СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОГО ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРОДУКТА ИЗ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН Российский патент 2024 года по МПК A61K35/51 A61P17/02 

Изобретение относится к области медицины, в частности к заживлению ран, и может быть использовано для лечения глубоких обширных повреждении кожи и мягких тканей и стимуляции их заживления. Описано использование готового к употреблению бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека. Бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека получен путем процедуры децеллюляризации Вартонова студня 0,05% раствором SDS и последующей солюбилизации солянокислым пепсином, как описано в патенте №2795904 [«Способ изготовления бесклеточного матрикса из пуповины человека для создания высокорегенеративного раневого покрытия». Приоритет изобретения 05 июля 2022 г. Калюжная-Земляная Л.И., Товпеко Д.В., Кондратенко А.А., Земляной Д.А., Чернов В.Е., Чеботарев С.В., Волов Д.А.].

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, в частности, к области заживления глубоких ран кожи и мягких тканей и может быть использовано для стимулирования процессов восстановления тканей у пациентов с обширными глубокими ранами.

Обширные или длительно незаживающие раны существенно снижают качество жизни больных, а также увеличивают сроки и стоимость лечения.

Исходы заживления обширных и глубоких ран, сопровождающиеся грубым рубцеванием, также негативно отражаются на качестве жизни пациентов, ограничивая функционирование организма [Прохоров, Д. В. Рубцы кожи: современные представления об этиопатогенезе, клинике и диагностике / Д. В. Прохоров, А. А. Щербенёва, М. В. Нгема, М. Б. Испирьян, М. Ю. Кузнецова // Крымский терапевтический журнал. – 2021. - №2. – С. 18-24]. Когда ограниченность пластических резервов у пострадавшего не позволяет использовать полнослойную кожную пластику, крупные дефекты замещают с помощью свободного расщепленного перфорированного дерматомного трансплантата. Пересадка применяется для лечения поверхностных дефектов кожного покрова глубиной до кожно-жирового и фасциального слоя [Шаповалов, В.М. Реконструктивно-пластический операции при лечении больных с дефектами покровных тканей / В.М. Шаповалов [и др.] // Гений ортопедии, 2014. – №4.– С.58 – 62]. Глубокие и обширные повреждения мягких тканей и кожи, особенно огнестрельные, склонны к инфицированию. Врачу пациентов с крупным глубоким дефектом мягких и костных тканей в сочетании с остеомиелитическим поражением кости приходится решать целый комплекс задач, направленных на борьбу с инфекционным осложнением, возмещением мягкотканого и резецированного костного дефекта [Dougherty, P.J. Joint and long bone gunshot injuries / P.J. Dougherty, R. Vaidya, C.D. Silverton // The Journal of Bone and Joint Surgery, 2009. – Vol. 91. – P. 980 - 997.]. Осевые мышечные лоскуты способны эффективно купировать воспалительный процесс при остеомиелитическом поражении кости [Белоусов, А.Е. Пластическая, реконструктивная и эстетическая хирургия. - СПб.: Гиппократ, 1998. - 744 с.]. Для замещения глубоких остеомиелитических дефектов пластичность материала имеет решающее значение, в связи с этим мышечные и кожно-мышечные лоскуты обладают качественным преимуществом, позволяющим заполнить дефект тканей. Осевые мышечные, кожно-мышечные и комбинированные тканевые комплексы с осевым кровоснабжением способны активно резорбировать раневой экссудат [Troisi, L. The distally based peroneus brevis flap: the 5-step technique / L. Troisi [et al.] // Annals of Plastic Surgery, 2018. – Т. 80, №. 3. – С. 272 – 276.]. Однако даже сочетание хирургической санации с вакуумным дренированием, антибактериальной, вазоактивной, противовоспалительной терапией не гарантирует полноценную элиминацию флогогенов и затухание инфекционного процесса [Давыдов Д.В., Керимов А.А., Беседин В.Д., Найда Д.А., Иванов Г.Г., Щедрина М.А. Лечение огнестрельных ран конечностей с использованием физических и ортобиологических методов. Медицинский вестник ГВКГ им. Н.Н. Бурденко. 2022; 4(10): 5-15. DOI 10.53652/2782-1730-2022-3-4-5-15]. Под угрозой инфицирования и неприживления находится и мышечный лоскут, закрытый расщепленным дерматомом, и сам дерматом, и окружающие ткани. Это увеличивает сроки и снижает анатомо-функциональный результат лечения. Аутодермотрансплантаты, считающиеся «золотым стандартом» лечения обширных и глубоких ран, не приживаются в сайте имплантации примерно в 25-30% случаев в зависимости от характера и локализации ран [Hashmi P.M., Ahmed K., Ali M., Musaddiq A., Hashmi A., Nawaz Z. Lateral supramalleolar flap: Is it based on perforator of peroneal / anterior tibial artery; A cross-sectional study at tertiary care centre. Ann. Med. Surg. (Lond). 2021;71: 102916. DOI: 10.1016/j.amsu.2021.102916, Варганов М.В., Микличев А.А., Богданов К.Д. Опыт использования препарата Реамберин и NPWT-терапии в подготовке ран к аутодермопластике. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2020;(6):76-81. DOI: 10.17116/hirurgia202006176].

