Способ исследования препарата ротовой жидкости Российский патент 2024 года по МПК G01N33/569 G01N33/577 G01N1/30 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, иммунологии и может быть использовано для визуализации нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) (Brinkmann V., Rechard U., Goosmann C. [et al.], 2004), оценки степени активации лейкоцитов и изменений в эпителиальных клетках, обнаруживаемых в ротовой жидкости у пациентов с патологическими процессами слизистой полости рта, пародонта.

Известен способ исследования нейтрофильных ловушек в мукозальных секретах (Патент №2463349), включающий окраску 0,1 мл нативного препарата 0,1 мл равнокомпонентной смесью синьки Эванса в концентрации 1:8000 и красителя Sytox Green в концентрации 1:500, инкубацию в течение 5 мин в темноте, при этом с помощью люминесцентной микроскопии с использованием фильтров, обеспечивающих возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм, обнаруживают нейтрофильные внеклеточные ловушки, представляющие собой свободнолежащие ярко-зеленые волокна, образующие сеть, живые бактериальные клетки ярко-оранжевого цвета, апоптозные бактериальные клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой, мертвые бактериальные клетки зеленого цвета и оценивают число нейтрофильных внеклеточных ловушек (%), содержащих бактерии в 100 подсчитанных ловушках.

Недостатком указанного способа является исследование нейтрофильных ловушек в препаратах назальной, цервикальной и вагинальной слизи и не описывает исследование НВЛ в ротовой жидкости. Кроме того, в данном способе предусматривается разведение мукозальных секретов физиологическим раствором, а также определение нетоза в мукозальных секретах. Способ идентифицирует: внеклеточные ловушки в слизи, погибшие нейтрофилы, апоптозные нейтрофилы и нежизнеспособные нейтрофилы.

Наиболее близким по существу является: «Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови» (патент РФ №2768152) в котором выделенную на двойном градиенте плотности раствора фиколла-верографина взвесь нейтрофилов после стимуляции смесью Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum суправитально окрашивают с использованием интеркалирующего красителя йодида пропидия и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С с моноклональными антителами к специфическому для нейтрофилов антигену CD15, меченными флуоресцентным красителем FITC, а результаты визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя возбуждающий светофильтр с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм, подсчитывая морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: интактные клетки ярко-зеленого цвета без прокрашенного ядра, слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и слабопрокрашенным ядром, активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы, гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза - ранний нетоз - с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитывают два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки, превышающие размер клетки более чем в 2 раза, облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза, отдельно подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в нейтрофильных ловушках в пересчете на одну сеть с последующим расчетом процентного соотношения разных групп морфологических элементов - морфологический профиль нетоза.

Недостатком, указанного способа является тот факт, что метод разработан для выявления нейтрофильных внеклеточных ловушек в препарате изолированных нейтрофилов после их стимуляции пробиотиком, но не рассчитан для выявления и оценки нейтрофильных внеклеточных ловушек в ротовой жидкости, кроме того прототип предусматривает использование моноклональных антител к CD15, при этом рецептор CD15 экспрессируюется в основном на поверхности нейтрофилов, что не позволяет выявлять общий лейкоцитарный антиген (CD45), представленный на поверхности всех лейкоцитов человека и соответственно идентифицировать в препарате не только нейтрофилы, но и моноциты.

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка метода исследования ротовой жидкости, позволяющего одномоментно визуализировать в ее образце: 1) нейтрофильные ловушки (ранний нетоз, нитевидные НВЛ и облаковидные НВЛ) с оценкой размеров сформированных ловушек нитевидного и облаковидного типов; 2) интактные жизнеспособные лейкоциты (моноциты, нейтрофилы и лимфоциты) и нейтрофилы, находящиеся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции; 3) эпителиальные клетки и идентифицировать их морфологические эквиваленты от интактных форм до нежизнеспособных; 4) эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов и без признаков адгезии микроорганизмов, фиксировать количество свободных колоний микроорганизмов.

