Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин по результатам генетического тестирования Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, к биотехнологии, медицинской генетике и может быть использовано для прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у мужчин.

Гипертоническая болезнь (ГБ, эссенциальная гипертензия) - это хронически протекающее заболевание, основным проявлением которого является артериальная гипертензия, не ассоциированная с патологическими процессами, при которых повышение артериального давления обусловлено известными причинами [Диагностика и лечение артериальной гипертензии [Текст]: рос. рекомендации (четвертый пересмотр) / Рос. мед. о-во по артериальной гипертонии, Всерос. науч. о-во кардиологов; Е.И. Чазова, Л.Г. Ратова, С.А. Бойцов [и др.]. - Москва, 2010. - 34 с. ]. Диагноз ГБ устанавливается при среднем значении двух и более последовательных измерений систолического АД ≥140 мм.рт.ст. и/или диастолического АД ≥90 мм.рт.ст. [Чазова, И.Е. Рекомендации по диагноcтике и лечению артериальной гипертензии / И.Е. Чазова, Е.В. Ощепкова, Ю.В. Жернакова // Кардиологичеcкий веcтник. - 2015. - № 1. - C. 3-30.]. Этиология и патогенез гипертонической болезни активно изучаются как российскими так и зарубежными исследователями. Известными факторами риска развития ГБ являются возраст, половая принадлежность, высокий уровень потребления соли, дислипидемия, абдоминальное ожирение, вредные привычки, частые стрессовые ситуации, низкая физическая активность, а также генетические факторы [Lee HA, Park H. Diet-Related Risk Factors for Incident Hypertension During an 11-Year Follow-Up: The Korean Genome Epidemiology Study. Nutrients. 2018;10(8):1077. Published 2018 Aug 13. doi:10.3390/nu10081077].

По некоторым оценкам, к 2025 г. число больных ГБ достигло 1,56 млрд [Taljaard, M. et al. Cardiovascular disease population risk tool (CVDPoRT): predictive algorithm for assessing CVD risk in the community setting. BMJ Open. 4, 213-219 (2014).]. Ежегодно во всем мире регистрируется более 9,4 млн случаев смерти в результате осложнений ГБ, таких как инсульт, инфаркт миокарда, почечная недостаточность и др. [Tocci, G. et al. Therapeutic approach to hypertension urgencies and emergencies during acute coronary syndrome. High Blood Press. Cardiovasc. Prev. 25, 253-259.].

По результатам зарубежных исследований распространенность артериальной гипертензии среди населения составляет 30-45 %, преобладает среди лиц мужского пола [Артериальная гипертензия у взрослых. Клинические гипертензия рекомендации 2020 / Ж. Д. Кобалава, А. О. Конради, С. В. Недогода [и др.] // Российский кардиологический журнал. - 2020. - Т. 25, № 3. - С. 149-218.]. Высокая частота среди лиц мужского пола также прослеживается и в российской популяции (в возрасте 25-65 лет - 47 % среди мужчин и 40 % среди женщин) [Эпидемиология артериальной гипертензии в Российской Федерации - важность выбора критериев диагностики / А. М. Ерина, О. П. Ротарь, В. Н. Солнцев [и др.] // Кардиология. - 2019. - Т. 59, № 6. - С. 5-11.].

Изучению молекулярно-генетических основ гипертонической болезни на основе анализа ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма отдельных генов-кандидатов (или групп генов-кандидатов) с развитием заболевания посвящено значительное количество работ как зарубежных, так и отечественных ученых. При этом следует отметить, что полученные данные неоднозначны, нередко противоречивы и имеют низкую воспроизводимость. Это определяет необходимость продолжения исследований молекулярно-генетических основ артериальной гипертензии, с использованием новых подходов активно развивающихся в настоящее время системной генетики и сетевой медицины.