Одним из вариантов решения проблемы ускорения регенеративных процессов в ране является повышение концентрации противовоспалительных цитокинов, транскрипционных и ростовых факторов, создание благоприятных условий для миграции в зону дефекта мезенхимальных стволовых клеток реципиента с их последующей дифференцировкой и паракринной активностью, стимуляцией продуцирования компонентов внеклеточного матрикса. Для закрытия раневого дефекта, временного функционирования и создания оптимальных условий для восстановления поврежденных мягких тканей возможно использование бесклеточных тканеинженерных конструкций.

Из уровня техники известно, что продукты тканевой инженерии, или тканеинженерные продукты (ТИП), изготовленные из децеллюляризованных органов и тканей человека и животных, успешно применяются для восстановления объема тканей раневого дефекта и стимулирования регенерации [Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host respons. /S. F. Badylak//AnnBiomedEng. – 2014. – Vol. 42. - № 7. – P. 1517-1527]. Децеллюляризация – это способ получения неиммуногенных биологических препаратов путем удаления клеточных структур и ядерного материала с сохранением структур внеклеточного матрикса (ВКМ), и фиксированных в нем сигнальных молекул.

Основная терапевтическая цель применения бесклеточных продуктов – это создание специфического микроокружения, поддерживающего жизнеспособность и пролиферацию мигрирующих в него пациент-специфических клеток [Севастьянов, В.И. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины. / Севастьянов В.И. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2014. – Т 16. - №3. – С. 93-108]. Постепенная деградация выполнившего свою функцию трансплантата и синтез компонентов собственного ВКМ, а, значит, и восстановление утраченной ткани, является итогом деятельности ТИП [Шехтер, А. Б. Морфология коллагеновых матриксов для тканевой инженерии (биосовместимость, биодеградация, тканевая реакция) / А. Б. Шехтер, А.Е. Гуллер, Л.П. Истранов и др. // Архив патологии. – 2015. – №77(6). – С. 29-38].

Аллогенный материал для децеллюляризации имеет ограниченную доступность. К тому же возрастные изменения донорских тканей неизбежно ухудшают свойства изготовленных из них продуктов [Целуйко, С. С. Морфофункциональная характеристика дермы кожи и ее изменения при старении (обзор литературы) / С. С. Целуйко, Е. А. Малюк, Л. С. Корнеева, Н. П. Красавина // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2016. - №60].

Ксеногенный биоматериал лишен данного недостатка, поскольку срок жизни животных существенно меньше, чем человека. Именно по этой причине создано большое количество коммерческих ТИП из подслизистого слоя тонкого кишечника, мочевого пузыря, клапанов сердца, дермы свиньи, дермы и перикарда крупного рогатого скота и др. [Delgado, L. M. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. / L. M. Delgado, Y. Bayon, A. Pandit, D. I. Zeugolis // Tissue Eng Part B Rev. – 2015. – Vol. 21. - № 3. – P. 298-313; Dziki, J. L. Solubilized extracellular matrix bioscaffolds derived from diverse source tissues differentially influence macrophage phenotype. / J. L. Dziki, D. S. Wang, C. Pineda, B. M. Sicari, T. Rausch, S. F. Badylak // Journal of Biomedical Materials Research Part A. – 2017. – Vol. 105A. – P. 138–147]. Тем не менее, ксеногенный биоматериал создает потенциальный риск передачи инфекции и возникновения отсроченных нежелательных реакций, в том числе отторжения.

Биоматериал провизорных органов человека имеет широкую сферу использования в регенеративной медицине, обусловленную богатым компонентным составом ВКМ и содержанием в нем большого количества сигнальных молекул и факторов роста [Roy, A. Placental Tissues as Biomaterials in Regenerative Medicine. / A. Roy, M. Mantay, C. Brannan, S. Griffiths // Biomed Research International. – 2022. – Vol. 21. - 6751456]. Этот биоматериал человека не подвергается старению, его получают без применения инвазивных процедур от обследованных и проверенных в отношении инфекционных агентов доноров. Еще одним важным его преимуществом является то, что нет этических ограничений для его использования, поскольку он утилизуется после родов как биологический отход.

Провизорные органы человека тщательно исследованы в качестве источника клеток с высоким регенеративным потенциалом [И.В. Арутюнян, А.В. Макаров, А.В. Ельчанинов, Т.Х. Фатхудинов. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки пупочного канатика: биологические свойства и клиническое применение. Гены и клетки. 2015, Т.10, С. 30-38]. Например, детально описано использование мезенхимальных стромальных клеток плаценты и Вартонова студня для стимулирования регенерации поврежденных тканей.