Техническим результатом, заявляемого решения является одновременная визуализациия в образце ротовой жидкости нейтрофильных ловушек (ранний нетоз, нитевидный нетоз и облаковидный нетоз), с оценкой размеров сформировавшихся НВЛ (с размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм), интактных жизнеспособных лейкоцитов (моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов), а также нейтрофилов (гипоактивированных, активированных, гиперактивированных), визуализации идентификации и подсчете процентного содержания моноцитов, визуализации эпителиальных клеток и идентификации их морфологических эквивалентов от интактных форм до нежизнеспособных и подсчету эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов и без признаков адгезии.

Указанный технический результат достигается тем, что предложен способ исследования ротовой жидкости, в котором собранную для исследования ротовую жидкость в объеме 1-2 мл разводят фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:1, при этом 2 части разведенной ротовой жидкости переносят на предметное стекло, добавляют 1 часть йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть моноклональных антител к CD45, меченных FITC, предварительно разведенных фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:10 и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С, а результаты визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя светофильтры: возбуждающий - с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм, и исследуют препарат на наличие, с определением процентного содержания:

нейтрофильных внеклеточных ловушек по типу

- раннего нетоза - нейтрофильные внеклеточные ловушки с увеличенным в размере ядром с выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, но не окружающее клетку со всех сторон;

- нитевидного нетоза с нейтрофильными внеклеточными ловушками в форме одиночной нити с размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм;

- облаковидного нетоза - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки с размерами: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100мкм;

лейкоцитов по типу

- интактных лейкоцитов без прокрашенного ядра;

- моноцитов без прокрашенного ядра;

- слабоактивированных нейтрофилов;

- активированных нейтрофилов;

- гиперактивированных нейтрофилов;

эпителиоцитов по типу

- интактных эпителиоцитов;

- эпителиоцитов с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой;

- эпителиоцитов с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой;

- пластов эпителиоцитов;

оценивают процентное содержание: эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов, эпителиоцитов без признаков адгезии микроорганизмов, свободных колоний микроорганизмов.

Возможность визуализации в препарате ротовой жидкости внеклеточных ловушек и нейтрофилов, находящихся в состоянии разной степени активации, объясняется тем, что в процессе активации нейтрофила происходит повышение активности фермента фосфолипазы А₂, отвечающего за образование арахидоновой кислоты из фосфолипидов (Dennis E.A., Cao J., Hsu Y.H. [et al.], 2011). При этом, с одной стороны, из арахидоновой кислоты образуются простагландины и лейкотриены, поддерживающие процесс воспаления, а с другой стороны - повышается проницаемость мембраны нейтрофила для йодида пропидия, который связывается с ДНК ядра гранулоцита. Чем выше степень активации нейтрофила, тем больше в него проникает интеркалирующего красителя. Повышение проницаемости мембраны нейтрофила является причиной увеличения концентрации Ca²⁺ в его цитоплазме, что способствует активации Ca²⁺ зависимой пептидил-аргинин деиминазы 4 типа (PAD4) и PAD4-опосредованному цитруллированию гистонов во время формирования НВЛ (Thiam H.R., Wong S.L., Wagner D.D. [et al.], 2020). При значительной активации нейтрофил способен сформировать нейтрофильную ловушку, которая окрашивается йодидом пропидия.

Способ осуществляется следующим образом.

За 30 мин до сбора ротовой жидкости пациент прополаскивает рот 100 мл физиологического раствора. Ротовую жидкость собирают в пластиковую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 1-2 мл. Непосредственно перед исследованием собранную ротовую жидкость разводят фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:1. Затем готовят препарат для люминесцентной микроскопии. Для приготовления препарата "раздавленная капля" 2 части (10 мкл) разведенной ротовой жидкости переносят на обезжиренное предметное стекло, добавляют 1 часть (5 мкл) йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть (5 мкл) моноклональных антител к CD45, меченных FITC в разведении фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:10, каплю накрывают покровным стеклом. Предметное стекло с препаратом во влажной камере помещают в суховоздушный термостат при 37°С на 5 минут.

Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя светофильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаруживают:

1. Группа 1. Нетоз (Фигура 1. Нетоз, визуализируемый в ротовой жидкости).

