ИНГИБИТОР РОСТА Российский патент 2024 года по МПК C12N5/77 A61K35/39 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к способу удаления в высокой степени пролиферирующихся Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции инсулин-продуцирующих клеток или в популяции β-клеток поджелудочной железы, полученных путем индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток.

Предпосылки создания изобретения

[0002] В настоящее время проводятся исследования по индуцированию дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как iPS-клетки или ES-клетки, в инсулин-секретирующие клетки, такие как инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы, и по применению полученных клеток для лечения сахарного диабета.

[0003] В настоящее время разработаны и описаны различные подходы для индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-секретирующие клетки. В непатентном документе 1 указано, что дифференцировка эндокринных клеток-предшественников, происходящих от человеческих iPS-клеток, может быть стимулирована путем обработки клеток соединением CAS192705-79-6 (1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевиной), то есть, ингибитором рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) 1.

[0004] Соединения пиридо(2,3-d)пиримидина и нафтиридина, эффективные для ингибирования протеинтирозинкиназы, являются известными. Сообщается, что эти соединения могут быть использованы для лечения атеросклероза, рестеноза и клеточно-пролиферативных раковых заболеваний (Патентный документ 1).

[0005] Кроме того, было подтверждено, что CAS192705-79-6 ингибирует пролиферацию клеток, вызываемую стимуляцией bFGF в крысиных миобластах, но не ингибирует пролиферацию клеток, вызываемую стимуляцией PDGE, и ингибирует удлинение микрососудов в кровеносных сосудах человеческой плаценты, что указывает на возможность применения этого соединения в качестве антипролиферативного агента и/или антиангиогенного агента, нацеленного на рост опухоли или образование новых кровеносных сосудов из атеросклеротических бляшек (Непатентный документ 2).

[0006] Между тем, ранее не было известно, что популяция инсулин-продуцирующих клеток или популяция β-клеток поджелудочной железы, полученная путем последующего индуцирования дифференцировки популяции эндокринных клеток-предшественников, происходящих от плюрипотентных стволовых клеток, или популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки, включает в высокой степени пролиферирующиеся клетки. Кроме того, удаление таких клеток не обсуждалось.

Список цитируемых документов

Патентные документы

[0007] Патентный документ 1: WO96/15128.

Непатентные документы

[0008] Непатентный документ 1: Scientific Reports 6, Article number:35908 (2016).

Непатентный документ 2: The journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, July 1998, Vol. 286(1), p.569-577.

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0009] Авторами настоящей заявки было обнаружено, что популяция клеток, полученная путем индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы, включает, наряду с этими инсулин-секретирующими клетками (инсулин-продуцирующими клетками и β-клетками поджелудочной железы), в высокой степени пролиферирующиеся клетки, характеризующиеся тем, что они являются позитивными по маркеру Ki67 (далее называемыми «Ki67-позитивными клетками»).

[0010] В случае применения инсулин-секретирующих клеток, полученных путем индуцирования дифференцировки, для лечения сахарного диабета и т.п., очень важно, с точки зрения безопасности, полностью удалять клетки, не являющиеся инсулин-секретирующими клетками. Кроме того, уже существующие или оставшиеся в высокой степени пролиферирующиеся клетки могут негативно влиять на реципиента или на длительность выживания трансплантата инсулин-секретирующих клеток, а поэтому они не являются предпочтительными.

[0011] В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является разработка способа удаления в высокой степени пролиферирующихся Ki67-позитивных клеток, присутствующих вместе с инсулин-секретирующими клетками, полученными путем индуцирования дифференцировки.

Решение проблемы

[0012] Авторами настоящей заявки были проведены тщательные исследования для достижения этой цели, и, в результате было обнаружено, что популяция эндокринных клеток-предшественников, полученная путем индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток, или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки, может быть обработана ингибитором FGFR1, в результате чего ингибируется пролиферация Ki67-позитивных клеток, что позволяет получить популяцию инсулин-продуцирующих клеток или популяцию β-клеток поджелудочной железы, имеющую пониженное содержание Ki67-позитивных клеток.

[0013] Настоящее изобретение основано на этих новых данных и включает нижеследующие варианты изобретения.

[1] Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий стадию обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы ингибитором FGFR1.

[2] Способ в соответствии с [1], дополнительно включающий стадию дифференциации популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1.

[3] Способ в соответствии с [1] или [2], где популяцию инсулин-продуцирующих клеток или популяцию β-клеток поджелудочной железы обрабатывают менее, чем 5 мкМ ингибитора FGFR1.

[4] Способ в соответствии с любым из [1]-[3], где продуцируемая популяция клеток содержит Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 3%.

[5] Способ в соответствии с любым из [1]-[4], где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)-пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину или ее соль.

[5-1] Способ в соответствии с любым из [1]-[4], где ингибитор FGFR1 представляет собой вещество, имеющее 50% FGFR1-ингибирующую концентрацию (IC₅₀) 1 мкМ или ниже.

[5-2] Способ в соответствии с любым из [1]-[4], где ингибитором FGFR1 является 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевина (CAS No.: 192705-79-6), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7), PD-173074 (CAS No.: 219580-11-7), FGFR4-IN-1 (CAS No.: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (CAS No.: 1448169-71-8), FIIN-2 (CAS No.: 1633044-56-0), AZD4547 (CAS No.: 1035270-39-3), FIIN-3 (CAS No.: 1637735-84-2), NVP-BGJ398 (CAS No.: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (CAS No.: 872511-34-7), CH5183284 (CAS No.: 1265229-25-1), деразантиниб (CAS No.: 1234356-69-4), рацемат деразантиниба, феруловая кислота (CAS No.: 1135-24-6), SSR128129E (CAS No.: 848318-25-2), свободная кислота SSR128129E (CAS No.: 848463-13-8), эрдафитиниб (CAS No.: 1346242-81-6), BLU9931 (CAS No.: 1538604-68-0), PRN1371 (CAS No.: 1802929-43-6), S49076 (CAS No.: 1265965-22-7), LY2874455 (CAS No.: 1254473-64-7), линситиниб (CAS No.: 867160-71-2), довитиниб (CAS No.: 405169-16-6), анлотиниб (CAS No.: 1058156-90-3), бриваниб (CAS No.: 649735-46-6), деразантиниб (CAS No.: 1234356-69-4), дигидрохлорид анлотиниба (CAS No.: 1360460-82-7), ACTB-1003 (CAS No.: 939805-30-8), BLU-554 (CAS No.: 1707289-21-1), рогаратиниб (CAS No.: 1443530-05-9), эзилат BIBF 1120 (CAS No.: 656247-18-6), гидрохлорид TG 100572 (CAS No.: 867331-64-4), ENMD-2076 (CAS No.: 934353-76-1), аланинат бриваниба (CAS No.: 649735-63-7), TG 100572 (CAS No.: 867334-05-2), BIBF 1120 (CAS No.: 656247-17-5), тартрат ENMD-2076 (CAS No.: 1291074-87-7), TSU-68 (CAS No.: 252916-29-3), понатиниб (CAS No.: 943319-70-8), сульфатиниб (CAS No.: 1308672-74-3), LY2784544 (CAS No.: 1229236-86-5), лактат довитиниба (CAS No.: 692737-80-7), SU 5402 (CAS No.: 215543-92-3), FGF-401 (CAS No.: 1708971-55-4), тирозинкиназа-IN-1 (CAS No.: 705946-27-6), PP58 (CAS No.: 212391-58-7), гидрохлорид TG 100801 (CAS No.: 1018069-81-2), креноланиб (CAS No.: 670220-88-9), TG 100801 (CAS No.: 867331-82-6), гидрохлорид пазопаниба (CAS No.: 635702-64-6), пазопаниб (CAS No.: 444731-52-6), PD1 68393 (CAS No.: 194423-15-9), апатиниб (CAS No.: 1218779-75-9), изетионат палбоциклиба (CAS No.: 827022-33-3), форетиниб (CAS No.: 849217-64- 7), ленватиниб (CAS No.: 417716-92-8), тандутиниб (CAS No.: 387867-13-2) или их соли.

[6] Способ в соответствии с любым из [2]-[5], где стадию дифференцировки популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1, осуществляют путем трансплантации животному.

[7] Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий стадию обработки популяции эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки менее чем 5 мкМ ингибитора FGFR1.

[8] Способ уменьшения числа или ингибирования пролиферации Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающий:

обработку популяции клеток ингибитором FGFR1.

[8-1] Способ ингибирования пролиферации Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции эндокринных клеток-предшественников или в популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающий:

обработку популяции клеток ингибитором FGFR1.

[8-2] Способ в соответствии с [8], где абсолютное количество Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции клеток, снижено.

[8-3] Способ в соответствии с любым из [8], [8-1] и [8-2], где количество клеток, которые являются эндокринными клетками-предшественниками или клетками на более поздней стадии дифференцировки и не являются Ki67-позитивными клетками, присутствующими в клеточной популяции, не снижается.

[9] Способ в соответствии с любым из [8]-[8-3], где популяция эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки представляет собой популяцию инсулин-продуцирующих клеток.

[10] Способ в соответствии с [8] или [9], где популяцию эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки обрабатывают менее чем 5 мкМ ингибитора FGFR1.

[11] Способ в соответствии с любым из [8]-[10], где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину или ее соль.

[12] Популяция клеток-предшественников поджелудочной железы или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 3%.

[12-1] Популяция клеток-предшественников поджелудочной железы или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 2%.

[12-2] Популяция клеток-предшественников поджелудочной железы или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 1%.

[12A] Популяция эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 3%.

[12A-1] Популяция эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 2%.

[12A-2] Популяция эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающая Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 1%.

[13] Популяция клеток в соответствии с любым из [12]-[12-2], где популяция клеток представляет собой популяцию инсулин-продуцирующих клеток.

[14] Популяция клеток в соответствии с [12] или [13], где популяцию клеток используют для трансплантации.

[14-1] Лекарственное средство, содержащее популяцию клеток в соответствии с [12] или [13].

[14-2] Пролекарство, содержащее популяцию клеток в соответствии с [12] или [13].

[15] Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий следующие стадии:

(0) проведения любого описанного здесь способа (например, любого способа, описанного в абзацах [0058] - [0106]);

(1) обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы ингибитором FGFR1; и

(2) дифференцировки популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1.

[16] Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий следующие стадии:

(1) обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы ингибитором FGFR1; и

(2) заливки популяции инсулин-продуцирующих клеток в гель, содержащий альгиновую кислоту.

[17] Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий стадии:

(0) доведения чистоты популяции клеток-мишеней по меньшей мере до 70% или более с применением способа очистки популяции клеток-мишеней;

(1) обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы ингибитором FGFR1; и

(2) дифференцировки популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1.

[18] Способ лечения сахарного диабета, включающий стадию трансплантации популяции клеток, обработанных ингибитором FGFR1.

Настоящее описание включет содержание, приведенное в описании изобретения и/или в чертежах заявки на патент Японии № 2018-082606, по отношению к которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.

Преимущественные эффекты изобретения

[0014] Настоящее изобретение относится к способу удаления в высокой степени пролиферирующихся Ki67-позитивных клеток, присутствующих вместе с инсулин-секретирующими клетками, полученными путем индуцирования дифференцировки.

Краткое описание чертежа

[0015] [Фиг. 1] На Фиг. 1 показаны результаты аутопсии и иммуногистологического окрашивания трансплантата, взятого через 5 недель после трансплантации популяции инсулин-продуцирующих клеток, полученных путем (или без) обработки ингибитором FGFR1. Черной стрелкой показан трансплантат.

Описание вариантов осуществления изобретения

[0016] 1. Терминология

Далее будут описаны термины, используемые в настоящей заявке.

[0017] Используемый здесь термин «приблизительно» означает величину, которая может варьироваться до плюс или минус 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от эталонной величины. Предпочтительно, термин «приблизительно» или «примерно» означает интервал величин от минус или плюс 15%, 10%, 5% или 1% от эталонной величины.

[0018] Используемые здесь термины «содержит(ат)» или «содержащий» означают включение элемента(ов), следующего(их) за данным(и) словом(ами) без какого-либо ограничения. Соответственно, это указывает на включение элемента(ов), следующего(их) за данным(и) словом(ами), но не указывает на исключение любого другого элемента.

[0019] Используемый здесь термин «состоит(ят) из» или «состоящий(е) из» означает включение всех элементов, следующих за за данным(и) словом(ами) и не ограничивается ими. Соответственно, термины «состоит(ят) из» или «состоящий(е) из» указывают на то, что перечисленные элементы являются обязательными или главными, а другие элементы, в основном, отсутствуют.

[0020] Используемый здесь термин «без использования фидерной(ых) клетки (клеток)» означает, в основном, отсутствие фидерных клеток и среды, предварительно кондиционированной путем культивирования фидерных клеток. В соответствии с этим, среда не содержит каких-либо веществ, таких как фактор роста или цитокин, секретируемых фидерными клетками.

[0021] «Фидерные клетки» или «фидеры» означают клетки, которые культивируют совместно с клетками других типов, что позволяет поддерживать клетки и обеспечивать среду для роста клеток. Фидерные клетки могут происходить от клеток одного и того же вида или от различных видов клеток, отличающихся от клеток, которые они поддерживают. Так, например, в качестве фидеров для человеческих клеток могут быть использованы фибробласты кожи человека или человеческие эмбриональные стволовые клетки или первичная культура эмбриональных фибробластов или иммортализованных эмбриональных мышиных фибробластов. Фидерные клетки могут быть инактивированы путем облучения или обработки митомицином С.

[0022] Используемый здесь термин «прилипшие (прилипаюшие)» относится к клеткам, прикрепленным к контейнеру, например, к клеткам, которые прикреплены к чашке для культивирования клеток или к колбе, изготовленной из стерилизованного пластика (или пластика с покрытием) в присутствии соответствующей среды. Некоторые клетки не могут поддерживаться или расти в культуре без прилипания к контейнеру для культивирования клеток. И напротив, неприлипающие клетки могут сохраняться и размножаться в культуре, не прилипая к контейнеру.

[0023] Используемый здесь термин «культивирование» относится к поддержанию, росту и/или дифференцировке клеток в среде in vitro. «Культивирование» означает поддержание, пролиферацию и/или дифференцировку клеток из ткани или живого организма, например, в чашке или в колбе для культивирования клеток. Культура включает двумерную культуру (плоскую культуру) и трехмерную культуру (суспензионную культуру).

[0024] Используемые здесь термины «обогащать» и «обогащение» относятся к увеличению количества определенного компонента в композиции, такой как композиция клеток, а термин «обогащенный», если он используется для описания композиции клеток, например, популяции клеток, означает увеличение количества определенного компонента в клеточной популяции по сравнению с процентным содержанием такого компонента в популяции клеток до обогащения. Так, например, композиция, такая как популяция клеток, может быть обогащена клетами-мишенями, и, соответственно, процент клеток-мишеней увеличивается по сравнению с процентом клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток до обогащения. Популяция клеток может быть обогащена клетками-мишенями с применением метода отбора и сортинга клеток, известного специалистам. Популяция клеток может быть обогащена с примененеим конкретного описанного здесь способа сортинга или отбора. В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяция клеток обогащена популяцией клеток-мишеней по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% методом обогащения популяции клеток-мишеней.

[0025] Используемые здесь термины «истощать» и «истощение» относятся к снижению количества определенного компонента в клетках или в композиции, такой как композиция клеток, а термин «истощенный», если он используется для описания композиции клеток, например, популяции клеток, означает снижение количества определенного компонента по сравнению с процентным содержанием такого компонента в популяции клеток до истощения. Так, например, композиция, такая как популяция клеток, может быть дефицитной по клетам-мишеням, и, соответственно, процент клеток-мишеней снижается по сравнению с процентом клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток до истощения. Популяция клеток может быть сделана дефицитной по клеткам-мишеням с применением метода отбора и сортинга клеток, известного специалистам. Популяция клеток может быть истощена с примененеим конкретного описанного здесь способа сортинга или отбора. В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяция клеток истощена (является дефицитной) по популяции клеток-мишеней по меньшей мере на 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% методом истощения популяции клеток-мишеней.