Использование стромального компонента биоматериала Вартонова студня пуповины является относительно новым. Вартонов студень состоит в основном из коллагенов, протеогликанов и гликозаминогликанов (ГАГ), иммобилизованных и встроенных в коллагеновую сеть [E. Bańkowski, K. Sobolewski, L. Romanowicz, L. Chyczewski, and S. Jaworski, “Collagen and glycosaminoglycans of Wharton’s jelly and their alterations in EPH-gestosis,” European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology, vol. 66, no. 2, pp. 109–117, 1996]. ВКМ пуповины содержит множество различных факторов роста, высвобождающихся во время его деградации [Sobolewski K, Małkowski A, Bańkowski E, Jaworski S. Wharton's jelly as a reservoir of peptide growth factors. Placenta. 2005; 26(10): 747-52. doi: 10.1016/j.placenta.2004.10.008. PMID: 16226124].

Наиболее близкими к заявленному решению являются ТИП из децеллюляризованного Вартонова студня пуповины человека, предложенные Beiki, Lu, Yuan, Ramzan, Dubus и Jadalannagari. Исследователи получили биосовместимые и биологически активные ТИП, стимулирующие регенерацию разных тканей [Dubus M, Scomazzon L, Chevrier J, Montanede A, Baldit A, Terryn C, Quilès F, Thomachot-Schneider C, Gangloff SC, Bouland N, Gindraux F, Rammal H, Mauprivez C, Kerdjoudj H. Decellularization of Wharton's jelly increases its bioactivity and antibacterial properties. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2022; 10: 828424. doi: 10.3389/fbioe.2022.828424. PMID: 35360386; Ramzan F, Ekram S, Frazier T, Salim A, Mohiuddin OA, Khan I. Decellularized human umbilical tissue derived hydrogels promote proliferation and chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Bioengineering. 2022; 9: 239. doi: 10.3390/bioengineering9060239 Lu J-H, Hsia K, Su CK, Pan YH, Ma H, Chiou SH, Lin CH. A novel dressingcomposed of adipose stem cells and decellularized Wharton's jelly facilitated wound healing and relieved lymphedema by enhancing angiogenesis and lymphangiogenesis in a rat model. Journal of functional biomaterials. 2023; 14(2): 104. doi:10.3390/jfb14020104. PMID: 36826903; Beiki B, Zeynali B, Seyedjafari E. Fabrication of a three dimensional spongy scaffold using human Wharton's jelly derived extra cellular matrix for wound healing. Materials Science and Engineering C-Materials for Biological Applications. 2017; 78: 627-638. doi: 10.1016/j.msec.2017.04.074. PMID: 28576031; Jadalannagari S, Converse G, McFall C, Buse E, Filla M, Villar MT, Artigues A, Mellot AJ, Wang J, Detamore MS, Hopkins RA, Aljitawi OS. Decellularized Wharton's jelly from human umbilical cord as a novel 3d scaffolding material for tissue engineering applications. PLoS One. 2017; 12(2): e0172098. doi: 10.1371/journal.pone.0172098. PMID: 28222169; Yuan Z, Cao F, Gao C, Yang Z, Guo Q, Wang Y. Decellularized human umbilical cord Wharton jelly scaffold improves tendon regeneration in a rabbit rotator cuff tendon defect model. The American Journal of Sports Medicine. 2022; 50(2): 371-383. doi: 10.1177/03635465211055722. PMID: 34739346]. Lu, Yuan, Ramzan и Jadalannagari не использовали финальную лиофилизацию ТИП, Dubus применили разные виды детергентов и нуклеазы для процедуры децеллюляризации, а Beiki с соавторами применяли химическое «сшивание» коллагенов в изготовленном из пуповины продукте с целью придания ему большей механической жесткости.

В использовании разработанного по нашей технологии продукта применены принципы:

• 1) создания такой формы продукта (сухая, или лиофилизированная), при которой он может быть длительно сохранен без

уменьшения своих биологических свойств в условиях морозильной камеры обычного бытового назначения. Эта форма бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, помимо несомненного преимущества хранения, обеспечивает также абсорбцию экссудата из ран.

• 2) эффективной неразрушительной стерилизации бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека доступным способом с помощью УФО, не повреждающего его биологические свойства;

• 3) применения пациенту разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека неоднократно по мере хирургической обработки раны в сыпучем виде без какой-либо предварительной подготовки в условиях перевязочной/операционной в количестве, зависимом от площади и глубины дефекта кожи и мягких тканей. Этот принцип считаем особо важным для военной медицины, поскольку он может обеспечить оказание помощи пострадавшим на ранних этапах эвакуации.