1.1. Ранний нетоз - нейтрофил с начальными признаками нетоза с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, но не окружающее клетку со всех сторон (Фигура 1 - а. Ранний нетоз);

1.2. Нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки, превышающие размер клетки более чем в 2 раза (Фигура 1 - б, в, г. Нитевидные НВЛ):

1.2.1. Нитевидный нетоз размером не более 40 мкм - НВЛ в форме одиночной нити (завиток), превышающей размер клетки в 2 раза, но в то же время размер самой длинной оси образованной нити не должен превышать 40 мкм (Фигура 1 - б. Нитевидные НВЛ размером не более 40 мкм);

1.2.2. Нитевидный нетоз размером от 41 до 100 мкм - размер НВЛ по самой длинной оси образовавшейся ловушки от 41 мкм до 100 мкм (Фигура 1 - в. Нитевидная НВЛ размером от 41 до 100 мкм).

1.2.3. Нитевидный нетоз размером более 100 мкм - размер НВЛ по самой длинной оси образовавшейся ловушки более 100 мкм (Фигура 1 - г. Нитевидные НВЛ размером более 100 мкм).

1.3. Облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника нетоза, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза (Фигура 2. Облаковидные НВЛ):

1.3.1. Облаковидный нетоз размером не более 40 мкм (Фигура 2 - а. Облаковидная НВЛ размером не более 40 мкм);

1.3.2. Облаковидный нетоз размером от 41 мкм до 100 мкм (размер определяется по самой длинной оси образовавшейся ловушки) (Фигура 2 - б. Облаковидная НВЛ размером от 41 мкм до 100 мкм);

1.3.3. Облаковидный нетоз размером более 100 мкм (размер определяется по самой длинной оси образовавшейся ловушки) (Фигура 2 - в. Облаковидная НВЛ размером более 100 мкм).

2. Группа 2. Лейкоциты (Фигура 3. Лейкоциты):

2.1. Интактные лейкоциты - интактные клетки ярко-зеленого цвета (CD45-FITC) без прокрашенного ядра (Фигура 3 - а. Интактные лейкоциты);

2.2. Моноциты - клетки желтого (золотистого) цвета с "шероховатой" мембраной без прокрашенного ядра (Фигура 3 - д. Моноцит);

2.3. Слабоактивированные нейтрофилы с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета (CD45-FITC) и слабопрокрашенным красным ядром (окрашено йодидом пропидия) (Фигура 3 - б. Слабоактивированная клетка);

2.4. Активированные нейтрофилы с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, не достигающим границы цитолеммы (Фигура 3 - в. Активированный нейтрофил);

2.5. Гиперактивированные нейтрофилы - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы (Фигура 3 - г. Гиперактивированные нейтрофилы);

3. Группа 3. Эпителиоциты (Фигура 4. Эпителиоциты):

3.1. Интактные (жизнеспособные) эпителиоциты - крупные клетки с цитолеммой флуоресцирующей зеленым цветом без прокрашенного пропидием йодидом ядра и цитоплазмы (интактная цитолемма непроницаема для пропидия йодида) - эпителиоциты с пропидий-негативными ядром и цитоплазмой (Фигура 4 - а. Интактные эпителиоциты);

3.2. Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой - крупные клетки с начальными признаками дегенерации, у которых цитолемма флуоресцирует зеленым цветом, а ядро - красно-оранжевым (Фигура 4 - б. Эпителиоцит с пропидий-позитивным ядром). У данного типа эпителиоцитов цитолемма становится проницаемой для пропидия йодида, который прокрашивает ядро. Поскольку на этом этапе в ядре не происходит дегенеративных процессов (кариопикноз, кариорексис, кариолизис), ДНК в цитоплазме отсутствует;

3.3. Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой - крупные клетки с красно-оранжевым ядром и цитоплазмой (Фигура 4 - в. Эпителиоцит с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой). В процессе инволюции эпителиоцитов, происходит деградация ядра (кариопикноз, карорексис, кариолизис), что может способствовать распределению «обломков» ДНК в цитоплазме;

