СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ СЕПСИСА С ПОМОЩЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСОЛЮТНОГО КОЛИЧЕСТВА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК Российский патент 2023 года по МПК G01N33/49 G01N1/30 G06M11/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для ранней диагностики сепсиса при воспалительном процессе, путем определение внеклеточной ДНК в периферической крови, образованной гранулоцитами.

Сепсис - это опасная для жизни дисфункция внутренних органов, вызванная нарушением регуляции ответа организма на инфекцию [1]. Если сепсис не распознать на ранней стадии и не обеспечить своевременное лечение, он может вызвать септический шок, полиорганную недостаточность и смерть. Согласно расчетам, частота возникновения сепсиса по всему миру ежегодно составляет более 30 миллионов человек и, согласно последним исследованиям, ежегодно уносит жизни 11 миллионов человек [2]. Опасность продолжает угрожать и выжившим пациентам, из которых только половина выздоравливают полностью, а остальные либо умирают в течение 1 года, либо живут с бременем хронической инвалидности [3]. Поэтому поиск методов ранней и точной диагностики и прогноза сепсиса, а также специфического лечения по-прежнему актуален [4].

В настоящее время известны следующие методы лабораторной диагностики сепсиса.

Микробиологические, которые основаны на выделении и идентификации микробного агента из крови на искусственных питательных средах. Микробиологический метод имеет свои недостатки: процесс трудоемкий, с учетом сроков исполнения (24-48 и более часов), не может использоваться в качестве раннего критерия сепсиса, а также бактериемия определяется лишь в 25-45% случаев.

Одним из лабораторных критериев генерализованной инфекции являются методы определения бактериальных эндотоксинов (БЭ) (ЛАЛ тест-Limulus Amebocyte Lysate Test, EAA - Endotoxin activity assay, и др.). Недостатками методов являются: недостаточная специфичность при анализе содержания БЭ в таких многокомпонентных растворах, как кровь и плазма; необходимость наличия специального дорогостоящего оборудования, что затрудняет их использование в качестве экспресс-методов в условиях стационара, трудности с пробоподготовкой и воспроизводимостью результатов из-за мешающих определению глюканов и других молекул, содержание которых в крови пациентов значительно варьирует. Особенно неоднозначно пока определение содержания БЭ в крови как диагностического критерия септических осложнений критических состояний [5].

«Классические» маркеры воспаления, такие как общее количество лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарная формула, скорость оседания эритроцитов, а также белки острой фазы воспаления (С-реактивный белок, церулоплазмин, ферритин, альбумин и др.) имеют низкую специфичность и соответственно для ранней и точной диагностики сепсиса ненадежны [6].

Определение так называемых «биомаркеров сепсиса». «Идеальный» биомаркер сепсиса должен обладать следующими преимуществами: высокая чувствительность и специфичность; доступность для практики; быстрое получение результата; высокая воспроизводимость; корреляция с тяжестью состояния и исходом; совпадение динамики содержания с клинической реакцией на проводимую терапию [7]. На сегодняшний день в экспериментальных условиях и в клинике рассматривают такие маркеры как прокальцитонин, С-реактивный белок, проадреномедуллин, TREM-1, TNF, ИЛ-6, ИЛ-8, LPS-binding protein, эндотоксин, пресепсин. Однако, согласно позиции экспертов, ни один из них на сегодняшний день не может претендовать на роль общепризнанного биомаркера сепсиса, отвечающего всем заявленным критериям. Среди недостатков вышеперечисленных маркеров можно выделить: недостаточно высокую чувствительность и специфичность, длительность проведения исследования, необходимость в дорогостоящем специализированном оборудовании и реактивах, ограниченное количество клинических наблюдений, специально обученный персонал.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в разработке быстрого, доступного и информативного способа ранней диагностики сепсиса. Указанная задача решается тем, что у пациентов, поступивших в отделение реанимации или интенсивной терапии определяют абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных гранулоцитами периферической крови, в мазке, окрашенном по Романовскому-Гимзе. Заявленный способ позволяет более точно проводить раннюю диагностику сепсиса, что позволит лечащему врачу оптимизировать тактику лечения для снижения вероятности развития тяжелых форм сепсиса и летального исхода.

В предлагаемом способе впервые определение абсолютного количества внеклеточных ловушек, образованных гранулоцитами периферической крови, в 1 сутки у пациентов, поступивших в отделение реанимации или интенсивной терапии может служить дополнительным маркером ранней диагностики сепсиса. При уровне абсолютного количества внеклеточных ловушек, образованных гранулоцитами периферической крови более 0,354×10⁹/л диагностируют сепсис при 93% чувствительности и 90% специфичности.

Способ осуществляется следующим образом. При поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии у пациентов проводят забор цельной периферической крови, проводят подсчет нейтрофильных внеклеточных ловушек. Для этого из цельной периферической крови готовят мазок на обезжиренном предметном стекле, фиксированный препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, учет проводят с помощью светового микроскопа (внеклеточная ДНК представлена тонкими фиолетово - красными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного лейкоцита [8].