В основу изобретения положена задача создания способа применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека для заживления ран, который позволяет более эффективно воздействовать на лечение ран, полученных при ранениях.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека для заживления ран, на поверхность раны, покрытую аутотрансплантатом, помещают 1,0 г бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, при этом кратность его применения определяет лечащий врач, она может быть однократной в зависимости от состояния раны, либо многократной через интервал от 3 до 7 суток после очередной хирургической обработки раны.

С целью сохранения ценных регенеративных свойств исходного биоматериала мы сознательно пренебрегли его природными незначительными механическими характеристиками, которые в любом случае не соответствуют механическим характеристикам потенциальных сфер применения изготовленного бесклеточного продукта.

Поскольку известно, что резидентные мезенхимальные клетки Вартонова студня пуповины способны дифференцироваться в направлении хрящевой, костной, жировой ткани, эндотелия и мышечных клеток сосудов, клеток кожи, постольку потенциальными сферами применения продуктов из ВКМ пуповины могут быть восстановление дефектов кожи, хрящевой, костной и мышечной тканей.

Формы продуктов из пуповины могут быть разными. Наш патент [Патент на изобретение №2745995 «Способ изготовления бесклеточного гидрогеля из Вартонова студня пуповины человека для внутрисуставного применения». Приоритет изобретения 16 сентября 2020 г. Калюжная-Земляная Л.И., Чернов В.Е., Чеботарев С.В., Земляной Д.А.] показал эффективность применения инъекционного бесклеточного гидрогеля из Вартонова студня пуповины человека для восстановления травматических дефектов синовиального суставного хряща в эксперименте. Основываясь на результатах этих экспериментальных исследований, мы предположили, что изготовленный гидрогель в высушенной (лиофилизированной) форме может оказаться удобной для иной сферы применения формой.

Представляемый в этой разработке разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека имеет высушенную в вакууме при -800С сухую твердую пористую структуру. Он может быть использован также в виде сыпучей мелкозернистой порошкообразной формы либо в виде пористых пластин модулируемой площади и толщины. Удобство таких сухих форм определяется возможностью и простотой дезинфекции и стерилизации, легкостью нанесения на рану сыпучего продукта независимо от геометрической формы поверхности раны, возможностью длительного хранения в низкотемпературном отделении бытового холодильника. Сухие формы (порошкообразные и в виде пластин) обладают высокой гидрофильностью, способны адсорбировать раневой экссудат, останавливать кровотечения из поврежденных в ране сосудов и проявляют регенеративные эффекты. В нашей лаборатории показано, что разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, хранившийся в течение 1 года при температуре -200С, эффективно ускоряет заживление ран кожи в эксперименте [А.А. Кондратенко, Л.И. Калюжная, Д.В. Товпеко, В.С. Шевелева, Р.И. Глушаков Биологические и функциональные свойства лиофилизированных форм тканеинженерных матриксов из пуповины человека. Вестник трансплантологии и искусственных органов. Том XXV № 1–2023 DOI: 10.15825/1995-1191-2023-1-113-122].

Для изготовления бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека предлагается использовать биоматериал пуповины человека – Вартонов студень с амниотической оболочкой, покрывающей пуповину. С целью создания оптимально удобной формы для применения при повреждениях мягких тканей, пуповина была лишена сосудов, децеллюляризирована, солюбилизирована и подвергнута лиофилизации. По сути, разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека является сухим бесклеточным гидрогелем, представленным в виде трехмерного покрытия либо сыпучей субстанции.

Достигаемым техническим результатом является применение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека в сухом порошкообразном виде для повышения эффективности аутодермопластики. Применение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека обеспечивает адсорбцию раневого экссудата, ускорение эпителизации и приживления аутодермотрансплантата. Разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека сохраняет эффективность при хранении в бытовой морозильной камере в течение года, возможно, и более длительный срок. Перед применением разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека не нуждается в специальной подготовке и может быть использовании на любом этапе аутодермопластики. Заявленный технический результат обеспечивается применением бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, полученным из децеллюляризованного Вартонова студня пуповины человека по нашей технологии в виде сухого пористого измельченного материала, совместно с аутодермотрансплантатом, при котором в раны помещают 1,0 г разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, при этом кратность его применения определяет лечащий врач, она может быть однократной в зависимости от состояния раны, либо многократной через интервал от 3 до 7 суток после очередной хирургической обработки раны.

Заявленный результат обеспечивается также способом изготовления разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, включающим удаление сосудов пуповины, гомогенизацию Вартонова студня, децеллюляризацию ионным детергентом додецилсульфатом натрия (с достаточным количеством промывок), солюбилизацию солянокислым пепсином, лиофилизацию и финишную стерилизацию.