3.4. Пласты эпителиоцитов (пласты) - несколько эпителиоцитов расположенных группой и имеющих плотные контакты друг c другом (Фигура 4 - г. Пласты эпителиоцитов);

4. Группа 4. Признаки адгезии бактерий эпителиоцитами, микроорганизмы, грибки и свободные колонии микроорганизмов. (Фигура 5. Визуализируемые в ротовой жидкости микроорганизмы, грибки и эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов). Методика позволяет идентифицировать наличие в ротовой жидкости бактерий (кокки, спириллы, кандида и др.) Бактерии как правило флуоресцируют ярко-красным свечением. Бактерии могут объединяться в конгломераты не связанные с какими-либо клеточными элементами (колонии). Псевдомицелий грибков рода Candida не флуоресцирует, но хорошо заметен в виде теней на фоне обильно формируемых вокруг него НВЛ. (Фигура 5 - а. Палочки; б. Спириллы; в. Кокки; д. Псевдомицелий кандида, визуализируемый на фоне сформировавшихся вокруг него НВЛ; е. Колония микроорганизмов). Визуализация в препарате ротовой жидкости бактерий позволяет подсчитать процентное содержание эпителиоцитов без признаков адгезии микроорганизмов на их поверхности и эпителиоцитов с осевшими на их поверхности микроорганизмами (Фигура 5 - г. Эпителиоцит с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой с осевшими на его поверхности микроорганизмами; ж. - Интактный эпителиоцит с осевшими на его поверхности микроорганизмами);

После обнаружения описанных морфологических элементов ротовой жидкости рассчитывают процентное содержание элементов, объединяя их в четыре основные группы:

Группа 1. Процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек по типу: 1) ранний нетоз, 2) нитевидный нетоз (с размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм), 3) облаковидный нетоз (с размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм).

Группа 2. Процентное содержание лейкоцитов по типу: 1) интактные лейкоциты, 2) моноциты, 3) слабоактивированные нейтрофилы, 4) активированные нейтрофилы, 5) гиперактивированные нейтрофилы.

Группа 3. Процентное содержание эпителиоцитов по типу: 1) интактные эпителиоциты, 2) Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой, 3) Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой, 4) пласты эпителиоцитов.

Группа 4. Процентное содержание: эпителиоцитов без признаков адгезии микроорганизмов, эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов, свободных колоний микроорганизмов.

Образец протокола исследования препарата ротовой жидкости:

1. Нетоз

1.1. Ранний нетоз (процентное содержание);

1.2. Нитевидный нетоз (процентное содержание):

1.2.1. с размерами не более 40 мкм;

1.2.2. с размерами от 41 до 100 мкм;

1.2.3. с размерами более 100 мкм.

1.3. Облаковидный нетоз (процентное содержание):

1.3.1. с размерами не более 40 мкм;

1.3.2. с размерами от 41 до 100 мкм;

1.3.3. с размерами более 100 мкм.

2. Лейкоциты:

2.1. Интактные лейкоциты без прокрашенного ядра (процентное содержание);

2.2. Моноциты без прокрашенного ядра (процентное содержание);

2.3. Слабоактивированные нейтрофилы (процентное содержание);

2.4. Активированные нейтрофилы (процентное содержание);

2.5. Гиперактивированные нейтрофилы (процентное содержание);

3. Эпителиоциты:

3.1. Интактные эпителиоциты (процентное содержание);

3.2. Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой (процентное содержание);

3.3. Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой (процентное содержание);

3.4. Пласты эпителиоцитов (пласты) (процентное содержание);

4. Признаки адгезии бактерий эпителиоцитами, свободные колонии микроорганизмов:

4.1. Эпителиоциты без признаков адгезии микроорганизмов (процентное содержание);

4.2. Эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов (процентное содержание);

4.3. Свободных колоний микроорганизмов (процентное содержание).

