АНТИТЕЛО К BAG2 И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/18 C12N15/13 C12N5/10 C12N15/63 C12N1/15 C12N1/19 C12N1/21 C12P21/08 A61K39/395 A61P35/00 

1. Область техники

Настоящее раскрытие относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфически связывается с полипептидом BAG2 или его фрагментом. Настоящая заявка также относится к противораковому терапевтическому агенту, используя композицию по настоящему изобретению.

2. Уровень техники и существующий уровень техники:

Семейство белков ко-шаперона Bcl-2-ассоциированного атаногена (BAG) опосредует множество физиологических процессов, включая внутриклеточное сворачивание белка, стрессовую реакцию, дифференциацию нейронов, апоптоз и пролиферацию клеток, а также функционально связывается с различными кооперативными белками. BAG2, один из членов семейства BAG-доменов с антиапоптозной активностью, является негативным регулятором С-конца белка, взаимодействующего с Hsc70 (CHIP), который представляет собой шаперон-ассоциированную убиквитинлигазу. Основная роль BAG2 в регуляции белков посредством ингибирования активности CHIP связана с нейродегенеративными заболеваниями и аутосомно-рецессивными расстройствами через стабилизацию белков, связанных с шаперонами, таких как PINK1 и CFTR. Сообщается, что BAG2 обладает проапоптотической активностью таким образом, что экспрессия BAG2 увеличивает апоптоз, индуцированный ингибитором протеасом, а нокдаун BAG2 частично ингибирует апоптоз, когда клетки карциномы щитовидной железы подвергаются действию ингибитора протеасом MG132. Помимо образования комплекса BAG2-Hsp70, белок BAG функционально взаимодействует с множеством партнеров по связыванию и регулирует различные клеточные процессы, такие как передача сигналов стресса, деление клеток, апоптоз и дифференцировка клеток. Сообщается также, что в различных опухолях, индуцированных мутантным K-Ras, сверхэкспрессия BAG2 способствует стабилизации белка STK33, который является мощным геном опухоли, и, таким образом, способствует развитию опухоли. Кроме того, было высказано предположение, что экспрессия и расположение белка BAG2 могут варьироваться в зависимости от гистопатологической и молекулярно-генетической патологии раковых клеток во время прогрессирования или метастазирования онкологического заболевания молочной железы. Было обнаружено, что белок BAG2 секретируется из клетки путем взаимодействия с катепсином B, который является ферментом, расщепляющим белок, во время туморогенеза, и подтверждено, что потеря белка BAG2 полностью подавляет образование онкологического заболевания и метастазирование в легкие на животных моделях онкологического заболевания молочной железы. В результате разработка ингибиторов BAG2 будет способствовать лечению и выживанию больных онкологическим заболеванием.

Однако, несмотря на эти открытия, роль BAG2 в прогрессировании и метастазировании онкологического заболевания точно не известна. Кроме того, никаких конкретных исследований моноклональных антител к BAG2 не проводилось. Соответственно, существует необходимость в разработке антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с полипептидом BAG2 или его фрагментом.

Сущность изобретения

Эти и другие цели настоящего изобретения будут более понятны из последующего описания настоящего изобретения, прилагаемых графических материалов и прилагаемой формулы изобретения.

В одном аспекте предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с полипептидом BAG2 или его фрагментом.

Другой аспект относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Другой аспект относится к клетке-хозяину, включающей полинуклеотид.

В другом аспекте предлагается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Дополнительные аспекты будут изложены частично в нижеследующем описании и частично будут очевидны из описания, или могут быть изучены при практическом использовании представленных вариантов осуществления настоящего изобретения.

В одном аспекте предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с полипептидом BAG2 или его фрагментом.

Полипептиды BAG2 могут происходить от млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком (Homo sapiens), мышью (Mus musculus), обезьяной, коровой или лошадью. BAG2 может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 69 представляет собой последовательность, соответствующую ссылке NCBI SEQ ID NO: NM_004282.4. Белок BAG2 включает варианты, которые обладают биологически эквивалентной активностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69, хотя их аминокислотные последовательности могут не совпадать с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 69. Полипептид BAG2 может включать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 69. Белок BAG2 может быть полипептидом, имеющим такую же последовательность SEQ ID NO: 69 за исключением по меньшей мере одного аминокислотного остатка, по меньшей мере двух аминокислотных остатков, по меньшей мере трех аминокислотных остатков, по меньшей мере четырех аминокислотных остатков, по меньшей мере пяти аминокислотных остатков, по меньшей мере шести аминокислотных остатков или по меньшей мере семи аминокислотных остатков. В настоящем описании «полипептид» может использоваться взаимозаменяемо с «белком».

Антитело относится к специфическому иммуноглобулину, направленному против антигенного сайта. Антитело относится к полипептиду или комбинации полипептидов, которые специфически связываются с полипептидом BAG2 или его фрагментом. Антитело может включать поликлональные антитела, моноклональные антитела или рекомбинантные антитела, такие как фрагменты ScFv, диатела, одноцепочечные антитела и т.п., и включать все иммуноглобулины. Антитело может включать полную форму антитела, имеющую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, а также может включать функциональные фрагменты его молекул антитела, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию благодаря включению, имеющему специфические антигенсвязывающие сайты, то есть связывающие домены, несмотря на отсутствие структуры полноразмерного интактного антитела с двумя легкими цепями и двумя тяжелыми цепями.

Антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент всей структуры иммуноглобулина и относится к части полипептида, включая часть, с которой антиген способен связываться. Например, его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')2 или их комбинацию.

Существует пять видов тяжелых цепей γ, δ, α, μ и ε, и тяжелая цепь может определять тип антитела. Каждый из α и γ включает 450 аминокислот, а каждый из μ и ε включает 550 аминокислот. Тяжелая цепь имеет две области, а именно вариабельную область и константную область.

Есть два типа легких цепей, каппа и лямбда, и они могут включать от около 211 аминокислот до около 217 аминокислот. Легкая цепь может иметь константную область и вариабельную область.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющую комплементарность область (VH-CDR)1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, и VH-CDR3 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и вариабельную области легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область (VL-CDR)1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, VH CDR2 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, VL CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, VHCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, VH CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, VHCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, a VH CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68; или их комбинацию.

6-я и 7-я Xaa в SEQ ID NO: 39 может быть глицином (Gly) или аланином (Ala). 2-я Хаа в SEQ ID NO: 35 может быть тирозином (Tyr) или гистидином (His). 8-я Хаа в SEQ ID NO: 41 может быть серином (Ser) или треонином (Thr). 12-я Хаа в SEQ ID NO: 47 может быть тирозином (Tyr) или гистидином (His). 3-я Хаа в SEQ ID NO: 53 может быть метионином (Met) или изолейцином (lie). 2-я Хаа в SEQ ID NO: 59 может быть Ala или Ser.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, включая аминокислотную последовательность любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:21-26; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 27-32; или вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27; вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 28; вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29; вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 30; вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; или вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 26 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 32, или их комбинацию.

Каждая 56-я Xaa и 57-я Xaa в SEQ ID NO: 21 может быть Gly или Ala. В SEQ ID NO: 23 1-я Xaa может быть глутамином (Gln) или глутаматом (Glu), 7-я Xaa может быть Ser или пролином (Pro), 12-я Xaa может быть валином (Val) или аланином (Ala), 27-я Xaa может быть Tyr или His, 58-я Хаа может быть Ser или Thr, 61-я Хаа может быть аспарагином (Asn) или Ser, 74-я Хаа может быть аргинином (Arg) или лизином (Lys), 83-я Хаа может быть фенилаланином (Phe) или лейцином (Leu), 92-я Xaa может быть Gly или Ala, и 108-я Xaa может быть His или Tyr. 53-я Хаа в SEQ ID NO: 27 может быть Ile или Phe. В SEQ ID NO: 29 29-я Хаа может быть Met или Ile, 51-я Хаа может быть Ala или Ser, и 79-я Хаа может быть Glu или аспарагиновой кислотой (Asp), а 106-я Хаа может быть Met или Ile.

Антитело или его антигенсвязывающие фрагменты включают множество антител или их антигенсвязывающих фрагментов, и могут представлять собой комбинацию антител, выбранных из одного из наборов №1 и одного из наборов №2; одного из наборов №1 и одного из наборов №3; и одного из наборов №2 и одного из наборов №3. Набор №1 может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающийся со средней областью белка BAG2, включая VH из SEQ ID NO: 21 и VL из SEQ ID NO:27 и VH из SEQ ID NO:22 и VL из SEQ ID NO:28. Набор №2 может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающийся с N-концом белка BAG2, включая VH из SEQ ID NO: 23 и VL из SEQ ID NO: 29 и VH из SEQ ID NO: 24 и VL из SEQ ID NO: 30. Набор № 3 может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающийся с С-концом белка BAG2, включая VH из SEQ ID NO: 25 и VL из SEQ ID NO: 31 и VH из SEQ ID NO: 26 и VL из SEQ ID NO: 32.

Антитело или его антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноклональными антителами. При этом моноклональное антитело может быть бивалентным, биспецифическим или триспецифическим.

Антитело или его антигенсвязывающие фрагменты могут быть помечены детектируемой меткой или меткой, способной испускать детектируемый сигнал. Метка относится к поддающемуся обнаружению соединению или композиции, прямо или косвенно конъюгированной с антителом для получения меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Метка может быть обнаружена сама по себе и катализировать химическую модификацию определяемого субстратного соединения или композиции.

Метка может быть иммунофлуоресцентной меткой, хемилюминесцентной меткой, фосфоресцентной меткой, радиоактивной меткой, эпитопной меткой, авидином/биотином, частицами коллоидного золота, окрашенными частицами, магнитными частицами, хромофорными метками, ЭХЛ меткой, ферментом или т.п.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть продуцирован клеткой гибридомы, выбранной из клеток гибридомы, депонированных с номерами доступа KCTC 137378P, KCTC 137388P, KCTC 137398P, KCTC 137408P, KCTC 137418P, KCTC 137428P, KCTC 137438P, KCTC 137448P, KCTC 137458P и KCTC 137468P.

Клетка гибридомы относится к гибридной клетке, обладающей онкогенностью за счет искусственного слияния двух типов клеток, и, как правило, может использоваться для непрерывного продуцирования антител путем слияния В-клеток и клеток плазмоцитомы, выделенных от иммунизированного субъекта. Клетка гибридомы также может ссылаться в данном документе к гибридной клетке или слитой клетке.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали антитело к BAG2, содержащее VH SEQ ID NO: 21 и VL(2A11, 4C2, 8C4) SEQ ID NO: 27; VH SEQ ID NO: 22 и VL(3B5) SEQ ID NO: 28; VH SEQ ID NO: 23 и VL(9B3, 9B12, 3B10) SEQ ID NO: 29; VH SEQ ID NO: 24 и VL(10H7) SEQ ID NO: 30; VH SEQ ID NO: 25 и VL(3G8) SEQ ID NO: 31; и VH SEQ ID NO: 26 и VL(3F12) SEQ ID NO: 32, и клетку гибридомы, продуцирующую то же самое. Было подтверждено, что идентифицированное антитело к BAG2 показало реакцию антиген-антитело в клетках онкологического заболевания молочной железы.

Другой аспект относится к полинуклеотиду, включая полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Полинуклеотид может быть любой одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и любую одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-20, кодирующую вариабельную область легкой цепи.

Полинуклеотид может быть вектором. Вектор можно получить путем репликации и/или экспрессии полинуклеотида в клетке. Клетка может быть эукариотической клеткой или прокариотической клеткой. Эукариотические клетки могут быть клетками млекопитающих, клетками растений, клетками дрожжей или клетками насекомых. Млекопитающее может быть человеком, обезьяной, кроликом, крысой, хомяком или мышью. Прокариотическая клетка может быть бактериальной клеткой. Бактерия может быть E. coli. Вектор может быть вектором экспрессии. В векторе экспрессии полинуклеотид функционально связан с соответствующей регуляторной областью, так что полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине. Регуляторная область может быть промотором, энхансером или терминатором. Вектор также может включать селективный маркер. Вектор может быть фагом, плазмидой, космидой, минихромосомой, вирусом или ретровирусным вектором. Вектор может включать полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела, или может включать как полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, так и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи.

Полинуклеотид может быть конъюгирован с детектируемой меткой или меткой, способной испускать детектируемый сигнал. Метка может представлять собой флуоресцентный краситель, фосфоресцентный краситель, радиоизотоп, хромофор, квантовую точку, гаситель, наночастицы магнитных микроносителей, наночастицы золота, нанофосфоры, наночастицы кремния, тонкие полупроводниковые частицы, обладающие светоизлучающими свойствами, и т.п. Например, флуоресцентный краситель может представлять собой цианин (цианин 2), амидометил кумарин, фторозан, индокарбоцианин (цианин 3), цианин 3,5, тетраметилродамин, родамин красный, техасский красный, индийский карбоцианин (цианин 5), цианин 5,5, цианин 7, устрицы и тому подобное. Например, мелкодисперсные полупроводниковые частицы могут представлять собой селен кадмия (CdSe), теллур кадмия (CdTe), фосфор индия-галлия (lnGaP), сульфид серебра, индия и цинка (AglnZnS) или тому подобное. Способ конъюгирования с меткой может представлять собой способ связывания маркирующего вещества с 3'-концом полинуклеотида, способ связывания маркирующего вещества с 5'-концом или способ включения нуклеотида, с которым связывается маркирующее вещество, в полинуклеотид. Конъюгирование метки с 3'-концом или 5'-концом может быть выполнено с помощью ферментативной реакции, и фермент может представлять собой РНК-лигазу Т4, концевую трансферазу, полиА-полимеразу или тому подобное. Метка может быть обнаружена с помощью флуоресцентного микроскопа, сканирующего электронного микроскопа, просвечивающего электронного микроскопа, компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии и т.п.

Другой аспект относится к клетке-хозяину, включающей полинуклеотид.

Полинуклеотид такой же, как описано выше.

Клетка-хозяин может быть бактериальной клеткой, дрожжевой клеткой, грибковой клеткой, клеткой насекомого, животной клеткой или растительной клеткой, каждая из которых содержит полинуклеотид. Бактериальные клетки могут быть Escherichia coli (E. coli), Streptomyces или Salmonella typhimurium. Дрожжевыми клетками могут быть Pichia pastoris. Клетки насекомых могут быть клетками Drosophila или Spodofterra Sf9. Клетками животных могут быть клетки яичника китайского хомячка (CHO), миелома мыши (SP2/0), лимфобластоид человека, COS, миелома мыши (NSO), 293T, клетки меланомы луковицы, HT-1080, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), эмбриональные клетки почек человека (НЕК) или PERC.6 (клетки сетчатки глаза человека).

Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяин. Введение относится к способу доставки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий антитело, в клетку-хозяин. Такие введения можно проводить различными методами, известными в данной области, включая соосаждение фосфатом кальция и ДНК, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, трансфекцию, опосредованную полибреном, электрошок, микроинъекцию, слияние липосом, слияние липофектамина и протопластов. Кроме того, трансдукция относится к доставке целевого продукта в клетки с использованием вирусных частиц путем инфицирования. Кроме того, вектор может быть введен в клетку-хозяин путем бомбардировки генов и т.п. Введение можно также назвать преобразованием.

В другом аспекте предлагается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Способ может включать культивирование клетки-хозяина; и отделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от полученной культуры.

Клетка-хозяин такая же, как описано выше.

Культивирование можно проводить в подходящих средах и условиях культивирования, известных в данной области техники. Специалисты в данной области техники могут легко контролировать среду и условия культивирования в соответствии с выбранным микроорганизмом. Метод культивирования может включать, например, периодическое, непрерывное и периодическое культивирование с подпиткой.

Среда может включать различные источники углерода, источники азота и компоненты микроэлементов.

Источником углерода могут быть, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал или целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло или кокосовое масло; глицерин жирных кислот, такой как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как этанол; органические кислоты, такие как уксусная кислота; или их комбинация. Источник азота может включать, например, источники неорганического азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, кукурузный настой (CSL) и соевую пшеницу, источники органического азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, или их комбинации. Среда в качестве источника фосфора может включать, например, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли или соли металлов, такие как антиоксидант магния или антиоксидант железа. Кроме того, в среду могут быть включены аминокислоты, витамины, соответствующие предшественники и т.п. Среду или отдельные компоненты могут добавляться в культуру периодически или непрерывно.

Кроме того, в течение периода времени, в течение которого клетки-хозяева культивируются, соединения, такие как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, могут быть добавлены к микробной культуре подходящим способом для регулирования pH культуры. Кроме того, во время культивирования клеток-хозяев могут использоваться противовспенивающие агенты, такие как сложные полигликолевые эфиры жирных кислот, для подавления образования пузырьков.

Клетки можно культивировать в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных условиях. Микроаэрофильное состояние относится к условиям культивирования, в которых кислород на уровне ниже, чем уровень кислорода в атмосфере, растворяется в среде. Низкий уровень кислорода может составлять, например, от около 0,1% до около 10%, от около 1% до около 9%, от около 2% до около 8%, от около 3% до около 7%, или от около 4% до около 6%. Кроме того, микроаэрофильные условия могут включать состояние, при котором концентрация растворенного кислорода в среде находится в диапазоне от около 0,9 ч.м. до около 3,6 ч.м. Температура культивирования может составлять, например, от около 20 °C до около 45 °C или от около 25 °C до около 40 °C. . Инкубацию можно продолжать до тех пор, пока желаемое количество антитела или его антигенсвязывающих фрагментов не достигнет целевого уровня.

Разделение может быть выполнено с помощью известного в данной области метода разделения антитела. Разделение может включать выполнение одного или более процессов, выбранных из центрифугирования, фильтрации, экстракции, распыления, сушки, выпаривания, осаждения, кристаллизации, электрофореза, фракционного растворения и хроматографии.