[0026] Используемые здесь термины «очищать» и «очистка» относятся к удалению примесей из композиции, такой как композиция клеток, и к ее очистке в отношении некоторых компонентов, а термин «очищенный», если он используется для описания композиции клеток, например, популяции клеток, относится к популяции клеток, в которой количество примесей уменьшено по сравнению с процентным содержанием таких компонентов в популяции клеток перед очисткой, и чистота определенного компонента повышается. Так, например, композиция, такая как популяция клеток, может быть очищена в целях увеличения числа клеток-мишеней определенного типа, и, в соответствии с этим, процентное содержание клеток-мишеней увеличивается по сравнению с процентом клеток-мишеней, присутствующих в популяции клеток до очистки. Популяция клеток может быть очищена для увеличения числа клеток-мишеней определенного типа методом отбора и сортинга клеток, известным специалистам в данной области. Популяция клеток может быть очищена конкретным описанным здесь способом сортинга или отбора. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения, чистота популяции клеток-мишеней достигается способом очистки популяции клеток-мишеней по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99%, или до той степени, когда примеси (включая загрязняющие клетки) не детектируются.

[0027] Используемый здесь термин «отсутствие снижения числа клеток» означает, что число клеток заметно не уменьшается из-за проведения способа согласно изобретению, и означает, что заметной разницы между числом клеток до проведения данного способа и числом клеток после проведения этого способа, не наблюдается. Однако, может наблюдаться снижение числа клеток, которое не вызвано проведением способа согласно изобретению (например, в результате естественной гибели клеток, которая обычно может наблюдаться на стадиях традиционного культивирования и дифференцировки клеток). Таким образом, термин ««отсутствие снижения числа клеток»» также включает случаи, когда уровень снижения числа клеток после проведения способа согласно изобретению по сравнению с уровнем, наблюдаемым до проведения этого способа, составляет 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, или 5% или менее.

Используемый здесь термин «подавление пролиферации» означает, что количество клеток заметно не увеличивается из-за проведения способа согласно изобретению, и означает, что какого-либо заметного увеличения числа клеток до проведения данного способа по сравнению с числом клеток после проведения этого способа, не наблюдается. «Подавление пролиферации» также включает случай, когда уровень увеличения числа клеток после проведения способа согласно изобретению по сравнению с уровнем увеличения числа клеток до проведения этого способа составляет 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее или 5% или менее.

[0028] Используемый здесь термин «маркер» означает клеточный антиген или его ген, который специфически экспрессируется в зависимости от предварительно определенного типа клеток, такой как «маркерный белок» и «маркерный ген». Предпочтительно, маркер представляет собой маркер клеточной поверхности, который позволяет определять концентрацию, выделять и/или детектировать живые клетки. Маркер может представлять собой маркер позитивного отбора или маркер негативного отбора.

[0029] Детектирование маркерного белка может быть проведено с помощью иммунологического анализа, например, ELISA, иммуноокрашивания или проточной цитометрии с использованием антитела, специфичного для маркерного белка. Детектирование маркерного гена может быть проведено методом амплификации и/или детектирования нуклеиновой кислоты, известного специалистам в данной области, например, с помощью ОТ-ПЦР, микромассива, биочипа или т.п. Используемый здесь термин «позитивный» по маркерному белку означает, что он был обнаружен как позитивный с помощью проточной цитометрии, а термин «негативный» по маркерному белку означает, что его количество равно или меньше нижнего предела детектирования в проточной цитометрии. Кроме того, «позитивный» по маркерному гену означает, что он был обнаружен с помощью ОТ-ПЦР, а «негативный» по маркерному гену означает, что его количество равно или меньше нижнего предела детектирования в ОТ-ПЦР.

[0030] Используемый здесь термин «экспрессия» определяется как транскрипция и/или трансляция определенной нуклеотидной последовательности под контролем внутриклеточного промотора.

[0031] Используемый здесь термин «фактор, обладающий CDK8/19-ингибирующей активностью» означает любое вещество, обладающее ингибирующей активностью по отношению к CDK8/19. CDK8, в отличие от других белков того же самого семейства CDK, не требуется для пролиферации клеток. Ингибирование CDK8 не имеет существенного эффекта в обычных условиях. CDK19 и CDK8 похожи друг на друга, как упоминалось выше. Обычно, ингибирование CDK8 включает также ингибирование CDK19.

[0032] «Факторы роста» представляют собой эндогенные белки, которые стимулируют дифференцировку и/или пролиферацию конкретных клеток. Примеры «факторов роста» включают эпидермальный фактор роста (EGF), кислотный фактор роста фибробластов (aFGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), инсулинподобный фактор роста 2 (IGF-2), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста нервных клеток (NGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста бета, ответственный за трансформацию (TGF-β), васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансферрин, различные интерлейкины (например, от IL-1 до IL-18), различные колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), различные интерфероны (например, IFN-γ и т.п.), и другие цитокины, вляющие на стволовые клетки, например, фактор стволовых клеток (SCF) и эритропоэтин (Epo).

[0033] Используемый здесь термин «ингибиторы ROCK» означает вещества, которые ингибируют Rho-киназу (ROCK: Rho-ассоциированная протеинкиназа, содержащая суперспираль) и могут представлять собой вещества, которые ингибируют ROCK I или ROCK II. Ингибиторы ROCK не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут выполнять вышеупомянутую функцию и их примерами являются N-(4-пиридинил)-4β-[(R)-1-аминоэтил]циклогексан-1α-карбоксамид (который также может обозначаться здесь как Y-27632), фазудил (HA1077), (2S)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил]сульфонил]гексагидро-1H-1,4-диазепин (H-1152), 4β-[(1R)-1-аминоэтил]-N-(4-пиридил)бензол-1-карбоксамид (Wf-536), N-(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-4-ил)-4PER(R)-1-аминоэтил] циклогексан-1α-карбоксамид (Y-30141), N-(3-{[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3-ил)-1-этил-1H-имидадазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси}фенил)-4-{[2-(4-морфолинил)этил]окси}бензамид (GSK269962A), N-(6-фтор-1H-индазол-5-ил)-6-метил-2-оксо-4-[4-(трифторметил)фенил]-3,4-дигидро-1H-пиридин-5-карбоксамид (GSK429286A). Ингибиторы ROCK не ограничиваются указанными соединениями, и могут быть также использованы антисмысловые олигонуклеотиды и киРНК, нацеленная на мРНК ROCK, антитела, которые связываются с ROCK, и доминантно-негативные мутанты ROCK, которые являются коммерчески доступными или были синтезированы как ингибиторы ROCK известным методом.

[0034] Используемые здесь «ингибиторы GSK3β» представляют собой вещества, который обладают активностью ингибирования GSK3β (гликогенсинтазы-киназы 3β). GSK3 (гликогенсинтаза-киназа 3) представляет собой сериновую/треониновую протеинкиназу и участвует во многих путях передачи сигнала, ассоциированных с продуцированием гликогена, апоптозом, поддержанием стволовых клеток и т.п. GSK3 имеет 2 изоформы α и β. «Ингибиторы GSK3β», используемые в настоящем изобретении, не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут обладать GSK3β- ингибирующей активностью, и могут представлять собой вещества, обладающие GSK3α-ингибирующей активностью и GSK3β-ингибирующей активностью.

[0035] Примерами ингибиторов GSK3β являются CHIR98014 (2-[[2 -[(5-нитро-6-аминопиридин-2-ил)амино]этил]амино]-4-(2,4-дихлорфенил)-5-(1H-имидазол-1-ил)пиримидин), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]никотинонитрил), TDZD-8 (4-бензил-2-метил-1,2,4-тиадиазолидин-3,5-дион), SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), TWS-119 (3-[6-(3-аминофенил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-илокси] фенол), кенпауллон, 1-азакенпауллон, SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), SB415286 (3-[(3-хлор-4-гидроксифенил)амино]-4-(2-нитрофенил)-1H-пиррол-2,5-дион) и AR-AO144-18, CT99021, CT20026, BIO, BIO-ацетоксим, комплекс пиридокарбазол-циклопентадиенилрутений, OTDZT, альфа-4-дибромацетофенон, литий и т.п. GSK3β не имеют конкретных ограничений, и могут быть также использованы антисмысловые олигонуклеотиды и киРНК, нацеленные на мРНК GSK3β, антитела, которые связываются с GSK3β, доминантно-негативные мутанты GSK3β и т.п., которые являются коммерчески доступными или были синтезированы как ингибиторы GSK3β известным методом.

[0036] Используемыми здесь примерами «заменителей сыворотки» являются заменитель сыворотки с нокаутом (KSR: Invitrogen), заменитель сыворотки StemSure (Wako), добавка B-27, добавка N2, альбумин (например, альбумин с высоким содержанием липидов), инсулин, трансферрин, жирные кислоты, предшественники коллагена, микроэлементы (например, цинк, селен (например, селенит натрия)), 2-меркаптоэтанол, 3'-тиолглицерин или их смеси (например, ITS-G). Предпочтительными заменителями сыворотки являются добавка B-27, KSR, заменитель сыворотки StemSure, ITS-G. Концентрация заменителя сыворотки в среде при добавлении в среду составляет 0,01-10% по массе, а предпочтительно, 0,1-2% по массе. В настоящем изобретении, вместо сыворотки предпочтительно используется «заменитель сыворотки».

[0037] 2. Популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки с ингибированной пролиферацией Ki67-позитивных клеток.

Настоящее изобретение относится к популяции эндокринных клеток-предшественников или к популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки, способных ингибировать пролиферацию Ki67-позитивных клеток. Эти популяции клеток могут быть получены путем обработки ингибитором FGFR1.

[0038] Используемый здесь термин «Ki67-позитивные клетки» означает клетки, которые присутствуют вместе с эндокринными клетками-предшественниками или клетками на более поздней стадии дифференцировки, по меньшей мере, в популяции эндокринных клеток-предшественников или в популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки, полученных путем индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы, и характеризуются экспрессией Ki67 в качестве маркера.

«Ki67» известен как ассоциированный с клеточным циклом нуклеопротеин и также как маркер клеточной пролиферации и клеточного цикла, поскольку его экспрессия обнаруживается на фазах G1, S, G2 и M пролиферирующихся клеток и не обнаруживается на фазе G0, то есть, на стадии покоя.

[0039] Известно, что клетки, обладающие различными свойствами в зависимости от стадий дифференцировки, появляются в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы (WO2009/012428 и WO2016/021734). Так, например, клетки на стадиях дифференцировки можно в широком смысле классифицировать на плюрипотентные стволовые клетки, дефинитивные клетки эндодермы, первичные клетки кишечной трубки, клетки задней части передней кишки, клетки-предшественники поджелудочной железы, эндокринные клетки-предшественники, инсулин-продуцирующие клетки и β-клетки поджелудочной железы в порядке от относительно недифференцированных к дифференцированным формам.

[0040] Используемый здесь термин «плюрипотентность» означает способность дифференцироваться в ткани и клетки, имеющие различные формы и функции, и дифференцироваться в клетки любой линии 3 зародышевых слоев. «Плюрипотентность» отличается от «тотипотентности», которая представляет собой способность дифференцироваться в любую ткань живого организма, включая плаценту, тем, что плюрипотентные клетки не могут дифференцироваться в плаценту и, следовательно, не обладают способностью к формированию живого организма.

[0041] Используемый здесь термин «мультипотентность» означает способность дифференцироваться во множественное и ограниченное число линий дифференцировки клеток. Так, например, мезенхимальные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, нервные стволовые клетки являются мультипотентными, но не плюрипотентными.

[0042] Используемый здесь термин «плюрипотентные стволовые клетки» относится к эмбриональным стволовым клеткам (ES-клеткам) и к клеткам, потенциально обладающим плюрипотентностью, аналогичной плюрипотентности ES-клеток, то есть, способностью дифференцироваться в различные ткани (все эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани) в живом организме. Примеры клеток, обладающих плюрипотентностью, аналогичной плюрипотентности ES-клеток, включают «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» (которые могут также называться здесь «iPS-клетками»). В настоящем изобретении, плюрипотентные стволовые клетки предпочтительно представляют собой человеческие плюрипотентные стволовые клетки.

[0043] Доступные «ES-клетки» включают мышиные ES-клетки, такие как различные мышиные линии ES-клеток, созданные inGenious, RIKEN и т.п., и человеческие ES-клетки, такие как различные линии ES-клеток человека, созданные NIH, RIKEN, Kyoto University, Cellartis и т.п. Так, например, доступные линии ES-клеток включают CHB-1 - CHB-12, RUES1, RUES2, HUES1-HUES28 от NIH и т.п.; H1 и H9 от WisCell Research; и KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES-4, KhES-5, SSES1, SSES2, SSES3 от RIKEN и т.п.

[0044] «Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» относятся к клеткам, которые были получены путем перепрограммирования соматических клеток млекопитающих или недифференцированных стволовых клеток в результате введения определенных факторов (факторов перепрограммирования ядер). В настоящее время существуют различные «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки», и могут быть использованы iPS-клетки, полученные Yamanaka et al., путем введения 4 факторов Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc в мышиные фибробласты (Takahashi K., Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676); iPS-клетки, полученные из клеток человека и созданные путем введения аналогичных 4 факторов в человеческие фибробласты (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872); Nanog-iPS-клетки, созданные путем сортинга клеток посредством экспрессии Nanog в качестве индикатора после введения 4 факторов (Okita, K., Ichisaka, T. и Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317); iPS-клетки, полученные способом без использования c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106); и iPS-клетки, созданные путем введения 6 факторов без вирусов (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31 (3) 458-66). Кроме того, могут быть использованы индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, созданные путем введения 4 факторов OCT3/4, SOX2, NANOG и LIN28, Thomson et al. (Yu. J., Thomson J. А. et al., Science (2007) 318: 1917-1920); индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные Daley et al. (Park IH, Daley GQ и др., Nature (2007) 451: 141-146); индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные Sakurada et al. (Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии № 2008-307007) и т.п.

[0045] Кроме того, могут быть использованы любые из известных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, известных специалистам в данной области и описанных во всех опубликованных статьях (например, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Issue 5, 568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., Et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, № 7, 795-797) или в патентах (например, в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии № 2008-307007, в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии № 2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007-069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009-006930, WO2009-006997, WO2009-007852).

[0046] Доступные индуцированные плюрипотентные клеточные линии включают различные iPS-клеточные линии, созданные NIH, Институтом физических и химических исследований (RIKEN), Киотским университетом и т.п. Так, например, такие человеческие iPS-клеточные линии включают клеточные линии RIKEN HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A и Nips-B2, а также клеточные линии Киотского университета Ff-WJ-18, Ff-I01s01, Ff-I01s02, Ff-I01s04, Ff-I01s06, Ff-I14s03, Ff-I14s04, QHJI01s01, QHJI01s04, QHJI14s03, QHJI14s04, 253G1, 201B7, 409B2, 454E2, 606A1, 610B1, 648A1, клеточные линии CDI, iPS-клетки MyCell (21525.102.10A), iPS-клетки MyCell (21526.101.10A) и т.п.

[0047] Используемый здесь термин «популяция клеток-предшественников поджелудочной железы» означает популяцию клеток, характеризующихся наличием клеток-предшественников поджелудочной железы. Используемый здесь термин «клетки-предшественники поджелудочной железы» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного из маркеров PDX-1, NKX6-1, PTF-1α, GATA4 и SOX9.