Клинические примеры

Пример 1

Окрашивали ротовую жидкость здоровой женщины Л. 31 год. Ротовую жидкость собирали в пластиковую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 1-2 мл. За 30 мин до сбора ротовой жидкости пациентка прополоскала рот 100 мл физиологического раствора. Непосредственно перед исследованием собранную ротовую жидкость разводили фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:1. Затем готовили препарат для люминесцентной микроскопии. Для приготовления препарата "раздавленная капля" 2 части (10 мкл) разведенной ротовой жидкости перенесли на обезжиренное предметное стекло, добавили 1 часть (5 мкл) йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть (5 мкл) моноклональных антител к CD45, меченных FITC в разведении фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:10, каплю накрыли покровным стеклом. Предметное стекло с препаратом во влажной камере поместили в суховоздушный термостат при 37^оС на 5 минут.

Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаружили НВЛ различного типа и клетки.

Протокол исследования препарата ротовой жидкости

1. Нетоз - 2%, среди НВЛ:

1.1. Ранний нетоз - 0%;

1.2. Нитевидный нетоз - 2%, среди нитевидных НВЛ:

1.2.1. с размерами не более 40 мкм - 2%;

1.2.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 0%;

1.2.3. с размерами более 100 мкм - 0%.

1.3. Облаковидный нетоз - 0%, среди облаковидных НВЛ:

1.3.1. с размерами не более 40 мкм - 0%;

1.3.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 0%;

1.3.3. с размерами более 100 мкм - 0%.

2. Лейкоциты - 26%, среди лейкоцитов:

2.1. Интактные лейкоциты - 5%;

2.2. Моноциты - 1%;

2.3. Слабоактивированные нейтрофилы - 10%;

2.4. Активированные нейтрофилы - 8%;

2.5. Гиперактивированные нейтрофилы - 2%;

3. Эпителиоциты - 72%, среди эпителиоцитов:

3.1. Интактные эпителиоциты - 9%;

3.2. Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой - 51%;

3.3. Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой - 12%;

3.4. Пласты эпителиоцитов - 0%;

4. Признаки адгезии бактерий эпителиоцитами, свободные колонии микроорганизмов:

4.1. Эпителиоциты без признаков адгезии микроорганизмов - 88,9%

4.2. Эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов - 11,1%

4.3. Свободных колоний микроорганизмов - 0%

Пример 2

Пациентка В., 38 лет, обратилась с жалобами на кровоточивость десны при чистке зубов, приеме твердой пищи. Объективно: неудовлетворительная гигиена полости рта, индекс гигиены OHI-S 1,9. Определяется мягкий зубной налет до 1/3 поверхности коронки на всех зубах. При осмотре - маргинальная десна в области всех зубов отечна, гиперемирована, кровоточит при зондировании десневой борозды, индекс кровоточивости PBI при обследовании всех зубов составил 2,1; индекс РМА - 43%. Потери прикрепления нет. Диагноз: Гингивит хронический К05.1. Простой маргинальный.

Ротовую жидкость собирали в пластиковую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 1-2 мл. За 30 мин до сбора ротовой жидкости пациентка прополоскала рот 100 мл физиологического раствора. Непосредственно перед исследованием собранную ротовую жидкость разводили фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:1. Затем готовили препарат для люминесцентной микроскопии. Для приготовления препарата "раздавленная капля" 2 части (10 мкл) разведенной ротовой жидкости перенесли на обезжиренное предметное стекло, добавили 1 часть (5 мкл) йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть (5 мкл) моноклональных антител к CD45, меченных FITC в разведении фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:10, каплю накрыли покровным стеклом. Предметное стекло с препаратом во влажной камере поместили в суховоздушный термостат при 37°С на 5 минут.

Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаружили НВЛ различного типа и клетки.

Протокол исследования препарата ротовой жидкости

1. Нетоз - 55%, среди НВЛ:

1.1. Ранний нетоз - 25%;

1.2. Нитевидный нетоз - 24%, среди нитевидных НВЛ:

1.2.1. с размерами не более 40 мкм - 8%;

1.2.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 15%;

1.2.3. с размерами более 100 мкм - 1%.

1.3. Облаковидный нетоз - 6%, среди облаковидных НВЛ:

1.3.1. с размерами не более 40 мкм - 4%;

1.3.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 1%;

1.3.3. с размерами от 41 до 100 мкм - 1%.