Способ может дополнительно включать мечение отделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Метка может быть иммунофлуоресцентной меткой, хемилюминесцентной меткой, фосфоресцентной меткой, радиоактивной меткой, эпитопной меткой, авидином/биотином, частицами коллоидного золота, окрашенными частицами, магнитными частицами, хромофорными метками, ЭХЛ меткой, ферментом или т.п.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ лечения онкологического заболевания, который представляет собой первичное или метастазирующее онкологическое заболевание, у индивидуума, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, анти-BAG2 или его антигенсвязывающего фрагмента, как обсуждалось выше. Способ может включать совместное введение или последовательное введение существующего терапевтического агента. Существующая терапия может представлять собой иммунотерапевтический агент против онкологического заболевания, который может включать ингибитор молекулы иммунной контрольной точки, такой как PD-1, PD-L1 или CTLA4. Иммунотерапевтическим агентом может быть гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 3 (IL-3), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), лиганд 4-1BB, GITRL, OX-40L, антитело к CD3, антитело к CD27, антитело к CTLA4, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к GITR, антитело к OX-40, антитело к 4-lBB, антитело к LAG-3 и антитело к TIM-3. Онкологическим заболеванием может представлять собой онкологическое заболевание молочной железы, колоректальное онкологическое заболевание, онкологическое заболевание головы и шеи, онкологическое заболевание толстой кишки, онкологическое заболевание кожи, онкологическое заболевание поджелудочной железы, онкологическое заболевание легких, онкологическое заболевание желудка, онкологическое заболевание простаты, онкологическое заболевание мочевого пузыря, онкологическое заболевание уретры, онкологическое заболевание печени, онкологическое заболевание почки, светлоклеточную саркому, меланому, цереброспинальную опухоль, онкологическое заболевание мозга, тимуса, мезотелиомы, онкологическое заболевание пищевода, онкологическое заболевание желчных протоков, онкологическое заболевание яичек, онкологическое заболевание половых клеток, онкологическое заболевание щитовидной железы, онкологическое заболевание паращитовидной железы, онкологическое заболевание шейки матки, онкологическое заболевание яичников, онкологическое заболевание эндометрия, лимфомы, миелодиспластические синдромы (MOS), миелофиброз, острый лейкоз, хронический лейкоз, множественную миелому, болезнь Ходжкина, эндокринное онкологическое заболевание и саркому.

Краткое описание графических материалов

Файл патента или заявки содержит как минимум один цветной графический материал. Копии данного патента или публикации заявки на патент с цветными графическими материалами будут предоставлены Ведомством по запросу и при уплате необходимой пошлины.

Настоящее изобретение станет более понятным из подробного описания, приведенного ниже, и сопроводительных графических материалов, которые приведены только для иллюстрации и, таким образом, не ограничивают настоящее изобретение, и при этом;

на Фиг. 1показаны результаты вестерн-блоттинга антител к BAG2, полученных из 10 клеток гибридомы мыши;

на Фиг. 2A и 2B показаны результаты вестерн-блоттинга для полноразмерного полипептида BAG2 антитела к BAG2 или его фрагмента;

на Фиг. 3 показан домен BAG2, который взаимодействует с соответствующими антителами к BAG2.

На Фиг. 4A-4D продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-L1 в модели онкологического заболевания молочной железы. (а) Мышам BALB/c вводили 2 × 10⁵ клеток ЕМТ6. На 12-й день после инъекции опухолевых клеток некоторым мышам вводили внутрибрюшинно (в/б) антитело к BAG2 3B10 (200 мкг на мышь) или контрольное антитело изотипа один раз в два дня. На 14 день некоторые мыши получали однократную инъекцию антитела к PD-L1 (100 мкг на мышь, в/б) или антитела изотипического контроля один раз в два дня. Представлена экспериментальная схема. (b и c) Объем опухоли у контрольных мышей (черная линия, n = 5), мышей, получавших только антитело к BAG2 3B10 (зеленая линия, n = 5), мышей, получавших только антитело к PD-L1 (синяя линия, n = 5), и мышей, получавших как 3B10, так и антитело к PD-L1 (красная линия, n = 5). Наблюдали за ростом опухоли и измеряли объемы опухолей с помощью электронных штангенциркулей на 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24 дни. На 25 день мышей умерщвляли. (b) Объемы опухолей у отдельных мышей в группах. (c) Средний рост опухоли в четырех группах лечения. (d) Профили CD3+/CD8+ Т-клеток в опухолевом микроокружении ЕМТ6 (TME) всех групп. Данные проточной цитометрии представляют собой среднее значение из двух независимых экспериментов. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, *** p <0,001 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a)

На Фиг. 5A-5D продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-L1 на модели онкологического заболевания легкого. (а) Мышам C57BL/6 вводили 5 × 10⁵ клеток LLC. Через около восемь дней, когда средний размер опухоли достиг около 60-80 мм³, мышей разделяли на группы (n = 5) так, чтобы средние размеры опухолей во всех группах были одинаковыми, и было начато лечение в/б инъекциями. На 8 день после инъекции опухолевых клеток некоторым мышам вводили в/б антитело к BAG2 3B10 (200 мкг на мышь), антитело к PD-L1 (100 мкг на мышь), комбинацию антитела к PD-L1 и 3B10, или изотипное контрольное антитело один раз в три дня до завершения исследования. Представлена программа эксперимента. (b и c) Объем опухоли у контрольных мышей (черная линия, n = 5), мышей, получавших только антитело к BAG2 3B10 (зеленая линия, n = 5), мышей, получавших только антитело к PD-L1 (синяя линия , n = 5), и мышей, обработанных как антителами к BAG2, так и к PD-L1 (красная линия, n = 5). Наблюдали за ростом опухоли и измеряли объемы опухоли с помощью электронных штангенциркулей на 8, 11, 14, 17 и 20 дни. На 20 день мышей умерщвляли. (b) Объемы опухолей у отдельных мышей в группах. (c) Средний рост опухоли в четырех группах лечения. (d) Профили CD3+/CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли LLC (TME) всех групп. Данные проточной цитометрии представляют собой среднее значение из двух независимых экспериментов. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, ** p <0,01 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a).

На Фиг. 6A-6C продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-L1 на модели метастазирования меланомы в легкое. (а) Мышам C57BL/6 внутривенно вводили 2 × 10⁵ клеток B16-F10-Luc2. При выполнении BLI мыши получали внутрибрюшинные (в/б) инъекции D-люциферина, и их сигналы BLI служили фоном. Рост метастазов меланомы в опухоль легкого отслеживали с помощью сигналов BLI на 14, 20, 26, 32 и 38дни, и мышей разделяли на группы (n = 4) так, чтобы средние сигналы BLI четырех групп были аналогичными. На 15 день после инъекции опухолевых клеток некоторым мышам вводили внутрибрюшинно (в/б) антитело к BAG2 3F12 (200 мкг на мышь) или изотипное контрольное антитело один раз каждые четыре дня. На 23 день некоторые мыши получали однократную инъекцию антитела к PD-L1 (100 мкг на мышь, внутрибрюшинно) или изотипного контрольного антитела один раз каждые четыре дня до завершения исследования. На 39 день мышей умерщвляли. Представлена программа эксперимента. (b) На 38 день репрезентативные сигналы BLI контрольных мышей (n = 4), мышей, получавших только антитело к PD-L1 (n = 4), мышей, получавших только антитело к BAG2 3F12 (n = 4), и мышей, получавших как антитело к BAG2 3F12, так и антитело к PD-L1 (n = 4). (c) Количественная оценка сигнала BLI опухолей в четырех группах лечения. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a).

На Фиг. 7A-7D продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-1 на модели колоректального онкологического заболевания. (а) Мышам C57BL/6 вводили 5 × 10⁵ клеток MC38. Через около восемь дней, когда средний размер опухоли достиг около 30 мм³, мышей разделяли на группы (n = 6) так, чтобы средние размеры опухолей во всех группах были одинаковыми, и было начато лечение в/б инъекциями. На 8 день после инъекции опухолевых клеток некоторых мышей лечили антителом к BAG2 3B10 (200 мкг на мышь), антителом к PD-1 (50 мкг на мышь), комбинацией антител к PD-1 и 3B10, или изотипным контрольным антитела один раз в четыре дня до завершения исследования. Представлена программа эксперимента. (b и c) Объем опухоли у контрольных мышей (черная линия, n = 6), мышей, получавших только антитело к BAG2 3B10 (зеленая линия, n = 6), мышей, получавших только антитело к PD-1 (синяя линия, n = 6), и мышей, обработанных как антителами к BAG2, так и к PD-1 (красная линия, n = 6). Наблюдали за ростом опухоли и измеряли объемы опухолей с помощью электронных штангенциркулей на 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 дни. На 20 день мышей умерщвляли. (b) Объемы опухолей у отдельных мышей в группах. (c) Средний рост опухоли в четырех группах лечения. (d) Профили CD3+/CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли MC38 (TME) всех групп. Данные проточной цитометрии представляют собой среднее значение из двух независимых экспериментов. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, ** p <0,01, *** p<0.001 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a).

На Фиг. 8A-8D продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-L1 на модели онкологического заболевания легкого. (а) Мышам BALB/c вводили 3 × 10⁵ клеток CT26. Через около 11 дней, когда средний размер опухоли достиг около 70 мм³, мышей разделили на группы (n = 7) так, чтобы средние размеры опухолей во всех группах были одинаковыми, и было начато лечение в/б инъекциями. На 11 день после инъекции опухолевых клеток некоторых мышей лечили антителом к BAG2 3B10 (250 мкг или 750 мкг на мышь), антителом к PD-L1 (200 мкг на мышь), комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 (250 мкг или 750 мкг на мышь) или изотипным контрольным антителом один раз каждые два дня до завершения исследования. Представлена программа эксперимента. (b и c) Объем опухоли у контрольных мышей (черная линия, n = 7), мышей, получавших только 3B10 (250 мкг, зеленая линия, n = 7), мышей, получавших только 3B10 (750 мкг, коричневая линия, n = 7), мышей, получавших только антитело к PD-L1 (синяя линия, n = 7), мышей, получавших как 3B10 (250 мкг), так и антитело к PD-L1 (красная линия, n = 7), и мышей, получавших лечение как 3B10 (750 мкг), так и антителом к PD-L1 (фиолетовая линия, n = 7). Наблюдали за ростом опухоли и измеряли объемы опухолей с помощью электронных штангенциркулей на 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23 дни. На 20 день мышей умерщвляли. (b) Объемы опухолей у отдельных мышей в группах. (c) Средний рост опухоли в четырех группах лечения. (d) Профили CD3+/CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли MC38 (TME) всех групп. Данные проточной цитометрии представляют собой среднее значение из двух независимых экспериментов. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, ** p <0,001 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a).

На Фиг. 9A-9E продемонстрирована терапевтическая эффективность антитела к BAG2 в комбинации с антителом к PD-1 или антителом к CTLA4 на модели онкологического заболевания поджелудочной железы. (а) Мышам C57BL/6 ортотопически вводили 2 × 10⁶ клеток PANC02-Luc. Через около 15 дней при выполнении BLI мыши получали инъекции внутрибрюшинные (в/б) D-люциферина, и их сигналы BLI служили фоном. Рост первичной опухоли поджелудочной железы отслеживали с помощью сигналов BLI, мышей разделяли на группы (n = 6-7) так, чтобы средние сигналы BLI пятнадцати групп были аналогичными. Мышей лечили 200 мкг (низкая доза)/мышь (с 16 по 32 день восемь раз) и 400 мкг (высокая доза)/мышь (с 35 по 39 день три раза) четырьмя антителами к BAG2 (3B10, 3F12, 3B5 и 3G8) или изотипным контрольным антителом три раза в неделю до завершения исследования. На 28 день после имплантации мышей обрабатывали антителом к PD-1 (75 мкг на мышь) или антителом к CTLA4 (200 мкг на мышь), или изотипным контрольным антителом три раза в неделю до завершения исследования. На 40 день мышей умерщвляли. Представлена программа эксперимента. (b) Рост опухоли контролировали с помощью визуализации сигнала BLI IVIS на 15, 27 и 39 дни после имплантации. BLI сигналы мышей, получавших только четыре антитела к BAG2 (3B10, 3F12, 3B5 и 3G8) или изотипное контрольное антитело (белая полоса, n = 7 на группу), мышей, аддитивно получавших антитело к PD-1 (черный столбец, n = 6 на группу), и мышей, аддитивно получавших антитело к CTLA4 (серая полоса, n = 4 на группу). (c) На 40 день масса первичной опухоли (мг) отдельных мышей в группах. (d) Среднее количество метастазов в печень (слева), плевральную (в центре) и диафрагму (справа) в пятнадцати группах лечения. (e) Профили популяции лимфоцитов, NK-, миелоидных и стромальных клеток в микроокружении опухоли (TME) PANC02-Luc всех групп. Опухолево-специфичные макрофаги CD45+/CD11b+/Gr1-/F4/80+, CD45+/CD11b+/Gr1+ MDSC и CD45-/CD90.2+ стромальные клетки Данные проточной цитометрии представляют собой среднее значение из двух независимых экспериментов. t-ТЕСТ: все данные представлены как среднее ± СОС (стандартная ошибка среднего). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (по сравнению с контрольной группой мыши, которой вводили IgG2a). н.з. (незначимый). Опухолеспецифические лимфоциты (CD3+/CD8+ Т-клетки и CD45+/CD3-/CD19+ + B-клетки); Опухолеспецифические NK-клетки (CD45+/CD3-/CD49b+); Опухолевые миелоидные клетки (макрофаг CD45+/CD11b+/Gr1-/F4/80+, CD45+/CD11b+/Gr1+ MDSC); Опухолево-специфические стромальные клетки (CD45-/CD90.2+).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Определения

В настоящей заявке слова в единственном числе означают также и множественное число.

Используемые в настоящем документе термины «около» или «по существу» обычно предоставляют свободу действий от ограничения точным числом. Например, при использовании в контексте длины полипептидной последовательности «около» или «по существу» означает, что полипептид не должен ограничиваться указанным числом аминокислот. Несколько аминокислот, добавленных к N-концу или C-концу или вычтенных из него, могут быть включены, пока присутствует функциональная активность, такая как их связывающая активность.

В данном контексте введение «в комбинации с» одним или более дополнительными терапевтическими агентами включает совместное (одновременное) и последовательное введение в любом порядке.

Используемый в настоящем документе термин «горячая точка», относящийся к последовательностям в областях, определяющих комплементарность, означает присутствие аминокислотных остатков, которые могут вызвать нестабильность в области связывания антигена, и, таким образом, такой мотив следует заменить для повышения эффективности связывания. Хотя не существует списка обычно заменяемых аминокислот, один из способов рассмотреть вопрос о замене аминокислотного остатка на CDR - это рассмотреть консервативность зародышевой линии и структуру последовательности антитела, а также выбрать и заменить аминокислоту с аналогичной структурой. Например, NG может быть мутирован в NA, поскольку структуры обеих аминокислот схожи. Такая модификация позволяет повысить эффективность связывания CDR с BAG2.

В контексте настоящего описания «аминокислота» и «аминокислоты» относятся ко всем встречающимся в природе L-αаминокислотам. Это определение включает норлейцин, орнитин и гомоцистеин.

Используемый в настоящем документе термин «вариант аминокислотной последовательности» относится к молекулам с некоторыми отличиями в их аминокислотных последовательностях по сравнению с эталонным (например, нативной последовательностью) полипептидом. Аминокислотные изменения могут представлять собой замены, вставки, делеции или любые желаемые комбинации таких изменений в нативной аминокислотной последовательности.

Варианты с заменами - это варианты, у которых удален по меньшей мере один аминокислотный остаток в нативной последовательности и на его место в том же положении вставлена другая аминокислота. Замены могут быть одиночными, когда была заменена только одна аминокислота в молекуле, или они могут быть множественными, когда две или более аминокислоты были заменены в одной и той же молекуле.

Замены аминокислоты в последовательности могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В объем изобретения также включены белки или их фрагменты или производные, которые проявляют такую же или аналогичную биологическую активность, и производные, которые дифференцированно модифицируются во время или после трансляции, например, путем гликозилирования, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или другой клеточной лиганд и так далее.

Варианты со вставкой - это варианты с одной или более аминокислотами, вставленными непосредственно рядом с аминокислотой в конкретном положении в нативной аминокислотной последовательности. Непосредственно рядом с аминокислотой означает присоединение к функциональной группе α-карбокси или α-амино аминокислоты.

Варианты с делецией - это варианты с удаленной одной или более аминокислотами в нативной аминокислотной последовательности. Обычно варианты с делецией содержат одну или две аминокислоты, удаленные в определенной области молекулы.

В данном контексте «фрагменты» или «функциональные производные» относятся к биологически активным вариантам аминокислотной последовательности и фрагментам полипептида по настоящему изобретению, а также к ковалентным модификациям, включая производные, полученные реакцией с органическими дериватизирующими агентами, посттрансляционными модификациями, производные с небелковыми полимерами и иммуноадгезины.

Используемый в настоящем документе термин «носители» включает фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, которые нетоксичны для клетки или млекопитающего, подвергающегося их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто фармацевтически приемлемый носитель представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; полипептид с низкой молекулярной массой (менее около 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахарные спирты, такие как маннит или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^®, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS^®.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрывающие антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и тому подобное. Использование таких сред и агентов для фармацевтических активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным ингредиентом, предполагается их использование в терапевтических композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.

Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и равномерной дозировки. Используемая в настоящем документе лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для лечения субъектов-млекопитающих; каждая единица содержит заранее определенное количество активного материала, рассчитанное на достижение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению продиктована и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного материала и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, присущих данному уровню техники приготовления таких препаратов активный материал для лечения заболеваний у живых субъектов, имеющих болезненное состояние, при котором ухудшается физическое здоровье.