[0048] Популяция клеток-предшественников поджелудочной железы представляет собой популяцию клеток, включающую клетки-предшественники поджелудочной железы в количестве 30% или более, предпочтительно, 50% или более, а более предпочтительно 70% или более. Популяция клеток-предшественников поджелудочной железы может включать и другие клетки (например, эндокринные клетки-предшественники, инсулин-продуцирующие клетки и Ki67-позитивные клетки) в дополнение к клеткам-предшественникам поджелудочной железы.

[0049] Используемый здесь термин «популяция эндокринных клеток-предшественников» означает популяцию клеток, характеризующуюся наличием эндокринных клеток-предшественников.

[0050] Используемый здесь термин «эндокринные клетки-предшественники» означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного из маркеров хромогранина A, NeuroD и NGN3 и отсутствием экспрессии маркера гормональной системы, связанной с поджелудочной железой (например, инсулина). Эндокринные клетки-предшественники могут экспрессировать маркер, такой как PAX-4, NKX2-2, Islet-1, PDX-1 или PTF-1α.

[0051] Популяция эндокринных клеток-предшественников представляет собой популяцию клеток, включающую эндокринные клетки-предшественники в количестве 30% или более, предпочтительно 50% или более, а более предпочтительно 70% или более. Популяция эндокринных клеток-предшественников может включать и другие клетки (например, клетки-предшественники поджелудочной железы, инсулин-продуцирующие клетки и Ki67-позитивные клетки) в дополнение к эндокринным клеткам-предшественникам.

[0052] Количество конкретных клеток в популяции клеток можно определить известным методом подсчета числа клеток, таким как проточная цитометрия.

[0053] Термин «популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки» означает популяцию клеток, характеризующуюся наличием клеток, которые находятся на более продвинутой стадии дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы, чем эндокринные клетки-предшественники. Клетки, которые находятся на более продвинутой стадии дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы, чем эндокринные клетки-предшественники, предпочтительно представляют собой инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы.

[0054] Используемый здесь термин «инсулин-продуцирующие клетки» означает клетки, характеризующиеся тем, что у них обнаруживается экспрессия маркера инсулина, а уровень экспрессии NGN3 составляет менее 1/3 от максимальной экспрессии, подтвержденной в эндокринных клетках-предшественниках. «Инсулин-продуцирующие клетки» представляют собой клетки, которые могут экспрессировать маркер NKX6.1, а предпочтительно экспрессируют оба маркера инсулина и NKX6.1, и имеют уровень экспрессии NGN3 на уровне менее 1/3 от максимальной экспрессии, подтвержденной в эндокринных клетках-предшественниках.

Уровень экспрессии NGN3 может быть определен с помощью количественной ОТ-ПЦР. кДНК, полученную из клеток на предварительно определенной стадии с помощью набора Cells-to-CT (Thermo Fisher Scientific), используют в измерениях с помощью наборов последовательностей зонда/праймера TaqMan против NGN3 и GAPDH, а затем относительный уровень экспрессии к уровню экспрессии GAPDH принимают за уровень экспрессии гена NGN3.

[0055] «Популяция инсулин-продуцирующих клеток» представляет собой популяцию клеток, содержащую инсулин-продуцирующие клетки в количестве 5% или более, предпочтительно 15% или более, а более предпочтительно, 30% или более. Популяция клеток может включать и другие клетки (например, эндокринные клетки-предшественники; другие клетки, продуцирующие гормон поджелудочной железы и экспрессирующие по меньшей мере один из маркеров, таких как глюкагон, соматостатин и полипептид поджелудочной железы; и Ki67-позитивные клетки), в дополнение к инсулин-продуцирующим клеткам.

Популяцию инсулин-продуцирующих клеток можно дополнительно подразделить на популяцию ранних инсулин-продуцирующих клеток», которая появляется на ранней стадии процесса дифференцировки из эндокринных клеток-предшественников, и «позднюю популяцию инсулин-продуцирующих клеток», которая появляется на более поздней стадии дифференцировки. Поздняяя популяция инсулин-продуцирующих клеток может быть охарактеризована, в частности, по включению инсулин-позитивных/NKX6.1-позитивных клеток (клеток, позитивных по двум INS/NKX6.1) в количестве 20% или более.

[0056] Используемый здесь термин «β-клетки поджелудочной железы» означает клетки, которые являются более зрелыми, чем «инсулин-продуцирующие клетки», а, в частности, означает клетки, характеризующиеся экспрессией по меньшей мере одного из маркеров MAFA, UCN3 и IAPP, которые являются маркерами созревания β-клеток поджелудочной железы, или реакцией на увеличение секреции инсулина посредством стимуляции глюкозой.

[0057] «Популяция β-клеток поджелудочной железы» представляет собой популяцию клеток, включающую β-клетки поджелудочной железы, которые могут быть получены посредством дифференцировки и/или созревания, а предпочтительно дифференцировки и/или созревания in vivo популяции эндокринных клеток-предшественников или популяции клеток на более поздней стадия дифференциации. Популяция клеток может включать и другие клетки (например, инсулин-продуцирующие клетки и Ki67-позитивные клетки) в дополнение к β-клеткам поджелудочной железы.

[0058] Популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки может быть получена с применением известного метода индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в β-клетки поджелудочной железы. В частности, каждая представляющая интерес популяция клеток может быть получена путем проведения нижеследующих стадий индуцирования дифференцировки:

стадии 1): индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивные клетки эндодермы;

стадии 2): индуцирования дифференцировки дефинитивных клеток эндодермы в первичные клетки трубки кишечника;

стадии 3): индуцирования дифференцировки первичных клеток трубки кишечника в клетки задней части передней кишки;

стадии 4): индуцирования дифференцировки клеток задней части передней кишки в клетки-предшественники поджелудочной железы;

стадии 5): индуцирования дифференцировки клеток-предшественников поджелудочной железы в эндокринные клетки-предшественники; и

стадии 6): индуцирования дифференцировки эндокринных клеток-предшественников в инсулин-продуцирующие клетки.

Далее будет описана каждая стадия, хотя индуцирование дифференцировки в каждую клетку не ограничивается этими методами.

[0059] Стадия 1). Дифференцировка в дефинитивные клетки эндодермы

Плюрипотентные стволовые клетки сначала подвергают дифференцировке в дефинитивные клетки эндодермы. Методы индуцирования дефинитивной эндодермы из плюрипотентных стволовых клеток уже известны и могут быть применены любые из этих методов. Предпочтительно, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в среде, содержащей активин А, а более предпочтительно в среде, содержащей активин А, ингибитор ROCK и ингибитор GSK3β для дифференцировки в дефинитивные клетки эндодермы. Количество клеток в начале культивирования не имеет конкретных ограничений и составляет от 22000 до 150000 клеток/см², предпочтительно от 22000 до 100000 клеток/см², а более предпочтительно от 22000 до 80000 клеток/см². Период культивирования составляет от 1 дня до 4 дней, предпочтительно от 1 дня до 3 дней, а особенно предпочтительно 3 дня.

[0060] Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%.

[0061] Средой, используемой на этой стадии, может быть базальная среда, используемая для культивирования клеток млекопитающих, такая как среда RPMI 1640, среда MEM, среда iMEM, среда DMEM/F12, улучшенная среда MEM с добавлением цинка, улучшенная среда MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин или среда MCDB131/20 мМ глюкозы/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/глутамакс/аскорбиновая кислота/пенициллин-стрептомицин.

[0062] Концентрация активина А в среде обычно составляет от 30 до 200 нг/мл, предпочтительно от 50 до 150 нг/мл, более предпочтительно от 70 до 120 нг/мл, а особенно предпочтительно приблизительно 100 нг/мл.

В другом варианте осуществления изобретения, активин A может содержаться в среде в низкой дозе, например, в количестве от 5 до 100 нг/мл, предпочтительно от 5 до 50 нг/мл, а более предпочтительно от 5 до 10 нг/мл.

В альтернативном варианте осуществления изобретения, концентрация активина А в среде составляет приблизительно от 0,1 до 100 нг/мл, предпочтительно приблизительно от 1 до 50 нг/мл, а более предпочтительно приблизительно от 3 до 10 нг/мл.

[0063] Концентрация ингибитора GSK3β в среде соответствующим образом зависит от типа используемого ингибитора GSK3β. Так, например, в случае использования CHIR99021 в качестве ингибитора GSK3β, его концентрация обычно составляет от 2 до 5 мкМ, предпочтительно от 2 до 4 мкМ, а особенно предпочтительно, приблизительно 3 мкМ.

[0064] Концентрация ингибитора ROCK в среде соответствующим образом зависит от типа используемого ингибитора ROCK. Так, например, в случае использования Y27632 в качестве ингибитора ROCK, его концентрация обычно составляет от 5 до 20 мкМ, предпочтительно от 5 до 15 мкМ, а особенно предпочтительно приблизительно 10 мкМ.

В среду можно дополнительно добавить инсулин. Инсулин может содержаться в среде в количестве от 0,01 до 20 мкМ, предпочтительно от 0,1 до 10 мкМ, более предпочтительно от 0,5 до 5 мкМ. Концентрация инсулина в среде может представлять собой, но не ограничиваться ею, концентрацию инсулина, содержащегося в добавляемой добавке B-27.

[0065] В частности, клетки культивируют в течение 1 дня в среде, содержащей активин A, ингибитор ROCK и ингибитор GSK3β, а затем дополнительно культивируют в течение 2 дней в среде, содержащей только активин A, с ежедневной заменой среды на свежую среду. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки могут быть подвергнуты первому культивированию в среде, содержащей от 0,01 до 20 мкМ инсулина, в присутствии низкой дозы активина А, а затем второму культивированию в среде для продуцирования без инсулина.

[0066] Стадия 2). Дифференцировка в первичные клетки трубки кишечника.

Дефинитивные клетки эндодермы, полученные на стадии 1), дополнительно культивируют в среде, содержащей фактор роста, для индуцирования их дифференцировки в первичные клетки трубки кишечника. Период культивирования составляет от 2 до 8 дней, а предпочтительно, приблизительно 4 дня.

[0067] Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%. Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом.

[0068] Базальная среда для культивирования клеток млекопитающих может быть использована в качестве культуральной среды, как на стадии 1). Среда, помимо фактора роста, может быть соответствующим образом дополнена заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и т.п.

[0069] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно EGF и/или KGF, а еще более предпочтительно KGF.

[0070] Концентрация фактора роста в среде соответствующим образом устанавливается в зависимости от типа используемого фактора роста и обычно составляет приблизительно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, предпочтительно приблизительно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть приблизительно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно, приблизительно от 5 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно, приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,3 до 116 нМ), предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ). Так, например, в случае использования KGF в качестве фактора роста, его концентрация обычно составляет от 5 до 150 нг/мл, предпочтительно от 30 до 100 нг/мл, а особенно предпочтительно приблизительно 50 нг/мл.

[0071] Стадия 3). Дифференцировка в клетки задней части передней кишки

Первичные клетки кишечной трубки, полученные на стадии 2), дополнительно культивируют в среде, содержащей фактор роста, циклопамин, ноггин и т.п. для индуцирования их дифференцировки в клетки задней части передней кишки. Период культивирования составляет от 1 дня до 5 дней, предпочтительно приблизительно 2 дня. Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом.

[0072] Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%.

[0073] Как и на стадии 1), базальная среда для культивирования клеток млекопитающих может быть использована в качестве культуральной среды. Среда, помимо фактора роста, может быть соответствующим образом дополнена заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и т.п.

[0074] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно EGF и/или KGF, а еще более предпочтительно KGF.

[0075] Концентрация фактора роста в среде соответствующим образом устанавливается в зависимости от типа используемого фактора роста и обычно составляет приблизительно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, предпочтительно приблизительно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть приблизительно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно приблизительно от 5 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно, приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,3 до 116 нМ), предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ). Так, например, в случае использования KGF в качестве фактора роста, его концентрация обычно составляет от 5 до 150 нг/мл, предпочтительно от 30 до 100 нг/мл, а особенно предпочтительно приблизительно 50 нг/мл.

[0076] Концентрация циклопамина в среде не имеет конкретных ограничений и обычно составляет от 0,5 до 1,5 мкМ, предпочтительно от 0,3 до 1,0 мкМ, а особенно предпочтительно приблизительно 0,5 мкМ.

[0077] Концентрация ноггина в среде не имеет конкретных ограничений и обычно составляет от 10 до 200 нг/мл, предпочтительно от 50 до 150 нг/мл, а особенно предпочтительно приблизительно 100 нг/мл.

[0078] Стадия 4). Дифференцировка в клетки-предшественники поджелудочной железы

Клетки задней части передней кишки, полученные на стадии 3), дополнительно культивируют в среде, содержащей фактор, обладающий CDK8/19-ингибирующей активностью, а предпочтительно в среде, содержащей фактор, обладающий CDK8/19-ингибирующей активностью, и фактор роста, для индуцирования дифференцировки этих клеток в клетки-предшественники поджелудочной железы. Период культивирования составляет от 2 дней до 10 дней, а предпочтительно приблизительно 5 дней. Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом.

[0079] В случае двумерного культивирования, согласно предыдущему отчету (Toyoda et al., Stem Cell Research (2015) 14, 185-197), клетки задней части передней кишки, полученные на стадии 3), обрабатывают и диспергируют путем пипетирования 0,25% трипсином-EDTA, и дисперсию подвергают центрифужному разделению с получением клеточной суспензии, а затем эту суспензию повторно высевают в свежую среду на стадии 4.

[0080] Как и на стадии 1), базальная среда для культивирования клеток млекопитающих может быть использована в качестве культуральной среды. Среда, помимо фактора роста, может быть соответствующим образом дополнена заменителем сыворотки, витамином, антибиотиком и т.п.

[0081] Каждое из вышеупомянутых соединений или их солей может быть использовано в качестве фактора, обладающего CDK8/19- ингибирующей активностью. Количество фактора, добавляемого в среду, соответствующим образом определяют в соответствии с используемым соединением или его солью, и оно обычно составляет приблизительно от 0,00001 до 5 мкМ, предпочтительно от 0,00001 до 1 мкМ. Концентрация фактора, обладающего CDK8/19- ингибирующей активностью в среде, предпочтительно представляет собой концентрацию, при которой CDK8/19-ингибирующая активность достигает 50% или более.

[0082] Фактором роста предпочтительно является EGF, KGF и/или FGF10, более предпочтительно EGF и/или KGF, а еще более предпочтительно KGF и EGF.

[0070] Концентрацию фактора роста в среде соответствующим образом устанавливают в зависимости от типа используемого фактора роста и обычно она составляет приблизительно от 0,1 нМ до 1000 мкМ, а предпочтительно приблизительно от 0,1 нМ до 100 мкМ. В случае EGF, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,8 до 320 нМ), предпочтительно приблизительно от 5 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,8 до 160 нМ), более предпочтительно, приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 1,6 до 160 нМ). В случае FGF10, его концентрация составляет приблизительно от 5 до 2000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,3 до 116 нМ), предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ), более предпочтительно приблизительно от 10 до 1000 нг/мл (то есть, приблизительно от 0,6 до 58 нМ). Так, например, в случае использования KGF и EGF в качестве фактора роста, концентрация EGF обычно составляет от 5 до 150 нг/мл, предпочтительно от 30 до 100 нг/мл, а особенно предпочтительно, приблизительно 50 нг/мл, а концентрация KGF обычно составляет от 10 до 200 нг/мл, предпочтительно от 50 до 150 нг/мл, а особенно предпочтительно приблизительно 100 нг/мл.

[0084] Культивирование в первый день на стадии 4) может быть осуществлено в присутствии ингибитора ROCK, а культивирование в последующие дни может быть осуществлено в среде, не содержащей ингибитора ROCK.

