СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ЦЕЛЬНОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 G01N33/577 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии и клинической лабораторной диагностике, и предназначено для обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии.

Одним из информативных и перспективных биомаркеров, характеризующих критическое состояние организма, является количество циркулирующей в крови внеклеточной ДНК [1, 2, 3, 4, 5].

Основной механизм образования внеклеточной ДНК это апоптоз и/или некроз лейкоцитов, а также выброс ДНК, функционально активированными клетками, в результате нетоза [6], когда при бактериемии в кровяном русле формируются ДНК-сети нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) с целью захвата и киллинга патогенных бактерий [7]. Основным источником ДНК в крови являются лейкоциты. При критических состояниях, таких как сепсис, более 90% внеклеточной ДНК поступает в кровоток в результате формирования НВЛ нейтрофильными гранулоцитами, на долю которых в крови человека приходится около 60% клеток от суммарной лейкоцитарной популяции [8].

Являясь связующим звеном между гибелью лейкоцитов, воспалением и тромбозом, ДНК-сети нейтрофилов, образующиеся при формировании НВЛ, играют решающую роль в патогенезе целого ряда патологических состояний инфекционной и неинфекционной природы [9, 10, 11, 12].

Известны различные подходы к выявлению внеклеточной ДНК, базирующиеся на ее выделении (экстракции) из крови и/или обнаружении непосредственно в крови. Способы экстракции внеклеточной ДНК (патенты RU 2539030, опубл. 2015.01.10; RU 2625503, опубл. 2017.07.14; ЕР 3572531, опубл. 2019.11.27; патент WO 2017173039, опубл. 2016.03.30; ЕР 2426217, опубл. 2012.07.03; US 2014/0093872, опубл. 2013.03.11; WO/2016/168844, опубл. 2016.10.20; WO/2016/028316, опубл. 2016.02.25; WO/2018/137685, опубл. 2018.08.02; WO/2006/128192, опубл. 2006.11.30; WO2011038507, опубл. 2011.04.07) позволяют определять весь спектр циркулирующих в кровяном русле фрагментов ДНК, различающихся по источникам и механизмам образования, длине фрагментов, формам циркуляции и структурным химическим модификациям. Главным недостатком этих методов является трудоемкость и долговременность (не менее 2 ч) исследования, значительный объем исследуемого образца крови (не менее 2-5 мл) и значительное варьирование полученных данных, осложняющее стандартизацию диагностической процедуры крови в клинической практике.

Известен более быстрый способ (патент RU 2715557, опубл. 2020.03.02) обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови, не требующий выделения плазмы и последующей экстракции из нее нуклеиновых кислот, который исключает потерю исследуемого клеточного материала и основан на выявлении с помощью микроскопии ДНК-сетей нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Однако недостатком микроскопического способа детекции ДНК-сетей НВЛ является его субъективность и трудоемкость при анализе сравнительно небольшого числа отдельных клеток.

Известен способ обнаружения нейтрофильных ловушек (патент RU 2384844, опубл. 2010.03.20) при окрашивании акридиновым оранжевым фиксированной на стекле взвеси нейтрофилов, выделенных из периферической венозной крови человека и активированных различными микроорганизмами с последующем исследованием с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Известен способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови (патент RU 2768152, опубл. 2022.03.23), заключающийся в окраске взвеси выделенных на фиколл-верографиновом градиенте плотности популяции нейтрофилов и окрашивании их после бактериальной стимуляции йодистым пропидием с инкубацией с моноклональным антителом CD15, меченным флуоресцентным красителем FITC. Визуализация результата осуществляется с помощью люминесцентной микроскопии с использованием возбуждающего светофильтра с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионного светофильтра с длиной волн 515-700 нм. Главным недостатком способов детекции внеклеточной ДНК, основанных на использовании люминесцентной микроскопии, является необходимость предварительного выделения в градиенте плотности клеток гранулоцитарной популяции из цельной периферической крови и, соответственно, возможность получения информации только по внеклеточной ДНК, образовавшейся в результате формирования НВЛ, без учета фрагментов ДНК, образующихся при гибели лимфоцитов и фагоцитов по типу апоптоза и постапоптотического (вторичного) некроза. Кроме того, эти способы сопряжены с потерей клеток на этапе выделения популяции нейтрофильных гранулоцитов (например, диагностически значимой субпопуляции нейтрофилов низкой плотности с протенетотическим фенотипом, обладающих склонностью к аутолизису - нетозу), трудоемки, а при выполнении количественного анализа не лишены определенного субъективизма.