Основной активный ингредиент составлен для удобного и эффективного введения в эффективных количествах с подходящим фармацевтически приемлемым носителем в стандартной лекарственной форме. Стандартная лекарственная форма может, например, содержать основное активное соединение в количествах от 0,5 мкг до около 2000 мг. В пропорциях активное соединение обычно присутствует в концентрации около 0,5 мкг/мл носителя. В случае композиций, содержащих дополнительные активные ингредиенты, дозировки определяются со ссылкой на обычную дозу и способ введения указанных ингредиентов.

В контексте настоящего описания термины «вектор», «полинуклеотидный вектор», «конструкция» и «полинуклеотидная конструкция» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Полинуклеотидный вектор по настоящему изобретению может быть в любой из нескольких форм, включая, помимо прочего, РНК, ДНК, РНК, инкапсулированную в ретровирусную оболочку, ДНК, инкапсулированную в оболочке аденовируса, ДНК, упакованную в другую вирусную или вирусоподобную форму (такие как простой герпес, и аденоструктуры, такие как полиамиды.

Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или была реципиентом вектора по настоящему изобретению. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и это потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по общему количеству комплемента ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» означает позвоночное животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека.

Используемый в настоящем документе термин «млекопитающее» в целях лечения относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных из зоопарков, спортсменов или домашних питомцев, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи и так далее. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

В данном контексте терапевтическое средство, которое «предотвращает» расстройство или состояние, относится к соединению, которое в статистической выборке снижает возникновение расстройства или состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом, или задерживает начало или уменьшает тяжесть одного или более симптомов расстройства или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом.

Термины «уменьшение», «уменьшенный», «уменьшение» или «ингибирование» используются в настоящем документе для обозначения уменьшения или уменьшения свойства, уровня или другого параметра на статистически значимую величину. В некоторых вариантах реализации «уменьшить», «уменьшение» или «уменьшить» или «ингибировать» обычно означает снижение по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольным уровнем (например, отсутствие данного лечения) и может включать, например, уменьшение по меньшей мере на около 10%, по меньшей мере на около 20%, по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% или более. Используемые в настоящем документе термины «снижение» или «ингибирование» не охватывают полное ингибирование или снижение по сравнению с контрольным уровнем. «Полное ингибирование» представляет собой 100% ингибирование по сравнению с контрольным уровнем. Снижение может быть предпочтительно до уровня, приемлемого для человека без данного расстройства в пределах нормы.

Термины «увеличенный», «увеличивающийся», «улучшающий» или «активирующий» все используются в данном документе для общего обозначения увеличения свойства, уровня или другого параметра на статически значимую величину; во избежание каких-либо сомнений, термины «увеличенный», «увеличивающийся», «усиливающий» или «активируемый» означают увеличение по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольным уровнем, например, увеличение по меньшей мере на около 20%, или по меньшей мере на около 30%, или по меньшей мере на около 40%, или по меньшей мере на около 50%, или по меньшей мере на около 60%, или по меньшей мере на около 70%, или по меньшей мере на около 80%, или по меньшей мере на около 90% или более до и включая увеличение на 100% или любое увеличение на 10-100% по сравнению с контрольным уровнем, или по меньшей мере около в 2 раза, или по меньшей мере около в 3 раза, или по меньшей мере около в 4 раза, или по меньшей мере около в 5 раз или по меньшей мере около в 10 раз увеличение, по меньшей мере около 20-кратное увеличение, по меньшей мере около 50-кратное увеличение, по меньшей мере около 100-кратное увеличение, по меньшей мере около 1000- кратное увеличение или более по сравнению с контрольным уровнем.

Термины «онкологическое заболевание» или «опухоль» в контексте настоящего описания относятся к неконтролируемому росту клеток, который мешает нормальному функционированию органов и систем организма. Субъект, у которого есть онкологическое заболевание или опухоль, представляет собой субъект, имеющий объективно измеримые раковые клетки, присутствующие в теле субъекта. В это определение входят доброкачественные и злокачественные опухоли, а также дремлющие опухоль или микрометастазы. Раковые образования, которые мигрируют из своего первоначального местоположения и засевают жизненно важные органы, могут в конечном итоге привести к смерти субъекта из-за функционального ухудшения пораженных органов. Примеры онкологического заболевания включают, но не ограничиваются ими, B-клеточные лимфомы (лимфомы Ходжкина и/или неходжкинские лимфомы), опухоль головного мозга, онкологическое заболевание молочной железы, онкологическое заболевание толстой кишки, онкологическое заболевание легких, гепатоцеллюлярное онкологическое заболевание, онкологическое заболевание желудка, онкологическое заболевание поджелудочной железы, онкологическое заболевание шейки матки, онкологическое заболевание яичников, онкологическое заболевание печени, онкологическое заболевание мочевого пузыря, онкологическое заболевание мочевыводящих путей, онкологическое заболевание щитовидной железы, онкологическое заболевание почек, карциному, меланому, онкологическое заболевание головы и шеи, онкологическое заболевание мозга, такое как глиобластома, и онкологическое заболевание простаты, включая, помимо прочего, андрогензависимое онкологическое заболевание простаты и андроген-независимое онкологическое заболевание простаты.

Используемый здесь термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству одного или нескольких антител против BAG2 или его фрагментов, или к количеству фармацевтических композиций, содержащих одно или несколько антител против BAG2 или его фрагментов, как раскрыто в настоящем документе. , для уменьшения, по меньшей мере, одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения, и относится к количеству фармакологической композиции, достаточному для обеспечения желаемого эффекта. Фраза «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего описания означает количество композиции, достаточное для лечения расстройства, с разумным соотношением польза/риск, применимым к любому медицинскому лечению.

Используемый в настоящем документе термин «введение» относится к введению агента или композиции, как раскрыто в данном документе, субъекту с помощью метода или пути, который приводит по меньшей мере к частичной локализации агентов или композиции в желаемом месте. «Путь введения» может относиться к любому пути введения, известному в данной области, включая, помимо прочего, пероральный, местный, аэрозольный, назальный, через ингаляцию, анальный, интраанальный, перианальный, трансмукозальный, трансдермальный, парентеральный, энтеральный или местный. «Парентеральный» относится к способу введения, который обычно связан с инъекцией, включая внутриопухолевый, внутричерепной, внутрижелудочковый, интратекальный, эпидуральный, интрадуральный, внутриглазничный, инфузионный, внутрикапсульный, внутрисердечный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрилегочный, внутриспинальный, внутрибрюшинный, внутриоболочечный, внутрисосудистый, внутривенный, внутриартериальный, субарахноидальный, субкапсулярный, подкожный, трансмукозальный или транстрахеальный. При энтеральном введении агент или композиция могут быть в форме капсул, гелевых капсул, таблеток, таблеток с сахарным покрытием, сиропов, суспензий, растворов, порошков, гранул, эмульсий, микросфер или наносфер, липидных пузырьков или полимерных везикул, позволяющих контролировать выпуск. Для местного применения средство или композиция могут быть в форме аэрозоля, лосьона, крема, геля, мази, суспензий, растворов или эмульсий. В одном варианте осуществления агент или композиция могут быть предоставлены в форме порошка и смешаны с жидкостью, такой как вода, с образованием напитка. В соответствии с настоящим изобретением «введение» может быть самостоятельным. Например, это считается «введением» того, что субъект потребляет композицию, описанную в данном документе.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» означает человека или животное. Обычно это позвоночное животное, такое как примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают шимпанзе, яванского макака, паукообразных обезьян и макак, например, резус. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и охотничьи животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, кошачьих, например домашних кошек, и собак, например собак, лис, волков. Термины «пациент», «индивидуум» и «субъект» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В одном из вариантов субъектом является млекопитающее. Млекопитающее может быть человеком, приматом, отличным от человека, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, но не ограничивается этими примерами. Кроме того, описанные в настоящем документе способы можно использовать для лечения домашних животных и/или домашних питомцах. В одном варианте осуществления, субъектом является человек.

«Млекопитающее» в контексте настоящего описания относится к любому члену класса Mammalia, включая, без ограничения, людей и приматов, не относящихся к человеку, таких как шимпанзе и другие виды приматов и обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы, морские свинки и т.п. Термин не обозначает конкретный возраст. Таким образом, предполагается, что взрослые и новорожденные, а также зародыши подпадают под действие этого термина.

Субъектом может быть тот, кому ранее был поставлен диагноз или идентифицирован как страдающий или имеющий состояние, требующее лечения (например, онкологическое заболевание или аутоиммунные заболевания) или одно или более осложнений, связанных с этим состоянием, и, необязательно, уже проходившее лечение состояния или одного или более осложнений, связанных с состоянием. Альтернативно, субъект также может быть тем, у кого ранее не было диагностировано состояние или одно или более осложнений, связанных с этим состоянием. Например, субъектом может быть человек, у которого проявляются один или более факторов риска для состояния, или одно или более осложнений, связанных с состоянием, или субъект, который не проявляет факторов риска. Например, субъектом может быть тот, у кого проявляются один или более симптомов состояния или одно или более осложнений, связанных с состоянием, или субъект, который не проявляет симптомов. «Субъект, нуждающийся» в диагностике или лечении определенного состояния, может быть субъектом, подозреваемым в наличии этого состояния, диагностированным как имеющим это состояние, уже пролеченным или проходящим лечение от этого состояния, не леченным от этого состояния или подверженным риску развития этого состояния.

Под «в группе риска» подразумевается повышенный риск по сравнению с нормальным субъектом или по сравнению с контрольной группой, например, популяция пациентов. Таким образом, субъект, несущий конкретный маркер, может иметь повышенный риск конкретного заболевания или расстройства и быть идентифицирован как нуждающийся в дальнейшем тестировании. «Увеличенный риск» или «повышенный риск» означает любое статистически значимое увеличение вероятности, например, того, что у субъекта есть нарушение. Риск предпочтительно увеличивается по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 20% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с контрольной группой, с которой проводится сравнение.

Термин «статистически значимый» или «значительно» относится к статистической значимости и обычно означает отклонение не менее двух стандартных отклонений (2SD) от контрольного уровня. Термин относится к статистическим свидетельствам того, что существует разница. Он определяется как вероятность принятия решения об отклонении нулевой гипотезы, когда нулевая гипотеза действительно верна.

Используемый здесь термин «совместное введение» относится к введению двух или более терапевтических средств или двух или более терапевтических агентов (например, антитела против BAG2 и дополнительных противораковых препаратов) в пределах 24-часового периода друг от друга для Например, как часть клинической схемы лечения. В других вариантах реализации «совместное введение» относится к введению в течение 12 часов, в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 4 часов, в течение 3 часов, в течение 2 часов, в течение 1 часа, в течение 45, в течение 30 минут, в течение 20, в пределах 15 минут, 10 минут или 5 минут друг от друга. В других вариантах осуществления «совместное введение» относится к введению в одно и то же время, либо как часть одного препарата, либо как несколько препаратов, которые вводятся одним и тем же или разными путями. Например, когда антитело против BAG2 и дополнительная противораковая терапия вводятся в разных фармацевтических композициях или в разное время, пути введения могут быть одинаковыми или разными.

Используемый здесь термин «лечение» представляет собой подход для получения полезных или желаемых клинических результатов. Для целей данного изобретения полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение. состояния болезни и ремиссии (частичной или полной), обнаруживаемой или необнаружимой. «Лечение» также может означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без лечения. «Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже страдает этим заболеванием, а также тех, у которых заболевание необходимо предотвратить. «Паллиатив» заболевания означает, что степень и / или нежелательные клинические проявления болезненного состояния уменьшаются и / или время прогрессирования замедляется или удлиняется по сравнению с ситуацией без лечения.

Используемый здесь термин «химерное» антитело относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, полученные из нечеловеческого иммуноглобулина, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, обычно выбираемые из матрицы человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Патент США №№ 5807715; 4816567; и 4816397.

«Гуманизированные» формы антител, не являющихся человеческим (например, мышиных) представляют собой химерные иммуноглобулины, которые содержат минимальные последовательности, полученные из иммуноглобулина, не относящегося к человеку. В общем, гуманизированное антитело будет включать практически все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или практически все области CDR соответствуют таковым иммуноглобулина, не относящегося к человеку, и все или практически все FR области представляют собой участки последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Способы гуманизации антител известны в данной области техники. См., например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патент США №№ 5530101; 5585089; 5693761; 5693762; и патент США № 6180370 к Queen et al.; EP239400; публикацию PCT WO 91/09967; патент США № 5225539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; и патент США № 5565332.

«Антитело человека» включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или от животных, трансгенных по одному или более иммуноглобулинам человека, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Антитела человека можно получить множеством способов, известных в данной области, включая методы фагового дисплея с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. патент США. №№ 4444887 и 4716111; и публикации РСТ WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; и WO 91/10741. Антитела человека также могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулина человека. См., например, публикации РСТ WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; патент США №№ 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771; и 5939598. Кроме того, такие компании, как LakePharma, Inc. (Белмонт, Калифорния) или Creative BioLabs (Ширли, Нью-Йорк) могут быть привлечены для получения антител человека, направленных против выбранного антигена, с использованием технологии, аналогичной описанной выше. Полностью антитела человека, распознающие выбранный эпитоп, могут быть получены с использованием метода, называемого «управляемый отбор». В этом подходе выбранное моноклональное антитело, не являющееся человеческим, например, мышиное антитело, используется для управления выбором полностью антитела человека, распознающего тот же эпитоп (см. Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

Используемый в данном документе термин «антителоподобная» означает молекулу, которая может быть сконструирована таким образом, чтобы она содержала части антител, но не являлась антителом, которое могло бы встречаться в природе. Примеры включают, но не ограничиваются ими, технологию Т-клеток CAR (химерный антигенный рецептор) и технологию Ylanthia^®. В технологии CAR используется эпитоп антитела, слитый с частью Т-клетки, так что иммунная система организма направлена на атаку определенного целевого белка или клетки. Технология Ylanthia^® состоит из «антителоподобной» библиотеки, которая представляет собой коллекцию синтетических препаратов человека, которые затем подвергаются скринингу на связывание с пептидными эпитопами из белков-мишеней. Выбранные Fab-области можно затем сконструировать в каркас или каркас так, чтобы они напоминали антитела.

В контексте настоящего описания «иммунотерапевтический агент» или «иммуномодулятор» означает агент, разработанный для того, чтобы вызывать или усиливать иммунный ответ или снижать, или подавлять ответ.

В данном контексте «высокая гомология» считается равной по меньшей мере 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 97% идентичности в обозначенной перекрывающейся области между любыми двумя полипептидами.

Удаление горячих точек

Во время производства, хранения и in vivo, терапевтические антитела подвержены риску разложения по ряду путей. Среди наиболее часто встречающихся реакций деградации белков - химическая деградация остатков Asn и Asp. Хотя эти реакции можно держать под контролем с помощью соответствующих условий хранения и приготовления конечной лекарственной субстанции и лекарственного продукта, разложение во время ферментации, последующей обработки и in vivo часто невозможно контролировать в достаточной степени. Если остатки Asn и Asp участвуют в распознавании антигена, их химическое изменение может привести к серьезной потере активности. В нескольких случаях сообщалось, что эти события деградации препятствуют долгосрочному функционированию mAb. In vivo, события деградации белка описаны в связи со старением белка, с раком, вызывающим апоптоз, или с серьезным воздействием на другие биологические функции, например, снижение стабильности бетаA3-кристаллина хрусталика человека, нарушение передачи сигналов MAPK, изменение потенциальной эффективности и специфичности бета-секретазы в процессе образования Abeta или повышение литической активности лизоцима в отношении бактериальных клеток. Идентификация склонных к деградации потенциальных лекарственных препаратов в идеале проводится на ранней стадии процесса разработки лекарственного препарата, чтобы соответствующим образом скорректировать процесс производства и рецептуры или перепроектировать проблемного кандидата для удаления таких горячих точек.

Остатки Asn и Asp разделяют путь деградации, который происходит через образование промежуточного циклического сукцинимида. Сукцинимид образуется в результате дезамидирования Asn или дегидратации Asp путем нуклеофильной атаки азота основной цепи последующей аминокислоты на γ-карбонильную группу боковой цепи Asn/Asp. Метастабильный циклический имид может гидролизоваться по любой из двух своих карбонильных групп с образованием аспартильных или изо-аспартильных связей в различных соотношениях, в зависимости от условий гидролиза и конформационных ограничений. Кроме того, были предложены альтернативные механизмы деградации Asn, такие как нуклеофильная атака карбонильным кислородом основной цепи с образованием циклического изоимида или прямой гидролиз от Asn до Asp. Было описано несколько аналитических методов, в основном чувствительных к заряду, таких как ионообменная хроматография или изоэлектрическое фокусирование, для обнаружения продуктов разложения, то есть сукцинимида, Asp или изоAsp. Наиболее подходящим для количественной оценки и локализации сайтов деградации в белках является анализ с помощью тандемной масс-спектрометрии с жидкостной хроматографией (ЖХ-МС/МС). Ссылка Sydow et al., “Structure-Based Prediction of Asparagine and Aspartate Degradation Sites in Antibody Variable Regions”, PLoS One. 2014; 9(6): e100736. Опубликовано онлайн 24 июня 2014 г. doi: 10.1371/journal.pone.0100736 тем самым включен в данный документ в качестве ссылки во всей своей полноте для раскрытия хорошо установленных знаний о существовании горячих точек на антиген-связывающей области антител и желательности замены таких горячих точек для обеспечения большей стабильности белка.

Один из таких примеров обнаружения и замены «горячей точки» можно увидеть в антителе 3B5. VH CDR 2 представляет собой: YIDPYNGGNTYNRKFKG, однако, горячая точка была обнаружена по присутствию «NG», эта горячая точка удаляется и заменяется на «NA», так что удаленной горячей точкой является YIDPYNAGNTYNRKFKG. Заявитель отмечает, что присутствие Y в начале CDR2 следует рассматривать как часть CDR2. В данной области общепризнанно, что последовательность CDR сохраняет свою связывающую активность, даже если некоторые из последовательностей на N-конце или C-конце укорачиваются или укорочены на несколько аминокислот. Считается, что длина CDR для сохранения активности находится в пределах разумного эксперимента.