[0085] Среда может также содержать активатор PKC. В качестве активатора PKC используются PdBU (активатор PKC II), TPB (активатор PKC V) или т.п., хотя активатор PKC не имеет конкретных ограничений. Концентрация добавляемого активатора PKC составляет приблизительно от 0,1 до 100 нг/мл, предпочтительно приблизительно от 1 до 50 нг/мл, а более предпочтительно приблизительно от 3 до 10 нг/мл.

В среду могут быть также добавлены диметилсульфоксид и/или активин (от 1 до 50 нг/мл).

На любой из этих стадий, среда, помимо вышеописанных компонентов, может быть дополнена заменителем сыворотки (например, добавкой B-27, ITS-G). Кроме того, при необходимости в нее могут быть добавлены аминокислота, L-глутамин, GlutaMAX (название продукта), заменимая аминокислота, витамин, никотинамид, антибиотик (например, антибиотик-противогрибковое средство (также называемое здесь AA), пенициллин, стрептомицин, или их смесь), противомикробные средства (например, амфотерицин B), антиоксидант, пировиноградная кислота, буфер, неорганические соли и т.п. В случае добавления в среду антибиотика, его концентрация в среде обычно составляет от 0,01 до 20% по массе, а предпочтительно от 0,1 до 10% по массе. Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом.

[0086] В случае двумерного культивирования, культивирование клеток осуществляют путем прикрепления культуры без использования фидерных клеток. Для такого культивирования используют контейнер для культивирования, например, чашку, колбу, микропланшет или планшет для культивирования клеток, такой как OptiCell (название продукта) (Nunc). Контейнер для культивирования предпочтительно подвергают поверхностной обработке для улучшения клеточной адгезии (гидрофильности), или покрывают субстратом для адгезии клеток, таким как коллаген, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, ламинин, фибронектин, матригель (например, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)) или витронектин. Контейнер для культивирования предпочтительно представляет собой контейнер для культивирования, покрытый коллагеном типа I, матригелем, фибронектином, витронектином или поли-D-лизином, а более предпочтительно, матригелем или поли-D-лизином.

[0087] Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%.

[0088] Клетки-предшественники поджелудочной железы, полученные на стадии 4), могут быть дополнительно очищены с использованием известного поверхностного маркера гликопротеина 2 (GP2) или т.п. Очистка может быть проведена известным методом per se, например, с использованием сфер с иммобилизованными антителами против GP2.

[0089] Стадия 5). Дифференцировка в эндокринные клетки-предшественники

Клетки-предшественники поджелудочной железы, полученные на стадии 4), дополнительно культивируют в среде, содержащей фактор роста, для индуцирования их дифференцировки в эндокринные клетки-предшественники. Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом. В случае двумерной культуры, клетки-предшественники поджелудочной железы, полученные на стадии 4), обрабатывают и диспергируют путем пипетирования 0,25% трипсином-EDTA, и дисперсию подвергают центрифужному разделению с получением клеточной суспензии, а затем эту суспензию повторно высевают в свежую среду на стадии 5). Период культивирования составляет от 2 дней до 3 дней, а предпочтительно приблизительно 2 дня.

Как и на стадии 1), в качестве культуральной среды может быть использована базальная среда для культивирования клеток млекопитающих. В среду добавляют SANT1, ретиноевую кислоту, ингибитор ALK5 II, T3 и LDN в соответствии с предыдущим отчетом (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133) и соответствующим образом могут быть также добавлены ингибитор Wnt, ингибитор ROCK, FGF (предпочтительно FGF2), заменитель сыворотки, витамин, антибиотик и т.п.

Культивирование осуществляют путем неадгезивного культивирования без использования фидерных клеток. Для такого культивирования используют чашку, колбу, микропланшет, пористый планшет (Nunc) или т.п. или биореактор. Контейнер для культивирования предпочтительно подвергают поверхностной обработке для уменьшения клеточной адгезии.

Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%.

[0090] Стадия 6). Дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки

Клетки-предшественники эндокринной системы, полученные на стадии 5), затем культивируют в среде, содержащей фактор роста, для индуцирования их дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки. Период культивирования составляет от 10 до 30 дней, а предпочтительно от 10 до 20 дней.

Как и на стадии 1), в качестве культуральной среды может быть использована базальная среда для культивирования клеток млекопитающих. В среду добавляют ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы XX, ингибитор γ-секретазы RO, N-цистеин, ингибитор AXL и аскорбиновую кислоту в соответствии с предыдущим отчетом (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133), и могут быть соответствующим образом добавлены ингибитор Wnt, ингибитор ROCK, FGF (предпочтительно FGF2), заменитель сыворотки, витамин, антибиотик и т.п. Так, например, в среду могут быть добавлены ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновая кислота, либо могут быть добавлены T3, ингибитор ALK5 II, ZnSO₄, гепарин, N-ацетилцистеин, тролокс и R428.

Культивирование может быть осуществлено двумерным или трехмерным способом. Культивирование осуществляют с использованием неадгезивной культуры без фидерных клеток. Для такого культивирования используют чашку, колбу, микропланшет, пористый планшет (Nunc) или т.п. или биореактор. Контейнер для культивирования предпочтительно подвергают поверхностной обработке для уменьшения клеточной адгезии.

Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, и культивирование проводят при температуре 30-40°С (например, 37°C). Концентрация диоксида углерода в контейнере для культивирования составляет, например, порядка 5%.

[0091] Дифференцировка в β-клетки поджелудочной железы

Клетки, полученные в предыдущей стадии, могут быть индуцированы для дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы. Стадия дифференцировки в популяцию β-клеток поджелудочной железы может быть осуществлена путем трансплантации популяции эндокринных клеток-предшественников или популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки, а предпочтительно инсулин-продуцирующих клеток, в живое тело животного.

[0092] «Животное» предпочтительно представляет собой млекопитающее. Примерами являются человек, приматы, не являющиеся человеком, свиньи, крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, ламы, собаки, кошки, кролики, мыши и морские свинки. Предпочтительным является человек.

[0093] Трансплантацию предпочтительно осуществляют in vivo в область, где популяция клеток может быть зафиксирована в данном положении, и такая трансплантация может быть осуществлена например, подкожно, внутрибрюшинно, в мезотелий брюшины, в большой сальник, в жировую ткань, в мышечную ткань или под капсулу каждого органа, такого как поджелудочная железа или почки животного. Количество трансплантируемых клеток может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия дифференцировки трансплантируемых клеток, возраст и масса тела реципиента, размер участка трансплантации и тяжесть заболевания, и не имеет конкретных ограничений. Так, например, число клеток может составлять в пределах от 10 × 10⁴ клеток до 10 × 10¹¹ клеток. Популяцию трансплантированных клеток индуцируют для дифференцировки в среде in vivo и, таким образом, эта популяция может дифференцироваться в представляющую интерес популяцию клеток, предпочтительно, популяцию β-клеток поджелудочной железы, которые затем могут быть выделены или могут оставаться в таком же виде in vivo.

[0094] Для трансплантации, популяция клеток может быть заключена в гель, содержащий альгиновую кислоту, а затем трансплантирована. Так, например, популяция клеток, заключенная в гель, содержащий альгиновую кислоту, может быть помещена в устройство, такое как капсула, пакет или камера, и трансплантирована в живое тело.

«Гель, содержащий альгиновую кислоту» может быть получен известным методом (WO2010/032242 и WO2011/154941) и может быть получен путем добавления перекрестно-сшивающего агента к раствору альгината или сложного эфира альгиновой кислоты для гелеобразования.

[0096] Альгинатом может быть водорастворимая соль, и могут быть использованы соль металла, соль аммония или т.п. Так, например, могут быть подходящим образом использованы альгинат натрия, альгинат кальция или альгинат аммония.

[0097] Сложный эфир альгиновой кислоты (также называемый альгинатом пропиленгликоля) представляет собой производное, в котором пропиленгликоль связан с карбоксильной группой альгиновой кислоты посредством сложноэфирной связи.

[0098] Отношение маннуроновой кислоты к гулуроновой кислоте (соотношение M/G), содержащихся в альгинате, является произвольным. Обычно, в случае M>G может образовываться очень рыхлый гель. В случае M<G может образоваться прочный гель. В настоящем изобретении может быть использован альгинат, содержащий гулуроновую кислоту в количестве от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 30 до 70% или от 40 до 60%.

[0099] Альгинат или сложный эфир альгиновой кислоты может содержаться в растворителе в количестве от 0,05 до 10 масс.%, предпочтительно, от 0,1 до 5 масс.%, а более предпочтительно от 0,5 до 3 масс.%. Растворителем может быть любой растворитель, способный растворять альгинат или сложный эфир альгиновой кислоты, при этом, можно использовать воду, физиологический раствор или т.п.

[0100] Перекрестно-сшивающий агент может представлять собой, без каких-либо конкретных ограничений, любой перекрестно-сшивающий агент, который позволяет раствору альгината или сложного эфира альгиновой кислоты образовывать гель. Может быть использован катион поливалентного металла. Катион поливалентного металла предпочтительно представляет собой катион двухвалентного металла, а более предпочтительно, ион кальция, ион стронция или ион бария. Перекрестно-сшивающий агент агент может быть использован в форме соли. В настоящем изобретении, в качестве перекрестно-сшивающего агента может быть использован по меньшей мере один агент, выбранный из хлорида кальция, хлорида стронция и хлорида бария.

[0101] Гель, содержащий альгиновую кислоту, может содержать нановолокно. Нановолокно представляет собой натуральное или синтетическое волокно, имеющее диаметр порядка нанометров. Примеры натурального нановолокна включают нановолокна, содержащие один или более компонентов, таких как коллаген, целлюлоза, фиброин шелка, кератин, желатин и полисахариды, такие как хитозан. Примерами синтетического нановолокна являются полимолочная кислота (PLA), поликапролактон (PCL), полиуретан (PU), сополимер лактида и гликолида (PLGA), сополимер 3-гидроксибутирата и гидроксивалерата (PHBV) и сополимер полиэтилена и винилацетата (PEVA). Нановолокно может содержаться в геле, включающем альгиновую кислоту, в количестве менее, чем 1% по массе, например 0,9% по массе, 0,8% по массе, 0,7% по массе, 0,6% по массе, 0,5% по массе или менее. Нижний предел количества нановолокна, содержащегося в геле, включающем альгиновую кислоту, не имеет конкретных ограничений и может составлять 0,05% по массе или более, а предпочтительно 0,1% по массе или более.

[0102] В настоящем изобретении, «заливка» означает, что популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки содержится в рассеянной форме в геле, содержащем альгиновую кислоту.

[0103] Заливка популяции клеток в гель, содержащий альгиновую кислоту, может быть осуществлена путем смешивания популяции клеток с раствором альгината или сложного эфира альгиновой кислоты и его гелеобразования.

[0104] Популяция клеток в растворе альгината или сложного эфира альгиновой кислоты может содержаться в количестве, выбранном из 1×10⁴ клеток - 1×10⁹ клеток/мл, а предпочтительно 1×10⁷ клеток - 1×10⁸ клеток/мл.

[0105] Гелеобразование раствора альгината или сложного эфира альгиновой кислоты, содержащего популяцию клеток, может быть осуществлено путем добавления к раствору перекрестно-сшивающего агента. Количество перекрестно-сшивающего агента, добавляемого в раствор, может быть выбрано из 0,1-5 масс.%, например 0,1-1 масс.%. Гелеобразование может быть осуществлено в контейнере, имеющем заданную конфигурацию и/или форму для использования при культивировании клеток или трансплантации клеток, или в форме, сконструированной так, чтобы получить гель, адаптированный к контейнеру.

[0106] Альтернативно, гелеобразование может быть осуществлено путем образования гелевой капсулы, содержащей альгиновую кислоту, в соответствии с известным методом (WO2010/010902). В частности, раствор альгината или сложного эфира альгиновой кислоты, содержащий популяцию клеток, может быть добавлен по каплям к раствору перекрестно-сшивающего агента для гелеобразования. Размер капель жидкости может быть скорректирован в зависимости от формы сопла для добавления по каплям или от метода добавления по каплям, а также от длины и размера гелевой капсулы, содержащей альгиновую кислоту. Способ добавления по каплям не имеет конкретных ограничений и может быть осуществлен таким методом, как метод воздушного распыления, метод безвоздушного распыления или метод статического распыления. Размер гелевой капсулы, содержащей альгиновую кислоту, не имеет конкретных ограничений, и такая капсула может иметь диаметр 5 мм или менее, 1 мм или менее или 500 мкм или менее.

Раствор перекрестно-сшивающего агента может содержать перекрестно-сшивающий агент в количестве, выбранном из 0,1-10 масс.%, например, 0,1-5 масс.%.

[0107] В настоящем изобретении, «ингибитор FGFR1» представляет собой вещество, обладающее ингибирующей активностью по меньшей мере в отношении рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) 1. FGFR1 является членом семейства трансмембранных тирозинкиназ четырех типов (FGFR1, FGFR2, FGFR3, и FGFR4), и представляет собой рецептор, обладающий высокой аффинностью к факторам роста FGF1-FGF17. FGFR1 участвует во многих путях передачи сигнала, ассоциированных с индуцированием и формированием паттерна мезодермы, пролиферацией и миграцией клеток, органогенезом, остеогенезом и т.п. Ингибитор FGFR1, используемый в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений, при условии, что ингибитор FGFR1 будет обладать FGFR1-ингибирующей активностью. Ингибитор FGFR1 может представлять собой вещество, обладающее FGFR-ингибирующей активностью, а также ингибирующей активностью в отношении других FGFR. В настоящем изобретении, «ингибитор FGFR1» включает вещество, обладающее FGFR-ингибирующей активностью, даже если эта активность является незначительной, а предпочтительно вещество, которое ингибирует FGFR1 на 50% или более, более предпочтительно, вещество, имеющее 50% FGFR1-ингибирующую концентрацию (IC₅₀) 1 мкМ или менее, а еще более предпочтительно, 100 нМ или менее. Метод определения FGFR-ингибирующей активности может быть выбран из известных методов. Примеры этих методов включают методы определения с использованием набора для анализа киназы EnzyChrom (системы BioAssay). В настоящем изобретении может быть использован общеизвестный «ингибитор FGFR1», описание которого можно найти в патентной литературе или в непатентной литературе. В настоящем изобретении, «ингибитор FGFR1» может обладать по меньшей мере FGFR1-ингибирующей активностью и может обладать ингибирующей активностью в отношении других FGFR. «Ингибитор FGFR1» согласно изобретению может представлять собой, например, ингибитор FGFR2, ингибитор FGFR3 или ингибитор FGFR4, при условии, что он бкдет обладать FGFR1-ингибирующей активностью.

[0108] В настоящем изобретении, примеры «ингибитора FGFR1» включают соединения, приведенные ниже (соединения группы D), а также соединения, обладающие ингибирующей активностью в отношении FGFR1 (или его соли), из числа соединений, имеющих структурные формулы, представленные общими формулами, приведенными ниже. Ингибитор FGFR1 предпочтительно представляет собой соединение, имеющее 50% FGFR-ингибирующую концентрацию (IC₅₀) 1 мкМ или менее, более предпочтительно 100 нМ или менее, (или его соли), то есть, соединение I и соединение II, имеющих структурные формулы, представленные нижеследующими общими формулами.

[0109] (Соединение I)

Примеры соединения I включают соединения, представленные следующей формулой 1:

где кольцо AB представляет собой бициклический гетероцикл, имеющий один или более заместителей (кольцо AB может представлять собой трициклический гетероцикл, имеющий один или более заместителей), или их соли.

Предпочтительно, в этой формуле, кольцо АВ представляет собой бициклический азот-содержащий гетероцикл, имеющий три заместителя.

Примеры заместителей включают заместители, указанные ниже, и заместители соединения группы D. Предпочтительными являются заместители соединения группы D.

