СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ АБСЦЕССА ЛЕГКОГО ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования развития абсцесса легкого у больных с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Нагноительные заболевания легких остаются одной из ведущих патологий среди всех заболеваний органов дыхания. У этих больных наблюдается нарушение дренажной функции бронхов и наличие вторичного иммунодефицита. Выявление степени иммунодефицита и его характеристик должно быть оценено как фактор ранней оценки риска развития абсцесса легкого при хронической обструктивной болезни.

Известен способ прогнозирования течения неспецифических заболеваний легких, в котором исследуют бронхиальный секрет и/или мокроту с помощью микробиологических методов. Определяют количество условно-патогенных бактерий, патогенных бактерий и грибов рода Candida, оценивая каждый показатель в баллах. При сумме баллов 0-2 прогнозируют ремиссию неспецифических заболеваний легких, при 3-5 - обострение пневмонии с благоприятным течением, при 6-8 баллах - хроническую пневмонию с бронхоэктазами и абсцедированием или хроническую пневмонию с неблагоприятным течением, при 9-12 баллах - выраженный иммунодефицит и наличие злокачественных новообразований в легких (патент РФ №2121675, 1998).

Описан способ прогнозирования стабильного течения хронической обструктивной болезни легких (патент РФ №2262889 от 27.10.2005), в котором измеряют объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) в литрах, определяют изменения объема форсированного выдоха за первую секунду (ΔОФВ1) в % от исходной величины после бронхопровокационной фармакологической пробы с 0,1% раствором ацетилхолина хлорида, решают дискриминантное уравнение: Д=2.94ОФВ1+1.34ΔОФВ1 и при величине Д больше - 19.34 прогнозируют стабильное течение ХОБЛ.

Известен способ прогнозирования течения хронических неспецифических воспалительных заболеваний бронхов. Биоптат слизистой бронхов культивируют в среде N 199, содержащей пенициллин, стрептомицин и сыворотку крови больного, фрагменты ткани переносят на поверхность миллипорового диска и помещают в термостат. Через 10 дней фильтры с культурами фиксируют и окрашивают, подсчитывают число аномальных клеток в колониях. Оценку и прогноз проводят по интенсивности роста культур и числу аномальных клеток (авторское свидетельство СССР N 1409944, 1988). Однако данный метод является травматичным при взятии биопсии и достаточно трудоемким, так как требует специальных сред, соблюдения строгой стерильности и не учитывает вид возбудителя. Кроме того, использование данных антибиотиков уже не актуально.

Известен способ прогнозирования затяжного течения острых пневмоний (авторское свидетельство СССР N 1833718, 1993), в котором определяют степень воспаления в цитограмме жидкости бронхоальвеолярного лаважа, наличие гемолитического стрептококка в мокроте, срок начала болезни, длительность лихорадки и сопутствующий бронхит; после чего рассчитывают коэффициент пневмонии с учетом 2-балльной оценки показателей по предложенной ими формуле и при значениях коэффициента более 1,5 прогнозируют переход к затяжному течению на 10-14 день заболевания. Указанный способ учитывает роль микроорганизмов, возбудителей пневмонии при малом спектре излучаемых микроорганизмов (только гемолитические стрептококки), к тому же не производится расшифровка вида стрептококка: Str. гр. A, Str. гр. В или Str. pneumoniae.

Известно, что возбудителями данных заболеваний являются также Haemophillus influenzae, St. aureus, Kl.pneumoniae и другие условно-патогенные микроорганизмы особенно в ассоциации, в том числе с грибами рода Candida, следовательно, если не выделяется из мокроты гемолитический стрептококк, а воспалительный процесс в легких обусловлен указанными выше микроорганизмами, обеспечивающими довольно обширные патологические процессы, прогноз течения пневмонии представляется недостаточным.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования затяжного течения острой пневмонии по определению 2,3-дифосфоглицериновой кислоты в эритроцитах крови больного в первые 14 дней заболевания. При снижении содержания указанного показателя менее определенного уровня в 1 г гемоглобина прогнозируют затяжное течение острой пневмонии (авторское свидетельство СССР N 1544380, 1990). Недостатком указанного способа является довольно трудоемкая методика по выделению эритроцитов, определению биохимических показателей и не оценивается значимость этиологического агента возбудителя.