Краткое описание рисунков

Изобретение поясняется фигурами, где на фиг.1 представлен внешний вид разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека; на фиг.2 – эпителий кожных ран свиньи; на фиг.3 – размер ран кожи свиньи на этапах наблюдения; на фиг.4 – внешний вид раны пациента С. при поступлении в клинику; на фиг.5 – А) вид раны на 5-е сутки после операции; Б) инфекционный процесс по периферии раны с частичным поражением трансплантата; В) верхне-внутренний квадрант раны с экссудацией; на фиг. 6 – разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, внесенный в рану пациента после аутодермопластики; на фиг.7 – А) вид раны на 10-е сутки после применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека; Б) значительное уплотнение струпа на большей части площади раны; В) верхне-внутренний и нижне-внутренний квадрант раны очищаются, дефект заполняется грануляциями; на фиг.8 – А) вид конечности на 20-ые сутки после применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека; Б) верхне-внутренний квадрант покрыт струпом, нижне-внутренний квадрант раны частично покрыт струпом; на фиг. 9 – внешний вид левой голени пациента Г. при поступлении в клинику; на фиг. 10 – слева – внешний вид расщепленного дерматомного трансплантата, справа – внешний вид левой голени при перевязке на 5-е сутки после оперативного лечения; на фиг. 11 – внешний вид левой голени при перевязке на 5-е сутки после оперативного лечения, использован разработанный по нашей технологии лиофилизированный бесклеточный продукт из пуповины человека; на фиг. 12 – внешний вид левой голени при перевязке на 25-е сутки после аутодермопластики и на 20-е сутки после применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека.

Осуществление изобретения

Ниже представлено детальное описание заявленного решения. Изготовление бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека осуществлено так, как описано [Патент №2795904 [«Способ изготовления бесклеточного матрикса из пуповины человека для создания высокорегенеративного раневого покрытия». Приоритет изобретения 05 июля 2022 г. Калюжная-Земляная Л.И., Товпеко Д.В., Кондратенко А.А., Земляной Д.А., Чернов В.Е., Чеботарев С.В., Волов Д.А.]. Удаление клеток из биоматериала пуповины человека проводили после 2-3 циклов его замораживания/оттаивания, аккуратного препарирования с целью удаления сосудов. Амниотическую оболочку, покрывающую пуповину, вместе с Вартоновым студнем пуповины подвергали измельчению, гомогенизации и децеллюляризации 0,05% раствором додецилсульфата натрия (SDS) в течение 24 часов при комнатной температуре в шейкере со скоростью 180 об/мин. После удаления остатков детергента путем промывания деионизированной водой полученный продукт лиофилизировали, далее 10 мг сухого продукта солюбилизировали раствором пепсина из расчета 1 мг фермента в 1 мл 0,01 N HCl, pH 2,0, в течение 72 ч при комнатной температуре и шейкировании 180 оборотов/мин. Нейтрализацию пепсина проводили 0,1 N раствором NaOH до pH 7,4 с последующей лиофилизацией по вышеуказанной схеме с получением бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека. Стерилизацию разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека проводили ультрафиолетом мощностью потока UV-C излучения 12 Вт в течении 15 минут. Хранили бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека герметично упакованными при температуре -20ᵒС в течение года.

Форма разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека позволяет сохранять биологически активные свойства ткани пуповины долгое время и использовать стерильный продукт без предварительной подготовки. Разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека может быть представлен как в трехмерной форме, так и в виде порошкообразной сыпучей массы (фиг. 1).

Для подтверждения элиминации ДНК из ткани пуповины проводили электрофорез в агарозном геле. Размер остаточных фрагментов ДНК в разработанном по нашей технологии бесклеточном лиофилизированном продукте из пуповины человека составил менее 200dp. Это обеспечивает неиммуногенность при его применении in vivo и в клинике.

Были изучены влагопоглощающие свойства разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека при 37°С. Бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека увеличивал массу в присутствии физиологического раствора в 22 раза по сравнению с высушенной формой. Это свойство обеспечивает способность разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека поглощать раневой экссудат.

Для исследования биоинтеграции и биологической активности мы изучили влияние разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека на заживление полнослойных кожных ран у животного, анатомическое и гистологическое строение кожи которого имеет максимальное сходство с кожей человека. Для этого свинье проводили обезболивание (внутримышечно Золетил-100 (Virbac, Франция, 10 мг/кг) и Ксилазин (Ксила, Эстония, 0,1 мл/кг) и после тщательного удаления щетины на спине и обработки кожи 70% раствором этилового спирта дермопанчем DMP08 диаметром 8 мм (Sterylab, Италия) наносили по две полнослойные кожные раны глубиной 1 см. Оперативные вмешательства по моделированию полнослойных дефектов кожи производили пятикратно с интервалом 7 суток. В опытные раны помещали 0,01 г разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека. Спустя 35 суток забирали биопсию участков опытных и контрольных ран.