Устранить недостатки, связанные с потерей исследуемого клеточного материала, длительностью и трудоемкостью цитологического анализа, а также с субъективностью оценки и интерпретации результатов анализа, позволяет проточно-цитофлуориметрический метод оценки нетоза в образцах цельной периферической крови. Известен метод, основанный на детекции ДНК-сетей НВЛ с помощью смеси меченых Alexa Flor700 моноклональных антител к цитруллинированному гистону Н₃ и меченых FITC антител к миелопероксидазе [13]. Однако данный метод также как и методы люминесцентной микроскопии, позволяет детектировать внеклеточную ДНК, высвобождаемую в кровь только при нетозе. ДНК, высвобождаемая из лейкоцитов и других клеток организма при апоптозе или некрозе, в этом случае не учитывается, а сам метод является дорогостоящим.

Задачей заявляемого изобретения является упрощение процедуры подготовки образца к исследованию, сокращение временных затрат, стандартизация условий окраски и последующей детекции внеклеточной ДНК в образцах цельной крови методом проточной цитометрии с целью повышения информативности и достоверности получаемых количественных данных при проведении диагностических исследований крови.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и точной детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови, а также в упрощении технологии подготовки образца к исследованию и снижении себестоимости анализа.

Технический результат достигается способом детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии. Сущность заявляемого способа заключается в использовании проточной цитометрии для выявления в цельной крови фрагментов внеклеточной ДНК за счет добавления в кровь раствора красителя йодистого пропидия при проведении стандартной процедуры иммунофенотипирования лейкоцитов цельной периферической крови флуоресцирующими маркерами CD45-FITC и/или CD95-PE по Lyse/No Wash протоколу [14, 15]. Способ позволяет выявлять в цельной крови внеклеточную ДНК, источником которой могут быть нейтрофилы и различные субпопуляции лейкоцитов, с одновременным определением принадлежности клеток, являющихся источником внеклеточной лейкоцитарной ДНК, к лимфоцитам или фагоцитам, а также с одновременной оценкой интенсивности в этих клетках процессов апоптоза (по экспрессии CD95 и деградации внутриклеточной лейкоцитарной ДНК) и лейкоцитолиза (по экспрессии CD45 и интенсивности бокового светорассеяния).

Принцип заявляемого способа детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии основан на экспериментально установленной способности лизирующего эритроциты раствора (BD FACS Lysing Solution), содержащего смесь 3% диэтиленгликоля, 1% формальдегида и 0,35% метанола, повышать проницаемость цитоплазматических мембран фиксированных лейкоцитов периферической крови для молекул красителя йодистого пропидия. Если при попадании раствора йодистого пропидия в цельную кровь он окрашивает в ней только внеклеточную ДНК клеточного дебриса и нитей ДНК НВЛ, то после добавления к образцу крови лизирующего эритроциты и фиксирующего лейкоциты реагента краситель проникает внутрь лейкоцитов и вступает во взаимодействие с внутриклеточной лейкоцитарной ДНК. В результате, при иммунофенотипировании лейкоцитов в образцах цельной периферической крови по Lyse/No Wash протоколу добавление в кровь йодистого пропидия приводит к окрашиванию в ней как внеклеточной ДНК, так и внутриклеточной лейкоцитарной ДНК. Это позволяет дифференцировать методом проточной цитометрии по интенсивности ДНК-флуоресценции фрагменты внеклеточной ДНК от внутриклеточной ДНК клеток с неповрежденной ципоплазматической мембраной, получать информацию как о присутствии (или отсутствии) в крови внеклеточной ДНК, так и о характере распределения лейкоцитов в образцах цельной крови по клеточному циклу, о наличии в крови лейкоцитов (фагоцитов или лимфоцитов) в апоптозе, несущих внутриклеточную молекулу ДНК на стадии деградации.