Нами были специально отобраны полиморфные локусы генов-кандидатов, связанные с развитием артериальной гипертензии по данным полно-геномных исследований (Churnosov M, Abramova M, Reshetnikov E, et al. Polymorphisms of hypertension susceptibility genes as a risk factors of preeclampsia in the Caucasian population of central Russia. Placenta. 2022;129:51-61. doi:10.1016/j.placenta.2022.09.010). В основу отбора полиморфных локусов для данной работы были положены следующие критерии: статистически значимые при уровне p≤5×10^-8 связи с АГ (или; встречаемость редкого аллеля 0,05 и более; наличие функциональных эффектов (связь с эпигенетическими характеристиками, транскрипцией генов согласно базы данных HaploReg, версия программы 4.1).

В Российской Федерации исследования вовлеченности данных о полиморфных локусах BAG6, AC026703.1 и OBFC1 в формировании предрасположенности к гипертонической болезни у мужчин единичны и фрагментарны, а данные о роли комбинации генотипов генов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1 в развитии гипертонической болезни у мужчин отсутствуют.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2023 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин в зависимости от данных о полиморфных локусах BAG6, AC026703.1 и OBFC1. Источник информации: сайт Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин на основе данных о SNP х SNP взаимодействий и на основе данных о комбинации генотипов генов BAG6, AC026703.1 и OBFC1.

Из области техники известен патент RU №2257139 (опубл. 27.07.2005) Способ прогнозирования возникновения гипертонической болезни. Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии, и может быть использовано при прогнозировании гипертонической болезни (ГБ), в том числе при профосмотрах. У испытуемых оценивают гемодинамический показатель в ответ на нагрузочную пробу. При этом в качестве нагрузочной пробы пациент делает глубокий вдох и задерживает дыхание. Оценивают полноту наполнения пульса до нагрузки и на высоте задержки дыхания и при сохранении или повышении полноты наполнения пульса на высоте задержки дыхания прогнозируют возникновение гипертонической болезни. Способ расширяет арсенал диагностических средств для прогноза гипертонической болезни. Недостаток указанного способа заключается в том, что не рассматриваются сочетания полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития гипертонической болезни, не учитывается половой диморфизм.

В патенте RU №2329503 (опубл. 20.07.2008) описан способ оценки риска прогрессирования артериальной гипертензии у женщин. Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения артериальной гипертензии (АГ). Сущность способа: готовят суспензию эритроцитов в буферном растворе и методом ³¹Р-ЯМР определяют содержание аденозинтрифосфата (АТФ) и 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) эритроцитов в относительных единицах. В зависимости от возраста женщин по прогностическим таблицам определяют процент риска утяжеления течения эссенциальной АГ в ближайшие 5 лет. Использование способа дает возможность регистрировать биохимические параметры энергетического метаболизма эритроцитов, что приводит к верификации медицинского прогноза. Также способ позволяет определить процент риска утяжеления течения эссенциальной АГ у женщин в ближайшие 5 лет. Недостаток метода заключается в сложности анализа и низкой доступности использованного оборудования, кроме того, данный способ применим только для женщин и не рассматриваются генетические полиморфизмы прогнозирования риска гипертонической болезни у мужчин.

Известен патент RU №2456608 (опубл. 20.07.2012) Способ прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин. Изобретение относится к медицине, конкретно к диагностике в кардиологии, и касается способа прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин. Выделяют геномную ДНК из периферической венозной крови пациентов и выявляют генотипы полиморфизмов rs2266782 гена флавиновой монооксигеназы 3 типа, rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1 и rs1799930 гена N-ацетилтрансферазы 2 типа. Оценивают характер употребления алкоголя, факт курения и наличие контакта с вредными химическими веществами. Затем каждому из указанных факторов присваивают соответствующие цифровые значения, после чего по уравнению логистической регрессии с рассчитанными для каждого фактора коэффициентами регрессии рассчитывают натуральный логарифм отношения шансов возникновения гипертонической болезни у пациента. Затем рассчитывают вероятность отнесения пациента к группе с низким - от 1 до 10%, средним - от 11 до 19% или высоким - более 20% риском возникновения гипертонической болезни. Способ обеспечивает существенное повышение точности прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин посредством совместной оценки комплекса генетических и средовых факторов риска заболевания и использования метода логистического регрессионного анализа. Недостаток метода заключается в том, что он не рассматриваются сочетания полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития гипертонической болезни у мужчин.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин на основе данных о полиморфных локусах BAG6, AC026703.1 и OBFC1.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития гипертонической болезни у мужчин русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой, на основе данных о полиморфных локусах BAG6, AC026703.1 и OBFC1, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1;