Заживление опытных и контрольных ран происходило без проявлений нежелательных воспалительных реакций. Вокруг разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека не формировалась фиброзная капсула и не была обнаружена массивная инфильтрация лейкоцитарными клетками, что свидетельствует об отсутствии антигенной стимуляции клеток реципиента имплантированным бесклеточным лиофилизированным продуктом из пуповины человека, и, следовательно, о его качественной децеллюляризации.

Формирование отчетливых слоев эпителия ран, содержащих разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, происходило быстрее по сравнению с контролем (фиг.2). Спустя неделю эпителизация контрольной раны произошла не полностью, при этом толщина формирующегося эпителия составила 47,45 (46,65; 48,65), тогда как в ране, содержащей разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека – 75,35 (70,55; 79,83) мкм (p=0,0001 по сравнению с контролем). Через четыре недели: в контроле 88,83 (79,06; 90,84), в ране, содержащей разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека 140,38 (133,47; 143,43) мкм. Через пять недель: 124,40 (121,64; 125,38) и 159,16 (157,48; 161,99) мкм соответственно. Разница в значениях данного показателя в опытных ранах, по сравнению с контролем, на всех этапах исследований была статистически значима (p=0,0001).

Волокна разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, имплантированного в раневое ложе, визуализировались в толще грануляционной ткани на начальных сроках исследования и постепенно подвергались биодеградации, «перемещаясь» через сосочковую и ретикулярную зоны в область гиподермы. При окрашивании трихромом в образцах из ран, содержащих разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, визуализировано образование коллагеновых структур в области грануляционной ткани уже на 3-ей неделе исследования. В контроле сходную картину наблюдали только спустя 5 недель.

По мере заживления площади ран постепенно уменьшались. Спустя 3 недели в контроле площадь раны составила 60,74% от изначальной площади дефекта; рана, содержащая разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, – 55,02%. Через 5 недель эксперимента: 48,05% в контроле, и 42,69% в ране с разработанным по нашей технологии бесклеточным лиофилизированным продуктом из пуповины человека (фиг. 3).

В рамках ограниченных клинических испытаний разработанный нами бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека был применен для лечения пострадавших с минно-взрывным ранением. В результате были определены параметры применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека для заживления ран пострадавших.

Клинический пример 1

Пациент С. госпитализирован с минно-взрывным ранением левой голени и правой стопы. Огнестрельный оскольчатый перелом проксимального метаэпифиза левой большеберцовой кости со смещением отломков, фиксированный аппаратом КСВП. Закрытое слепое огнестрельное ранение верхней трети голени с дефектом мягких тканей. Огнестрельные оскольчатые переломы 3,4,5 плюсневых костей правой стопы со смещением отломков. Закрытое слепое огнестрельное ранение наружной поверхности стопы с дефектом мягких тканей (фиг. 4).

Пациенту неоднократно один раз в 7 дней выполнялась хирургическая обработка ран с иссечением нежизнеспособных тканей, в том числе производилась секвестрэктомия большеберцовой кости, установка промывных систем, а также систем вакуумного дренирования. Пациент получил курс антибактериальной, антикоагулянтной, противовоспалительной терапии. В результате проведенного лечения и контрольного микробиологического исследования, которое подтвердило отсутствие инфекции в ране, выполнена комбинированная мышечно-кожная пластика огнестрельной раны голени. Хирургическая операция по замещению дефекта включала в себя следующие этапы: удалены нежизнеспособные ткани из глубины раны (мышцы, костные осколки, некротизированные элементы большеберцовой кости). Фигурным полуовальным задне-медиальным доступом обнажена медиальная головка икроножной мышцы, мобилизована, часть брюшка отсечена из сухожильной части и выполнена ее подкожная транспозиция в зону огнестрельной раны на переднюю поверхность с плотным укрытием отломков большеберцовой кости. С помощью дерматома извлечен расщепленный кожный аутотрансплантат из области наружной поверхности бедра, которым выполнили пластическое закрытие кожного дефекта. Рана укрыта асептической повязкой, придавлена марлевыми тампонами. Несмотря на продолжающуюся антибактериальную терапию, которая была основана на микробиологическом исследовании чувствительности колоний выявленных бактерий к доступным антибиотикам, заживление дефекта осложнилось развитием инфекционного процесса (фиг.5). Микробиологическое исследование показало контаминацию Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA, Escherichia coli, Acintobacter baumani и определило наиболее оптимальную антибактериальную терапию. Выполняли активную санацию раны с помощью антисептических средств, блокад по Рожкову-Дерябину, повязок с борной кислотой, мазевой повязкой с метилурацилом, левосином. Контрольное микробиологическое исследование подтвердило отсутствие возбудителей инфекции в ране.