Гуманизация антител

Процесс гуманизации антитела хорошо известен, и поэтому для получения гуманизированных антител можно использовать обычные методы. Один иллюстративный протокол может быть следующим:

Моноклональные антитела мыши гуманизируются путем трансплантации CDR, и критические остатки каркаса родительского антитела мыши идентифицируются и вводятся в гуманизированные последовательности. Затем гуманизированные VH/VL преобразуются в полноразмерный формат hIgG1. Варианты выражают с помощью временной трансфекции и очищают с помощью аффинной хроматографии. Очищенные антитела характеризуют с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, ДНС-ПААГ, ИФА и Biacore (определение аффинности). Отбираются лучшие кандидаты с потерей аффинности и активности не более чем в 3 раза.

В процесс гуманизации антител можно включить пять фаз. Во-первых, дизайн гуманизации антитела (возможность удаления горячих точек и дизайн гуманизации антитела) завершается.

Остатки VH/VL CDR определяют и аннотируют с помощью системы нумерации Kabat. Анализ последовательности применяется для выявления основных рискованных горячих точек, включая неспаренные остатки цистеина, сайты N-гликозилирования и сайты дезаминирования в пределах CDR. Для удаления пагубных мотивов горячих точек может потребоваться инженерия. Возможность удаления горячих точек проверяется и выполняется, если в CDR есть горячие точки.

Разработано удаление горячих точек, и относительные мышиные VH и мышиные VL объединяются в несколько химерных антител. Каждое химерное антитело временно экспрессируется в 100 мл клеток 293, и супернатант улавливается и очищается с помощью Mabselect PrismA (GE, 17549801) с записью выхода аффинной очистки. Очищенные химерные антитела тестируют с помощью ДНС-ПААГ и эксклюзионной ВЭЖХ с последующим подтверждением аффинности с помощью ИФА или Biacore. Ранжирование аффинности химерных антител выполняется для подтверждения возможности удаления горячих точек.

Такая гуманизированная последовательность может быть следующей для следующих антител;

3B5 субклон 1: VH регион; подчеркнутый - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTFYWVRQAPGQRLEWIGYIDPYNAGNT

YNRKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYRYGGGGDFDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO:75)

3B5 субклон 1: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIHKVSNRFS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHIPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:76)

3B5 субклон 2: область VH; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTFYWVRQAPGQRLEWIGYIDPYNAGNT

YNRKFKGKVTITVDKSASTAYMELNSLRSEDTAVYYCARGYYRYGGGGDFDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO:77)

3B5 субклон 2: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIHKVSNRFS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHIPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:78)

3B10 субклон 1: область VH; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHAFTNYMIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGT

YNSEKVKGRVTLTADRSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCRIYGNYKGYFDHWGQGTLVTV

SS (SEQ ID NO:79)

3B10 субклон 1: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDMNSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNRLVDGVPSR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNDEFPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:80)

3B10 субклон 2: область VH; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTKYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTNTGE

ATYGEEVKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARLGLRYLDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:81)

3B10 субклон 2: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSDYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHNRELPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:82)

3G8 субклон 1: область VH; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTKYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGE

ATYGEEVKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARLGLRYLDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:83)

3G8 субклон 1: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSDYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHNRELPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:84)

3G8 субклон 2: область VH; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTKYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTNTGE

ATYGEEVKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARLGLRYLDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:85)

3G8 субклон 2: область VL; подчеркнутая - это область CDR после проверки горячей точки.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSDYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHNRELPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:86)

Применение антител к Bag2 для лечения онкологического заболевания

Те антитела, которые ингибируют рост онкологического заболевания или переход в более метастатическое состояние, выбираются для применения в качестве противораковых терапевтических средств и могут вводиться пациенту для лечения или профилактики онкологического заболевания. Выбранные антитела можно дополнительно оптимизировать, например, путем конструирования или получения химерных антител человека или полностью антител человека. Для того, чтобы продемонстрировать эффективность этого подхода,

Обнаружение повышенных уровней Bag2 в образце пациента является диагностикой наличия онкологического заболевания или его прогрессирования до более агрессивного или метастатического состояния. Обнаружение повышенных уровней видов BAG2 в образце пациента будет показателем того, что пациент болен онкологическим заболеванием или находится в группе риска развития онкологического заболевания. Уровни видов BAG2 можно измерить или оценить с помощью ПЦР, схем гибридизации, технологий циклических зондов, FISH, иммуноцитохимии, ИГХ, вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, сэндвич-анализов, анализов ИФА и т.п. Образец пациента может быть образцом жидкости, образцом крови, молока, мочи, клеток, жидкой биопсией, биопсией и т.п. У пациента с диагнозом онкологическое заболевание повышенный уровень BAG2 является показателем повышенного метастатического потенциала. Повышенные уровни BAG2 являются индикаторами онкологического заболевания простаты. Антитела по настоящему изобретению используются для обнаружения BAG2 и используются в качестве диагностического инструмента.

Поскольку клетки и ткани обычно не секретируют BAG2, эффективным способом диагностики онкологического заболевания или диагностики более агрессивной или метастатической формы или перехода к более агрессивной форме является измерение уровней BAG2 в образце, взятом у пациента, из сбор клеток или тканей или из культивируемых клеток по сравнению с уровнями BAG2 в здоровом образце или с уровнями BAG2, которые, как известно, существуют в здоровых взрослых клетках или тканях. Повышенные уровни BAG2 указывают на наличие онкологического заболевания, наличие метастатического онкологического заболевания или начало метастазирования. Образец, анализируемый на наличие BAG2, может представлять собой набор клеток, которые могут быть культивируемыми клеточными линиями или клетками пациента, физиологической жидкостью, образцом крови, образцом ткани или образцом биопсии. Таким образом, диагностический анализ, позволяющий выявить наличие онкологического заболевания или его прогрессирование, включает следующие этапы: 1) получение образца от пациента, страдающего онкологическим заболеванием или подверженного риску развития онкологического заболевания; 2) подвергнуть этот образец анализу, способному обнаруживать или измерять уровни BAG2; 3) сравнение уровней измеренного белка BAG2 в тестируемом образце с уровнями у контрольных пациентов или контрольных клеток; 4) определение того, что уровни BAG2 повышены по сравнению с контролем; и 5) заключение о том, что у донора исследуемой пробы есть онкологическое заболевание или прогрессирование онкологического заболевания, если контроль, с которым сравнивался тест, был получен от донора, у которого ранее было диагностировано онкологическое заболевание.

В этом анализе контрольный образец, с которым сравнивается тестовый образец, может быть незлокачественными клетками, культивированными клетками, образцом от здорового донора, доброкачественным образцом от донора или образцом от донора тестового образца, при этом контрольный образец был взят у донора в предыдущий момент времени. Источником таких образцов может быть любой образец, взятый у пациента, которого проверяют на наличие или прогрессирование онкологического заболевания, включая физиологические жидкости, спинномозговую жидкость, образцы костного мозга, кровь, ткани, клетки, биопсии тканей или клетки, культивированные клетки, полученные из клетки пациента и тому подобное. Источником образца, с которым сравнивается исследуемый образец, могут быть физиологические жидкости, спинномозговая жидкость, образцы костного мозга, кровь, ткани, клетки, биопсии тканей или клетки, или культивированные клетки, которые могут быть получены от здорового донора или испытуемого пациента, при этом образцы были взяты в предыдущий момент времени. Измеренные уровни, с которыми сравнивается тестовый образец, могут быть взяты из ранее записанных данных и скомпилированы в списки для сравнения с тестовыми образцами.

Комбинированная терапия

Первый агент вводят вместе с другим агентом. «В сочетании с» относится к введению одного способа лечения в дополнение к другому способу лечения такому как введение иммуномодулятора, описанного в данном документе, в дополнение к введению антитела к BAG2 или его фрагмента одному и тому же индивиду. Таким образом, «в сочетании с» относится к введению одного способа лечения до, во время или после введения другого способа лечения индивиду. Такие комбинации считаются частью одного режима или схемы лечения.

Иммуномодулирующее средство

Иммуномодулирующие или иммунотерапевтические средства можно условно разделить на четыре категории: ингибиторы контрольных точек, цитокины, агонисты и адъюванты. Ингибиторы контрольных точек работают, блокируя иммунные контрольные точки - «тормоза» иммунной системы, которыми опухоли часто манипулируют, чтобы отключить иммунные реакции и защитить себя. В результате ингибиторы контрольных точек способны вызывать новые иммунные ответы против онкологического заболевания, а также усиливать существующие ответы, способствуя устранению раковых клеток. По состоянию на 2020 год ингибиторы контрольных точек являются, пожалуй, наиболее известными и наиболее успешными иммуномодуляторами, разработанными на данный момент.

Например, путь иммунной контрольной точки PD-1/PD-L1 может отключать Т-клетки, нацеленные на онкологическое заболевание. Однако, когда ингибиторы контрольных точек блокируют путь PD-1/PD-L1, они могут позволить Т-клеткам уничтожать раковые клетки.

Цитокины - это молекулы-мессенджеры, которые регулируют созревание, рост и реакцию иммунных клеток. В настоящее время существует четыре одобренных FDA цитокиновых иммунотерапевтических средств для лечения подгрупп пациентов с онкологическим заболеванием почки, лейкемией, лимфомой, меланомой и саркомой.

Агонисты активируют пути, которые способствуют адаптивным иммунным ответам, либо помогая активировать «киллерные» Т-клетки, которые напрямую атакуют раковые клетки, либо стимулируя активность врожденных иммунных клеток, таких как дендритные клетки, которые координируют общие иммунные ответы против онкологического заболевания, отображая маркеры онкологического заболевания и повышение активности Т-клеток.

Адъюванты активируют пути, задействованные во врожденной иммунной системе, которые могут стимулировать общие иммунные ответы и, в конечном итоге, способствовать адаптивным иммунным ответам. Одна одобренная FDA адъювантная иммунотерапия в настоящее время доступна для лечения подгруппы пациентов с плоскоклеточной карциномой, типом рака кожи.

Примерами таких иммуномодуляторов являются гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 3 (IL- 3), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), лиганд 4-1BB, GITRL, OX-40L, антитело к CD3, антитело к CD27, антитело к CTLA4, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к GITR, антитело к OX-40, антитело к 4-lBB, антитело к LAG-3 и антитело к TIM-3.

Дополнительные способы лечения

Антитела к BAG2 можно использовать в дополнение к другим агентам или средствам лечения, обладающим противораковыми свойствами, или с ними. При дополнительном использовании антитело к BAG2 и другой агент(ы) могут быть составлены вместе в единую комбинированную фармацевтическую композицию или могут быть составлены и введены отдельно, либо по единой скоординированной схеме применения, либо по разным схемам применения. Агенты, вводимые в дополнение к антителам к BAG2 или вместе с ними, обычно будут обладать дополнительными активностями по отношению к антителам к BAG2, так что антитела и другие агенты не влияют отрицательно друг на друга.

Агенты, которые можно вводить в дополнение к антителу к CD40 или вместе с ним, включают, помимо прочего, алкилирующие агенты, ингибиторы ангиогенеза, антитела, антиметаболиты, антимитотики, антипролиферативные препараты, противовирусные препараты, ингибиторы киназы аврора, активаторы пути рецептора смерти, ингибиторы киназы Bcr-Abl, антитела BiTE (привлекающий T-клетки биспецифический активатор), конъюгаты антител с лекарственными средствами, модификаторы биологического ответа, ингибиторы циклин-зависимых киназ, ингибиторы клеточного цикла, ингибиторы циклооксигеназы-2, DVD, ингибиторы рецепторов гомологов вирусных онкогенов (ErbB2) лейкемии, ингибиторы фактора роста, ингибиторы белка теплового шока (HSP)-90, ингибиторы гистоновой деацетилазы (HDAC), гормональную терапию, иммунологические препараты, ингибиторы ингибиторов белков апоптоза (IAP), интеркалирующие антибиотики, ингибиторы киназы, ингибиторы кинезина, ингибиторы Jak2, ингибиторы мишени для рапамицина (mTor) млекопитающих, микроРНК, митоген-активируемые внеклеточные ингибиторы киназы, регулируемой сигналом, нестероидные антибиотик, противовоспалительные препараты (НПВП), ингибиторы поли-АДФ (аденозиндифосфат)-рибозо-полимеразы (PARP), химиотерапевтические препараты платины, ингибиторы тирозинкиназы Брутона (ВТК) (например, ибрутиниб, акалабрутиниб), ингибиторы polo-подобных киназ (Plk), ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), ингибиторы протеасом, аналоги пурина, аналоги пиримидина, ингибиторы рецепторной тирозинкиназы, растительные алкалоиды ретиноидов/дельтоидов, малые ингибирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК), ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы убиквитинлигазы, а также их комбинации и т.п. одного или более из этих агентов.

Примеры иммунологических препаратов включают, но не ограничиваются ими, интерфероны, ингибиторы иммунных контрольных точек и другие иммуностимулирующие агенты. Интерфероны включают интерферон альфа, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон бета, интерферон гамма-1а, интерферон гамма-1b или интерферон гамма-n1, их комбинации и т.п. Ингибиторы иммунных контрольных точек включают антитела, которые нацелены на PD-1 (например, пембролизумаб и ниволумаб), PD-L1 (например, дурвалумаб, атезолизумаб, авелумаб, MEDI4736, MSB0010718C и MPDL3280A) и CTLA4 (например, цитотоксический лимфоцитарный антиген 4; ипилимумаб, тремелимумаб). Иммуностимулирующие агенты включают агонистические антитела к OX40, которые активируют Т-клетки.

Антитело к BAG2 также можно использовать для повышения эффективности лучевой терапии. Примеры лучевой терапии включают внешнюю лучевую терапию, внутреннюю лучевую терапию (например, брахитерапию) и системную лучевую терапию.

Тераностика

Пациентов, у которых диагностирован повышенный уровень секретируемого белка BAG2, затем лечат терапевтическими агентами, которые специфически связываются с BAG2. Таким образом, пациенты, у которых диагностирован повышенный уровень секретируемого BAG2, выиграют от лечения терапевтическими агентами, которые ингибируют BAG2. Таким образом, оценка пригодности лечения онкологического заболевания и введения эффективного количества терапевтического средства для лечения или профилактики онкологического заболевания будет состоять из следующих стадий: 1) получение образца у пациента с подозрением на онкологическое заболевание или с риском развития онкологического заболевания или с риском развития метастатического онкологического заболевания; 2) измерение количества секретируемого BAG2, при котором измеренные уровни значительно выше уровней, измеренных в контрольном образце; 3) определение того, что у пациента присутствует онкологического заболевания или развилось более агрессивное или метастатическое онкологическое заболевания; 4) введение пациенту эффективного количества терапевтического агента, подавляющего экспрессию BAG2. В предпочтительном варианте осуществления терапевтический агент, ингибирующий

Химически модифицированные пептиды

Терапевтические препараты на основе полипептидов или антител могут иметь короткий период полужизни в кровотоке, протеолитическое разложение и низкую растворимость. Для улучшения фармакокинетики и фармакодинамических свойств биофармацевтических препаратов по настоящему изобретению можно использовать такие способы, как изменение аминокислотной последовательности, для уменьшения или увеличения иммуногенности и уменьшения протеолитического расщепления; может быть осуществлено слияние или конъюгирование пептидов с иммуноглобулинами и белками сыворотки, такими как альбумин; также может быть осуществлено включение в носители для доставки лекарственных средств для биофармацевтических препаратов, таких как пептиды по изобретению и антитела, для защиты и замедленного высвобождения; и также предполагается конъюгирование с природными или синтетическими полимерами. В частности, для конъюгирования синтетического полимера также предполагается пэгилирование или ацилирование, такое как N-ацилирование, S-ацилирование и так далее.

Конструкции нуклеиновой кислоты

Также предложен вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, как описано в настоящем документе, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью контроля экспрессии. Также предложена система вектор-хозяин для продукции полипептида, которая включает вектор экспрессии по изобретению, который был введен в клетку-хозяин, подходящую для экспрессии полипептида. Подходящей клеткой-хозяином может быть бактериальная клетка, такая как E.coli, дрожжевая клетка, такая как Pichia pastoris, клетка насекомого, такая как Spodoptera frugiperda, или клетка млекопитающего, такая как клетка COS, HEK или CHO.

Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептидов по изобретению путем выращивания клеток описанной в настоящем документе системы хозяин-вектор в условиях, позволяющих продуцировать полипептид и извлекать полученный таким образом полипептид. Полипептиды, полезные для осуществления настоящего изобретения, могут быть получены экспрессией в прокариотической или эукариотической системе экспрессии.

Рекомбинантный ген может быть экспрессирован, а полипептид очищен с использованием любого количества методов. Ген может быть субклонирован в бактериальный вектор экспрессии, такой как, например, но не в качестве ограничения, pZErO.

Полипептиды могут быть очищены любым способом, который позволяет последующее образование стабильного биологически активного белка. Например, не в качестве ограничения, факторы могут быть извлечены из клеток либо в виде растворимых белков, либо в виде телец включения, из которых они могут быть количественно экстрагированы с помощью 8M гидрохлорида гуанидиния и диализа. Для дополнительной очистки факторов можно использовать любое количество методов очистки, включая, но не ограничиваясь ими, обычную ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на различных сахарах, хроматографию гидрофобного взаимодействия, хроматографию с обращенной фазой или гель-фильтрование.