- прогнозирование высокого риска развития артериальной гипертензии у мужчин при выявлении комбинации генотипов rs805303 GG BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 AA OBFC1.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития гипертонической болезни у мужчин на основе данных о комбинации генотипов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции [Miller, S. A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. A. Miller, D. D. Dykes, H. F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. - 1988. - Vol. 16, № 3. - P. 1215] в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl₂, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20⁰С.

Анализ полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1 осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad) c использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Генотипирование исследуемых образцов осуществлялось с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ).

Метод MDR в его модификации MB-MDR [Mbmdr: an R package for exploring gene-gene interactions associated with binary or quantitative traits / M. L. Calle, V. Urrea, N. Malats, K. Van Steen // Bioinformatics. - 2010. - Vol. 26, № 17. - P. 2198-2199] применялся для изучения интерлокусных взаимодействий, ассоциированных с артериальной гипертензии ом. Рассматривались двух-, трех-, четырех-, пяти- и шестилокусные модели. Расчеты проводили с ковариатами в программе MB-MDR (версия 2.6) в программной среде R. Наиболее значимые модели интерлокусных взаимодействий, связанных с артериальной гипертензии ом, отбирались на основе поправки Бонферрони (при этом рассматривалось число возможных комбинаций изучаемых SNPs генов BAG6, AC026703.1 и OBFC1 при 2-, 3-, 4-, 5- и 6-локусных моделях). В дальнейший анализ (валидация моделей с помощью пермутационного теста) включались модели межлокусных взаимодействий, соответствующие следующим критериям: 2-х локусные модели - p<1,78*10^-3 (<0,05/28), 3-х локусные модели - p<8,92*10^-4 (<0,05/56), 4-х локусные модели - p<7,14*10^-4 (<0,05/70), 5-ти локусные модели - p<8,92*10^-4 (<0,05/56), 6-ти локусные модели - p<1,78*10^-3 (<0,05/28). Для отобранных в соответствии с вышеуказанными критериями наиболее значимых моделей SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с гипертонической болезнью, выполнялся пермутационный тест (проводилось 1000 пермутаций). Статистически значимым считали р_perm≤0,001. Отдельные комбинации генотипов, связанные с риском развития гипертонической болезни у мужчин определялись методом MB-MDR при p<0,05.

Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 821 пациента (таблица 1).

Изучаемые группы включали мужчин русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. Выборки формировались в соответствии с критериями включения и исключения. Критерии включения в группу больных ГБ: 1. Наличие артериальной гипертензии; 2. Русская национальность; 3. Уроженцы Центрально-Черноземного региона РФ. Критерии исключения: 1. Наличие симптоматических или вторичных гипертензий, печеночная недостаточность, почечная недостаточность; 2. Родство с лицами, включенными в исследование; 3. Отказ от участия в исследовании. Критерии включения в контрольную группу: 1. Русская национальность; 2. Уроженцы Центрально-Черноземного региона РФ; 3. Уровень систолического артериального давления <140 мм.рт.ст. и диастолического АД <90 мм.рт.ст. Критерии исключения: 1. Наличие у индивидуума метаболического синдрома, сердечно-сосудистых, аутоиммунных, онкологических заболеваний; 2. Родство с лицами, включенными в исследование; 3. Отказ от участия в исследовании.