К числу осложнений внебольничной пневмонии относятся: 1) плевральный выпот, 2) эмпиема плевры, 3) деструкция/абсцедирование легочной ткани, 4) острый респираторный дистресс - синдром, 5) острая дыхательная недостаточность, 6) септический шок, 7) вторичная бактериемия, сепсис, гематогенные очаги отсева, 8) перикардит, миокардит, нефрит и др. При этом особое значение имеют гнойно-деструктивные осложнения заболевания (абсцессы) (Синопальников А.И., Козлов Р.С., 2006).

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования развития абсцесса легких у больных при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Технический результат - получение критериев прогнозирования возможности развития абсцесса легкого у больных хронической обструктивной болезнью.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: в крови больных с ХОБЛ, взятой натощак из вены, определяют содержание лейкоцитов, палочкоядерных нейтрофилов (п/я), IgG, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов, процент лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза), фагоцитарный индекс. Общее количество лейкоцитов оценивают с использованием гематологического анализатора AcTDiff2 (Beckman Coulter, США). Подсчет лейкоформулы осуществляют традиционным способом в мазках крови, фиксированных по Мей-Грюнвальду и окрашенных красителем Романовского-Гимза с помощью микроскопа JENAMED 2, под иммерсией (10×100).

Определяют фагоцитарный индекс (ФИ - процент поглотивших объекты лейкоцитов из числа потенциальных фагоцитов клеток) (Новиков Д.К, Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. - Москва - Витебск, 1996. - 261 C., Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях: Методические рекомендации для научных работников и врачей практического здравоохранения / Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин // Иммунология. - 1992. - №6. - С.51-52).

Уровни содержания сывороточного IgG определяют иммунохимическим методом с помощью биохимического анализатора SYNCHRON СХ 5 PRO (Beckman Coulter).

В данной работе используют метод определения ЦИК, описанный В.В.Меньшиковым (1987) в модификации научно-исследовательской лаборатории клинического и гуморального иммунитета Всероссийского Центра Экстренной и Радиационной Медицины МЧС РОССИИ, Санкт-Петербург. Исследуемые сыворотки крови разводят боратным буфером рН 8,4, вносят по 200 мкл в лунки плоскодонного планшета для ИФА и добавляют равные объемы растворов ПЭГ 6000 в концентрации -7% для определения высокомолекулярных ЦИК. Инкубируют 1 час при комнатной температуре на шейкере. Учет результата проводят на планшетном цитофлюориметре для ИФА Multiskan EX (Финляндия) при длине волны 630 нм, выражали в условных единицах по разнице оптической плотности (ОП) в опытных (содержащих ПЭГ) лунках и контрольных (без добавления ПЭГ).

Оценка апоптоза (программированной клеточной гибели) лимфоцитов

Анализ проводят с использованием метода окрашивания ДНК клетки с помощью проточного цитофлюориметра. Одним из флуоресцентных красителей. Основное свойство ДНК-флюорохромов - это стереохимическое связывание, т.е. количество молекул связавшегося красителя строго пропорционально количеству ДНК в клетке. Одним из соединений, обладающих способностью окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты, является йодистый пропидий. В данной работе используют метод оценки апоптоза по структурным изменениям ядерной ДНК путем окрашивания клеток йодистым пропидием (Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. / Екатеринбург, 2008, 59 с.).

Принцип метода. Типичная гистограмма, получаемая при окраске ДНК йодистым пропидием. Покоящиеся клетки (G0) и клетки, находящиеся в предсинтетической фазе клеточного цикла (G1), содержат количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом (2N); на гистограмме это отражается в виде так называемого диплоидного (G0+G1) пика. В премитотической фазе (G2) и фазе митоза (М) число хромосом и содержание ДНК удваиваются (4N), что отражается в виде С2+М-пика. В фазе синтеза S содержание ДНК колеблется от 2N до 4N. Содержание ДНК в сравнении с клетками, находящимися в G0 и G1 фазах клеточного цикла, в апоптотирующих клетках после соответствующей обработки (преципитирующие фиксаторы, отмывание) снижается, что выражается в появлениях на гистограммах так называемого гиподиплоидного (<2 N) пика. Этот пик называют также «суб-(G0+G1)-пиком». Стереохимический характер связывания ДНК-флюорохрома позволяет проводить четкие количественные параллели между интенсивностью флюоресценции и содержанием ДНК.

Используют следующий протокол оценки негативного (апоптоз) и позитивного (активация) состояния внутриклеточной ДНК, определяемого путем окрашивания клеток йодистым пропидием (PI).