[0110] (Соединение II)

Примеры соединения II включают соединения, представленные следующей формулой 2:

[Формула 2]

где кольцо D представляет собой 5- или 6-членный моноциклический азот-содержащий гетероцикл, необязательно имеющий заместитель (заместители); и

один или более азот-содержащих гетероциклов, кроме кольца D,

или их соли.

Предпочтительно, в этой формуле, кольцо D представляет собой ароматическое кольцо, содержащее один или два атома азота и имеющее, но необязательно, заместитель (заместители).

Предпочтительно, примеры одного или более азот-содержащих гетероциклов, отличающихся от кольца D, включают пиперазин, имеющий, но необязательно, заместитель (заместители).

Примеры заместителей включают заместители, указанные ниже, и заместители соединения группы D. Предпочтительными являются заместители соединения группы D.

[0111] Используемые здесь примеры «гетероцикла» включают ароматические гетероциклы и неароматические гетероциклы, каждый из которых содержит в качестве составляющего кольцо атома, помимо атома углерода, от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

[0112] Используемые здесь примеры «ароматического гетероцикла» включают 5-14-членный (предпочтительно 5-10-членный) ароматический гетероцикл, содержащий в качестве составляющего кольцо атома, помимо атома углерода, 1-4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода. Предпочтительные примеры «ароматического гетероцикла» включают 5- или 6-членные моноциклические ароматические гетероциклы, такие как тиофен, фуран, пиррол, имидазол, пиразол, тиазол, изотиазол, оксазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, 1,2,4-оксадиазол, 1,3,4-оксадиазол, 1,2,4-тиадиазол, 1,3,4-тиадиазол, триазол, тетразол и триазин; и 8-14-членные конденсированные полициклические (предпочтительно бициклические или трициклические) ароматические гетероциклы, такие как бензотиофен, бензофуран, бензимидазол, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензотриазол, имидазопиридин, тиенопиридин, фуропиридин, пирролопиридин, пиразолопиридин, оксазолопиридин, тиазолопиридин, имидазопиразин, имидазопиримидин, тиенопиримидин, фуропиримидин, пирролопиримидин, пиразолопиримидин, оксазолопиримидин, тиазолопиримидин, пиразолопиримидин, пиразолотриазин, нафто[2,3-b]тиофен, фенлоксатиин, индол, изоиндол, 1-Н-индазол, пурин, изохинолин, хинолин, фталазин, нафтиридин, хиноксалин, хиназолин, циннолин, карбазол, β-карболин, фенантридин, акридин, феназин, фенотиазин и феноксазин.

[0113] Используемые здесь примеры «неароматического гетероцикла» включают 3-14-членный (предпочтительно 4-10-членный) неароматический гетероцикл, содержащий в качестве образующего кольцо атома, помимо атома углерода, 1-4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода. Предпочтительными примерами «неароматического гетероцикла» являются 3-8-членные моноциклические неароматические гетероциклы, такие как азиридин, оксиран, тииран, азетидин, оксетан, тиетан, тетрагидротиофен, тетрагидрофуран, пирролин, пирролидин, имидазолин, имидазолидин, оксазолин, оксазолидин, пиразолин, пиразолидин, тиазолин, тиазолидин, тетрагидроизотиазол, тетрагидрооксазол, тетрагидроизоксазол, пиперидин, пиперазин, тетрагидропиридин, дигидропиридин, дигидротиопиран, тетрагидропиримидин, тетрагидропиридазин, дигидропиран, тетрагидропиран, тетрагидротиопиран, морфолин, тиоморфолин, азепанин, диазепан, азепин, азокан, диазокан, оксепан; и 9-14-членные конденсированные полициклические (предпочтительно би- или трициклические) неароматические гетероциклы, такие как дигидробензофуран, дигидробензимидазол, дигидробензоксазол, дигидробензотиазол, дигидробензизотиазол, дигидронафто[2,3-b]тиофен, тетрагидроизохинхолин, тетрагидрохинолин, 4Н-хинолидин, индолин, изоиндолин, тетрагидротиено[2,3-с]пиридин, тетрагидробензазепин, тетрагидрохиноксалин, тетрагидрофенантридин, гексагидрофенотиазин, гексагидрофеноксазин, тетрагидрофталазин, тетрагидронафтириин, тетрагидрохиназолин, тетрагидроциннолин, тетрагидрокарбазол, тетрагидро-β-карболин, тетрагидроакридин, тетрагидрофеназин, тетрагидротиоксантин, октагидроизохинолин.

[0114] Используемые здесь примеры «азот-одержащего гетероцикла» включают «гетероциклы», содержащие, по меньшей мере, один или более атомов азота в качестве атома, составляющего кольцо.

[0115] Далее, каждый используемый здесь заместитель будет определен подробно. Каждый заместитель является таким, как он определен ниже, если это не оговорено особо.

[0116] Используемые здесь примеры «атома галогена» включают фтор, хлорид, бром и йод.

[0117] Используемые здесь примеры «C_1-6алкильной группы» включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил, 1-этилпропил, гексил, изогексил, 1,1-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 3,3-диметилбутил и 2-этилбутил.

[0118] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_1-6алкильной группы»» включают C_1-6алкильную группу, имеющую, но необязательно, 1-7, а предпочтительно 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают метил, хлорметил, дифторметил, трихлорметил, трифторметил, этил, 2-бромэтил, 2,2,2-трифторэтил, тетрафторэтил, пентафторэтил, пропил, 2,2-дифторпропил, 3,3,3-трифторпропил, изопропил, бутил, 4,4,4-трифторбутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил, 5,5,5-трифторпентил, гексил и 6,6,6-трифторгексил.

[0119] Используемые здесь примеры «C_2-6алкенильной группы» включают этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 2-метил-1-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 4-метил-3-пентенил, 1-гексенил, 3-гексенил и 5-гексенил.

[0120] Используемые здесь примеры «C_2-6алкинильной группы» включают этинил, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 3-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4-пентинил, 1-гексинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил, 5-гексинил и 4-метил-2-пентинил.

[0121] Используемые здесь примеры «C_3-10циклоалкильной группы» включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, бицикло[2.2.1]гептил, бицикло[2.2.2]октил, бицикло[3.2.1]октил и адамантил.

[0122] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_3-10циклоалкильной группы» включают C_3-10циклоалкильную группу, необязательно имеющую 1-7, а предпочтительно 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают циклопропил, 2,2-дифторциклопропил, 2,3-дифторциклопропил, циклобутил, дифторциклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

[0123] Используемые здесь примеры «C_3-10циклоалкенильной группы» включают циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и циклооктенил.

[0124] Используемые здесь примеры «C_6-14арильной группы» включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 1-антрил, 2-антрил и 9-антрил.

[0125] Используемые здесь примеры «C_7-16аралкильной группы» включают бензил, фенетил, нафтилметил и фенилпропил.

[0126] Используемые здесь примеры «C_1-6алкоксигруппы» включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентилокси и гексилокси.

[0127] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_1-6алкоксигруппы» включают C_1-6алкоксигруппу, необязательно имеющую 1-7, предпочтительно 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают метокси, дифторметокси, трифторметокси, этокси, 2,2,2-трифторэтокси, пропокси, изопропокси, бутокси, 4,4,4-трифторбутокси, изобутокси, втор-бутокси, пентилокси и гексилокси.

[0128] Используемые здесь примеры «C_3-10циклоалкилокси-группы» включают циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклогексилокси, циклогептилокси и циклооктилокси.

[0129] Используемые здесь примеры «C_1-6алкилтиогруппы» включают метилтио, этилтио, пропилтио, изопропилтио, бутилтио, втор-бутилтио, трет-бутилтио, пентилтио и гексилтио.

[0130] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_1-6алкилтиогруппы» включают C_1-6алкилтиогруппу, необязательно имеющую 1-7, а предпочтительно, 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают метилтио, дифторметилтио, трифторметилтио, этилтио, пропилтио, изопропилтио, бутилтио, 4,4,4-трифторбутилтио, пентилтио и гексилтио.

[0131] Используемые здесь примеры «C_1-6алкилкарбонильной группы» включают ацетил, пропаноил, бутаноил, 2-метилпропаноил, пентаноил, 3-метилбутаноил, 2-метилбутаноил, 2,2-диметилпропаноил, гексаноил и гептаноил.

[0132] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_1-6алкилкарбонильной группы» включают C_1-6алкилкарбонильную группу, необязательно имеющую 1-7, а предпочтительно, 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают ацетил, хлорацетил, трифторацетил, трихлорацетил, пропаноил, бутаноил, пентаноил и гексаноил.

[0133] Используемые здесь примеры «C_1-6алкоксикарбонильной группы» включают метоксикарбонил, этоксикарбонил, пропоксикарбонил, изопропоксикарбонил, бутоксикарбонил, изобутоксикарбонил, втор-бутоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, пентилоксикарбонил и гексилоксикарбонил.

[0134] Используемые здесь примеры «C_6-14арилкарбонильной группы» включают бензоил, 1-нафтоил и 2-нафтоил.

[0135] Используемые здесь примеры «C_7-16аралкилкарбонильной группы» включают фенилацетил и фенилпропионил.

[0136] Используемые здесь примеры «5-14-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы» включают никотиноил, изоникотиноил, теноил и фуроил.

[0137] Используемые здесь примеры «3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы» включают морфолинилкарбонил, пиперидинилкарбонил и пирролидинилкарбонил.

[0138] Используемые здесь примеры «моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы» включают метилкарбамоил, этилкарбамоил, диметилкарбамоил, диэтилкарбамоил и N-этил-N-метилкарбамоил.

[0139] Используемые здесь примеры «моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильной группы» включают бензилкарбамоил и фенетилкарбамоил.

[0140] Используемые здесь примеры «C_1-6алкилсульфонильной группы» включают метилсульфонил, этилсульфонил, пропилсульфонил, изопропилсульфонил, бутилсульфонил, втор-бутилсульфонил и трет-бутилсульфонил.

[0141] Используемые здесь примеры «необязательно галогенированной C_1-6алкилсульфонильной группы» включают C_1-6алкилсульфонильную группу, необязательно имеющую 1-7, а предпочтительно, 1-5 атомов галогена. Конкретные примеры включают метилсульфонил, дифторметилсульфонил, трифторметилсульфонил, этилсульфонил, пропилсульфонил, изопропилсульфонил, бутилсульфонил, 4,4,4-трифторбутилсульфонил, пентилсульфонил и гексилсульфонил.

[0142] Используемые здесь примеры «C_6-14арилсульфонильной группы» включают фенилсульфонил, 1-нафтилсульфонил и 2-нафтилсульфонил.

[0143] Используемые здесь примеры «заместителя» включают атом галогена, цианогруппу, нитрогруппу, необязательно замещенную углеводородную группу, необязательно замещенную гетероциклическую группу, ацильную группу, необязательно замещенную аминогруппу, необязательно замещенную карбамоильную группу, необязательно замещенную тиокарбамоильную группу, необязательно замещенную сульфамоильную группу, необязательно замещенную гидроксигруппу, необязательно замещенную сульфанильную (SH) группу и необязательно замещенную силильную группу.

[0144] В настоящем описании, примеры «углеводородной группы» (включая «углеводородную группу» из «необязательно замещенных углеводородных групп») включают C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, C_3-10циклоалкильную группу, C_3-10циклоалкенильную группу, C_6-14арильную группу и C_7-16аралкильную группу.

[0145] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной углеводородной группы» включают углеводородную группу, необязательно имеющую заместитель (заместители), выбранный(ые) из нижеследующих заместителей группы A.

[заместители группы A]

(1) атом галогена,

(2) нитрогруппа,

(3) цианогруппа,

(4) оксогруппа,

(5) гидроксигруппа,

(6) необязательно галогенированная C_1-6алкоксигруппа,

(7) C_6-14арилоксигруппа (например, фенокси, нафтокси),

(8) C_7-16аралкилоксигруппа (например, бензилокси),

(9) 5-14-членная ароматическая гетероциклилоксигруппа (например, пиридилокси),

(10) 3-14-членная неароматическая гетероциклилоксигруппа (например, морфолинилокси, пиперидинилокси),

(11) C_1-6алкилкарбонилоксигруппа (например, ацетокси, пропаноилокси),

(12) C_6-14арилкарбонилоксигруппа (например, бензоилокси, 1-нафтоилокси, 2-нафтоилокси),

(13) C_1-6алкоксикарбонилоксигруппа (например, метоксикарбонилокси, этоксикарбонилокси, пропоксикарбонилокси, бутоксикарбонилокси),

(14) моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоилоксигруппа (например, метилкарбамоилокси, этилкарбамоилокси, диметилкарбамоилокси, диэтилкарбамоилокси),

(15) C_6-14арилкарбамоилоксигруппа (например, фенилкарбамоилокси, нафтилкарбамоилокси),

(16) 5-14-членная ароматическая гетероциклилкарбонилоксигруппа (например, никотиноилокси),

(17) 3-14-членная неароматическая гетероциклилкарбонилоксигруппа (например, морфолинилкарбонилокси, пиперидинилкарбонилокси),

(18) необязательно галогенированная C_1-6алкилсульфонилоксигруппа (например, метилсульфонилокси, трифторметилсульфонилокси),

(19) C_6-14арилсульфонилоксигруппа, необязательно замещенная C_1-6алкильная группа (например, фенилсульфонилокси, толуолсульфонилокси),

(20) необязательно галогенированная C_1-6алкилтиогруппа,

(21) 5-14-членная ароматическая гетероциклическая группа,

(22) 3-14-членная неароматическая гетероциклическая группа,

(23) формильная группа,

(24) карбоксильная группа,

(25) необязательно галогенированная C_1-6алкилкарбонильная группа,

(26) C_6-14арилкарбонильная группа,

(27) 5-14-членная ароматическая гетероциклилкарбонильная группа,

(28) 3-14-членная неароматическая гетероциклилкарбонильная группа,

(29) C_1-6алкоксикарбонильная группа,

(30) C_6-14арилоксикарбонильная группа (например, фенилоксикарбонил, 1-нафтилоксикарбонил, 2-нафтилоксикарбонил),

(31) C_7-16аралкилоксикарбонильная группа (например, бензилоксикарбонил, фенетилоксикарбонил),

(32) карбамоильная группа,

(33) тиокарбамоильная группа,

(34) моно- или ди-С_1-6алкилкарбамоильная группа,

(35) C_6-14арилкарбамоильная группа (например, фенилкарбамоил),

(36) 5-14-членная ароматическая гетероциклилкарбамоильная группа (например, пиридилкарбамоил, тиенилкарбамоил),

(37) 3-14-членная неароматическая гетероциклилкарбамоильная группа (например, морфолинилкарбамоил, пиперидинилкарбамоил),

(38) необязательно галогенированная С_1-6алкилсульфонильная группа,

(39) C_6-14арилсульфонильная группа,

(40) 5-14-членная ароматическая гетероциклилсульфонильная группа (например, пиридилсульфонил, тиенилсульфонил),

(41) необязательно галогенированная C_1-6алкилсульфинильная группа,

(42) C_6-14арилсульфинильная группа (например, фенилсульфинил, 1-нафтилсульфинил, 2-нафтилсульфинил),

(43) 5-14-членная ароматическая гетероциклилсульфинильная группа (например, пиридилсульфинил, тиенилсульфинил),

(44) аминогруппа,

(45) моно- или ди-С_1-6алкиламиногруппа (например, метиламино, этиламино, пропиламино, изопропиламино, бутиламино, диметиламино, диэтиламино, дипропиламино, дибутиламино, N-этил-N-метиламино),

(46) моно- или ди-C_6-14ариламиногруппа (например, фениламино),

(47) 5-14-членная ароматическая гетероциклиламиногруппа (например, пиридиламино),

(48) C_7-16аралкиламиногруппа (например, бензиламино),

(49) формиламиногруппа,

(50) C_1-6алкилкарбониламиногруппа (например, ацетиламино, пропаноиламино, бутаноиламино),

(51) (С_1-6алкил)(С_1-6алкилкарбонил)аминогруппа (например, N-ацетил-N-метиламино),

(52) C_6-14арилкарбониламиногруппа (например, фенилкарбониламино, нафтилкарбониламино),

(53) C_1-6алкоксикарбониламиногруппа (например, метоксикарбониламино, этоксикарбониламино, пропоксикарбониламино, бутоксикарбониламино, трет-бутоксикарбониламино),

(54) C_7-16аралкилоксикарбониламиногруппа (например, бензилоксикарбониламино),

(55) C_1-6алкилсульфониламиногруппа (например, метилсульфониламино, этилсульфониламино),

(56) C_6-14арилсульфониламиногруппа, необязательно замещенная С_1-6алкильная группая (например, фенилсульфониламино, толуолсульфониламино),

(57) необязательно галогенированная С_1-6алкильная группа,

(58) C_2-6алкенильная группа,

(59) C_2-6алкинильная группа,

(60) C_3-10циклоалкильная группа,

(61) C_3-10циклоалкенильная группа и

(62) C_6-14арильная группа.