Диагноз ГБ устанавливался в соответствии с рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов, на основании результатов клинического и лабораторно-инструментального обследования [Диагностика и лечение артериальной гипертензии: рос. рекомендации (четвертый пересмотр) / Рос. мед. о-во по артериальной гипертонии, Всерос. науч. о-во кардиологов; Е.И. Чазова, Л.Г. Ратова, С.А. Бойцов [и др.]. - Москва, 2010. - 34 с. ]. Общеклиническое, лабораторное, клинико-инструментальное обследование пациентов проводилось в неврологическом и кардиологическом отделениях областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода. В контрольную группу включались лица, проходившие профилактический осмотр в поликлинике областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода. Все пациенты включались в исследование после подписания информированного согласия на использование полученных данных для научно-исследовательских целей. Протокол исследования одобрен этическим комитетом медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета.

В группу больных включались индивидуумы с уровнем систолического артериального давления ≥140 мм.рт.ст. и/или диастолического АД ≥90 мм.рт.ст. Измерение показателей АД проводилось аускультативным методом по Короткову, результатом считали среднее значение трех последовательных измерений. При нахождении на стационарном лечении измерение уровня артериального давления осуществлялось ежедневно.

Для всех пациентов, включенных в исследование, заполнялась специальная анкета-опросник, разработанная профессором Полониковым А.В. (Курский государственный медицинский университет). Анкета включала анамнестические, лабораторные и инструментальные данные, сведения об образе жизни пациента, наличии у него профессиональных вредностей. Кроме того, в анкетах регистрировались данные о наличии у пациентов таких средовых факторов риска артериальной гипертензии, как ожирение, высокий уровень употребления алкоголя, курение, особенности питания (в том числе, употребление жирной пищи, «солевой аппетит», регулярность употребления овощей и фруктов), подверженность стрессам и уровень физических нагрузок.

Все исследования проводились под контролем этического комитета медицинского факультета Белгородского государственного университета с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, связанных с заболеванием, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.

При изучении SNP х SNP взаимодействий наиболее значимой четырехлокусной моделью, вовлеченную в формирование гипертонической болезни у мужчин, является rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1 (р_perm≤0,001). С развитием заболевания наиболее значимая ассоциация выявлена для комбинации генотипов rs805303 GG BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 AA OBFC1 (beta =2,29, p=0,029), имеющей рисковую направленность.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа проведено генетическое обследование мужчин русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и гена rs4387287 гена OBFC1.

У пациента С. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1, была выявлена комбинации генотипов rs805303 GG BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 AA OBFC1, что позволило отнести пациента в группу больных с повышенным риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз артериальной гипертензии у пациента.

У пациента Ф. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1, была выявлена комбинации генотипов rs805303 АА BAG6 × rs1173771 GG AC026703.1 × rs4387287 CC OBFC1, что позволило отнести пациента в группу пациентов с низким риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз у пациента.

У пациента И. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1 была выявлена комбинации генотипов rs805303 GA BAG6 × rs1173771 GA AC026703.1 × rs4387287 CA OBFC1, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз артериальной гипертензии у пациента.

У пациента Я. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs805303 гена BAG6, rs1173771 гена AC026703.1 и rs4387287 гена OBFC1 была выявлена комбинации генотипов rs805303 AA BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 CC OBFC1, что позволило отнести пациента в группу индувидуумов с низким риском развития артериальной гипертензии. При дальнейшем наблюдении диагноз артериальной гипертензии у пациента Я. не подтвердился.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития гипертонической болезни.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, биотехнологии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин по результатам генетического тестирования. Из периферической венозной крови выделяют ДНК. Проводят анализ полиморфных локусов BAG6, AC026703.1 и OBFC1. При выявлении комбинации генотипов rs805303 GG BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 AA OBFC1 прогнозируют высокий риск развития гипертонической болезни у мужчин. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития гипертонической болезни у мужчин русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой, на основе данных о полиморфных локусах BAG6, AC026703.1 и OBFC1. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин по результатам генетического тестирования, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов BAG6, AC026703.1 и OBFC1, при этом высокий риск развития гипертонической болезни у мужчин прогнозируют при выявлении комбинации генотипов rs805303 GG BAG6 × rs1173771 AA AC026703.1 × rs4387287 AA OBFC1.