2. Лейкоциты - 32%, среди лейкоцитов:

2.1. Интактные лейкоциты - 10%;

2.2. Моноциты - 2%;

2.3. Слабоактивированные нейтрофилы - 2%;

2.4. Активированные нейтрофилы - 10%;

2.5. Гиперактивированные нейтрофилы - 8%;

3. Эпителиоциты - 13%, среди эпителиоцитов:

3.1. Интактные эпителиоциты - 1%;

3.2. Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой - 4%;

3.3. Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой - 6%;

3.4. Пласты эпителиоцитов - 2%;

4. Признаки адгезии бактерий эпителиоцитами, свободные колонии микроорганизмов:

4.1. Эпителиоциты без признаков адгезии микроорганизмов - 58%

4.2. Эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов - 40%

4.3. Свободных колоний микроорганизмов - 2%

Пример 3

Контрольный визит пациентки В., 38 лет (Диагноз: Гингивит хронический К05.1. Простой маргинальный) через 1 месяц после лечения. Лечение: профессиональная гигиена полости рта с использованием Air Flow Флоу-Клинз-Профи. Проведение реминерализирующей терапии. Подбор средств гигиены полости рта. Обучение гигиене полости рта. Субъективно пациентка отмечает улучшение: отсутствие кровоточивости при чистке зубов, отсутствие неприятного запаха. Объективно: гигиена полости рта удовлетворительная, индекс гигиены OHI-S 0,9. Видимый мягкий зубной налет не определяется. При осмотре - маргинальная десна в области всех зубов бледно-розового цвета, не увеличена, при зондировании десневой борозды кровоточивость отсутствует, за исключением зубов 2.2 и 2.3, где индекс кровоточивости PBI составил 1,0; индекс РМА - 2%. Диагноз: Гингивит хронический К05.1. Простой маргинальный.

Ротовую жидкость собирали в пластиковую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 1-2 мл. За 30 мин до сбора ротовой жидкости пациентка прополоскала рот 100 мл физиологического раствора. Непосредственно перед исследованием собранную ротовую жидкость разводили фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:1. Затем готовили препарат для люминесцентной микроскопии. Для приготовления препарата "раздавленная капля" 2 части (10 мкл) разведенной ротовой жидкости перенесли на обезжиренное предметное стекло, добавили 1 часть (5 мкл) йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть (5 мкл) моноклональных антител к CD45 меченных FITC в разведении фосфатным буферным раствором (pH 7,4) в соотношении 1:10, каплю накрыли покровным стеклом. Предметное стекло с препаратом во влажной камере поместили в суховоздушный термостат при 37°С на 5 минут.

Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаружили НВЛ различного типа и клетки.

Протокол исследования препарата ротовой жидкости

1. Нетоз - 25%, среди НВЛ:

1.1. Ранний нетоз - 20%;

1.2. Нитевидный нетоз - 5%, среди нитевидных НВЛ:

1.2.1. с размерами не более 40 мкм - 4%;

1.2.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 1%;

1.2.3. с размерами более 100 мкм - 0%.

1.3. Облаковидный нетоз - 0%, среди облаковидных НВЛ:

1.3.1. с размерами не более 40 мкм - 0%;

1.3.2. с размерами от 41 до 100 мкм - 0%;

1.3.3. с размерами более 100 мкм - 0%.

2. Лейкоциты - 57%, среди лейкоцитов:

2.1. Интактные лейкоциты - 22%;

2.2. Моноциты - 3%;

2.3. Слабоактивированные нейтрофилы - 4%;

2.4. Активированные нейтрофилы - 17%;

2.5. Гиперактивированные нейтрофилы - 11%;

3. Эпителиоциты - 18%, среди эпителиоцитов:

3.1. Интактные эпителиоциты - 1%;

3.2. Эпителиоциты с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой - 12%;

3.3. Эпителиоциты с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой - 5%;

3.4. Пласты эпителиоцитов - 0%;

4. Признаки адгезии бактерий эпителиоцитами, свободные колонии микроорганизмов:

4.1. Эпителиоциты без признаков адгезии микроорганизмов - 58%

4.2. Эпителиоциты с признаками адгезии микроорганизмов - 40%

4.3. Свободных колоний микроорганизмов - 2%

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет исследовать препарат ротовой жидкости на наличие, с определением процентного содержания нитевидных и облаковидных нейтрофильных ловушек (размерами размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм), раннего нетоза, интактных лейкоцитов, моноцитов, нейтрофилов (гипоактивированных, активированных и гиперактивированных), эпителиоцитов (интактных форм, эпителиоцитов с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой, эпителиоцитов с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой), пластов эпителиоцитов, оценить долю эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов и без признаков адгезии микроорганизмов, колоний микроорганизмов в их общем пуле.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, иммунологии и может быть использовано для визуализации в ротовой жидкости нейтрофильных внеклеточных ловушек. Собирают ротовую жидкость в количестве 1-2 мл, после чего ее разводят фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:1. При этом 2 части разведенной ротовой жидкости переносят на предметное стекло, добавляют 1 часть йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть моноклональных антител к CD45, меченных FITC, предварительно разведенных фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:10 и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С. После чего препарат визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя светофильтры: возбуждающий - с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм. Исследуют препарат на наличие, с определением процентного содержания: нейтрофильных внеклеточных ловушек по типу раннего нетоза; нитевидного нетоза; облаковидного нетоза; лейкоцитов по типу: интактных лейкоцитов без прокрашенного ядра; моноцитов без прокрашенного ядра; слабоактивированных нейтрофилов; активированных нейтрофилов; гиперактивированных нейтрофилов; эпителиоцитов по типу: интактных эпителиоцитов; эпителиоцитов с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой; эпителиоцитов с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой; пластов эпителиоцитов. Оценивают процентное содержание: эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов, эпителиоцитов без признаков адгезии микроорганизмов, микроорганизмов, свободных колоний микроорганизмов. Изобретение обеспечивает одновременную визуализацию в образце ротовой жидкости нейтрофильных ловушек разного типа с возможностью подсчета бактерий, захваченных сформировавшимися НВЛ, интактных жизнеспособных лейкоцитов, а также нейтрофилов, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, визуализации, идентификации и подсчете процентного содержания моноцитов, визуализации эпителиальных клеток и идентификации их морфологических эквивалентов от интактных форм до нежизнеспособных и подсчету эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов и без признаков адгезии. 5 ил., 3 пр.

Способ исследования препарата ротовой жидкости, включающий сбор ротовой жидкости в количестве 1-2 мл, после чего ее разводят фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:1, при этом 2 части разведенной ротовой жидкости переносят на предметное стекло, добавляют 1 часть йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 1 часть моноклональных антител к CD45, меченных FITC, предварительно разведенных фосфатным буферным раствором при pH=7,4 в соотношении 1:10, и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С, после чего препарат визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя светофильтры: возбуждающий - с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм, и исследуют препарат на наличие, с определением процентного содержания:

нейтрофильных внеклеточных ловушек по типу

- раннего нетоза – нейтрофильные внеклеточные ловушки с увеличенным в размере ядром с выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, но не окружающего клетку со всех сторон;

- нитевидного нетоза с нейтрофильными внеклеточными ловушками в форме одиночной нити с размерами нити: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм;

- облаковидного нетоза – неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки с размерами: не более 40 мкм, от 41 до 100 мкм, более 100 мкм;

лейкоцитов по типу

- интактных лейкоцитов без прокрашенного ядра;

- моноцитов без прокрашенного ядра;

- слабоактивированных нейтрофилов;

- активированных нейтрофилов;

- гиперактивированных нейтрофилов;

эпителиоцитов по типу

- интактных эпителиоцитов;

- эпителиоцитов с пропидий-позитивным ядром и пропидий-негативной цитоплазмой;

- эпителиоцитов с пропидий-позитивными ядром и цитоплазмой;

- пластов эпителиоцитов;

оценивают процентное содержание: эпителиоцитов с признаками адгезии микроорганизмов, эпителиоцитов без признаков адгезии микроорганизмов, свободных колоний микроорганизмов.