Мононуклеары выделяют по методу Boyum A.et al.(1968). 2 мл крови разводят ФСБР в соотношении 1:1 и осторожно наслаивали на 2,5 мл среды для выделения лимфоцитов плотностью 1,077 г/см (Lympholite, Cedarlane Lab., Canada). Пробирки центрифугируют при 400 g в (1300 об/мин) в течение 30 мин на центрифуге Jouan B3.11 (Франция). Полученную интерфазу (опалесцирующее кольцо, содержащее мононуклеары) переносят в чистую пробирку, клетки дважды отмывают 5-кратным объемом ФСБР (400 g - 10 мин) и ресуспендировали в 1 мл ФСРБ. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева с использованием светового микроскопа JENAMED 2. Осадок клеток, ресуспендированный в малом (100 мкл ФСРБ), содержащий 5×10⁵ мононуклеаров, фиксируют в 9-кратном количестве ледяного 96° этанола и хранят в холодильнике (-20°С до окрашивания).

Процедуру окрашивания проводят в стандартных пробирках для цитометрии. Клетки отмывают после этанола ФСБР и ресуспендируют в красящем растворе, содержащем 0,005% йодистого пропидия, 0,1% цитрата Na, 0,1% Тритона X100. Непосредственно перед проведением процедуры к красящему раствору добавляют РНК-азу (Sigma) в концентрации 50 мкг/мл для удаления примесей двуспиральной РНК в образцах.

Анализ полученных образцов проводят в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм), с использованием логарифмического канала флюоресценции.

При значениях содержания лейкоцитов выше 9.5·10⁹, палочкоядерных нейтрофилов выше 2.67%, IgG выше 14.8 г/л, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов выше 10.6 у.е., процента лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза) выше 2.0, фагоцитарного индекса выше 55.6 прогнозируют развитие абсцесса легкого.

Было произведено исследование, в котором в крови больных с ХОБЛ (30 чел.) и больных абсцессом легкого (30 чел.), возникшего на фоне ХОБЛ, взятой натощак из вены, определяли содержание лейкоцитов. Абсолютное число лимфоцитов, нейтрофилов (юные, палочкоядерные, сегментоядерные), лимфоциты, моноциты, эозинофилы, базофилы, субпопуляции лимфоцитов (CD3+CD16-, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD4+/ CD8+, CD19+, CD3-CD16+, CD3+CD16+, CD3-CD8+, CD4+CD25+, CD25+ CD4+95+, CD95+, CD4+HLADR+, HLADR+, CD45RO+CD4+, CD45RA+CD4+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+, CD19+CD23+), исследовалась функциональная активность лимфоцитов (спонтанная пролиферация, ответ на PWM, ответ на Конвалин А (СоnА), ответ на Фитогемагглютинин), апоптоз лимфоцитов, фагоцитоз, метаболическая активность в НСТ-тесте, уровень сывороточных иммуноглобулинов, Циркулирующие Иммунные Комплексы (ЦИК), ИЛ-6.

Результаты исследования показали, что уровень этих показателей у лиц, подверженных развитию абсцесса при ХОБЛ, имеет следующие закономерности: из всех показателей у больных абсцессом легкого по сравнению с больными хронической обструктивной болезнью наиболее повышены следующие: лейкоциты, палочкоядерные нейтрофилы, процент лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза), фагоцитарный индекс, IgG, высокомолекулярные циркулирующие иммунные комплексы.

Полученные результаты стали основанием к рекомендации учета уровня лейкоцитов, палочкоядерных нейтрофилов, процента лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза), фагоцитарного индекса, IgG, высокомолекулярных ЦИК и при значениях: лейкоцитов - выше 9.5·10⁹, палочкоядерных нейтрофилов - выше 2,67%, процента лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза) - выше 2,0, фагоцитарного индекса - выше 55,6, IgG - выше 14,8 г/л, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов - выше 10,6 у.е. прогнозировать развитие абсцесса легкого.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больной М., 58 лет, (история болезни №878). В 2007 году поставлен диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких.

Жалобы на: кашель с мокротой, одышку (при незначительной физической нагрузке), общую слабость, чувство стеснения в грудной клетке, возникающее при физической нагрузке.

2 месяца назад наступило ухудшение сосояния (усилился кашель, усилилась одышка, появилось чувство стеснения в грудной клетке.

Объективно: цианотическое окрашивание слизистых оболочек. Относительно горизонтальное направление ребер, бочкообразная грудная клетка.