[0146] Число вышеупомянутых заместителей в «необязательно замещенной углеводородной группе» составляет, например, 1-5, а предпочтительно 1-3. Если количество заместителей равно двум или более, то соответствующие заместители могут быть одинаковыми или различными.

[0147] В настоящем описании, примеры «гетероциклической группы» (включая «гетероциклическую группу» из «необязательно замещенных гетероциклическых групп») включают (i) ароматическую гетероциклическую группу, (ii) неароматическую гетероциклическую группу и (iii) 7-10-членную мостиковую гетероциклическую группу, каждая из которых содержит в качестве составляющего кольцо атома, помимо атома углерода, 1-4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

[0148] В настоящем описании, примеры «ароматической гетероциклической группы» (включая «5-14-членную ароматическую гетероциклическую группу») включают 5-14-членную (предпочтительно 5-10-членную) ароматическую гетероциклическую группу, содержащую в качестве составляющего кольцо атома, помимо атома углерода, 1-4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

Предпочтительные примеры «ароматической гетероциклической группы» включают 5- или 6-членные моноциклические ароматические гетероциклические группы, такие как тиенил, фурил, пирролил, имидазолил, пиразолил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, изоксазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил и т.п.; и

8-14-членные конденсированные полициклические (предпочтительно би- или трициклические) ароматические гетероциклические группы, такие как бензотиофенил, бензофуранил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензотиазолил, бензизотиазолил, бензотриазолил, имидазопиридинил, тиенопиридинил, фуропиридинил, пирролопиридинил, пиразолопиридинил, оксазолопиридинил, тиазолопиридинил, имидазопиразинил, имидазопиримидинил, тиенопиримидинил, фуропиримидинил, пирролопиримидинил, пиразолопиримидинил, оксазолопиримидинил, тиазолопиримидинил, пиразолотриазинил, нафто[2,3-b]тиенил, феноксатиинил, индолил, изоиндолил, 1H-индазолил, пуринил, изохинолил, хинолил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил и т.п.

[0149] В настоящем описании, примеры «неароматической гетероциклической группы» (включая «3-14-членную неароматическую гетероциклическую группу») включают 3-14-членную (предпочтительно 4-10-членную) неароматическую гетероциклическую группу, содержащую в качестве составляющего кольцо атома, помимо атома углерода, от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

Предпочтительные примеры «неароматической гетероциклической группы» включают 3-8-членные моноциклические неароматические гетероциклические группы, такие как азиридинил, оксиранил, тииранил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, тетрагидротиенил, тетрагидрофуранил, пирролинил, пирролидинил, имидазолинил, имидазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, пиразолинил, пиразолидинил, тиазолинил, тиазолидинил, тетрагидроизотиазолил, тетрагидрооксазолил, тетрагидроизооксазолил, пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиридинил, дигидропиридинил, дигидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидропиридазинил, дигидропиранил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, морфолинил, тиоморфолинил, азепанил, диазепанил, азепинил, оксапанил, азоканил, диазоканил и т.п.; и

9-14-членные конденсированные полициклические (предпочтительно би- или трициклические) неароматические гетероциклические группы, такие как дигидробензофуранил, дигидробензимидазолил, дигидробензоксазолил, дигидробензотиазолил, дигидробензизотиазолил, дигидронафто[2,3-b]тиенил, тетрагидроизохинолил, тетрагидрохонолил, 4Н-хинолизинил, индолинил, изоиндолинил, тетрагидротиено[2,3-с]пиридинил, тетрагидробензазепинил, тетрагидрохиноксалинил, тетрагидрофенантридинил, гексагидрофенотиазинил, гексагидрофеноксазинил, тетрагидрофталазинил, тетрагидронафтиридинил, тетрагидрохиназолинил, тетрагидроциннолинил, тетрагидрокарбазолил, тетрагидро-β-карболинил, тетрагидроакридинил, тетрагидрофеназинил, тетрагидротиоксантенил, октагидроизохинолил и т.п.

[0150] В настоящем описании, предпочтительные примеры «7-10-членной мостиковой гетероциклической группы» включают хинуклидинил и 7-азабицикло[2.2.1]гептанил.

[0151] В настоящем описании, примеры «азот-содержащей гетероциклической группы» включают «гетероциклическую группу, содержащую по меньшей мере один атом азота в качестве атома, составляющего кольцо.

[0152] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной гетероциклической группы» включают гетероциклическую группу, необязательно имеющую заместитель(и), выбранный(е) из вышеупомянутых заместителей группы A.

[0153] Число заместителей в «необязательно замещенной гетероциклической группе» составляет, например, от 1 до 3. Если количество заместителей равно двум или более, то соответствующие заместители могут быть одинаковыми или различными.

[0154] В настоящем описании, примеры «ацильной группы» включают формильную группу, карбоксигруппу, карбамоильную группу, тиокарбамоильную группу, сульфиногруппу, сульфогруппу, сульфамоильную группу и фосфоногруппу, каждая из которых необязательно имеет «1 или 2 заместителя, выбранных из C_1-6алкильной группы, C_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_3-10циклоалкенильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы и 3-14-членной неароматической гетероциклической группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из атома галогена, необязательно галогенированной C_1-6алкоксигруппы, гидроксигруппы, нитрогруппы, цианогруппы, аминогруппы и карбамоильной группы».

[0155] Примеры «ацильной группы» также включают углеводород-сульфонильную группу, гетероциклилсульфонильную группу, углеводород-сульфинильную группу и гетероциклилсульфинильную группу.

В данном случае, углеводород-сульфонильная группа означает сульфонильную группу, связанную с углеводородной группой; гетероциклилсульфонильная группа означает сульфонильную группу, связанную с гетероциклической группой; углеводород-сульфинильная группа означает сульфинильную группу, связанную с углеводородной группой, а гетероциклилсульфинильная группа означает сульфинильную группу, связанную с гетероциклической группой.

Предпочтительные примеры «ацильной группы» включают формильную группу, карбоксигруппу, C_1-6алкилкарбонильную группу, C_2-6алкенилкарбонильную группу (например, кротоноил), C_3-10циклоалкилкарбонильную группу (например, циклобутанкарбонил, циклопентанкарбонил, циклогексанкарбонил, циклогептанкарбонил), C_3-10циклоалкенилкарбонильную группу (например, 2-циклогексенкарбонил), C_6-14арилкарбонильную группу, C_7-16аралкилкарбонильную группу, 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбонильную группу, 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонильную группу, С_1-6алкоксикарбонильную группу, С_6-14арилоксикарбонильную группу (например, фенилоксикарбонил, нафтилоксикарбонил), С_7-16аралкилоксикарбонильную группу (например, бензилоксикарбонил, фенетилоксикарбонил), карбамоильную группу, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильную группу, моно- или ди-С_2-6алкенилкарбамоильную группу (например, диаллилкарбамоил), моно- или ди-C_3-10циклоалкилкарбамоильную группу (например, циклопропилкарбамоил), моно- или ди-C_6-14 арилкарбамоильную группу (например, фенилкарбамоил), моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильную группу, 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, пиридилкарбамоил), тиокарбамоильную группу, моно- или ди-C_1-6алкилтиокарбамоильную группу (например, метилтиокарбамоильную группу, N-этил-N-метилтиокарбамоил), моно- или ди-C_2-6алкенилтиокарбамоильную группу (например, диаллилтиокарбамоил), моно- или ди-C_3-10 циклоалкилтиокарбамоильную группу (например, циклопропилтиокарбамоил, циклогексилтиокарбамоил), моно- или ди-C_6-14арилтиокарбамоильную группу (например, фенилтиокарбамоил), моно- или ди-C_7-16аралкилтиокарбамоильную группу (например, бензилтиокарбамоил, фенэтилтиокарбамоил), 5-14-членную ароматическую гетероциклилтиокарбамоильную группу (например, пиридилтиокарбамоил), сульфиногруппу, C_1-6алкилсульфинильную группу (например, метилсульфинил, этилсульфинил), сульфогруппу, C_1-6алкилсульфонильную группу, C_6-14арилсульфонильную группу, фосфоногруппу и моно- или ди-C_1-6алкилфосфоногруппу (например, диметилфосфоно, диэтилфосфоно, диизопропилфосфоно, дибутилфосфоно).

[0156] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной аминогруппы» включают аминогруппу, необязательно имеющую «1 или 2 заместителя, выбранных из C_1-6алкильной группы, C_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы, C_7-16аралкилкарбонильной группы, 5-14-членной ароматической группы гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, C_1-6алкоксикарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы, моно- или ди-C_7-16 аралкилкарбамоильной группы, C_1-6алкилсульфонильной группы и C_6-14арилсульфонильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0157] Предпочтительные примеры необязательно замещенной аминогруппы включают аминогруппу, моно- или ди-(необязательно галогенированный C_1-6алкил)аминогруппу (например, метиламино, трифторметиламино, диметиламино, этиламино, диэтиламино, пропиламино, дибутиламино), моно- или ди-C_2-6алкениламиногруппу (например, диаллиламино), моно- или ди-C_3-10циклоалкиламиногруппу (например, циклопропиламино, циклогексиламино), моно- или ди-C_6-14ариламиногруппу (например, фениламино), моно- или ди-C_7-16аралкиламино-группу (например, бензиламино, дибензиламино), моно- или ди-(необязательно галогенированный C_1-6алкил)карбониламиногруппу (например, ацетиламино, пропиониламино), моно- или ди-C_6-14арилкарбониламиногруппу (например, бензоиламино), моно- или ди-C_7-16аралкилкарбониламиногруппу (например, бензилкарбониламино), моно- или ди-5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбониламиногруппу (например, никотиноиламино, изоникотиноиламино), моно- или ди-3-14-членная неароматическую гетероциклилкарбониламиногруппу (например, пиперидинилкарбониламино), моно- или ди-C_1-6алкоксирбониламиногруппу (например, трет-бутоксикарбониламино), 5-14-членную ароматическую гетероциклиламиногруппу (например, пиридиламино), карбамоиламиногруппу, (моно- или ди -C_1-6алкилкарбамоил)аминогруппу (например, метилкарбамоиламино), (моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоил)аминогруппу (например, бензилкарбамоиламино), C_1-6алкилсульфониламиногруппу (например, метилсульфониламино, этилсульфониламино), C_6-14арилсульфонильную группу (например, фенилсульфониламино), (C_1-6алкил)(C_1-6алкилкарбонил)аминогруппу (например, N-ацетил-N-метиламино) и (C_1-6алкил)(C_6-14арилкарбонил)аминогруппу (например, N-бензоил-N-метиламино).

[0158] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной карбамоильной группы» включают карбамоильную группу, необязательно имеющую «1 или 2 заместителя, выбранных из C_1-6алкильной группы, C_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы, C_7-16 аралкилкарбонильной группы, 5-14-членной ароматической группы гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, C_1-6алкоксикарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы и моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0159] Предпочтительные примеры необязательно замещенной карбамоильной группы включают карбамоильную группу, моно- или ди-С_1-6алкилкарбамоильную группу, моно- или ди-С_2-6алкенилкарбамоильную группу (например, диаллилкарбамоил), моно- или ди-C_3-10циклоалкилкарбамоильную группу (например, циклопропилкарбамоил, циклогексилкарбамоил), моно- или ди-C_6-14арилкарбамоильную группу (например, фенилкарбамоил), моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильную группу, моно- или ди-C_1-6алкилкарбонилкарбамоильную группу (например, ацетилкарбамоил, пропионилкарбамоил), моно- или ди-C_6-14арилкарбонилкарбамоильную группу (например, бензоилкарбамоил) и 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, пиридилкарбамоил).

[0160] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной тиокарбамоильной группы» включают тиокарбамоильную группу, необязательно имеющую «1 или 2 заместителя, выбранных из C_1-6алкильной группы, C_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы, C_7-16 аралкилкарбонильной группы, 5-14-членной ароматической группы гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, C_1-6алкоксикарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы и моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0161] Предпочтительные примеры необязательно замещенной тиокарбамоильной группы включают тиокарбамоильную группу, моно- или ди-C_1-6алкилтиокарбамоильную группу (например, метилтиокарбамоил, этилтиокарбамоил, диметилтиокарбамоил, диэтилтиокарбамоил, N-этил-N-метилтиокарбамоил), моно- или ди-C_2-6алкенилтиокарбамоильную группу (например, диаллилтиокарбамоил), моно- или ди-C_3-10циклоалкилтиокарбамоильную группу (например, циклопропилтиокарбамоил, циклогексилтиокарбамоил), моно- или ди-C_6-14-арилтиокарбамоильную группу (например, фенилтиокарбамоил), моно- или ди-C_7-16аралкилтиокарбамоильную группу (например, бензилтиокарбамоил, фенетилтиокарбамоил), моно- или ди-С_1-6алкилкарбонилтиокарбамоильную группу (например, ацетилтиокарбамоил, пропионилтиокарбамоил), моно- или ди-C_6-14 арилкарбонилтиокарбамоильную группу (например, бензоилтиокарбамоил) и 5-14-членную ароматическую гетероциклилтиокарбамоильную группу (например, пиридилтиокарбамоил).

[0162] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной сульфамоильной группы» включают сульфамоильную группу, необязательно имеющую «1 или 2 заместителя, выбранных из C_1-6алкильной группы, C_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы, C_7-16аралкилкарбонильной группы, 5-14-членной ароматической группы гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, C_1-6алкоксикарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы и моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0163] Предпочтительные примеры необязательно замещенной сульфамоильной группы включают сульфамоильную группу, моно- или ди-C_1-6алкилсульфамоильную группу (например, метилсульфамоил, этилсульфамоил, диметилсульфамоил, диэтилсульфамоил, N-этил-N-метилсульфамоил), моно- или ди-C_2-6алкенилсульфамоильную группу (например, диаллилсульфамоил), моно- или ди-C_3-10циклоалкилсульфамоильную группу (например, циклопропилсульфамоил, циклогексилсульфамоил), моно- или ди-C_6-14арилсульфамоильную группу (например, фенилсульфамоил), моно- или ди-C_7-16аралкилсульфамоильную группу (например, бензилсульфамоил, фенетилсульфамоил), моно- или ди-C_1-6алкилкарбонилсульфамоильную группу (например, ацетилсульфамоил, пропионилсульфамоил), моно- или ди-C_6-14арилкарбонилсульфамоильную группу (например, бензоилсульфамоил) и 5-14-членную ароматическую гетероциклилсульфамоильную группу (например, пиридилсульфамоил).