Окраска внеклеточной ДНК, высвобождаемой в кровь при нетозе, апоптозе и/или постапоптотическом (вторичном) некрозе, проводится раствором йодистого пропидия в 50 мкл цельной периферической крови одновременно с окраской клеток флуоресцирующими CD-маркерами (CD45-FITC и/или CD95-PE, либо маркерами CD45 и CD95, мечеными другими флуорохромами, совместимыми при проточно-цитометрическом анализе с красителем йодистым пропидием) по стандартной Lyse/No Wash процедуре иммунофенотипирования лейкоцитов с последующим учетом результатов анализа методом проточной цитометрии. Заявляемый способ позволяет быстро выявлять наличие внеклеточной ДНК в крови и проводить мониторинг изменений по данному показателю в условиях in vivo или in vitro. Одновременно с количественной оценкой уровня содержания в крови фрагментов внеклеточной ДНК он обеспечивает возможность характеристики интенсивности процессов апоптоза (по экспрессии CD95 и деградации внутриклеточной лейкоцитарной ДНК) и лейкоцитолиза (по экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 и интенсивности светорассеяния) в популяциях фагоцитов и лимфоцитов, что повышает достоверность и информативность диагностического исследования крови.

Заявляемый способ детекции внеклеточной ДНК в образцах цельной периферической крови может быть использован для:

- прогнозирования состояний, сопровождающихся массивной гибелью нейтрофилов периферической крови по типу нетоза и/или постапоптотического некроза (сепсис, рак, тяжелые травмы, системные аутоиммунные и аллергические заболевания);

- оценки напряженности антибактериального иммунитета, основанной на учете реакций лейкоцитолиза и альтерации нейтрофилов (ППН-тест);

- изучения функциональной активации и гибели клеток крови в условиях моделирования бактериемии in vitro;

- исследования возрастных нарушений регуляции баланса апоптоза и эффероцитоза, сопровождающихся увеличением внеклеточной ДНК в крови.

Его возможности в сравнении с другими известными методами детекции внеклеточной ДНК в периферической крови представлены в таблице.

Способ осуществляется следующим образом: на фосфатном буфере (рН 7,4) готовится раствор красителя (йодистого пропидия) с концентрацией 100 мкг/мл, содержащий 100±0,00002 мкг/мл РНКазы. Этот раствор в количестве 10 мкл одновременно с 10±0,06 мкл меченых FITC моноклональных антител к общему лейкоцитарному антигену (CD45-FITC) и/или 10±0,06 мкл меченых фикоэритрином моноклональных антител к поверхностному фенотипическому маркеру раннего апоптоза (CD95-PE) добавляется к 50±0,15 мкл цельной гепаринизированнной крови, образец тщательно перемешивается на вортексе и инкубируется в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем к образцу добавляется 450±1,0 мкл разведенного деионизованной водой раствора BD FACS Lysing Solution (BD Cat. No 343236), образец перемешивается и инкубируется 30 мин в темноте при комнатной температуре до полного лизиса эритроцитов. Последующий анализ лейкоцитов крови проводится на проточном цитометре непосредственно в BD FACS Lysing Solution, без осаждения и отмывки клеток центрифугированием. Количественный учет результатов проводится в логарифмическом режиме измерения интенсивности ДНК-флуоресценции для обеспечения необходимой чувствительности и разрешающей способности проточно-цитофлуориметрического анализа, без исключения из оценки клеточного дебриса, автоматически дифференцируемого от неповрежденных лейкоцитов по экспрессии CD45 и интенсивности бокового светорассеяния.

Эффективность предлагаемого способа детекции внеклеточной ДНК подтверждается примерами:

Пример 1. Сравнительный анализ содержания внеклеточной ДНК в крови лиц различных возрастных групп.

Сравниваемые образцы крови готовили для анализа заявляемым нами способом и исследовали на проточном цитометре. На фиг. 1 представлен результат анализа крови здоровой молодой женщины 24-х лет (цитограмма А, ДНК-гистограммы А1 и А2) в сравнении с результатом исследования крови пожилой женщины возрастом 63 года (цитограмма Б, ДНК-гистограммы Б1 и Б2). При построении цитограмм А и Б с помощью дискриминатора вводилось ограничение по малоугловому светорассеянию (по размеру регистрируемых цитометром объектов), чтобы в зону анализа, наряду со всеми основными популяциями клеток исследуемого образца, попадал клеточный дебрис, образуемый при лизисе лейкоцитов (клеточные фрагменты с низким уровнем экспрессии CD45), но при этом исключались из анализа сигналы от «теней» эритроцитов, тромбоцитов, бактерий, вирусов и других мелких объектов.