Любой из способов, известных специалистам в данной области техники, для вставки фрагментов ДНК в вектор может быть использован для конструирования векторов экспрессии, кодирующих полипептиды по изобретению, с использованием соответствующих сигналов контроля транскрипции/трансляции и последовательностей, кодирующих белок. Эти методы могут включать рекомбинантную ДНК in vitro и синтетические методы, а также рекомбинации in vivo (генетическая рекомбинация). Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды по изобретению, может регулироваться второй последовательностью нуклеиновой кислоты, так что полипептид экспрессируется в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой ДНК. Например, экспрессия описанных в настоящем документе полипептидов может контролироваться любым промоторным/энхансерным элементом, известным в данной области техники. Промоторы, которые можно использовать для контроля экспрессии полипептида, включают, но не ограничиваются ими, длинный концевой повтор, как описано у Squinto et al., (1991, Cell 65: 1-20); область раннего промотора SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), промотор ЦМВ, 5'-концевой повтор M-MuLV, промотор, содержащийся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto, et al. al., 1980, Cell 22: 787-797), промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 144-1445), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); прокариотические векторы экспрессии, такие как промотор β-лактамазы (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) или промотор tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25), см. также “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242:74-94; промоторные элементы дрожжей или других грибов, такие как промотор Gal 4, промотор ADH (алкогольдегидрогеназа), промотор PGK (фосфоглицеринкиназа), промотор щелочной фосфатазы и следующие области контроля транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы в трансгенных животных: контрольная область гена эластазы I, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); контрольная область гена инсулина, которая активна в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), контрольная область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), контрольная область вируса опухоли молочной железы мыши, которая активна в тестикулярных, молочных, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), вирус Сендай, лентивирус, контрольная область гена альбумина, которая активна в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), контрольная область гена альфа-фетопротеина, которая активна в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); контрольная область гена альфа-1-антитрипсина, которая активна в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), контрольная область гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); контрольная область гена основного белка миелина, которая активна в клетках олигодендроцитов в головном мозге (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); контрольная область гена легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (Shani, 1985, Nature 314: 283-286), и контрольная область гена гонадотропного рилизинг-гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Таким образом, в соответствии с изобретением векторы экспрессии, способные реплицироваться в бактериальном или эукариотическом хозяине, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, как описано в настоящем документе, используются для трансфекции хозяина и, таким образом, направляют экспрессию такой нуклеиновой кислоты для получения полипептидов, которые затем могут быть выделены в биологически активной форме. В данном контексте биологически активная форма включает форму, способную связываться с соответствующим рецептором и вызывать дифференцированную функцию и/или влиять на фенотип клетки, экспрессирующей рецептор.

Векторы экспрессии, содержащие вставки нуклеиновых кислот, могут быть идентифицированы, без ограничения, по меньшей мере, тремя общими подходами: (а) гибридизацией ДНК-ДНК, (b) наличием или отсутствием функций «маркерного» гена и (c) экспрессией встроенных последовательностей. В первом подходе присутствие чужеродных нуклеиновых кислот, встроенных в вектор экспрессии, может быть обнаружено гибридизацией ДНК-ДНК с использованием зондов, содержащих последовательности, гомологичные встроенным последовательностям нуклеиновой кислоты. Во втором подходе система рекомбинантный вектор/хозяин может быть идентифицирована и выбрана на основе наличия или отсутствия определенных функций «маркерного» гена (например, активности тимидинкиназы, устойчивости к антибиотикам, фенотипа трансформации, образования окклюзионных тел в бакуловирусе и т. д.), вызванные вставкой последовательностей чужеродных нуклеиновых кислот в вектор. Например, если EFL последовательность нуклеиновой кислоты вставляется в последовательность маркерного гена вектора, рекомбинанты, содержащие вставку могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В третьем подходе рекомбинантные векторы экспрессии могут быть идентифицированы путем анализа продукта чужеродной нуклеиновой кислоты, экспрессируемого рекомбинантными конструкциями. Такие анализы могут быть основаны, например, на физических или функциональных свойствах представляющего интерес продукта нуклеиновой кислоты, например, путем связывания лиганда с рецептором или его частью, которая может быть помечена, например, детектируемым антителом или его частью или связыванием с антителами, продуцируемыми к интересующему белку или его фрагменту.

Полипептид, в частности модифицированный по настоящему изобретению, может экспрессироваться в клетках-хозяевах временно, конститутивно или постоянно.

Эффективные дозы, полезные для лечения заболеваний или нарушений, указанных в настоящей заявке, могут быть определены с использованием методов, известных специалисту в данной области техники (см., например, Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975). Фармацевтические композиции для применения согласно изобретению включают полипептиды, описанные выше, в фармакологически приемлемом жидком, твердом или полутвердом носителе, связанные с носителем или нацеливающей молекулой (например, антитело, гормон, фактор роста и т. д.) и/или включенные в липосомы, микрокапсулы и препарат с контролируемым высвобождением перед введением in vivo. Например, фармацевтическая композиция может содержать полипептид в водном растворе, таком как стерильная вода, физиологический раствор, фосфатный буфер или раствор декстрозы. Альтернативно, активные агенты могут содержаться в твердой (например, воск) или полутвердой (например, гелеобразном) композиции, которая может быть имплантирована пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Путь введения может представлять собой любой способ введения, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, внутривенно, интратекально, подкожно, внутриматочно, путем инъекции в пораженную ткань, внутриартериально, интраназально, перорально или через имплантированное устройство.

Введение может привести к распределению активного агента по изобретению по всему телу или в определенной области. Например, в некоторых состояниях, которые затрагивают отдаленные области нервной системы, может быть желательным внутривенное или интратекальное введение агента. В некоторых ситуациях имплант, содержащий активный агент, может быть помещен в поврежденную область или рядом с ней. Подходящие импланты включают, но не ограничиваются ими, импланты на основе гелевой пены, воска, спрея или микрочастиц.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанные в настоящем документе полипептиды в фармакологически приемлемом носителе. Композиции можно вводить системно или местно. Можно использовать любой подходящий способ введения, известный в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, внутривенный, интратекальный, внутриартериальный, интраназальный, пероральный, подкожный, внутрибрюшинный или путем местной инъекции, или хирургического импланта. Также предусмотрены композиции с замедленным высвобождением.

Генная терапия

Генная терапия относится к терапии, проводимой путем введения субъекту экспрессированной или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В этом варианте осуществления изобретения нуклеиновые кислоты продуцируют кодируемый ими белок, который опосредует терапевтический эффект.

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой из способов генной терапии, доступных в данной области техники. Примеры способов описаны ниже.

Общие обзоры способов генной терапии см. в Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); и Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993). Можно использовать способы, широко известные в области технологии рекомбинантных ДНК, описанные в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

Доставка нуклеиновых кислот пациенту может быть либо прямой, в этом случае пациент подвергается прямому воздействию нуклеиновой кислоты или векторов, несущих нуклеиновую кислоту, либо непрямой, в этом случае клетки сначала трансформируются нуклеиновыми кислотами in vitro, затем пересаживают пациенту. Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия in vivo или ex vivo.

В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты вводят непосредственно in vivo, где они экспрессируются с образованием кодируемого продукта. Это может быть выполнено любым из многочисленных способов, известных в данной области техники, например, путем конструирования их как части подходящего вектора экспрессии нуклеиновых кислот и введения его так, чтобы он стал внутриклеточными, например, путем инфицирования с использованием дефектных или ослабленных ретровирусных или других вирусных векторов, или путем прямой инъекции обнаженной ДНК, или покрытия липидами или рецепторами на клеточной поверхности или трансфицирующими агентами, инкапсуляции в липосомы, микрочастицы или микрокапсулы, или путем введения их соединенными с пептидом, который, как известно, проникает в ядро, путем введения конъюгата с лигандом, вызывающим рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (который можно использовать для нацеливания на типы клеток, специфически экспрессирующие рецепторы) и так далее. В другом варианте осуществления могут быть образованы комплексы нуклеиновая кислота-лиганд, в которых лиганд включает фузогенный вирусный пептид для разрушения эндосом, позволяя нуклеиновой кислоте избежать лизосомальной деградации. В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота может быть нацелена in vivo для клеточно-специфического поглощения и экспрессии путем нацеливания на конкретный рецептор. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и включена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

В конкретном варианте осуществления используются вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, который будет использоваться в генной терапии, клонируют в один или более векторов, что облегчает доставку гена пациенту. Лентивирусные векторы, такие как ретровирусные векторы, и другие векторы, такие как аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусы, являются примерами вирусных векторов, которые можно использовать. Ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина.

Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями для доставки генов в респираторный эпителий, потому что они естественным образом инфицируют респираторный эпителий, вызывая легкое заболевание. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовирусов являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы обладают тем преимуществом, что они способны инфицировать неделящиеся клетки. Кроме того, аденоассоциированный вирус (AAV) также был предложен для использования в генной терапии.

Другой подход к генной терапии включает перенос гена в клетки в культуре ткани с помощью таких методов, как электропорация, липофекция, трансфекция, опосредованная фосфатом кальция, или вирусная инфекция. Обычно метод переноса включает перенос селектируемого маркера в клетки. Затем клетки подвергают отбору, чтобы изолировать те клетки, которые поглотили и экспрессируют перенесенный ген. Затем эти клетки доставляются пациенту.

В этом варианте осуществления нуклеиновая кислота вводится в клетку перед введением in vivo полученной рекомбинантной клетки. Такое введение может осуществляться любым методом, известным в данной области техники, включая, помимо прочего, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, инфицирование вирусным или бактериофаговым вектором, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, слияние клеток, опосредованный хромосомами перенос генов, опосредованный микроэлементами клетки перенос генов, слияние сферопластов и так далее. В данной области техники известны многочисленные методы введения чужеродных генов в клетки, и их можно использовать в соответствии с настоящим изобретением при условии, что не нарушаются необходимые онтогенетические и физиологические функции реципиентных клеток. Методика должна обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, чтобы нуклеиновая кислота могла экспрессироваться клеткой и предпочтительно передавалась по наследству и экспрессировалась ее клеточным потомством.

Клетки, в которые может быть введена нуклеиновая кислота для целей генной терапии, включают любой желаемый доступный тип клеток и включают, но не ограничиваются ими, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты; клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты; различные стволовые клетки или клетки-предшественники, в частности гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, например, полученные из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, печени плода и так далее.

В предпочтительном варианте осуществления клетка, используемая для генной терапии, является аутологичной для пациента.

В варианте осуществления, в котором рекомбинантные клетки используются в генной терапии, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, вводятся в клетки таким образом, чтобы они могли экспрессироваться клетками или их потомством, а затем рекомбинантные клетки вводят in vivo для терапевтического эффекта. В конкретном варианте осуществления используются стволовые клетки или клетки-предшественники. Любые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, которые могут быть выделены и поддерживаться in vitro, потенциально могут быть использованы в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения.

В конкретном варианте осуществления нуклеиновая кислота, вводимая для целей генной терапии, включает индуцибельный промотор, функционально связанный с кодирующей областью, так что экспрессия нуклеиновой кислоты может контролироваться путем контроля присутствия или отсутствия соответствующего индуктора транскрипции.

Терапевтическая композиция

Составы терапевтических соединений в основном известны в данной области техники, и можно удобно сослаться на Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA. Например, можно вводить от около 0,05 нг до около 20 мг на килограмм массы тела в день. Режим дозирования может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, можно вводить несколько разделенных доз ежедневно, или доза может быть пропорционально уменьшена в зависимости от необходимости терапевтической ситуации. Активное соединение можно вводить удобным способом, таким как пероральный, внутривенный (если водорастворимый), внутримышечный, подкожный, интраназальный, внутриглазный, внутрикожный или суппозиторный пути или имплантацией (например, с использованием молекул с медленным высвобождением внутрибрюшинным путем или с использованием клеток, например моноцитов или дендритных клеток, сенсибилизированных in vitro и адоптивно перенесенных реципиенту). В зависимости от пути введения может потребоваться покрытие пептида материалом для защиты его от действия ферментов, кислот и других природных условий, которые могут инактивировать указанные ингредиенты.

Например, низкая липофильность пептидов позволит им разрушаться в желудочно-кишечном тракте ферментами, способными расщеплять пептидные связи, и в желудке путем кислотного гидролиза. Для того чтобы вводить пептиды иным путем, чем парентеральное введение, они будут покрыты или введены материалом для предотвращения его инактивации. Например, пептиды можно вводить в адъюванте, совместно с ингибиторами ферментов или в липосомах. Рассматриваемые в настоящем документе адъюванты включают резорцины, неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилполиэтиленовый эфир. Ингибиторы ферментов включают ингибитор трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфат (DEP) и тразилол. Липосомы включают эмульсии CGF типа вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы.

Активные соединения также можно вводить парентерально или внутрибрюшинно. Можно также приготовить дисперсии в глицериновых жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и использования эти препараты содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (если они водорастворимы) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко набрать с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования суперфактантов. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, теомерсала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Продолжительное всасывание композиций для инъекций может быть достигнуто за счет использования в композиции средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций готовят путем включения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем включения различных стерильных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и способ сублимационной сушки, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрованием.

Когда пептиды надлежащим образом защищены, как описано выше, активное соединение можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем, или оно может быть заключено в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, или оно может быть спрессовано в таблетки, или оно может быть включено непосредственно с пищей диеты. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено со вспомогательными веществами и использоваться в форме таблеток для приема внутрь, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 1% масс. активного соединения. Процентное содержание композиций и препаратов может, конечно, варьироваться и обычно может составлять от около 5 до около 80% от массы единицы. Количество активного соединения в таких терапевтически полезных композициях таково, что будет получена подходящая дозировка. Предпочтительные композиции или препараты согласно настоящему изобретению готовят так, чтобы пероральная стандартная лекарственная форма содержала от около 0,1 мкг до 2000 мг активного соединения.

Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. также могут содержать следующее: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; вспомогательные вещества, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; лубрикант, такой как стеарат магния; и может быть добавлен подслащивающий агент, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или ароматизатор, такой как перечная мята, масло грушанки или вишневый ароматизатор. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, помимо материалов вышеуказанного типа, жидкий носитель. Различные другие материалы могут присутствовать в качестве покрытий или иным образом модифицировать физическую форму дозированной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или обоими. Сироп или эликсир могут содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такой как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Конечно, любой материал, используемый для приготовления любой стандартной лекарственной формы, должен быть фармацевтически чистым и практически нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активное соединение может быть включено в препараты и композиции с замедленным высвобождением.

Системы доставки

Известны различные системы доставки, которые можно использовать для введения соединения по изобретению, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, рецептор-опосредованный эндоцитоз, конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровируса или другой вектор и т. д. Способы введения включают, но не ограничиваются ими, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, внутриглазный, эпидуральный и пероральный пути. Соединения или композиции можно вводить любым удобным путем, например инфузией или болюсной инъекцией, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой и кишки и т. д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может быть желательно ввести фармацевтические соединения или композиции по изобретению в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая внутрижелудочковые и интратекальные инъекции; внутрижелудочковой инъекции может способствовать внутрижелудочковый катетер, например, прикрепленный к резервуару, такому как резервуар Ommaya. Также можно использовать легочное введение, например, с помощью ингалятора или распылителя, а также композиции с аэрозольным агентом.

В конкретном варианте осуществления может быть желательным введение фармацевтических соединений или композиций по настоящему изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, неограничиваюсь ими, местной инфузией во время операции, местного применения, например, в сочетании с повязкой на рану после операции, путем инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория, или посредством импланта, при этом указанный имплант представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны, такие как сиалластические мембраны или волокна. Предпочтительно, при введении белка, включая антитело или пептид по настоящему изобретению, необходимо соблюдать осторожность при использовании материалов, в которых белок не абсорбируется. В другом варианте осуществления соединение или композиция могут быть доставлены в везикуле, в частности в липосоме. В еще одном варианте осуществления соединение или композиция могут быть доставлены в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления можно использовать насос. В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, что требует лишь части системной дозы.

Следующие ниже примеры предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения.

Примеры

Пример 1: отбор, секвенирование и реакция антиген-антитело антитела к BAG2

1. Отбор моноклональных антител, направленных на BAG2, и анализ их аминокислотных последовательностей

Авторы изобретения выбрали антитела, нацеленные на BAG2, проанализировали их аминокислотные последовательности, и определили определяющую комплементарность область (CDR) каждого из антител.

Более подробно, ген, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 70, кодирующий белок BAG2 человека, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69 клонировали в плазмиду pCAGGS и линеаризовали, а затем линеаризованную конструкцию инокулировали в мышцы пяти самок мышей BALB/c в возрасте 6 недель с помощью электрошока. Конструкцию вводили внутримышечно трижды с трехнедельными интервалами, и она состояла из 100 мкг ДНК в 100 мкл ФСБ. В это время таким же образом использовали плазмиду контрольной группы. Для получения терапевтических и диагностических антител была проведена более эффективная стратегия иммунизации на основе ДНК-вакцины, чем инъекция антигена на основе белка. Кровь собирали из полой вены или хвостовой вены мыши и исследовали иммуноферментным анализом, показывающим титр сывороточных антител, и через 3 дня после последней иммунизации у мыши, показывающей достаточный титр антител, извлекали селезенки. В-лимфоциты выделяли из селезенки с последующим слиянием с клетками миеломы, культивированными с выделенными В-лимфоцитами, то есть линией клеток SP2/0-Ag14 АТСС, получая тем самым слитые клетки. После культивирования слитых клеток в среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, были получены клетки гибридомы, полученные слиянием клеток миеломы и В-лимфоцитов, и были отобраны около 130 клонов. Из клеток гибридомы, полученных в процессе отбора с помощью иммуноблоттинга, было получено 10 клеток гибридомы, продуцирующих антитела, специфически связывающиеся с BAG2 человека.