[0164] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной гидроксигруппы» включают гидроксильную группу, необязательно имеющую «заместитель, выбранный из C_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы, C_7-16аралкилкарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, C_1-6алкоксикарбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-C_1-6алкилкарбамоильной группы, моно- или ди-C_7-16аралкилкарбамоильной группы, C_1-6алкилсульфонильной группы и C_6-14арилсульфонильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0165] Предпочтительные примеры необязательно замещенной гидроксигруппы включают гидроксигруппу, C_1-6алкоксигруппу, C_2-6алкенилокси группу (например, аллилокси, 2-бутенилокси, 2-пентенилокси, 3-гексенилокси), C_3-10циклоалкилоксигруппу (например, циклогексилокси), C_6-14арилоксигруппу (например, фенокси, нафтилокси), C_7-16аралкилоксигруппу (например, бензилокси, фенетилокси), C_1-6алкилкарбонилоксигруппу (например, ацетилокси, пропионилокси, бутирилокси, изобутирилокси, пивалоилокси), C_6-14арилкарбонилоксигруппу (например, бензоилокси), C_7-16аралкилкарбонилоксигруппу (например, бензилкарбонилокси), 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбонилоксигруппу (например, никотиноилокси), 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонилоксигруппу (например, пиперидинилкарбонилокси), C_1-6алкоксикарбонилоксигруппу (например, трет-бутоксикарбонилокси), 5-14-членную ароматическую гетероциклилоксигруппу (например, пиридилокси), карбамоилоксигруппу, C_1-6алкилкарбамоилоксигруппу (например, метилкарбамоилокси), C_7-16аралкилкарбамоилоксигруппу (например, бензилкарбамоилокси), C_1-6алкилсульфонилоксигруппу (например, метилсульфонилокси, этилсульфонилокси) и C_6-14арилсульфонилоксигруппу (например, фенилсульфонилокси).

[0166] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной сульфанильной группы» включают сульфанильную группу, необязательно имеющую «заместитель, выбранный из С_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы, C_7-16аралкильной группы, C_1-6алкилкарбонильной группы, C_6-14арилкарбонильной группы и 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A», и галогенированную сульфанильную группу.

[0167] Предпочтительные примеры необязательно замещенной сульфанильной группы включают сульфанильную (-SH) группу, C_1-6алкилтиогруппу, C_2-6алкенилтиогруппу (например, аллилтио, 2-бутенилтио, 2-пентенилтио, 3-гексенилтио), C_3-10циклоалкилтиогруппу (например, циклогексилтио), C_6-14арилтиогруппу (например, фенилтио, нафтилтио), C_7-16аралкилтиогруппу (например, бензилтио, фенэтилтио), C_1-6алкилкарбонилтиогруппу (например, ацетилтио, пропионилтио, бутирилтио, изобутирилтио, пивалоилтио), C_6-14арилкарбонилтиогруппу (например, бензоилтио), 5-14-членную ароматическую гетероциклилтиогруппу (например, пиридилтио) и галогенированную тиогруппу (например, пентафтортио).

[0168] В настоящем описании, примеры «необязательно замещенной силильной группы» включают силильную группу, необязательно имеющую «от 1 до 3 заместителей, выбранных из C_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, C_3-10циклоалкильной группы, C_6-14арильной группы и C_7-16аралкильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из заместителей группы A».

[0169] Предпочтительные примеры необязательно замещенной силильной группы включают три-C_1-6алкилсилильную группу (например, триметилсилил, трет-бутил(диметил)силил).

[0170] Более конкретно, примеры ингибитора FGFR1, который может быть использован в настоящем изобретении, включают PD-166866 (1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину: CAS No.: 192705-79-6) (в настоящем описании, это соединение также упоминается как «CAS192705-79-6»), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7), PD-173074 (CAS No.: 219580-11-7), FGFR4-IN-1 (CAS No.: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (CAS No.: 1448169-71-8), FIIN-2 (CAS No.: 1633044-56-0), AZD4547 (CAS No.: 1035270-39-3), FIIN-3 (CAS No.: 1637735-84-2), NVP-BGJ398 (CAS No.: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (CAS No.: 872511-34-7), CH5183284 (CAS No.: 1265229-25-1), деразантиниб (CAS No.: 1234356-69-4), рацемат деразантиниба, феруловую кислоту (CAS No.: 1135-24-6), SSR128129E (CAS No.: 848318-25-2), свободную кислоту SSR128129E (CAS No.: 848463-13-8), эрдафитиниб (CAS No.: 1346242-81-6), BLU9931 (CAS No.: 1538604-68-0), PRN1371 (CAS No.: 1802929-43-6), S49076 (CAS No.: 1265965-22-7), LY2874455 (CAS No.: 1254473-64-7), линситиниб (CAS No.: 867160-71-2), довитиниб (CAS No.: 405169-16-6), анлотиниб (CAS No.: 1058156-90-3), бриваниб (CAS No.: 649735-46-6), деразантиниб (CAS No.: 1234356-69-4), дигидрохлорид анлотиниба (CAS No.: 1360460-82-7), ACTB-1003 (CAS No.: 939805-30-8), BLU-554 (CAS No.: 1707289-21-1), рогаратиниб (CAS No.: 1443530-05-9), эзилат BIBF 1120 (CAS No.: 656247-18-6), гидрохлорид TG 100572 (CAS No.: 867331-64-4), ENMD-2076 (CAS No.: 934353-76-1), аланинат бриваниба (CAS No.: 649735-63-7), TG 100572 (CAS No.: 867334-05-2), BIBF 1120 (CAS No.: 656247-17-5), тартрат ENMD-2076 (CAS No.: 1291074-87-7), TSU-68 (CAS No.: 252916-29-3), понатиниб (CAS No.: 943319-70-8), сульфатиниб (CAS No.: 1308672-74-3), LY2784544 (CAS No.: 1229236-86-5), лактат довитиниба (CAS No.: 692737-80-7), SU 5402 (CAS No.: 215543-92-3), FGF-401 (CAS No.: 1708971-55-4), тирозинкиназу-IN-1 (CAS No.: 705946-27-6), PP58 (CAS No.: 212391-58-7), гидрохлорид TG 100801 (CAS No.: 1018069-81-2), креноланиб (CAS No.: 670220-88-9), TG 100801 (CAS No.: 867331-82-6), гидрохлорид пазопаниба (CAS No.: 635702-64-6), пазопаниб (CAS No.: 444731-52-6), PD168393 (CAS No.: 194423-15-9), апатиниб (CAS No.: 1218779-75-9), изетионат палбоциклиба (CAS No.: 827022-33-3), форетиниб (CAS No.: 849217-64-7), ленватиниб (CAS No.: 417716-92-8), тандутиниб (CAS No.: 387867-13-2) и их соли (эти соединения упоминаются как соединения группы D). Каждое из этих соединений может иметь один или более заместителей, выбранных из описанных выше заместителей, при условии, что такое соединение будет обладать FGFR1-ингибирующей активностью, а предпочтительно, будет иметь 50% FGFR1-ингибирующую концентрацию (IC₅₀), равную 100 нМ или ниже.

Субструктура (заместитель, кольцо и т.п.) каждого из этих соединений может быть частично преобразована, при условии, что такое соединение будет обладать FGFR1-ингибирующей активностью, а предпочтительно, будет иметь 50% FGFR1-ингибирующую концентрацию (IC₅₀), равную 100 нМ или ниже.

[0171] В настоящем изобретении, ингибитор FGFR1 предпочтительно представляет собой CAS192705-79-6 (1-[2-амино-6- (3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину: CAS No.: 192705-79-6), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7) или PD173074 (CAS No.: 219580-11-7).

Было обнаружено, что CAS192705-79-6 обладает ингибирующей активностью в отношении FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, как было установлено с помощью следующего теста, в котором: флуоресцентные зонды, связывающиеся с FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, полученными как рекомбинантные белки, использовали так, чтобы они действовали в присутствии или в отсутствии CAS192705-79-6, и флуоресцентные сигналы детектировали на планшет-ридере. Ингибирующую активность CAS192705-79-6 в отношении каждого белка (pIC₅₀) вычисляли по изменению флуоресцентного сигнала в присутствии и в отсутствии CAS192705-79-6.

[0172] Ингибитор FGFR1 не ограничивается соединениями, описанными выше, и в качестве ингибитора FGFR1 могут быть также использованы антисмысловой олигонуклеотид или киРНК против мРНК FGFR1, антитело, связывающееся с FGFR1, доминантно-негативный мутант FGFR1 или т.п. Такой ингибитор FGFR1 является коммерчески доступным или может быть синтезирован известным методом.

[0173] Каждое упомянутое выше соединение или его соль могут быть использованы в качестве ингибитора FGFR1. Количество ингибитора EGFR1, добавляемого в среду, соответствующим образом определяют в зависимости от используемого соединения или его соли, и обычно оно составляет приблизительно от 0,00001 до 100 мкМ, а предпочтительно от 0,01 до 10 мкМ.

[0174] Популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки может быть обработана ингибитором FGFR1 путем контактирования популяции клеток с ингибитором FGFR1. Так, например, обработка может быть проведена путем культивирования популяции клеток в среде с добавлением ингибитора FGFR1. Ингибитор FGFR1 может содержаться в любом количестве, способном ингибировать активность FGFR1 в среде, и может содержаться в количестве, например, 10 мкM или менее, или 5 мкМ или менее, а предпочтительно, менее, чем 5 мкМ, менее, чем 4 мкМ, менее, чем 3 мкМ, или менее, чем 2 мкМ. Нижний предел количества добавляемого ингибитора FGFR1 не имеет конкретных ограничений и может составлять 0,1 мкМ или более, а предпочтительно 0,5 мкМ или более. Количество добавляемого ингибитора FGFR1 предпочтительно составляет менее, чем 5 мкМ и 0,1 мкМ или более, а более предпочтительно менее, чем 5 мкМ, и 0,5 мкМ или более. Культивирование в присутствии ингибитора FGFR1 может быть осуществлено в течение по меньшей мере 12 часов, предпочтительно 24 часов или более, 2 дней или более, 4 дней или более, 8 дней или более, 10 дней или более или 15 дней или более. Культивирование в присутствии ингибитора FGFR1 предпочтительно осуществляют в течение 4 дней или более. В течение периода обработки ингибитором FGFR1, среда может быть заменена средой с добавлением ингибитора FGFR1, имеющей такой же состав как и до замены, или другой состав, в соответствии со схемой культивирования.

В настоящем изобретении, число Ki67-позитивных клеток в клетках, которые должны быть обработаны ингибитором FGFR1 (клетки исходного материала), не имеет конкретных ограничений и может составлять 1% или более, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более или 90% или более.

В настоящем изобретении, число клеток, позитивных по щелочной фосфатазе, в клетках, которые должны быть обработаны ингибитором FGFR1 (клетки исходного материала), не имеет конкретных ограничений и может составлять 10% или менее, 5% или менее, 1% или менее, или 0,5% или менее.

[0175] Популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки может быть подвергнута дополнительной стадии дифференцировки в представляющую интерес популяцию клеток (например, популяцю инсулин-продуцирующих клеток или популяцию β-клеток поджелудочной железы) в дополнение к обработке ингибитором FGFR1. Используемый здесь термин «в дополнение к обработке ингибитором FGFR1» включает проведение стадии обработки ингибитором FGFR1 и стадии дифференцировки одновременно, обработку популяции клеток ингибитором FGFR1 с последующим проведением стадии дифференцировки и стадию дифференцировки популяции клеток с последующим проведением стадии обработки ингибитором FGFR1. Таким образом, среда, используемая для обработки ингибитором FGFR1, и среда, используемая для дифференцировки популяции клеток, могут представлять собой отдельные среды, или среда, используемая на стадии дифференцировки, может быть дополнена ингибитором FGFR1.

[0176] В одном варианте осуществления изобретения, ингибитор FGFR1 может содержаться в среде, используемой на стадии дифференцировки эндокринных клеток-предшественников в инсулин-продуцирующие клетки, а более предпочтительно, он может содержаться в среде, используемой на стадии дифференцировки (например, в течение приблизительно последних 4-15 дней, а более предпочтительно приблизительно последних 4-7 дней стадии 6) популяции ранних инсулин-продуцирующих клеток, полученных путем индуцирования дифференцировки популяции эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки. В случае обработки популяции эндокринных клеток-предшественников ингибитором FGFR1, число представляющих интерес клеток может быть резко снижено. В случае обработки популяции ранних инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки ингибитором FGFR1, такое резкое снижение количества представляющих интерес клеток может быть предотвращено. В частности, в случае обработки популяции ранних инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки ингибитором FGFR1, конечное число инсулин-продуцирующих клеток может быть увеличено по сравнению с числом клеток после обработки популяции эндокринных клеток-предшественников ингибитором FGFR1.

[0177] Обработка популяции эндокринных клеток-предшественников или популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки ингибитором FGFR1 может приводить к ингибированию пролиферации Ki67-позитивных клеток в популяции клеток.

Этот подход позволяет уменьшать число оставшихся пролиферирующихся клеток, содержащихся в линии дифференцировки поджелудочной железы, или удалять эти клетки, не подавляя пролиферацию тератомы.

Этот подход позволяет уменьшать число оставшихся пролиферирующихся клеток, содержащихся в линии дифференцировки поджелудочной железы, или удалять эти клетки, не подавляя пролиферацию iPS-клеток (например, не уменьшая число клеток, позитивных по щелочной фосфатазе).

[0178] Этот подход позволяет снижать абсолютное число Ki67-позитивных клеток в популяции эндокринных клеток-предшественников или в популяции клеток на более поздней стадии дифференцировки путем обработки ингибитором FGFR1. Это позволяет истощать Ki67-позитивные клетки в полученной популяции клеток.

[0179] В частности, число Ki67-позитивных клеток в полученной популяции клеток может быть уменьшено по сравнению с числом клеток в случае культивирования и/или дифференцировки без обработки ингибитором FGFR1. Это число может составлять менее, чем 10%, менее, чем 9%, менее, чем 8%, менее, чем 7%, менее, чем 6%, менее, чем 5%, менее, чем 4%, менее, чем 3%, менее, чем 2% или менее, чем 1%, а предпочтительно менее, чем 3%, менее, чем 2% или менее, чем 1%.

[0180] В соответствии с этим подходом, популяция эндокринных клеток-предшественников или популяция клеток на более поздней стадии дифференцировки, обработанная ингибитором FGFR1, может быть дифференцирована в инсулин-продуцирующие клетки или в β-клетки поджелудочной железы с получением популяции клеток, ингибирующих рост Ki67-позитивных клеток и включающих обогащенные инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы. В частности, число инсулин-продуцирующих клеток или β-клеток поджелудочной железы в популяции клеток, полученной после индуцирования дифференцировки, может быть увеличено по сравнению с популяцией клеток, полученной без обработки ингибитором FGFR1. Это число может составлять 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более или 90% или более.

[0181] Инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы, полученные этим методом, могут оставаться в неизменном виде и использоваться в качестве инсулин-секретирующих клеток при их трансплантации в живой организм животного и при дифференцировке в живом организме животного. Инсулин-продуцирующие клетки или β-клетки поджелудочной железы, полученные этим методом, могут предотвращать пролиферацию Ki67-позитивных клеток и обеспечивать безопасную и длительную выживаемость трансплантата трансплантированных клеток.

[0182] В соответствии с настоящим изобретением, популяцию инсулин-продуцирующих клеток или популяцию β-клеток поджелудочной железы, из которых были удалены в высокой степени пролиферирующиеся Ki67-позитивные клетки (популяцию клеток согласно изобретению), трансплантируют в их обычной форме или в форме капсулы в пораженный участок и, таким образом, эти клетки могут быть использованы в качестве клеточного лекарственного средства для лечения сахарного диабета, а в частности, сахарного диабета типа I.