Представленные на фиг. 1 данные свидетельствуют, что в крови пожилой женщины доля клеточного дебриса, положительного по экспрессии лейкоцитарного антигена, составляет 28,42% (Total-R1=100%-71,58%), что в 9 раз выше показателя интенсивности лейкоцитолиза, зарегистрированного при анализе крови молодой женщины (Total-R1=100%-96,83%=3,17%). Анализ ДНК гистограмм позволил зарегистрировать в крови пожилой женщины повышенное содержание внеклеточной ДНК (12,97% сигналов от фрагментов ДНК в области R4 на гистограмме Б1) в сравнении с аналогичным показателем, полученным при анализе крови молодой женщины (2,53% сигналов в области R4 на гистограмме А1).

При гейтировании ДНК-гистограмм по области R1 (то есть, при исключении из анализа зоны дебриса) показатели содержания внеклеточной ДНК снижались соответственно до 5,83% (Б2) и 0,51% (А2). Таким образом, выявляли внеклеточную ДНК, как во фракции целых неповрежденных лейкоцитов, так и во фракции клеточного дебриса, образуемого при лизисе лейкоцитов периферической крови. Причем, подавляющее число внеклеточных флуоресцирующих фрагментов ДНК локализовалось во фракции дебриса.

На фиг. 1 показано повышенное содержание клеточного дебриса и внеклеточной ДНК в крови пожилого человека с хроническим воспалительным заболеванием, где А и Б - это цитограммы распределения лейкоцитов крови по степени гранулярности (интенсивности бокового светорассеяния - Side Scatter (SS)) и уровню экспрессии клетками крови общего лейкоцитарного антигена CD45, на которых целые неповрежденные лимфоциты, моноциты и гранулоциты отделяются в область R1 от клеточного дебриса. ДНК- гистограммы (А1, Б1) и (А2,Б2) были получены в условиях с гейтированием и без гейтирования по R1 соответственно. На каждой из ДНК-гистограмм выделены три области, где по интенсивности ДНК-флуоресценции учитываются: R2 - живые неповрежденные диплоидные лейкоциты;

R3 - апоптотические клетки, несущие внутриклеточную ДНК на стадии деградации;

R4 - фрагменты внеклеточной ДНК, локализованные в крови преимущественно во фракции клеточного дебриса и обладающие слабой интенсивностью ДНК-флуоресценции менее 10 условных единиц.

Пример 2. Детекция внеклеточной лейкоцитарной ДНК в крови больного тяжелой формой COVID-19 и реконвалесцента.

Повышенное содержание в крови нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и внеклеточной лейкоцитарной ДНК служит критерием негативного течения COVID-19 и риска летального исхода [1, 16].

На фиг. 2. показаны результаты анализа образцов крови больного тяжелой формой COVID-19 и реконвалесцента. Применяли заявляемый цитофлуориметрический способ детекции вкДНК, основанный на окраске образцов цельной крови красителем йодистым пропидием, а также способ, который основан на микроскопическом обнаружении в мазках крови нитей ДНК внеклеточных нейтрофильных ловушек. В, B1, В2 - соответствуют образцу крови больного тяжелой формой COVID-19 в острый период развития заболевания. Г, Г1, Г2 - образцу крови реконвалесцента через неделю после завершения лечения тяжелой формы новой коронавирусной инфекции. Фотографии В2 и Г2 иллюстрируют наличие в мазках крови ДНК-сетей нейтрофильных ловушек с адсорсированными в них эритроцитами.

Заявляемый способ детекции внеклеточной ДНК позволял регистрировать наличие большого количества фрагментов внеклеточной лейкоцитарной ДНК в крови больных тяжелой формой COVID-19 (фиг. 2 В1), существенно снижающееся при благоприятном исходе болезни на стадии реконвалесценции (рис. 2 Г1).

Пример 3. Повышение уровня содержания внеклеточной лейкоцитарной ДНК при деградации внутриклеточной ДНК в апоптотических гранулоцитах цельной периферической крови

Известно, что активация апоптоза нейтрофилов в условиях in vitro неизбежно приводит к постапоптотическому аутолизису (вторичному некрозу) этих клеток с высвобождением ядерного содержимого во внеклеточное пространство из-за отсутствия в среде макрофагов,

выполняющих функцию эффероцитоза [17].