Суммарную РНК антител к BAG2 получали из 5x106 клеток гибридомы, а 5'-RACE-кДНК получали из 100 нг общей РНК с использованием набора для амплификации кДНК SMART RACE (Clontech) в соответствии с инструкциями производителя. Кодирующие области вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) амплифицировали с помощью ПЦР, и амплифицированные гены вставляли в вектор pGEM-T (Promega, США), клонировали и анализировали их нуклеотидные последовательности с помощью автоматического генетического анализатора (ABI Prism 310, Applied Biosystem Co.). Нуклеотидные последовательности проанализированных генов были идентифицированы путем сравнения с ранее сообщенной нуклеотидной последовательностью, и идентифицированные нуклеотидные последовательности были искусственно транслированы для использования при определении последовательностей определяющих комплементарность областей VH-CDR1, -CDR2 и -CDR3 и VL-CDR1, -CDR2 и -CDR3. Определение последовательностей определяющих комплементарность областей проводили с использованием базы данных Kabat (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

В результате из клеток гибридомы были получены 10 антител к BAG2, специфически связывающихся с BAG2. 10 антител к BAG2 представляли собой антитела 2A11, 4C2, 8C4, 3B5, 9B3, 9B12, 3B10, 10H7, 3GB и 3F12. Кроме того, были определены аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи, вариабельной области легкой цепи и ее определяющих комплементарность областей, как показано в Таблицах 1-3, и нуклеотидные последовательности генов, кодирующих антитела.

Антитела 2A11, 4C2 и 8C4 включают вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27. В антителе 2A11 56-я и 57-я Xaa из SEQ ID NO: 21 каждая представляет собой Gly и 53-я Xaa SEQ ID NO: 27 представляет собой lie. В антителе 4C2 56-я и 57-я Xaa из SEQ ID NO: 21 представляют собой Gly и Ala, соответственно, и 53-я Xaa из SEQ ID NO: 27 представляет собой Phe. В антителе 8C4 56-я и 57-я Xaa из SEQ ID NO: 21 представляют собой Ala и Gly, соответственно, и 53-я Xaa из SEQ ID NO: 27 представляет собой Phe.

VH-CDR1, -CDR2 и -CDR3 антител 2A11, 4C2 и 8C4 состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 33, 39 и 45 соответственно, и VL-CDR1, - CDR2 и -CDR3 состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 51, 57 и 63 соответственно. В антителе 2A11 56-я и 57-я Xaa из SEQ ID NO: 21 каждая представляют собой - Gly. Что касается антитела 4C2, в SEQ ID NO: 21, 56-я Хаа представляет собой Gly, и 57-я Хаа представляет собой Ala. Что касается антитела 8C4, в SEQ ID NO: 21, 56-я Хаа представляет собой Ala, и 57-я Хаа представляет собой Gly.

Антитела 9B3, 9B12 и 3B10 включают вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29. Что касается антитела 9B3, в SEQ ID NO: 23, 1-я Xaa представляет собой Glu, 7-я Xaa представляет собой Ser, 12-я Xaa представляет собой Val, 27-я Xaa представляет собой Tyr, 58-я Xaa представляет собой Ser, 61-я Xaa представляет собой Asn, 74-я Xaa представляет собой Lys, 83-я Xaa представляет собой Phe, 92-я Xaa представляет собой Ala и 108-я Xaa представляет собой Tyr. Что касается антитела 9B3, в SEQ ID NO: 29, 29-я Хаа представляет собой Ile, 51-я Хаа представляет собой Ala, 79-я Хаа представляет собой Glu и 106-я Хаа представляет собой Ile. Что касается антитела 9B12, в SEQ ID NO: 23 1-я Хаа представляет собой Gin, 7-я Хаа представляет собой Ser, 12-я Хаа представляет собой Val, 27-я Хаа представляет собой Tyr, 58-я Хаа представляет собой Ser, 61-я Хаа представляет собой Asn, 74-я Хаа представляет собой Arg, 83-я Хаа представляет собой Phe, 92-я Хаа представляет собой Gly, а 108-я Хаа представляет собой His. Что касается антитела 9B12, в SEQ ID NO: 29, 29-я Хаа представляет собой Met, 51-я Хаа представляет собой Ala, 79-я Хаа представляет собой Glu, и 106-я Хаа представляет собой Met. Что касается антитела 3B10, в SEQ ID NO: 23, 1-я Xaa представляет собой Gln, 7-я Xaa представляет собой Pro, 12-я Xaa представляет собой Ala, 27-я Xaa представляет собой His, 58-я Xaa представляет собой Thr, 61-я Xaa представляет собой Ser, 74-я Xaa представляет собой Arg, 83-я Xaa представляет собой Leu, 92-я Xaa представляет собой Gly и 108-я Xaa представляет собой His. Что касается антитела 3B10, в SEQ ID NO: 29, 29-я Хаа представляет собой Met, 51-я Хаа представляет собой Ser, 79-я Хаа представляет собой Asp, и 106-я Хаа представляет собой Ile.

Что касается антител 9B3, 9B12 и 3B10, то VH-CDR1, -CDR2 и -CDR3 состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 35, 41 и 47, соответственно, и VL-CDR1, -CDR2 и -CDR3 состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 53, 59 и 65, соответственно. Что касается антитела 9B3, 2-я Хаа из SEQ ID NO: 35 представляет собой Tyr, 8-я Хаа из SEQ ID NO: 41 представляет собой Ser, 12-я Хаа из SEQ ID NO: 47 представляет собой Tyr, 3-я Xaa из SEQ ID NO: 53 представляет собой lie, а 2-я Хаа в SEQ ID NO: 59 представляет собой Ala. Что касается антитела 9B12, 2-я Хаа из SEQ ID NO: 35 представляет собой Tyr, 8-я Хаа из SEQ ID NO: 41 представляет собой Ser, 12-я Хаа из SEQ ID NO: 47 представляет собой His, 3-я Xaa из SEQ ID NO: 53 представляет собой Met, а 2-я Хаа из SEQ ID NO: 59 представляет собой Ala. Что касается антитела 3B10, 2-я Хаа из SEQ ID NO: 35 представляет собой His, 8-я Хаа из SEQ ID NO: 41 представляет собой Thr, 12-я Хаа из SEQ ID NO: 47 представляет собой His, 3-я Xaa из SEQ ID NO: 53 представляет собой Met, а 2-я Хаа из SEQ ID NO: 59 представляет собой Ser.

Таблица 1

Название антитела Нуклеотидная последовательность гена VH Нуклеотидная последовательность гена VL 2A11 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 11 4C2 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 12 8C4 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 13 3B5 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 14 9B3 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 15 9B12 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 16 3B10 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 17 10H7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 18 3G8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 19 3F12 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 20

Таблица 2

Название антитела Аминокислотная последовательность области VH Аминокислотная последовательность области VL 2A11 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 27 4C2 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 27 8C4 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 27 3B5 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 28 9B3 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 29 9B12 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 29 3B10 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 29 10H7 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 30 3G8 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 31 3F12 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 32

Таблица 3

Название антитела Аминокислотная последовательность VH-
CDR1 Аминокислотная последовательность VH- CDR2 Аминокислотная последовательность VH- CDR3 Аминокислотная последовательность VL-CDR1 Аминокислотная последовательность VL-CDR2 Аминокислотная последовательность VL-
CDR3 2A11 SEQ ID
NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID
NO: 45 SEQ ID
NO: 51 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 63 4C2 SEQ ID
NO: 33 SEQ ID
NO: 39 SEQ ID
NO: 45 SEQ ID
NO: 51 SEQ ID
NO: 57 SEQ ID
NO: 63 8C4 SEQ ID
NO: 33 SEQ ID
NO: 39 SEQ ID
NO: 45 SEQ ID
NO: 51 SEQ ID
NO: 57 SEQ ID
NO: 63 3B5 SEQ ID
NO: 34 SEQ ID
NO: 40 SEQ ID
NO: 46 SEQ ID
NO: 52 SEQ ID
NO: 58 SEQ ID
NO: 64 9B3 SEQ ID
NO: 35 SEQ ID
NO: 41 SEQ ID
NO: 47 SEQ ID
NO: 53 SEQ ID
NO: 59 SEQ ID
NO: 65 9B12 SEQ ID
NO: 35 SEQ ID
NO: 41 SEQ ID
NO: 47 SEQ ID
NO: 53 SEQ ID
NO: 59 SEQ ID
NO: 65 3B10 SEQ ID
NO: 35 SEQ ID
NO: 41 SEQ ID
NO: 47 SEQ ID
NO: 53 SEQ ID
NO: 59 SEQ ID
NO: 65 10H7 SEQ ID
NO: 36 SEQ ID
NO: 42 SEQ ID
NO: 48 SEQ ID
NO: 54 SEQ ID
NO: 60 SEQ ID
NO: 66 3G8 SEQ ID
NO: 37 SEQ ID
NO: 43 SEQ ID
NO: 49 SEQ ID
NO: 55 SEQ ID
NO: 61 SEQ ID
NO: 67 3F12 SEQ ID
NO: 38 SEQ ID
NO: 44 SEQ ID
NO: 50 SEQ ID
NO: 56 SEQ ID
NO: 62 SEQ ID
NO: 68

2. Идентификация ответов антиген-антитело антител к BAG2 в клетках онкологического заболевания молочной железы

На Фиг. 1 представлены результаты иммуноблоттинга антител к BAG2, полученных из 10 разных клеток гибридомы мыши. В частности, клетки MDA-MB-231, которые представляют собой клетки онкологического заболевания молочной железы человека, культивировали в среде DMEM (Welgene), содержащей 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при температуре 37 °C. Клетки собирали из лунок и промывали ФСБ и растворяли в растворе лизисного буфера, содержащем 1% Brij 97, 5 мМ ЭДТА, 0,02 М HEPES pH 7,3, 0,15 М NaCl, 1 мМ PMSF, 0,5 мМ NaF, 10 мкг/мл апротинина и 0,2 мМ ортованадата натрия. После 15 минут инкубации на льду ядра удаляли из клеток центрифугированием и собирали супернатанты. К соответствующему количеству супернатантов добавляли 2X буфер для образцов, состоящий из 20% глицерина, 4,6% SOS, 0,125 М трис, pH 6,8, 0,1% бромфенолового синего. Образцы белка по 10 мкг подвергали анализу SOS-PAGE на 12% геле в стандартных условиях с использованием системы mini-Protean II (Bio-Rad Hercules, Калифорния). Для иммунного блоттинга белок переносили на Millipore, мембрану из ПВДФ. Блокирующему раствору, состоящему из 0,1% Твин 20 и 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBS, давали возможность реагировать в течение 1 часа. Впоследствии первичное антитело было разбавлено 1/2000 антитела к BAG2, экстрагированного из культуры клеток гибридомы, а конъюгат козьего антимышиного HRP (Dako), используемый в качестве вторичного антитела, был разбавлен до 1/5000. Фотопроявление на пленке проводили в темноте с использованием реагента EGL (Amersham Pharmacia Biotech) в качестве субстрата. Фотосенсибилизированные полосы сравнивали со стандартными молекулярными маркерами для идентификации полос, соответствующих размеру BAG2.

В результате, как показано на Фиг.1, по сравнению с ab58682 (Abeam), коммерческим поликлональным антителом к BAG2, используемым в качестве положительного контроля, антитела 2A11, 3B5, 3B10, 3F12, 3GB, 4C2, 8C4, 9B3, 9B12 и 10H7 показали реакции антиген-антитело, нацеленные на BAG2.

Затем для картирования домена антигена BAG2, десяти антител, идентифицированных в разделе 1 выше, в клетки вводили вектор GST-Empty (вектор pcDNA3.1 +/GST, NovoPro Bioscience Inc., Китай), который имеет молекулярную массу около 26 кДа, и полученные клетки использовали в качестве отрицательного контроля. Полный вектор GST-Bag, вектор GST-Bag F1, вектор GST-Bag F2, вектор GST-Bag F3 и вектор GST-Bag F4, каждый из которых включает полинуклеотиды, кодирующие белок BAG2 человека, и полинуклеотиды, кодирующие фрагменты белка BAG2, были введены в клетки и клетки с введенными в них векторами культивировали для экспрессии генов, а затем получали клеточные лизаты. Для клеточных лизатов иммуноблоттинг проводили с использованием каждого из 10 антител. Полинуклеотид, кодирующий белок BAG2 человека, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 70. Векторы GST-Bag F1, -Bag F2, -Bag F3 и -Bag F4 состоят из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: с 71 по 74, соответственно.

На Фиг. 2A и 2B представлены результаты иммуноблоттинга для полноразмерного полипептида BAG2 антитела к BAG2 или его фрагмента. На Фиг. 2A представлены диаграммы векторов и белков BAG2 и их фрагментов, а на B представлены результаты иммуноблоттинга. Подробно, иммуноблоттинг выполняли следующим образом: каждый из векторов вводили в клетки HEK293T методом трансфекции липофектамином (Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США), и полученные трансформированные клетки культивировали при температуре 37 ° С в среде DMEM (Welgene), содержащей 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в течение 30 часов, а затем клетки выделяли. Выделенные клетки разрушали с использованием того же метода, который описан для Фиг. 1 и подвергали анализу SOS-PAGE на 12% геле. Для иммуноблоттинга после реакции в течение 1 часа с тем же блокирующим раствором, который описан для Фиг. 1, каждое из 10 очищенных антител к BAG2, имеющих концентрацию 2 мг/мл, использовали в качестве первичного антитела при разведении 1/10000 и приводили в контакт с клетками. Конъюгат козьего антимышиного HRP, используемый в качестве вторичного антитела, использовали при разведении 1/5000, и фотопроявление пленки проводили в темноте с использованием реагента EGL (Amersham Pharmacia Biotech) в качестве субстрата. Для подтверждения размера BAG2 были экспрессированы стандартные размеры молекулярных маркеров.

В результате, как показано на Фиг. 2, каждое антитело к BAG2 было дифференциально связано с полноразмерным полипептидом BAG2 или его фрагментами. В частности, для каждого из 10 антител к BAG2 сигналы обычно детектировались в положении около 50 кДа в клеточных лизатах, полученных с помощью вектора GST-Bag Full. Этот результат показывает, что все эти антитела могут связываться с полноразмерными полипептидами BAG2. Наконец, была идентифицирована область домена BAG2, с которой реагирует каждое антитело к BAG2.

На Фиг. 3 показан домен BAG2, который реагирует с соответствующими антителами к BAG2. Как показано на Фиг. 3, 9B3, 9B12, 3B10 и 10H7 антитела были связаны с N-концом белка BAG2, антитела 2A11, 3B5, 4C2 и 8C4 были связаны со средней частью белка BAG2, а антитела 3F12 и 3GB были связаны с C -концом белка BAG2. N-конец обычно включает область суперспирали из 21-60 аминокислот, а средняя область связана с частью области BNB из 109-189 аминокислот. Следовательно, используя набор антител, которые связываются с разными сайтами, белок BAG2 или его фрагменты, присутствующие в образце, могут быть обнаружены с высокой чувствительностью и специфичностью.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с полипептидом BAG2 или его фрагментами в соответствии с одним аспектом, могут вызывать реакцию антиген-антитело с полипептидом BAG2 или его фрагментом различной длины.

Полинуклеотиды, кодирующие антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, и клетки-хозяева, включая их в соответствии с другим аспектом, можно использовать для получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов.

В соответствии со способом получения антитела или его связывания с антигеном в соответствии с другим аспектом можно эффективно продуцировать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Пример 2. Лекарственное средство и подготовка мышиной модели для способа лечения онкологического заболевания

Десять гибридомных клеточных линий анти-BAG2 очищали из соответствующего культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии на колонках с сефарозным белком A/G в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare Biosciences AB). Контрольный Mu-IgG2a (ATCC, CCL-167^TM) использовали в качестве изотипного контрольного антитела и получали от Американской коллекции типовых культур. Антитела к BAG2 мыши и изотипные контрольные антитела, используемые в исследованиях in vitro и in vivo, получали в условиях отсутствия эндотоксина (<0,01 ЕЭ/мкг) с помощью Nanotools.

Моноклональные антитела к PD-L1 (BioXCell, кат. № BE0101), моноклональные антитела к PD-1 (BioXCell, кат. No. BE0033-2) и моноклональное антитело к CTLA4 (BioXCell, Cat. No. BE0131) готовили в соответствии с инструкциями производителя.

Для подтверждения противоопухолевых эффектов in vivo самцы мышей SPF C57BL/6 и BALB/c возрастом 5 недель были приобретены у Koatech Co. (Южная Корея). Этих мышей содержали в контролируемой комнате при температуре около 22 ^oC, беспрепятственно давая им доступ к пище и воде. Через 1 неделю 2 ×10⁵ клеток линии клеток карциномы молочной железы мыши EMT6 (ATCC, CRL-2755^TM), 5 × 10⁵ клеток линии клеток карциномы легких Льюиса (LLC) (ATCC, CRL1642^TM), 5 × 10⁵ клеток линии клеток карциномы толстой кишки мыши МС38 (Kerafast, ENH204-FP) и 3 × 10⁵ клеток линии клеток колоректального онкологического заболевания мыши CT26 (АТСС, CRL2638^TM) вводили 6-недельным мышам путем подкожной инъекции. В эксперименте использовали мышей в возрасте 7-8 недель через 8-12 дней после инъекции линий клеток EMT6, LLC, MC38 и CT26. Через 1 неделю этим 7-недельным мышам путем внутривенной инъекции в хвост инъецировали 2 × 10⁵ клеток линии клеток меланомы кожи мыши B16-F10-Luc2 (ATCC, CRL-6475-Luc2^TM). В эксперименте использовали 9-недельных мышей через 15 дней после инъекции B16-F10-Luc2. Через 1 неделю 2 ×10⁶ клеток линии клеток аденокарциномы поджелудочной железы мыши PANC02-Luc (профессор Кю Лим, Национальный университет Чунгнам, Республика Корея) ортотопически имплантировали в конец поджелудочной железы 7-недельных мышей. В эксперименте использовали 10-недельных мышей через 16 дней после инъекции клеточных линий PANC02-Luc.