[0183] Популяция клеток согласно изобретению может представлять собой пролекарство. Пролекарство означает популяцию клеток, которые дифференцируются после трансплантации в живой организм и превращаются в клетки, обладающие лечебной функцией.

[0184] Популяция клеток согласно изобретению имеет низкую токсичность (например, острую токсичность, хроническую токсичность, генетическую токсичность, репродуктивную токсичность, кардиотоксичность и канцерогенность) и может безопасно вводиться в своей обычной форме или в форме фармацевтической композиции, содержащей популяцию клеток, смешанную с фармакологически приемлемым носителем и т.п., млекопитающему (например, мышам, крысам, хомячкам, кроликам, кошкам, собакам, крупному рогатому скоту, овцам, обезьянам и человеку).

[0185] Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на Примеры. Однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Примеры

[0186] Индуцирование дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в популяцию эндокринных клеток-предшественников осуществляли в соответствии с вышеуказанными стадиями 1)-5), и в соответствии с предыдущим отчетом (Stem Cell Research (2015) 14, 185-197) и т.п.

[0187] Пример 1: Уменьшение числа нежелательных клеток (Ki67-позитивных клеток) в популяции клеток, полученной путем обработки популяции эндокринных клеток-предшественников ингибитором рецептора FGF1

1. Метод

(1) Получение популяции инсулин-продуцирующих клеток

Индуцирование дифференцировки популяции эндокринных клеток-предшественников в популяцию инсулин-продуцирующих клеток проводили в соответствии с вышеописанной стадией 6) или предыдущим отчетом (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133).

Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 12 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту) и ингибитор рецептора FGF1 (CAS192705-79-6), с получением популяции инсулин-продуцирующих клеток. Количество Ki67-позитивных клеток в полученной популяции клеток оценивали с помощью проточной цитометрии.

[0188] (2) Трансплантация клеток, обработанных ингибитором рецептора FGF1, в живой организм.

В приведенном ниже описании, подготовку мышей и трансплантацию клеток осуществляли известными методами.

Популяцию инсулин-продуцирующих клеток, полученную путем культивирования в среде для индуцирования дифференцировки, содержащей CAS192705-79-6, как описано в предыдущем разделе (1), или популяцию инсулин-продуцирующих клеток, полученную путем культивирования в среде для индуцирования дифференцировки, без CAS192705-79-6, и используемую в качестве сравнительного примера, трансплантировали под капсулу почки иммунодефицитных мышей NOD/SCID с инсулинзависимым сахарным диабетом, индуцированным стрептозотоцином. Для последующего наблюдения после трансплантации были измерены концентрации С-пептида и уровни глюкозы в крови человека. Трансплантаты были удалены через 5 недель после трансплантации.

[0189] (3) Оценка нежелательных клеток в трансплантате

Иссеченные трансплантаты фиксировали и дегидратировали, а затем получали замороженные срезы и подвергали иммуногистологическому окрашиванию для оценки нежелательных клетки. Представляющие интерес клетки, которые, как можно было ожидать, созревали в клетки панкреатических островков in vivo, были оценены по содержанию в них инсулина (и NKX6.1) или глюкагона в качестве индикатора, а нежелательные клетки, которые, вероятно, негативно влияют на длительную выживаемость трансплантата представляющих интерес клеток, оценивали на содержание в них Ki67 в качестве индикатора.

[0190] 2. Результаты

(1) Получение популяции инсулин-продуцирующих клеток

Эксперимент по обработке клеток в течение 12 дней средой для индуцирования дифференцировки, содержащей CAS192705-79-6 (1 мкМ), проводили пять раз. Результаты оценки числа Ki67-позитивных клеток ± стандартное отклонение для полученной популяции клеток представлены в Таблице 1. В случае обработки популяции эндокринных клеток-предшественников ингибитором CAS192705-79-6 в течение 12 дней, число Ki67-позитивных клеток в полученной популяции клеток было гораздо меньше, чем у контроля. Эти результаты показали, что обработка популяции эндокринных клеток-предшественников соединением CAS192705-79-6 снижает число Ki67-позитивных клеток или ингибирует их пролиферацию.

[0191] [Таблица 1]

Обработка ингибитором рецептора FGF Отсутствует Присутствует (1 мкМ) Процент содержания Ki67-позитивных клеток (до трансплантации) 10,78±4,09% 0,98±0,29%

[0192] (2) Трансплантация клеток, обработанных ингибитором рецептора FGF1, в живой организм

Результаты оценки концентраций С-пептида и уровней глюкозы в крови человека, определенных для последующего наблюдения после трансплантации, показаны в Таблице 2. Популяция инсулин-продуцирующих клеток, полученная путем обработки в течение 12 дней средой для индуцирования дифференцировки, содержащей CAS192705-79-6 (1 мкМ), секретировала С-пептид в кровь человека и показала эффект снижения высокого уровня глюкозы в крови через 4 месяца после трансплантации. Их уровни были эквивалентны уровням, наблюдаемым в случае трансплантации популяции инсулин-продуцирующих клеток, полученной без обработки CAS192705-79-6.

[0193] [Таблица 2]

Обработка ингибитором рецептора FGF Отсутствует Присутствует (1 мкМ) Концентрация C-пептида в крови человека через 4 месяца после трансплантации (пM) 1440±573 1486±305 Уровень глюкозы в крови во время трансплантации и через 4 месяца после трансплантациии (мг/дл) 516±35 (на момент трансплантации)
85±16 (через 4 месяца) 516±33 (на момент трансплантации)
86±22 (через 4 месяца)

[0194] (3) Оценка нежелательных клеток в трансплантате

Результаты иммуногистологического окрашивания трансплантатов, вырезанных через 5 недель после трансплантации, показаны на фиг. 1.

В случае трансплантации под капсулу почки было обнаружено, что популяция инсулин-продуцирующих клеток, полученная путем обработки в течение 12 дней средой для индуцирования дифференцировки, содержащей CAS192705-79-6 (1 мкМ), давала резкое подавление вздутия трансплантатов почек по сравнению с со случаем трансплантации под капсулу почки популяции инсулин-продуцирующих клеток, полученной без обработки CAS192705-79-6. Эти результаты показали, что обработка популяции эндокринных клеток-предшественников соединением CAS192705-79-6, снижает количество Ki67-позитивных клеток, которые являются нежелательными клетками, или ингибирует их пролиферацию.

[0195] Пример 2: Уменьшение числа нежелательных клеток (Ki67-позитивных клеток) и поддержание представляющих интерес клеток (инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток) в популяции клеток, полученной путем обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток ингибитором рецептора FGF1

1. Метод

1) Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 11 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту) и ингибитор рецептора FGF1 (CAS192705-79-6), с получением популяции инсулин-продуцирующих клеток.

2) Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 4 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту) и индуцировали их дифференцировку в популяцию инсулин-продуцирующих клеток. Затем, в среду для индуцирования дифференцировки (в улучшенную среду MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащую факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту), добавляли ингибитор рецептора FGF1 (CAS192705-79-6, 1 мкМ), и клетки культивировали в течение 7 дней.

3) Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 7 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту) и индуцировали их дифференцировку в популяцию инсулин-продуцирующих клеток. Затем, в среду для индуцирования дифференцировки (в улучшенную среду MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащую факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту), добавляли ингибитор рецептора FGF1 (CAS192705-79-6, 1 мкМ), и клетки культивировали в течение 4 дней.

4) Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 11 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту) и не содержащей CAS192705-79-6, а затем индуцировали дифференцировку в популяцию инсулин-продуцирующих клеток.

[0196] Количество Ki67-позитивных клеток в клеточной популяции, полученной каждым из вышеуказанных способов 1), 2) и 3), подсчитывали с помощью проточной цитометрии для определения числа Ki67-позитивных клеток в каждой популяции клеток.

Количество инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток в популяции клеток, полученной каждым из вышеуказанных способов 1), 2) и 3), подсчитывали с помощью проточной цитометрии. Число инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток в каждом способе подсчитывали как относительную величину, если количество инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток в контрольной популяции клеток, полученной вышеуказанным способом 4), было определено как 100%.

[0197] 2. Результаты

Эксперимент с применением каждого способа повторяли три раза для оценки влияния времени обработки соединением CAS192705-79-6 на стадии получения инсулин-продуцирующих клеток. Результаты для среднего числа Ki67-позитивных клеток и инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток, полученных в каждом способе ± стандартное отклонение, показаны в Таблице 3.

Число Ki67-позитивных клеток в полученной популяции клеток существенно не отличалось в случае обработки клеток с использованием CAS192705-79-6 с начала стадии индуцирования дифференцировки и в случае обработки клеток в течение последних 7 дней и последних 4 дней, и во всех случаях это число было гораздо меньше, чем у контроля. Эти результаты показали, что обработка соединением CAS192705-79-6 в способе получения инсулин-продуцирующих клеток или β-клеток поджелудочной железы может снижать количество Ki67-позитивных клеток в клеточной популяции или ингибировать их пролиферацию.

С другой стороны, число инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток заметно отличалось в случае обработки клеток с начала стадии индуцирования дифференцировки и в случае обработки клеток в течение последних 7 дней или 4 дней. В частности, в случае обработки клеток (популяции эндокринных клеток-предшественников) соединением CAS192705-79-6 с начала стадии индуцирования дифференцировки было подтверждено, что количество представляющих интерес инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток заметно снижалось. И напротив, в случае обработки клеток (популяции ранних инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки) соединением CAS192705-79-6 на определенной стадии прохождения дифференцировки через 4 дня или 7 дней после начала индуцирования дифференцировки, было подтверждено, что число представляющих интерес инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток снижалось довольно редко.

[0198] [Таблица 3]

Обработка ингибитором рецептора FGF Отсутствует Присутствует (1 мкМ)
От начала Присутствует (1 мкМ)
За последние 7 дней Присутствует (1 мкМ)
За последние 4 дня Число Ki67-позитивных клеток; 7,57± 1,05% 0,57±0,35% 0,47±0,15% 0,57±0,15% Число инсулин-позитивных (и NKX6.1-позитивных) клеток 100±18% 45±15% 88±13% 91±16%

[0199] Пример 3: Уменьшение числа нежелательных клеток (Ki67-позитивных клеток) в популяции клеток, полученной путем обработки ингибитором FGFR1, отличающимся от CAS192705-79-6

1. Метод

Популяцию эндокринных клеток-предшественников, полученную путем индуцирования дифференцировки из iPS-клеток, культивировали в течение 8 дней в среде для индуцирования дифференцировки (в улучшенной среде MEM/1% B27/пенициллин-стрептомицин), содержащей факторы дифференцировки (ингибитор ALK5 II, T3, LDN, ингибитор γ-секретазы RO и аскорбиновую кислоту). Затем, в среду для индуцирования дифференцировки (MCDB131/20 мМ глюкозы/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/глутамакс/аскорбиновая кислота/пенициллин-стрептомицин), содержащую факторы дифференцировки (T3, ингибитор ALK5 II, ZnSO₄, гепарин, N-ацетилцистеин, Trolox и R428), добавляли CAS192705-79-6, E-3810 или PD173074 в трех концентрациях (низкой, средней и высокой), и клетки культивировали в среде в течение 4 дней. Число Ki67-позитивных клеток в полученной популяции клеток оценивали с помощью проточной цитометрии.

[0200] 2. Результаты

Число Ki67-позитивных клеток в популяции клеток, полученной путем обработки CAS192705-79-6 или E-3810, показано в Таблице 4. В Таблице 5 также показано число Ki67-позитивных клеток в клеточной популяции, полученной путем обработки PD173074.

На основании этих результатов было подтверждено, что в популяциях клеток, полученных путем обработки не только CAS192705-79-6, но и другими ингибиторами FGFR1, число Ki67-позитивных клеток была гораздо ниже, чем у контроля. Эти результаты показали, что обработка для ингибирования FGFR1, не ограничивающаяся обработкой только соединением CAS192705-79-6, снижает число Ki67-позитивных клеток или ингибирует их пролиферацию.

[0201] [Таблица 4]

Ингибитор FGFR1 Число Ki67-позитивных клеток (%);
Концентрация при обработке (мкМ) Отсутствует 4,13% - - CAS192705-79-6 2,15%;
0,1 мкМ 0,99%;
0,3 мкМ 0,7%;
1 мкМ E-3810 2,74%;
0,3 мкМ 1,51%;
1 мкМ 0,67%;
10 мкМ

[0202] [Таблица 5]

Ингибитор FGFR1 Число Ki67-позитивных клеток (%);
Концентрация при обработке (мкМ) Отсутствует 2,7% - - PD-173074 0,7%;
0,1 мкМ 0,7% ;
1 мкМ 0,5% ;
5 мкМ

[0203] Описанные выше результаты продемонстрировали, что обработка популяции эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки ингибитором FGFR1 способна уменьшить число Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции клеток, или ингибировать их пролиферацию, в результате чего может быть получена популяция клеток, обогащенная представляющими интерес клетками.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно к способу получения популяции инсулин-продуцирующих клеток или популяции β-клеток поджелудочной железы, имеющей пониженное число Ki67-позитивных клеток. Способ предусматривает обработку популяции эндокринных клеток-предшественников или клеток на более поздней стадии дифференцировки ингибитором FGFR1, который представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину, E-3810, PD-173074 или его соль. Продуцируемая популяция клеток содержит Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 3%. Полученные клетки могут быть использованы в качестве клеточного лекарственного средства для лечения сахарного диабета. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Способ получения популяции инсулин-продуцирующих клеток, включающий

(i) стадию индуцирования дифференцировки популяции эндокринных клеток-предшественников в популяцию инсулин-продуцирующих клеток; и

(ii) стадию обработки популяции инсулин-продуцирующих клеток, полученной на стадии (i), ингибитором FGFR1, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину, E-3810, PD-173074 или его соль,

где стадия (i) не включает обработку ингибитором FGFR1.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию дифференцировки популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1.

3. Способ по п. 1 или 2, где популяцию инсулин-продуцирующих клеток обрабатывают менее чем 5 мкМ ингибитора FGFR1.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где продуцируемая популяция клеток содержит Ki67-позитивные клетки в количестве менее чем 3%.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину или ее соль.

6. Способ по любому из пп. 2-5, где стадию дифференцировки популяции инсулин-продуцирующих клеток, обработанных ингибитором FGFR1, осуществляют путем трансплантации животному.

7. Способ уменьшения числа Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающий

(i) стадию индуцирования дифференцировки популяции эндокринных клеток-предшественников в популяцию инсулин-продуцирующих клеток; и

(ii) обработку популяции клеток, полученной на стадии (i), ингибитором FGFR1, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину, E-3810, PD-173074 или его соль,

где стадия (i) не включает обработку ингибитором FGFR1.

8. Способ по п. 7, где популяция инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки представляет собой популяцию инсулин-продуцирующих клеток.

9. Способ по п. 7 или 8, где популяцию инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки обрабатывают менее чем 5 мкМ ингибитора FGFR1.

10. Способ по любому из пп. 7-9, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину или ее соль.

11. Способ получения популяции β-клеток поджелудочной железы, включающий стадию обработки популяции β-клеток поджелудочной железы ингибитором FGFR1, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину, E-3810, PD-173074 или его соль.

12. Способ ингибирования пролиферации Ki67-позитивных клеток, присутствующих в популяции инсулин-продуцирующих клеток или клеток на более поздней стадии дифференцировки, включающий обработку популяции клеток ингибитором FGFR1, где ингибитор FGFR1 представляет собой 1-[2-амино-6-(3,5-диметоксифенил)пиридо(2,3-d)пиримидин-7-ил]-3-трет-бутилмочевину, E-3810, PD-173074 или его соль.