Способ моделирования изопротеренолиндуцированной хронической сердечной недостаточности у крыс возрастом 24 месяца Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к области воспроизведения в эксперименте болезней человека в пожилом возрасте. Изобретение может быть использовано для моделирования хронической сердечной недостаточности (ХСН) в стареющем организме с целью изучения возрастных особенностей ремоделирования миокарда и динамики изменения специфических маркеров на различных сроках формирования ХСН. Постарение населения большинства развитых стран обострило необходимость изучения механизмов развития ХСН в старом и суперстаром возрасте и апробация фармакологических веществ, разработанных для рациональной терапии и профилактики, требует разработки адекватной экспериментальной модели сердечной недостаточности у крыс возрастом 24 месяца.

Известны способы моделирования ХСН у молодых животных возрастом от 4 до 6 месяцев [Teerlink J.R. 1994; Цветкова А.С., 2019; Капелько 2014; Zhang XJ, 2021]. Данные способы являются наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату. Недостатком этих способов при моделировании ХСН у крыс возрастом 24 месяца является гибель 90% экспериментальных животных уже в первые часы.

В проанализированной патентной и научной литературе адекватного прототипа моделирования ХСН у крыс возрастом 24 месяца не обнаружено.

Целью изобретения является создание способа развития у крыс возрастом 24 месяца стойких морфологических изменения тканей миокарда, мозга, легких и почек характерных для ХСН.

Цель достигается следующим образом. Животным под кожу в области холки вводят изопротеренол гидрохлорид в дозе 10мг/кг 4 раза в течение 11 суток по следующей схеме: 1-я инъекция на 1-й день эксперимента, 2-я инъекция на 4-й день эксперимента, 3-я инъекция на 8-й день эксперимента, 4-я инъекция на 11-й день эксперимента. Определение морфологических изменений в тканях миокарда, мозга, легких и почек проводят через 60 суток после последней инъекции. Всё это время животных содержали в условиях вивария.

Нами впервые экспериментально показано, что у крыс возрастом 24 месяца, после подкожного введения изопротеренола гидрохлорида в дозе 10мг/кг 4 раза в течение 11 суток и последующего содержания в течение 60 суток в условиях вивария, развиваются выраженные изменения миокарда, мозга, легких и почек характерные для ХСН.

Заявляемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине и биологии для моделирования, изучения возраст специфических механизмов формирования ХСН и доклинической апробации новых фармакологических препаратов, разрабатываемых для лечения недостаточности миокарда у пожилых людей.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что для постановки модели изопротеринол гидрохрид вводят в дозе 10 мг/кг 4 раза с интервалом между инъекциями 2 суток, что меньше в 17 раз используемой для молодых животных дозы препарата и позволяет значительно увеличить процент выживания животных в первые сутки после его введения. Так же новым в предлагаемом способе является увеличение до 60 суток срока формирования ХСН у старых животных, поскольку по истечении 30 суток после введения препарата нам не удалось обнаружить характерных морфологических изменений, отмечаемых на этом сроке у молодых особей.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для изучения молекулярно-клеточных механизмов формирования ХСН в стареющем организме.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ моделирования ХСН у крыс в возрасте 24 месяца соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур.

На фиг. 1 представлены микрофотографии гистологических препаратов миокарда крыс (а) - контрольной группы и (б) - группы с ХСН (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200 и х400 соответственно).

На фиг. 2 представлена гистологическая картина миокард крысы с ХСН при проведении поляризационной микроскопии. Увеличение х400.

На фиг. 3 представлены микрофотографии гистологических препаратов почек крыс (а) - контрольной группы и (б) - группы с ХСН (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200 и х400 соответственно).

На фиг. 4 представлена гистологическая картина легких крыс (а) - контрольной группы и (б) - группы с ХСН (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200).

На фиг. 5 представлена гистологическая картина головного мозга крыс (а) - контрольной группы и (б) - группы с ХСН (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400).