Способность предлагаемого способа детекции выявлять изменения в содержании внеклеточной ДНК, связанные с интенсивностью гибели лейкоцитов крови по типу апоптоза, оценивалась in vitro при сравнительном анализе образцов крови доноров, различающихся по относительному количеству в крови гранулоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркер раннего апоптоза (CD95). Кровь инкубировали в течение 6 ч при 37°С. Результаты учитывали до и после инкубации, используя заявленный способ окраски образцов крови красителем иодистым пропидием. Экспрессию CD95 оценивали в гейте гранулоцитов - в клеточной популяции, генетически запрограммированной на быструю гибель по типу апоптоза.

На фиг. 3 представлены гистограммы, свидетельствующие, что после инкубации образца крови с повышенным содержанием клеток, экспрессирующих маркер раннего апоптоза, в нем появлялись в большом количестве апоптотические гранулоциты, несущие ДНК на стадии деградации (22,09% в области R3 гистограммы Д1) и дополнительно повышалось относительное содержание в крови внеклеточных фрагментов молекулы ДНК (до 16,16% в области R4 гистограммы Д1). Этого не наблюдалось в крови другого донора, где изначально не было большого числа гранулоцитов, экспрессирующих фенотипический маркер раннего апоптоза. В результате, в таком образце крови доля апоптотических клеток на стадии позднего апоптоза с молекулой ДНК на стадии деградации была к 6 ч инкубации всего 4,42%, а доля внеклеточных фрагментов ДНК повышалась всего до 6,06% (области R3 и R4 гистограммы Б1).

На фиг. 3 гистограммы Е, К, С, Д - иллюстрируют частотные распределения гранулоцитов по уровню экспрессии на клетку поверхностного фенотипического маркера раннего апоптоза (CD95). Положительные по экспрессии маркера апоптоза клетки локализуются в области R6 каждой гистограммы. Е и К - получены соответственно через 0 ч и 6 ч инкубации крови донора с низким исходным содержанием CD95⁺ гранулоцитов. С и Д - в те же сроки соответственно для крови донора с повышенным содержанием CD95⁺ гранулоцитов. На гистограммах Е1, К1, С1, Д1 (справа) представлены ДНК - гистограммы, соответствующие образцам крови, для которых были получены гистограммы Е, К, С, Д. На каждой из ДНК-гистограмм R2, R3 и R4 - это области, где по интенсивности ДНК-флуоресценции учитываются, соответственно, живые неповрежденные диплоидные лейкоциты, апоптотические клетки, несущие внутриклеточную ДНК на стадии деградации, и фрагменты внеклеточной лейкоцитарной ДНК.

Таким образом, предложенный способ позволяет при работе с образцами цельной крови, используя проточную цитометрию просто, быстро и точно дифференцировать по интенсивности ДНК-флуоресценции фрагменты внеклеточной ДНК от внутриклеточной ДНК клеток с неповрежденной ципоплазматической мембраной, получать информацию как о присутствии (или отсутствии) в крови внеклеточной ДНК, так и о характере распределения лейкоцитов в образцах цельной крови по клеточному циклу, о наличии в крови лейкоцитов (фагоцитов или лимфоцитов) в стадии апоптоза, несущих внутриклеточную молекулу ДНК на стадии деградации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Stawski R, Nowak D., Perdas E. Cell-free DNA: potential application in COVID-19 diagnostics and management. Viruses. 2022,14, 321. https://doi.org/10.3390/v 14020321

2. Филев А.Д., Писарев B.M. Внеклеточная ДНК в медицине неотложных состояний. Журнал им. Н.В. Склифосовского Неотложная медицинская помощь, 2020; 9(1):96-107

3. Филипенко М.Л. Диагностический потенциал внеклеточной ДНК в качестве жидкой биопсии. Вестник РГМУ, 2017; 4:5-13

4. Козлов В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии. Медицинская иммунология, 2013; 15(5):399-412

5. Sandquist M., Wong H.R. Biomarkers of sepsis and their potential value in diagnosis, prognosis and treatment. Expert Rev Clin Immunol., 2014,10:1349-1356

6. Dwivedi D.J., Toltl L.J., Swystun L.L. et. al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Crit. Care, 2012, 16, R151. https://doi.org/10.1186/cc11466