Далее проводят подсчет общего количества лейкоцитов. Для подсчета общего количества лейкоцитов используют камеру Горяева. Перед проведением исследования 5 мкл цельной крови смешивают со 100 мкл 5% уксусной кислоты для разрушения оболочки лейкоцитов. Далее в 100 больших квадратах согласно правилу Егорова, считают лейкоциты при малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8). Производят подсчет по формуле: Л=В*250*20*10^6/100 (где Л - количество лейкоцитов в 1 л крови; В - сумма лейкоцитов в 100 больших квадратах; 250 - множитель, приводящий к объему крови 1 мкл (объем большого квадрата 1/250 мкл); 20 -разведение крови; 100 - число больших квадратов; 10^6 - количество мкл в одном литре).

Далее рассчитывают абсолютное количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и при уровне НВЛ более 0,354×10⁹/л диагностируют сепсис. В исследовании учувствовало 60 пациентов после хирургического вмешательства, 49 из них с диагнозом сепсис.

Оценку диагностической эффективности проводили по показателям чувствительности, специфичности, а также площади под характеристической кривой (ROC-кривой). AUC (Area Under Curve) для диагностики посредством определения абсолютного количества НВЛ на 1 сутки заболевания составила 0,988 (р<0,0001), чувствительность теста 93%, специфичность теста 90%, все это свидетельствует о высоком качестве модели.

Пример 1. Пациент А. 62 года, находился на лечении после оперативного вмешательства в связи с холецистэктомией. У больного температура тела повысилась до 38-39°С, пульс участился до 101 удара в 1 мин., частота дыхания 22 в 1 мин. Для определения внеклеточных ловушек была взята кровь из локтевой вены для общего анализа крови. При подсчете формулы крови, также было оценено количество внеклеточных сетей, образованных гранулоцитами. В общем анализе крови количество лейкоцитов было повышено до 15×10⁹/л. Абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных гранулоцитами периферической крови составило 0,434×10⁹/л. На основание данного показателя был выставлен диагноз сепсис и назначено лечение.

Также кровь, забранная у пациента, была направлена на бактериологическое исследование для подтверждения диагноза. Образцы крови были обработаны с помощью системы BacT/Alert. Положительная культура крови была получена только после 24 часов инкубации. Микроорганизмы идентифицировали с помощью типичной морфологии окраски по Граму и стандартных методов клинической микробиологии. Идентификацию изолята подтверждали с помощью специальных карточек, обработанных прибором VITEK 2 (BioMerieux, Франция). Получен результат бактериологического исследования крови, был обнаружен рост Staphylococcus aureus.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики сепсиса по сравнению с существующими имеет следующие преимущества: проведение измерения не требует длительного времени, способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения не более 1 часа), что также позволяет отслеживать эффективность проводимой терапии, не трудоемок, не требует дорогостоящей аппаратуры и тест-систем, способ позволяет диагностировать сепсис на 1 сутки заболевания.

Список литературы

1. Singer, М. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3) / M. Singer, C.S. Deutschman, C.W. Seymour [et al.] // JAMA. - 2016. - Vol. 315, №8. - P. 801-810.

2. Fleischmann, C. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations / C. Fleischmann, A. Scherag, N.K. Adhikari [et al.] // American journal of respiratory and critical care medicine. - 2016. - Vol. 193, №3. - P. 259-272.

3. Prescott, H.C. Enhancing recovery from sepsis: a review / H.C. Prescott, D.C. Angus // JAMA. - 2018. - Vol. 319, №1. - P. 62-75.

4. Семидесятая сессия всемирной ассамблеи здравоохранения. - WHA70.7. - 29 мая 2017. - С. 5.

5. Методы определения бактериального эндотоксина в медицине критических состояний (обзор). М.Н. Копицына, А.С.Морозов, И.В. Бессонов, В.М. Писарев / Общая реаниматология, 2017, 13, 5. С. 109-120

6. Бельков, В.В. Комплексная лабораторная диагностика системных инфекций и сепсиса: С-реактивный белок, прокальцитонин, пресепсин / В.В. Бельков. - Москва: ЗАО «Диакон», 2015. - 117 с.

7. Marshall J.C, Vincent J-L., Fink M. et al. Measurs, markers and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the fifth Toronto sepsis roundtable // Ctrit. Care Med. - 2003. - Vol. 31, №5. - P.1560-1567.

8. Патент РФ №271555 Савочкина А.Ю., Пыхова Л.Р., Абрамовских О.С., Четвернина Е.А., Полторак А.Е. Способ обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови. Заявка №2019119629, дата поступления 24.06.2019, приоритет 24.06.2019, зарегистрирован в Государственном реестре 02.03.2020.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для ранней диагностики сепсиса. В 1 сутки заболевания определяют абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами в периферической крови. При уровне абсолютного количества внеклеточных ловушек более 0,354×10⁹/л диагностируют сепсис. Способ обеспечивает быструю, доступную и информативную диагностику сепсиса в ранние сроки за счет определения в периферической крови абсолютного количества внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами в 1 сутки заболевания. 1 пр.

Способ ранней диагностики сепсиса, характеризующийся тем, что в 1 сутки заболевания определяют абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами в периферической крови, и при уровне абсолютного количества внеклеточных ловушек более 0,354×10⁹/л диагностируют сепсис.