджелудочной железы и α-клетки поджелудочной железы,

где биосовместимым материалом является фибриновый гель,

где животное-хозяин представляет собой млекопитающее,

где клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека, являются продуцирующие инсулин клетки,

где доля Ki67-положительных клеток в продуцирующих инсулин клетках составляет менее 3%.

11. Способ по п. 10, в котором фибриновый гель получают путем смешивания клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, с фибриногеном и тромбином для гелеобразования непосредственно перед использованием композиции.

12. Способ по п. 10, в котором клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, находятся в виде множества сфероидов.

13. Способ по п. 10, в котором биологической тканью животного-хозяина является подкожная ткань.

14. Способ по любому из пп. 10-13, в котором биологическая тканеподобная структура содержит: множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, полученных путем индукции дифференцировки диспергированных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека; соединительную ткань, полученную у животного-хозяина; и кровеносные сосуды, полученные у животного-хозяина, причем множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, диспергированно находятся в биологической тканеподобной структуре, соединительная ткань окружает множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток, а кровеносные сосуды внедрены во множество кластеров, состоящих из дифференцированных клеток.

15. Способ по п. 14, в котором дифференцированные клетки не содержат экзокринных клеток.