С целью повышения концентрации биологически активных факторов, стимулирующих коллагенообразование, рекрутинг стволовых клеток к месту повреждения, васкуляризацию и сосудистую перестройку, применен разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека в порошкообразном виде в количестве 1,0 г на рану после ее хирургической обработки (фиг. 6). В 1-е сутки после применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека отмечали образование струпа размером 60% площади раны. Верхне-внутренний и нижне-внутренний квадрант раны, как наиболее подвергшиеся инфекционному поражению, заполнены серозно-гнойным экссудатом, образования струпа в этих местах в 1-ые сутки не произошло. На 10-ые сутки после применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека струп не только стал плотней, но и покрыл большую часть трансплантата (78% площади раны). При этом экссудат верхне-внутреннего и нижнее-внутреннего квадранта раны приобрел в основном серозный характер (фиг.7).

Заключение травматологов, осуществлявших применение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека: он способствует уменьшению экссудации, быстро формирует покрытие (струп), который является биологической мембраной и способствует оптимальной эпителизации. Бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека положительно влияет на выживаемость свободного кожного трансплантата. В условиях массивного инфекционного поражения аутотрансплантата с помощью бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека удалось его сохранить и обеспечить его полную эпителизацию на 21-е сутки от момента его применения (фиг.8).

Таким образом, этот клинический случай показывает эффективность однократного применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека у конкретного пациента после очередной хирургической обработки раны.

В объяснение достигнутого у пациента С. эффекта применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека можно принять во внимание то, что благодаря достигнутой неиммуногенности разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека при его использовании у пациента не возникает явлений вторичной альтерации. В представленном клиническом исследовании отмечена безопасность применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, не провоцирующего воспалительные реакции. Таким образом, разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека уменьшает выраженность фазы альтерации воспалительного процесса.

Важным свойством разработанного нами бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека является его свойство минимизировать сосудистые реакции воспалительного процесса, которых можно было бы ожидать в ответ на внедрение его в рану. Это выявлено как в эксперименте на крупном лабораторном животном (свинья) [А.А. Кондратенко, Л.И. Калюжная, Д.В. Товпеко, В.С. Шевелева, Р.И. Глушаков Биологические и функциональные свойства лиофилизированных форм тканеинженерных матриксов из пуповины человека. Вестник трансплантологии и искусственных органов. Том XXV № 1–2023 DOI: 10.15825/1995-1191-2023-1-113-122], так и описано в данном клиническом случае. Отсутствие в эксперименте энергичной миграции нейтрофилов, первыми атакующих инородный объект, а позднее – и макрофагов, а так же уменьшение серозного экссудата, описанное в клиническом случае, позволяют сделать заключение о способности разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека модулировать стадию сосудистых реакций воспалительного процесса и активность клеток иммунной системы реципиента.

Приведенный клинический пример показывает, что введение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, примененного лишь однократно после очередной хирургической обработки, в дефект кожи и мягких тканей спустя 1 месяц после получения травмы способствует активному приживлению трансплантата благодаря формированию над ним покрытия (струпа). Учитывая, что состояние раны в момент применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека соответствует пролиферативной стадии воспаления, можно констатировать, что он биологически активен в плане репаративных процессов. Предположительно, это связано с его компонентным составом, представленным структурным полипептидами и гликозаминогликанами, и функциональными регенеративными молекулами клеточной адгезии, факторов роста. В эксперименте на свинье гистологически подтверждено заселение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека клетками реципиента фибробластной морфологии.

Частично замещая дефект кожи в области ячеек перфорированного кожного лоскута, разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека создает благоприятные условия для миграции эпителиальных клеток с рассеченных участков аутотрансплантата. В эксперименте in vivo (свинья) показано, что эпителизация ран, созданных стандартным инструментом (punch), происходит намного быстрее при использовании разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, чем в контроле. Уменьшение диаметра раны, леченной разработанным по нашей технологии бесклеточным лиофилизированным продуктом из пуповины человека, наступает быстрее, чем в контроле, при том, что стягивание краев ран только за счет мышечных клеток в составе дермы не характерно для использованного в эксперименте вида животных (свинья). Предполагаемый механизм контракции раны в наших исследованиях in vivo может состоять в продукции сократительных коллагеновых волокон и эластина клетками фибробластной морфологии, адгезированных к структурам разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека. Таким образом, он способствует стягиванию краев раневого дефекта и ускорению эпителизации. В описываемом нами клиническом случае исследователи отмечают ускорение эпителизации областей свободного кожного лоскута в зоне воздействия разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека. Учитывая, что площадь раны в эксперименте на животном существенно меньше площади дефекта кожи и мягких тканей у пострадавших от ранений, соответственно и количество вносимого в раны пациентов разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека было увеличено до 1,0 грамма на рану.