Механизм действия

Белок BAG2, секретируемый опухолью, может связываться с поверхностью лимфоидных, миелоидных и стромальных клеток для обеспечения антииммунитета (адаптивного или врожденного иммунитета) в микроокружении опухоли. Мы предположили, что нейтрализация BAG2 будет нацелена на лимфоидно, миелоидно или стромально-опосредованную иммуносупрессию, в то время как ингибитор иммунных контрольных точек будет восстанавливать функцию анергизированных противоопухолевых Т-клеток и провоспалительные свойства миелоидных клеток.

2.1 Результаты лечения на мышиной модели онкологического заболевания молочной железы

Результаты показывают следующее:

Одно только антитело к BAG2 обладает противоопухолевой активностью на мышиной модели онкологического заболевания молочной железы.

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и антителом к PD-L1 обладает синергической противоопухолевой активностью на мышиной модели онкологического заболевания молочной железы.

Как показано на Фиг. 4a, через 12 дней после инокуляции опухоли мышей BALB/c с опухолью EMT6 рандомизировали по размеру опухоли перед введением лекарственного средства. Мышей лечили антителом 3B10 к BAG2 на 12 день после инъекции опухолевых клеток. Впоследствии, на 14 день, мышам вводили однократную инъекцию антитела к PD-L1.

Как показано на Фиг. 4b и 4c, на 24 день объем опухоли в группе, которой вводили антитело к PD-L1, группе, которой вводили антитело к BAG2, 3B10, и группе, получавшей комбинацию антитела к PD-L1 и 3B10 уменьшился на около 20,2%, около 39,8% и около 70,1% по сравнению с объемом опухоли в изотипной контрольной группе, соответственно. Лечение антителом к PD-1 имело маргинальный эффект на рост опухоли, но лечение вместе с 3B10 значительно ингибировало рост опухоли. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое средство по отдельности.

Как показано на Фиг. 4d, количество опухолеспецифических CD3+/CD8+ Т-клеток (эффекторные клетки памяти убивающие раковые клетки) группы, которой вводили антитело к PD-L1, группы, которой вводили антитело к BAG2 3B10, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3B10, увеличивалось около в 2,4 раза, 2,8 раза и 8,2 раза по сравнению с количеством CD3+/CD8+ Т-клеток в группе изотипного контроля, соответственно. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 активировало опухолеспецифические CD3+/CD8+ Т-клетки в большей степени, чем любое средство по отдельности. Активация может быть прямой или косвенной, т.е. ингибирование клеток-супрессоров.

2.2. Результаты лечения на мышиной модели онкологического заболевания легких

Результаты показывают следующее:

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и ингибиторами иммунных контрольных точек обладает синергической противоопухолевой активностью на мышиной модели онкологического заболевания.

Как показано на Фиг. 5а, мышей C57BL/6 с опухолью LLC первоначально лечили антителом к BAG2 3B10 на 8 день после инъекции опухолевых клеток. Впоследствии, на 14 день, мышам вводили однократную инъекцию антитела к PD-L1.

Как показано на Фиг. 5b и 5c, на 20 день объем опухоли в группе, которой вводили антитело к PD-L1, группе, которой вводили антитело к BAG2, 3B10, и группе, получавшей комбинацию антитела к PD-L1 и 3B10, уменьшился на около 8,7%, около 17,8% и около 62,2% по сравнению с объемом опухоли в изотипной контрольной группе, соответственно. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое средство по отдельности.

Как показано на Фиг. 5d, количество опухолеспецифических CD3+/CD8+ Т-клеток (эффекторные клетки памяти убивающие раковые клетки) группы, которой вводили антитело к PD-L1, группы, которой вводили антитело к BAG2 3B10, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3B10, увеличивалось около в 1,3 раза, 2,8 раза и 6,6 раза по сравнению с уровнем CD3+/CD8+ Т-клеток в группе изотипного контроля, соответственно. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 активировало опухолеспецифические CD3+/CD8+ Т-клетки в большей степени, чем любое средство по отдельности. Активация может быть прямой или косвенной, т.е. ингибирование клеток-супрессоров.

2.3. Результаты лечения на мышиной модели меланомы

Результаты показывают следующее:

Антитело к BAG2 обладает противоопухолевой активностью на мышиной модели метастазирования меланомы в легкое.

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и антителом к PD-L1 обладает синергетической противоопухолевой активностью на мышиной модели метастазирования меланомы в легкое.

Как показано на Фиг. 6а, мышей C57BL/6 с опухолью B16-F10-Luc2 первоначально лечили антителом к BAG2 3F12 на 15 день после внутривенной инъекции опухолевых клеток. Впоследствии, на 23 день, мышам вводили однократную инъекцию антитела к PD-L1.

Как показано на Фиг. 6b и 6c, на 38 день объем опухоли в группе, которой вводили антитело к PD-L1, группе, которой вводили антитело к BAG2, 3F12, и группе, получавшей комбинацию антитела к PD-L1 и 3F12, уменьшился на около 19%, около 54% и около 92% по сравнению с BLI сигналами в изотипной контрольной группе, соответственно. Однократная обработка антителом к PD-1 имела маргинальный эффект на рост опухоли меланомы в легких, но антитело к BAG2 3F12 значительно ингибировало рост опухоли меланомы в легких. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3F12 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое средство по отдельности.

2.4. Лечение колоректального онкологического заболевания

Предпосылки

Микросателлитная нестабильность (MSI) при колоректальном онкологическом заболевании высокой степени (CRC) имеет недостаточность исправления ошибок спаривания (MMR) и повышенные уровни PD-L1, LAG-3 и IDO и положительно реагирует на терапию против запрограммированной смерти (PD). Низкие или микросателлитно-стабильные MSI (MSS) CRC, которые составляют большинство опухолей в клинической практике, не продемонстрировали какую-либо положительную реакцию на ингибирование PD-1. MSS CRC имеет более высокую долю онкогенных мутаций KRAS по сравнению с MSI CRC. Комбинаторный эффект антитела к BAG2 с агентом против PD-1 был изучен на сингенных моделях мышей C57BL/6 (MC38; KRASwt, MSI) и BALB/c (CT26; KRASmut, MSS).

2.4.1. Результаты лечения на мышиной модели колоректального онкологического заболевания типа MSI-высокой степени

Результаты показывают следующее:

Одно только антитело к BAG2 обладает противоопухолевой активностью на мышиной модели колоректального онкологического заболевания с типом MSI-высокой степени.

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и антителом к PD-1 обладает синергической противоопухолевой активностью в мышиной модели CRC.

Как показано на Фиг. 7а, мышей C57BL/6 с опухолью MC38 первоначально лечили антителом к BAG2 3B10 на 8 день после инъекции опухолевых клеток. Впоследствии, на 10 день, мышам вводили однократную инъекцию антитела к PD-1.

Как показано на Фиг. 7b и 7c, на 20 день объем опухоли в группе, которой вводили антитело к PD-1, группе, которой вводили антитело к BAG2, 3B10, и группе, получавшей комбинацию антитела к PD-1 и 3B10, уменьшился на около 43%, около 40,8% и около 86,8% по сравнению с объемом опухоли в изотипной контрольной группе, соответственно. Однократная обработка антителом к PD-1 или антителом к BAG2 3B10 значительно подавляла рост опухоли. Лечение комбинацией антитела к PD-1 и 3B10 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое средство по отдельности.

Как показано на Фиг. 7d, количество опухолеспецифических CD3+/CD8+ Т-клеток (эффекторные клетки памяти убивающие раковые клетки) группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили антитело к BAG2 3B10, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-1 и 3B10, увеличивалось около в 4,4 раза, 3,9 раза и 36,2 раза по сравнению с уровнем CD3+/CD8+ Т-клеток в группе изотипного контроля, соответственно. Лечение комбинацией антитела к PD-1 и 3B10 активировало опухолеспецифические CD3+/CD8+ Т-клетки в большей степени, чем любое средство по отдельности. Активация может быть прямой или косвенной, т.е. ингибирование клеток-супрессоров.

2.4.2. Результаты лечения на мышиной модели колоректального онкологического заболевания типа MSS

Результаты показывают следующее:

Одно только антитело к BAG2 обладает противоопухолевой активностью на мышиной модели колоректального онкологического заболевания с типом MSS.

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и антителом к PD-1 обладает синергической противоопухолевой активностью на мышиной модели CRC типа MSS.

Как показано на Фиг. 8a, мышей BALB/c с опухолью CT26 лечили 250 мкг (низкая доза) или 750 мкг (высокая доза)/мышь антитела к BAG2 3B10, антитела к PD-L1, комбинации 3B10 и антитела к PD-L1 или контрольного антитела на 11 день после инъекции опухолевых клеток. Мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию один раз в два дня до завершения исследования. Наблюдали за ростом опухоли и измеряли объемы опухоли с помощью электронных штангенциркулей в указанные моменты времени.

Как показано на Фиг. 8b и 8c, на 23 день объем опухоли в группе, которой вводили низкую дозу 3B10, группе, которой вводили высокую дозу 3B10, группе, которой вводили антитело к PD-L1, группе, которой вводили комбинацию антитела к PD-L1 и низкую дозу 3B10, и группе которой вводили комбинацию антитела к PD-L1 и высокую дозу 3B10, уменьшился на около 9,1%, около 78,8%, около 17,4%, около 52,2% и около 95,1%, по сравнению с объемом опухоли в изотипной контрольной группе, соответственно. Однократная обработка высокой дозой 3B10 сильно подавляла рост опухолей CT26. Лечение антителом к PD-L1 было гораздо менее успешным в подавлении роста опухоли в качестве единственного агента. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и низкой дозы 3B10 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое средство по отдельности. Более того, комбинированное лечение антителом к PD-L1 и высокой дозой 3B10 показало регресс отдельных опухолей до неопределяемых уровней у большинства обработанных мышей.

Как показано на Фиг. 8d, количество опухолеспецифических CD3+/CD8+ Т-клеток (эффекторных клеток памяти убивающих раковые клетки) группы, которой вводили низкую дозу 3B10, группы, которой вводили высокую дозу 3B10, группы, которой вводили антитело к PD-L1, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-L1 и низкую дозу 3B10, и группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-L1 и высокую дозу 3B10, увеличилось в около 1,4 раза, 3,8 раза, -1,5 раза, 6,6 раз и 8,7 раза по сравнению с уровнем CD3+/CD8+ Т-клеток в группе изотипного контроля, соответственно. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3B10 активировало опухолеспецифические CD3+/CD8+ Т-клетки в большей степени, чем любое средство по отдельности. Активация может быть прямой или косвенной, т.е. ингибирование клеток-супрессоров.

2.5. Результаты лечения на мышиной модели онкологического заболевания поджелудочной железы

Результаты показывают следующее:

Одно только антитело к BAG2 обладает противоопухолевой активностью на мышиной модели онкологического заболевания поджелудочной железы.

Комбинированная терапия антителом к BAG2 и ингибиторами иммунных контрольных точек (антитело к PD-1 и антитело к CTLA4) обладает синергетической противоопухолевой активностью на мышиной модели онкологического заболевания поджелудочной железы.

Как показано на Фиг. 9а, мышей C57BL/6 с опухолью PANC02-Luc лечили 200 мкг (низкая доза)/мышь (с 16 по 32 день) и 400 мкг (высокая доза)/мышь (с 35 дня по 39 день три раза) четырьмя антителами к BAG2 (3B10, 3F12, 3B5 и 3G8) или контрольным антителом после инъекции опухолевых клеток. Мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию три раза в неделю до завершения исследования. С 30 по 39 день мыши получали инъекцию антитела к PD-1 или антитела к CTLA4. Рост опухоли контролировали с помощью визуализации сигнала биолюминесценции (BLI) IVIS на 15, 27 и 39 дни после имплантации.

Как показано на Фиг. 9b, на 40 день интенсивность сигнала BLI групп, которым вводили антитела к BAG2 индивидуально, группы, которой вводили 3B10, группы, которой вводили 3F12, группы, которой вводили 3B5 и группы, которой вводили 3G8, уменьшилась на около 79,3%, около на 68,4%, около 24,8% и около 8,3% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно. Интенсивность сигнала BLI группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3B10, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3F12, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD- 1 и 3B5, и группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3G8, уменьшилась на около на -14,7%, около 95,9%, около 92,8%, около 62,3% и около -10,9% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно. Интенсивность сигнала BLI группы, которой вводили антитело к CTLA4, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3B10, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3F12, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3B5, и группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3G8, уменьшилась на около на -14,5%, около 91,1%, около 85,3%, около 66,3% и около 10,9% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно.

Как показано на Фиг. 9c, на 40 день масса первичной опухоли группы, которой вводили только антитело к BAG2 3B10, группы, которой вводили 3F12, группы, которой вводили 3B5 и группы, которой вводили 3G8, уменьшилась на около 63,8%, около на 56,7%, около 27,8% и около 18,9% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно. Интенсивность сигнала BLI группы, которой вводили только антитело к PD-1, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3B10, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3F12, группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3B5, и группы, которой вводили комбинацию антитела к PD-1 и 3G8, уменьшилась на около на 17,8%, около 85,7%, около 87,4%, около 58,1% и около -24,8% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно. Интенсивность сигнала BLI группы, которой вводили только антитело к CTLA4, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3B10, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3F12, группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3B5, и группы, которой вводили комбинацию антитела к CTLA4 и 3G8, уменьшилась на около на 3,4%, около 76,1%, около 74,2%, около 54,8% и около 29,7% по сравнению с изотипной контрольной группой, соответственно.

Как показано на Фиг. 9b и 9c, однократная обработка 3B10 и 3F12 сильно ингибировала интенсивность сигнала BLI и уменьшала массу первичной опухоли у мышей с опухолью PANC02-Luc, но 3B5 и 3G8 не оказывали значительного ингибирования интенсивности сигнала BLI и не уменьшали массу первичной опухоли мышей. Различный феномен у четырех клонов может быть вызван сродством к перекрестной реактивности с мышью и человеком.

Лечение антителом к PD-1 было гораздо менее успешным в подавлении роста опухоли в качестве единственного агента. Лечение комбинацией антитела к BAG2 (3B10, 3F12 или 3B5) и антитела к PD-1 или антитела к CTLA4 ингибировало рост опухоли в большей степени, чем любое антитело по отдельности. Более того, комбинированное лечение антителом к BAG2 (3B10, 3F12 или 3B5) и антителом к PD-L1 или антителом к CTLA4 уменьшало частоту метастаз в печени, плевру и диафрагму по сравнению с любым антителом по отдельности (Фиг.9d).

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD3+/CD8+ Т-клеток (эффекторные клетки памяти убивающие раковые клетки) группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3BF12, увеличилось около в 1,8 раза, 3,5 раза и 14,2 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD45+/CD3-/CD19+ В-клеток группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3BF12, увеличилось около в -1,1 раза, -1,05 раза и 1,04 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD45+/CD3-/CD49b+ NK (NK-клетки)-клеток группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3F12, увеличилось около в 1,3 раза, 2,1 раза и 3,6 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD45+/CD11b+/Gr1-/F4/80+ макрофагов группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3F12, уменьшилось около в 1,1 раза, 1,7 раза и 2,7 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD45+/CD11b+/Gr1+ MDSC (миелоидных супрессорных клеток) группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3F12, уменьшилось около в 1,07 раза, 1,15 раза и 1,9 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Как показано на Фиг. 9e, количество опухолеспецифических CD45-/CD90.2+ стромальных клеток группы, которой вводили антитело к PD-1, группы, которой вводили 3F12, и группы, получавшей комбинацию, которой вводили антитело к PD-L1 и 3F12, уменьшилось около в -1,06 раза, 1,35 раза и 1,86 раза по сравнению с уровнем в группе изотипного контроля, соответственно.

Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3F12 активировало опухолеспецифические CD3+/CD8+ T-клетки и CD45+/CD3-/CD49b+ NK (NK-клетки)-клетки в большей степени, чем любое средство по отдельности. Но популяция CD45+/CD3-/CD19+ B-клеток не увеличивалась. Лечение комбинацией антитела к PD-L1 и 3F12 уменьшало количество опухолеспецифических CD45+/CD11b+/Gr1-/F4/80+ макрофагов, CD45+/CD11b+/Gr1+ MDSC и CD45-/CD90.2+ стромальных клеток в большей степени чем любой агент в одиночку.

Активация может быть прямой или косвенной, т.е. ингибирование клеток-супрессоров.

Соответственно, 1) антитело к BAG2, как было обнаружено, обладает значительным ингибирующим действием на рост опухоли и метастазирование по сравнению с изотипной контрольной группой. 2) Было обнаружено, что комбинация антитела к PD-L1, антитела к PD-1 и антитела к CTLA4 в качестве ингибиторов иммунных контрольных точек и антител к BAG2 оказывает значительный ингибирующий эффект на опухоль по сравнению с каждым из антитела к PD-L1, антитела к PD-1, антитела к CTLA4 и антитела к BAG2 в отдельности в моделях рака молочной железы, легких, меланомы, колоректального рака и рака поджелудочной железы у мышей.

Следует понимать, что описанные в настоящем документе варианты осуществления следует рассматривать только в описательном смысле, а не в целях ограничения. Описание функций или аспектов в каждом варианте осуществления обычно следует рассматривать как доступное для других аналогичных функций или аспектов в других вариантах осуществления. Хотя один или несколько вариантов осуществления были описаны со ссылкой на графические материалы, специалистам в данной области техники будет понятно, что в них могут быть внесены различные изменения в форме и деталях без отступления от сущности и объема раскрытия, как определено нижеприведенной формулой изобретения.