Способ осуществляют следующим образом. Крысам-самцам возрастом 24 месяца, подкожно в область холки вводят раствор изопротеринола гидрохлорида в 9% NaCl в дозе 10мг/кг 4 раза в течение 11 суток с интервалами между инъекциями по следующей схеме: 1-я инъекция на 1-й день эксперимента, 2-я инъекция на 4-й день эксперимента, 3-я инъекция на 8-й день эксперимента, 4-я инъекция на 11-й день эксперимента. Животных содержат в условиях вивария на стандартном рационе в течение 60 суток после последней инъекции. В течение этого срока у них формируется ХСН. На 60 сутки после последней инъекции изопротеринола гидрохлорида осуществляют забор миокарда, легких, почек и головного мозга. Для гистологического исследования органы фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологические препараты изготавливают по стандартной методике, срезы окрашивают гематоксилином и эозином [Меркулов, 1969 ].

Пример

При проведении экспериментов крысы достигшие возраста 24 месяца были разделены на две группы.

1. Контроль - 10 крыс-самцов, которым подкожно вводили 9% NaCl по схеме введения препарата из расчета 1мл/кг.

2. Группа ХСН - 10 крыс-самцов, которым была смоделирована ХСН путем подкожного введения изопротеренол гидрохлорида в дозе 10 мг/кг 4 раза в течение 11 суток с интервалами между инъекциями по следующей схеме: 1-я инъекция на 1-й день эксперимента, 2-я инъекция на 4-й день эксперимента, 3-я инъекция на 8-й день эксперимента, 4-я инъекция на 11-й день эксперимента. Формирование ХСН происходит в течение 60 суток после последней инъекции.

После окончания инъекций животных обеих групп оставляли в течение 60 суток в условиях вивария на стандартном рационе.

Животных опытной и контрольной групп выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC [European Convention].

Для подтверждения развития ХСН при использовании предлагаемого способа проведен сравнительный анализ морфологической картины в тканях миокарда, мозга, легких и почек крыс опытной и контрольной групп. Для гистологического исследования органы иссекали из организма животного и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Выполняли стандартную проводку образцов в спиртах с приготовлением парафиновых блоков и гистологических препаратов.

На фиг. 1 изображены срезы миокарда крыс из группы контроля (а) и группы с ХСН (б). В миокарде животных с ХСН наблюдается выраженный периваскулярный (1) и петлистый межуточный (2) фиброз, очаговая регенераторная гипертрофия кардиомиоцитов (3). Выявленные особенности морфологической картины миокарда характерны для ХСН, что подтверждает формирование ХСН у животных опытной группы и адекватность выбранной нами модели.

Проведение поляризационной микроскопии срезов миокарда животных опытной группы (фиг. 2) показало, что в участках некроза кардиомиоцитов отмечается фрагментация волокон (4) и селективное свечение клеток (5), также определяются контрактурные изменения I-II порядка с наличием полных и частичных поперечных разрывов цитоплазмы кардиомиоцитов (6).

На гистологических препаратах почек крыс с ХСН (фиг. 3б) наблюдаются характерные для данной патологии изменения ткани почек неравномерно выраженное полнокровие капилляров клубочков (7) и межканальцевой сети (8). Для эпителия проксимальных почечных канальцев характерна зернистая дистрофия (9). В группе контрольных крыс, такие особенности морфологической картины почек отсутствовали.

На фиг. 4 представлена гистологическая картина легких крыс контрольной группы (а) и группы с ХСН (б). В препаратах лёгких крыс с ХСН отмечается неравномерное полнокровие внутриорганных капилляров (10), в части полей зрения определяются дистелектазы (11), явления фиброза межальвеолярных перегородок (12) и перивазальный фиброз (13). В группе контрольных крыс, такие особенности морфологической картины лёгких отсутствовали.

На фиг. 5 представлена гистологическая картина головного мозга крыс контрольной группы (а) и группы с ХСН (б). В головном мозге животных с ХСН отмечается полнокровие капилляров (10), слабый перицеллюлярный или умеренный перивазальный отек (14), дистрофические изменения нейронов коры (15).