7. McDonald В., Urrutia R., Yipp B.G et al. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 2012; 12(3): 324-33. DOI:10.1016/j.chom.2012.06.011

8. Peters P.L., Pretorius P.J. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA - a new paradigm in genetic behavior. Clin Chim Acta. 2011;412(11-12):806-11. https://doi.org/10.1016/j.cca.2011.01.026

9. Chen Z., Zhang H., Qu M. et al. Review: The emerging role of Neutrophil Extracellular Traps in sepsis and sepsis-associated thrombosis. Front Cell Infect Microbiol. 2021, 11: 653228. DOI:10/3389/fcimb.2021.653228

10. De Meo M.L., Spiler J.D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Seminar in Immunology. Available online 4 Feb. 2022. DOI:10.1016/j.smim.2022.101595

11. Нурбаева К.С., Решетняк Т.М., Лила A.M. Нетоз в патогенезе антифосфолипидного синдрома и системной красной волчанки. Современная ревматология. 2021;15(5):96-102. DOI: 10.14412/1996-7012-2021-5-96-102.

12. Morrissay S., Geller А.Е., Ни X. et al. A specific low-density neutrophil population correlates with hypercoagulation and disease severity in hospitalized COVID-19 patients. J. Clin. Investig. Insight. 2021; 10;6(9):e148435. https:// insight, jci.org/articles/view/1

13. Gavilet M., Martinod K., Renella R. et al. Flow cytometric assay for direct quantitation of neutrophil extracellular traps in blood samples. Am.J. Hematology. 2015; 90(12): 1155-1158. DOI: 10.1002/AJH.2418548435

14. Direct Immunofluorescence Staining of Whole Blood using a Lyse/No-Wash Procedure. BD Bioscience Resources and Tools. Available at: https://www.bdbioscience.com/en-us/resources/protocols/stain-lyse-no-wash

15. Vera E.J., Chew Y.V., Nicholson L. et al. Standartization of flow cytometry for whole blood immunophenotyping of islet transplant and transplant clinical trail recipients. PLoS ONE.2019; 14(5):e0217163. https:// doi.org/10.1371/journal pone.0217163

16. Кассина Д.В., Василенко И.А., Гурьев A.C. и др. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: значение для диагностики и прогноза COVID-19. Альманах клинической медицины. 2020; 48(S1):S43-50.

17. Silva М.Т. Bacteria-induced phagocyte secondary necrosis as a pathogenicity mechanism. J. Leukocyte Biology. 2010; 88(5): 885-896. DOI: 10.1189/jlb.0410205

Изобретение относится к области лабораторной диагностики. Описан способ детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии. Способ предусматривает приготовление раствора красителя йодистого пропидия с концентрацией 100 мкг/мл, содержащего 100 мкг/мл РНКазы, одновременное добавление 10 мкл раствора йодистого пропидия и 10 меченых FITC моноклональных антител к общему лейкоцитарному антигену CD45-FITC и/или 10 мкл меченых фикоэритрином моноклональных антител к поверхностному фенотипическому маркеру раннего апоптоза CD95-PE к 50 мкл цельной гепаринизированнной крови, перемешивание и инкубацию образца в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Следом идёт добавление к образцу 450 мкл разведенного в 10 раз деионизованной водой раствора BD FACS Lysing Solution (BD Cat. No 343236), перемешивание и инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин, с последующим проведением цитометрического ДНК-анализа по Lyse/No Wash протоколу. Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и точной детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови, а также в упрощении технологии подготовки образца к исследованию. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ детекции внеклеточной ДНК в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии предусматривающий приготовление раствора красителя йодистого пропидия с концентрацией 100 мкг/мл, содержащего 100 мкг/мл РНКазы, одновременное добавление 10 мкл раствора йодистого пропидия и 10 меченых FITC моноклональных антител к общему лейкоцитарному антигену CD45-FITC и/или 10 мкл меченых фикоэритрином моноклональных антител к поверхностному фенотипическому маркеру раннего апоптоза CD95-PE к 50 мкл цельной гепаринизированнной крови, перемешивание и инкубацию образца в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, последующие добавление к образцу 450 мкл разведенного в 10 раз деионизованной водой раствора BD FACS Lysing Solution (BD Cat. No 343236), перемешивание и инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин, с последующим проведением цитометрического ДНК-анализа по Lyse/No Wash протоколу.