Следует понимать, что описанные в настоящем документе варианты осуществления следует рассматривать только в описательном смысле, а не в целях ограничения. Описание функций или аспектов в каждом варианте осуществления обычно следует рассматривать как доступное для других аналогичных функций или аспектов в других вариантах осуществления. Хотя один или несколько вариантов осуществления были описаны со ссылкой на графические материалы, специалистам в данной области техники будет понятно, что в них могут быть внесены различные изменения в форме и деталях без отступления от сущности и объема раскрытия, как определено нижеприведенной формулой изобретения.

[Регистрационный номер]

Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13737BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13738BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13739BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий

Регистрационный номер: KCTC13740BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13741BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13742BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13743BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13744BP Дата выхода: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13745BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г. Депозитарий: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологий Регистрационный номер: KCTC13746BP Дата депозита: 28 ноября 2018 г.

Все цитируемые в настоящем документе ссылки включены в настоящий документ в полном объеме.

* * * *

Специалисты в данной области поймут или смогут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, конкретно описанных в настоящем документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Medpacto Inc.

<120> АНТИТЕЛО К BAG2 И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ

<130> 6987-0310

<160> 86

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11-VH

<400> 1

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg

60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact

120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactggtgc tactgcctac

180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac

240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa

300

ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 2

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 4C2-VH

<400> 2

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg

60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact

120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactggtgc tactgcctac

180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac

240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa

300

ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 3

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8C4-VH

<400> 3

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg

60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact

120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactgctgg tactgcctac

180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac

240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa

300

ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 4

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VH

<400> 4

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagtta

60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacacct tttactgggt gaggcagagc

120

catggagaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg taatacttat

180

aaccggaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc

240

atgcatctca acagcctgac atctgaagac tctgcagtct attactgtgc gagagggtac

300

tataggtacg gggggggggg ggactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc

360

tcctca

366

<210> 5

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3-VH

<400> 5

gaggtccagc tgcaacaatc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg

60

tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg

120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttattac

180

aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca aatcctccag cactgcctac

240

atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctgcggtct atttctgtcg gatctatggt

300

aactacaagg ggtactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca

357

<210> 6

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B12-VH

<400> 6

caggtccaac tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg

60

tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg

120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttataac

180

aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca gatcctccag cactgcctac

240

atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctggggtct atttctgtcg gatctatggt

300

aactacaagg ggtactttga ccattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca

357

<210> 7

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10-VH

<400> 7

caggtccaac tgcagcagcc tggagctgag ctggcaaggc ctgggacttc agtgaaggtg

60

tcctgcaagg cttctggcca cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg

120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tacttataac

180

agtgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca gatcctccag cactgcctac

240

atgcagctca gcagcctgac agctgatgac tctggggtct atttctgtcg gatctatggt

300

aactacaagg ggtactttga ccattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca

357

<210> 8

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VH

<400> 8

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc

60

tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa ttcactgggt gaggcaggct

120

ccaggaaagg gttttaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat

180

gcagatgact tcaagggacg gtttgccctc tctttggaaa cctctgccag cactgcctac

240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagatttgac

300

tacggtacta gttactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc

360

tca

363

<210> 9

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VH

<400> 9

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc

60

tcctgcaagg cttctgggta tagcttcaca aagtatggaa tgaactgggt gaagcaggct

120

ccaggaaagg atatcaagtg gatggggtgg ataaacacca acactggaga ggcaacatat

180

ggtgaagagg tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat

240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagattggga

300

ttgaggtacc ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a

351

<210> 10

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VH

<400> 10

caggtgcaac tgcaggagtc aggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc

60

acctgcactg tcactgggta ctccatcacc agtggttata gctggcactg gatccggcag

120

tttccaggaa acaaattgga atggatgggc tacatatatt atagaggtag cactaactac

180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc

240

ctgctgttga aatctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagaggct

300

tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tcagca

336

<210> 11

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11-VL

<400> 11

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc

60

atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg

120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt

180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc

240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct

300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa

336

<210> 12

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 4C2-VL

<400> 12

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc

60

atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg

120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgttct acaaagtttc caaccgattt

180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc

240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct

300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa

336

<210> 13

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8C4-VL

<400> 13

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc

60

atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg

120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgttct acaaagtttc caaccgattt

180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc

240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct

300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa

336

<210> 14

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VL

<400> 14

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc

60

atctcttgca gatccagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg

120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatcc acaaagtttc caaccgattt

180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc

240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tatttctgct ctcaaaatac acatattcct

300

ccgacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaa

336

<210> 15

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3-VL

<400> 15

gaggtccagc tgcaacaatc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg

60

tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg

120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttattac

180

aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca aatcctccag cactgcctac

240

atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctgcggtct atttctgtcg gatctatggt

300

aactacaagg ggtactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca

357

<210> 16

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B12-VL

<400> 16

gacattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact

60

atcacttgca aggcgagtca ggacatgaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca

120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca

180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat

240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag aatgatgagt ttccattcac gttcggctcg

300

gggacaaagc tggaaatgaa g

321

<210> 17

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10-VL

<400> 17

gacattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact

60

atcacttgca aggcgagtca ggacatgaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca

120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt tcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca

180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggactat

240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag aatgatgagt ttccattcac gttcggctcg

300

gggacaaagc tggaaataaa a

321

<210> 18

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VL

<400> 18

gatgtccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagccacc

60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaaccc

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca

180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct

240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacacta ccccgctcac tttcggtgga

300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgtggagga gccagcctcg tggaattcaa g

351

<210> 19

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VL

<400> 19

gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc

60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctgact atagttatat gcactggtac

120

caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct

180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acaataggga gcttcctccc

300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

333

<210> 20

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VL

<400> 20

gatgttttga tgacccaaac tccactcact ttgtcggtta cctttgggca gccagcctcc

60

atctcttgca ggtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gagagacata tttgaattgg

120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac

180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc

240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg

300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa

336

<210> 21

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VH

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (56)..(57)

<223> Xaa представляет собой Gly или Ala

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Glu Thr Xaa Xaa Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Lys Phe Tyr Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VH

<400> 22

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Phe Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VH

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa представляет собой Glu или Gln

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Ser или Pro

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (12)..(12)

<223> Xaa представляет собой Val или Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (27)..(27)

<223> Xaa представляет собой Tyr или His

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (58)..(58)

<223> Xaa представляет собой Ser или Thr

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (61)..(61)

<223> Xaa представляет собой Asn или Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (74)..(74)

<223> Xaa представляет собой Arg или Lys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (83)..(83)

<223> Xaa представляет собой Phe или Leu

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (92)..(92)

<223> Xaa представляет собой Gly или Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (108)..(108)

<223> Xaa представляет собой His или Tyr

<400> 23

Xaa Val Gln Leu Gln Gln Xaa Gly Ala Glu Leu Xaa Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Met Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Xaa Tyr Tyr Xaa Glu Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Xaa Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Xaa Ser Ser Leu Thr Ala Asp Asp Ser Xaa Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Arg Ile Tyr Gly Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Asp Xaa Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VH

<400> 24

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VH

<400> 25

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Ile Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VH

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Leu Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105 110

<210> 27

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VL

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (53)..(53)

<223> Xaa представляет собой Ile или Phe

<400> 27

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Xaa Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Gln Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VL

<400> 28

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Ile Pro Pro Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VL

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (29)..(29)

<223> Xaa представляет собой Met или Ile

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (51)..(51)

<223> Xaa представляет собой Ala или Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (79)..(79)

<223> Xaa представляет собой Glu или Asp

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (106)..(106)

<223> Xaa представляет собой Met или Ile

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Xaa Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Xaa Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Xaa Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Asp Glu Phe Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys

100 105

<210> 30

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VL

<400> 30

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VL

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Asp Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VL

<400> 32

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Phe Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR1

<400> 33

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu

5

<210> 34

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VHCDR1

<400> 34

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr

5

<210> 35

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VHCDR1

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой Tyr или His

<400> 35

Gly Xaa Ala Phe Thr Asn Tyr Met

5

<210> 36

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VHCDR1

<400> 36

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

5

<210> 37

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VHCDR1

<400> 37

Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr Gly

5

<210> 38

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VHCDR1

<400> 38

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser

5

<210> 39

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR2

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(7)

<223> Xaa представляет собой Gly или Ala

<400> 39

Ile Asp Pro Glu Thr Xaa Xaa Thr

5

<210> 40

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VHCDR2

<400> 40

Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Asn

5

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B5-VHCDR2

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> Xaa представляет собой Ser или Thr

<400> 41

Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Xaa

5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VHCDR2

<400> 42

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro

5

<210> 43

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VHCDR2

<400> 43

Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala

5

<210> 44

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VHCDR2

<400> 44

Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr

5

<210> 45

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR3

<400> 45

Thr Arg Gly Lys Phe Tyr Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VHCDR3

<400> 46

Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 47

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VHCDR3

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (12)..(12)

<223> Xaa представляет собой Tyr или His

<400> 47

Arg Ile Tyr Gly Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Asp Xaa

1 5 10

<210> 48

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VHCDR3

<400> 48

Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 49

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VHCDR3

<400> 49

Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VHCDR3

<400> 50

Ala Arg Glu Ala Tyr

5

<210> 51

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR1

<400> 51

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 52

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VLCDR1

<400> 52

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 53

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR1

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa представляет собой Ile или Met

<400> 53

Gln Asp Xaa Asn Ser Tyr

5

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VLCDR1

<400> 54

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 55

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VLCDR1

<400> 55

Lys Ser Val Ser Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 56

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VLCDR1

<400> 56

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 57

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR2

<400> 57

Lys Val Ser

1

<210> 58

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VLCDR2

<400> 58

Lys Val Ser

1

<210> 59

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR2

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой Ala или Ser

<400> 59

Arg Xaa Asn

1

<210> 60

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VLCDR2

<400> 60

Ala Ala Ser

1

<210> 61

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VLCDR2

<400> 61

Leu Ala Ser

1

<210> 62

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VLCDR2

<400> 62

Leu Val Ser

1

<210> 63

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR3

<400> 63

Phe Gln Gly Ser Gln Val Pro Pro Thr

5

<210> 64

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5-VLCDR3

<400> 64

Ser Gln Asn Thr His Ile Pro Pro Thr

5

<210> 65

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR3

<400> 65

Leu Gln Asn Asp Glu Phe Pro Phe Thr

5

<210> 66

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 10H7-VLCDR3

<400> 66

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr

5

<210> 67

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8-VLCDR3

<400> 67

Gln His Asn Arg Glu Leu Pro Pro Thr

5

<210> 68

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3F12-VLCDR3

<400> 68

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

5

<210> 69

<211> 211

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 69

Met Ala Gln Ala Lys Ile Asn Ala Lys Ala Asn Glu Gly Arg Phe Cys

1 5 10 15

Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu

20 25 30

Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Glu Ala Ala Thr Ala

35 40 45

Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val

85 90 95

Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Gln Glu Ser Leu Lys His

100 105 110

Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Asn Lys Phe Leu Asp Asp Leu

115 120 125

Gly Asn Ala Lys Ser His Leu Met Ser Leu Tyr Ser Ala Cys Ser Ser

130 135 140

Glu Val Pro His Gly Pro Val Asp Gln Lys Phe Gln Ser Ile Val Ile

145 150 155 160

Gly Cys Ala Leu Glu Asp Gln Lys Lys Ile Lys Arg Arg Leu Glu Thr

165 170 175

Leu Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ser Asp Lys Ala Ile Lys Leu Leu Glu

180 185 190

His Ser Lys Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Gln Gln Asn Ala Glu Ser

195 200 205

Arg Phe Asn

210

<210> 70

<211> 636

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 70

atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc

60

atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa

120

gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc

180

cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta

240

aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca

300

attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg

360

gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt

420

gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca gttgatcaga agtttcaatc catagtaatt

480

ggctgtgctc ttgaagatca gaagaaaatt aagagaagat tagagactct gcttagaaat

540

attgaaaact ctgacaaggc catcaagcta ttagagcatt ctaaaggagc tggttccaaa

600

actctgcaac aaaatgctga aagcagattc aattag

636

<210> 71

<211> 270

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор GST-Bag F1

<400> 71

atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc

60

atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa

120

gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc

180

cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta

240

aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga

270

<210> 72

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор GST-Bag F2

<400> 72

atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc

60

atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa

120

gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc

180

cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta

240

aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca

300

attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg

360

<210> 73

<211> 450

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор GST-Bag F3

<400> 73

atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc

60

atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa

120

gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc

180

cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta

240

aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca

300

attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg

360

gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt

420

gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca

450

<210> 74

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор GST-Bag F4

<400> 74

atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc

60

atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa

120

gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc

180

cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta

240

aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca

300

attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg

360

gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt

420

gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca gttgatcaga agtttcaatc catagtaatt

480

ggctgtgctc ttgaagatca gaagaaaatt aagagaagat tagagactct gcttagaaat

540

<210> 75

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5 субклон 1: Область VH

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Phe Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 76

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5 субклон 1: Область VL

<400> 76

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 77

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5 субклон 2: Область VH

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Phe Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B5 субклон 2: Область VL

<400> 78

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 79

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10 субклон 1: Область VH

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Met Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Asn Ser Glu Lys Val

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ile Tyr Gly Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10 субклон 1: Область VL

<400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Met Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ser Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Asp Glu Phe Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 81

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10 субклон 2: Область VH

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 82

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3B10 субклон 2: Область VL

<400> 82

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg Glu

85 90 95

Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 83

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8 субклон 1: Область VH

<400> 83

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 84

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8 субклон 1: Область VL

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Asp Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 85

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8 субклон 2: Область VH

<400> 85

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 86

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3G8 субклон 2: Область VL

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Asp Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии и онкологии. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с полипептидом BAG2 или его фрагментом, его получение и применения. Антитело к BAG2 обладает значительным ингибирующим действием на рост опухоли и метастазирование и может быть использовано в качестве терапевтического средства в способе лечения онкологического заболевания, которое представляет собой первичное или метастазирующее онкологическое заболевание. Комбинация ингибиторов иммунных контрольных точек и антител к BAG2 оказывает значительный ингибирующий эффект на опухоль в моделях рака молочной железы, легких, меланомы, колоректального рака и рака поджелудочной железы. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с полипептидом BAG2 или его фрагментом, отличающееся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, где 6й и 7й остатки Xaa в SEQ ID NO: 39 каждый представляют собой Gly, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, где 6й и 7й остатки Xaa в SEQ ID NO:39 представляют собой, соответственно, Gly и Ala, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, где 6й и 7й остатки Xaa в SEQ ID NO:39 каждый представляют собой, соответственно, Ala и Gly, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO: 35 представляет собой Tyr, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, где восьмой остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой Ser, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, где двенадцатый остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой Tyr; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53, где третий остаток Xaa в SEQ ID NO: 53 представляет собой Ile, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO: 59 представляет собой Ala, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO:35 представляет собой Tyr, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, где восьмой остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой Ser, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, где двенадцатый остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой His; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53, где третий остаток Xaa в SEQ ID NO: 53 представляет собой Met, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO: 59 представляет собой Ala, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO: 35 представляет собой His, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, где восьмой остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой Thr, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, где двенадцатый остаток Xaa в SEQ ID NO: 41 представляет собой His; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53, где третий остаток Xaa в SEQ ID NO: 53 представляет собой Met, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, где второй остаток Xaa в SEQ ID NO: 59 представляет собой Ser, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, VH-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44, и VH-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50; и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL-CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, VL-CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62, и VL-CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающее

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 28;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 30;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; или

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 26 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 32.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что антитело является гуманизированным.

5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что горячая точка сконструирована в CDR антитела.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, отличающееся тем, что моноклональное антитело является моновалентным, Fab или одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv).

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, отличающееся тем, что моноклональное антитело является бивалентным.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент продуцируется клеткой гибридомы, выбранной из клеток гибридомы, депонированных с номерами доступа KCTC 13737BP, KCTC 13738BP, KCTC 13739BP, KCTC 13740BP, KCTC 13741BP, KCTC 13742BP, KCTC 13743BP, KCTC 13744BP, KCTC 13745BP и KCTC 13746BP.

9. Меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с полипептидом BAG2 или его фрагментом, включающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, коньюгированное с детектируемой меткой или меткой, способной испускать детектируемый сигнал.

10. Конъюгат, специфически связывающийся с полипептидом BAG2 или его фрагментом, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, слитое с химическим соединением или белком.

11. Конъюгат по п. 10, отличающийся тем, что моноклональное антитело слито с токсином или цитокином.

12. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1.

13. Полинуклеотид по п. 12, отличающийся тем, что полинуклеотид представляет собой вектор.

14. Конъюгат, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащий полинуклеотид по п. 13, конъюгированный с детектируемой меткой или меткой, способной испускать детектируемый сигнал.

15. Клетка-хозяин для продукции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 1, содержащая полинуклеотид по п. 12.

16. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, включающий:

культивирование клетки-хозяина по п. 15; и

выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из полученной культуры.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий мечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

18. Способ лечения онкологического заболевания, которое является первичным или метастазирующим онкологическим заболеванием у индивидуума, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, антитела к BAG2 или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 1, где онкологическое заболевание вызвано повышенными уровнями секретируемого BAG2, и где онкологическое заболевание представляет собой онкологическое заболевание молочной железы, легкого, меланому, колоректальное онкологическое заболевание или онкологическое заболевание поджелудочной железы.

19. Способ по п. 18, включающий совместное введение или последовательное введение существующего терапевтического агента, где существующий терапевтический агент представляет собой иммунотерапевтический агент против онкологического заболевания.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что иммунотерапевтический агент представляет собой ингибитор молекулы иммунной контрольной точки.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что молекула иммунной контрольной точки представляет собой PD-1, PD-L1 или CTLA4.

22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что иммунотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), лиганда 4-1BB, GITRL, OX-40L, антитела к CD3, антитела к CD27, антитела к CTLA4, антитела к PD-1, антитела к PD-L1, антитела к GITR, антитела к OX-40, антитела к 4-lBB, антитела к LAG-3 и антитела к TIM-3.