В эксперименте на крысах-самцах возрастом 24 месяца показано, что при подкожном введении изопротеренол гидрохлорида в дозе 10 мг/кг по предложенной схеме на 60 сутки после последней инъекции в тканях миокарда, мозга, легких и почек сформировались изменения этих органов типичные для ХСН. Предлагаемый способ обеспечивает развитие приближенной к клиническим условиям картины изменений в жизненно важных органах и может быть использован для моделирования ХСН у крыс возрастом 24 месяца.

Список литературы

1. Капелько В.И. Комплексное исследование сердца крыс при поражении изопротеренолом / Капелько В.И., Лакомкин В.Л., Лукошкова Е.В. и др. // Кардиология -2014.-№ 3.- С. 46-56. doi: 10.18565/cardio.2014.3.46-56

2. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отделение, 1969. 422 с.

3. Цветкова А.С. Электрофизиологическое ремоделирование правого желудочка при экспериментальной сердечной недостаточности различной этиологии. / Цветкова А.С., Крандычева В.В., Харин С.Н. // Бюллетень сибирской медицины. - 2019.- Т.18- №2.- С. 165-174. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019- 2-165-174

4. Matsuyoshi Y.N. Left ventricular function of isoproterenol-induced hypertrophied rat hearts perfused with blood: mechanical work and energetics. / Matsuyoshi Y.N., Nishiyama A., Takaki М. et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2009.-297.-H1736-H1743. doi: 10.1152/ajpheart.00672.2009

5. Teerlink J.R. Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol-induced myocardial necrosis in rats. / Teerlink J.R., Pfeffer J.M., Pfeffer M.A. // Circ. Res. - 1994. - Vol.75.-№1.- Р. 105-113. doi: 10.1161/01.res.75.1.105

6. Zhang X.J. Ferulic Acid Ameliorates Isoproterenol-Induced Heart Failure by Decreasing Oxidative Stress and Inhibiting Cardiocyte Apoptosis via Activating Nrf2 Signaling Pathway in Rats. / Zhang X.J., Cui Z.H., Zhao Y.X., et al. // Biol Pharm Bull. 2021;44(3):396-403. doi: 10.1248/bpb.b20-00783. PMID: 33642547

7. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for exsperimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986:51.

Изобретение относится к медицине, а именно к области воспроизведения в эксперименте болезней человека в пожилом возрасте, и может быть использовано для моделирования хронической сердечной недостаточности у лабораторных крыс возрастом 24 месяца. Для этого крысам в возрасте 24 месяцев подкожно вводят изопротеренол в дозе 10 мг/кг 4 раза в течение 11 суток по следующей схеме: 1-я инъекция в 1-й день эксперимента, 2-я инъекция на 4-й день эксперимента, 3-я инъекция на 8-й день эксперимента, 4-я инъекция на 11-й день эксперимента. Морфологическое исследование сердца, почек, легких и головного мозга с целью подтверждения развития хронической сердечной недостаточности проводят через 60 суток после последней инъекции. Изобретение обеспечивает развитие стойких морфофункциональных изменений в тканях миокарда, мозга, легких и почек. 5 ил., 1 пр.

Способ моделирования изопротеренолиндуцированной хронической сердечной недостаточности у крыс возрастом 24 месяца, заключающийся в том, что подкожно вводят изопротеренол, отличающийся тем, что препарат вводят в дозе 10 мг/кг 4 раза в течение 11 суток по следующей схеме: 1-я инъекция в 1-й день эксперимента, 2-я инъекция на 4-й день эксперимента, 3-я инъекция на 8-й день эксперимента, 4-я инъекция на 11-й день эксперимента, при этом морфологическое исследование сердца, почек, легких и головного мозга с целью подтверждения развития хронической сердечной недостаточности проводят через 60 суток после последней инъекции.