Число дыхательных движений в покое 22 в минуту.

Отек голеностопных суставов (признак правожелудочковой недостаточности).

При пальпации и перкуссии легких никаких изменений не выявлено.

Аускультация: ослабление дыхательных шумов, сухие хрипы во время спокойного дыхания.

Сердечные тоны лучше выслушиваются над грудиной, ослабление тонов сердца.

При пальпации органов ЖКТ печень выступает из-под края реберной дуги на 1,5 см, безболезненна.

Лабораторные данные: содержание в сыворотке крови лейкоцитов - 9,1·10⁹/л, п/я нейтрофилов - 2%, % лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза) - 1.57, фагоцитарный индекс, 50, IgG - 12.32 г/л, высокомолекулярные ЦИК - 8 у.е.

Спирография - крайне резкое снижение ЖЕЛ, крайне резкие нарушения проходимости дыхательных путей. ЖЕЛ-11,3%, ФЖЕЛ-12.9%, ОФВ1-14,1%.

Рентгенография: легочный рисунок усилен, деформирован. Корни легких фиброзно изменены, тяжистые. Диафрагма ограничена в подвижности.

Заключение: Хронический бронхит. Пневмосклероз.

Пример 2. Больной С., 47 лет, (история болезни №2109), поступил в отделение торакальной хирургии с диагнозом: Острый абсцесс верхней доли правого легкого.

Жалобы на общую слабость, высокую температуру, озноб, боли в правой половине грудной клетки при дыхании, кашель с наличием небольшого количества мокроты.

Больным себя считает более месяца, когда повысилась температура, появились боли в грудной клетке. В 2008 году выставлен диагноз:

Хроническая обструктивная болезнь легких.

При осмотре - отставание больной половины грудной клетки при дыхании.

При пальпации грудной клетки - болезненность по ходу межреберных промежутков.

Перкуторно: ясный легочный звук во всех отделах.

При аускультации - ослабление везикулярного и появление бронхиального оттенка дыхания. Усиление бронхофонии.

ССС: Тоны сердца ослаблены.

Органы пищеварения: не изменены.

Лабораторные данные: содержание в сыворотке крови лейкоцитов - 12,5·10⁹/л, п/я нейтрофилов - 5%,%лимфоцитов с увеличением количества ДНК (G1-фаза) - 3,86, фагоцитарный индекс - 70, IgG - 25.33 г/л, высокомолекулярные ЦИК - 17 у.е..

Спирография: Значительное снижение ЖЕЛ. Умеренная обструкция дистальных бронхов. ОФВ1 - 55,44%, ЖЕЛ - 45%, ФЖЕЛ - 61,3

Рентгенография - справа во 2-4 межреберьях полость с толстыми стенками 7·9 см на фоне инфильтрации легочной ткани с наличием горизонтального уровня. Корень правого легкого инфильтрирован. Левая половина диафрагмы уплощена, расположена на уровне переднего отрезка 5 ребра. Заключение: абсцесс Д1 справа.

Анализ содержания исследуемых показателей выявил их значительное повышение у больных хронической обструктивной болезнью легких, осложненной абсцессом легкого.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии. Предложен способ прогнозирования развития абсцесса легкого. В крови больных с хронической обструктивной болезнью легких определяют содержание лейкоцитов, п/я нейтрофилов, % лимфоцитов с увеличением количества ДНК (Gl-фаза), фагоцитарный индекс, IgG, высокомолекулярные ЦИК. При значениях содержания лейкоцитов выше 9.5, палочкоядерных нейтрофилов выше 2.67, IgG выше 14.8, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов выше 10.6, процента лимфоцитов с увеличением количества ДНК (Gl-фаза) выше 2.0, фагоцитарного индекса выше 55.6 прогнозируют развитие абсцесса легкого.

Способ прогнозирования развития абсцесса легкого, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в крови больных с хронической обструктивной болезнью легких определяют содержание лейкоцитов, палочкоядерных нейтрофилов, IgG, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов, процент лимфоцитов с увеличением количества ДНК (Gl-фаза), фагоцитарный индекс и при значениях содержания лейкоцитов выше 9,5·10⁹/л, палочкоядерных нейтрофилов выше 2,67%, IgG выше 14,8 г/л, высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов выше 10,6 у.е., процента лимфоцитов с увеличением количества ДНК (Gl-фаза) выше 2,0, фагоцитарного индекса выше 55,6 прогнозируют развитие абсцесса легкого.