Таким образом, разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека, временно функционируя в области дефекта, играет роль каркаса для прикрепления к нему пациентспецифических клеток фибробластной морфологии, ускоряя включение пролиферативной фазы воспаления.

Клинический пример 2

Пациент Г. получил огнестрельное ранение левой голени. На четвертые сутки после ранения поступил в клинику Военной травматологии и ортопедии. Установлен диагноз: Огнестрельное осколочное ранение левой нижней конечности с обширным дефектом мягких тканей. Перелом левой большеберцовой кости с обширным дефектом костной ткани (фиг.9).

Проведена хирургическая обработка: удалены инородные тела и фрагменты обмундирования, раны резецированы наркотизированные ткани, укреплен аппарат внешней фиксации.

Пациенту назначена антибактериальная, антикоагулянтная, противовоспалительная, обезболивающая, инфузионная терапия.

Через 18 дней после получения ранения пациенту выполнена операция: аутодермопластика передне-наружной поверхности левой голени расщепленным дерматомным трансплантатом из передней поверхности левого бедра (фиг.10, слева).

В первые сутки после оперативного лечения пациенту дополнительно назначена антиоксидантная, сосудисто-метаболическая терапия, курс гипербарической оксигенациии.

Первая перевязка выполнена на 5-е сутки после оперативного лечения. Оценивая местный статус, в целом отметили удовлетворительное состояние расщепленного кожного лоскута, однако на значимой площади наблюдали частичный лизис дерматома. Последнее связывали с избыточным мокнутием раневой поверхности из-за экссудации (фиг.10, справа).

Для достижения высокой концентрации биологически активных факторов, которые стимулируют образование коллагена, привлекают стволовые клетки к поврежденной области, способствуют образованию новых кровеносных сосудов, был использован разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека с периодичностью нанесения 1 раз в 3 дня в количестве 1 г на рану после очередной хирургической обработки раны (фиг.11). Рана закрывалась асептической повязкой без применения каких-либо других лекарственных средств и медицинских изделий локального действия.

В дальнейшем применяли разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека при перевязках каждые 3 дня после очередной хирургической обработки раны. При этом наблюдали образование сухого струпа, неравномерно покрывающего зону аутодермопластики. Этот эффект связали с высокой гигроскопичностью разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, который поглощал избыточное количество раневого отделяемого. Под струпом визуализировали процесс реэпителизации, а сам струп осуществлял защитную функцию.

Попытки активного очищения зоны дефекта от струпа вызывали капиллярное кровотечение, что косвенно свидетельствует о процессе неоваскуляризации.

На третьей неделе после закрытия дефекта пациенту выполнен остеосинтез костей голени аппаратом Илизарова, компоновка системы тибиализации малоберцовой кости.

На фоне достижения стабильной фиксации отломков аппаратом Илизарова отек стопы значительно уменьшился, снизилось количество раневого отделяемого. На 21-е сутки после аутодермопластики наблюдали самостоятельное очищение области дефекта тканей от струпа (фиг.12). Ремоделированная зона дефекта мягких тканей приобрела окраску схожую с окружающими тканями, а сама зона контакта дерматома с неповреждённой кожей была плотной и не имела четких границ.

В удовлетворительном состоянии пациент переведен для дальнейшего лечения в первый госпиталь по территориальному предназначению.

Подводя предварительный итог апробации метода аутодермопластики в сочетании с разработанным по нашей технологии бесклеточным лиофилизированным продуктом из пуповины человека, использованным в качестве раневого покрытия можно сделать следующие выводы:

- применение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, содержащего богатый набор биологически активных молекул, таких, как ростовые факторы и цитокины, повышает регенеративную способность тканей, проявляющуюся активными процессами неоваскуляризации и реэпителизации в зоне раневого дефекта;

- разработанный по нашей технологии бесклеточный лиофилизированный продукт из пуповины человека обеспечивает защиту раны от вторичного инфицирования и поддерживает оптимальные условия для регенерации тканей, не вызывая аллергические, воспалительные реакции;

- применение разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека поддерживает формирование новой ткани, которая имеет структуру и функциональность, близкую к исходной;

- использование разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека в качестве раневого покрытия в сочетании с расщепленным дерматомным лоскутом способствует снижению объема рубцового образования. Это может быть использовано для достижения эстетически приемлемого рубца.

В данном клиническом случае исходя из состояния, размеров, глубины, осложнений в течении раны лечащий врач принял иное решение о начале применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека; повторял применение его через каждые 3 дня. В то время как обязательная хирургическая обработка ран в клинике принята раз в неделю (раз в 7 суток).

Таким образом, лечащий врач принимает решение о начале применения разработанного по нашей технологии бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, кратности, и в случае многократности его применения – продолжительности интервалов от 3 до 7 суток его применения после очередной хирургической обработки раны.

Изобретение относится к области медицины, в частности к заживлению ран. Используют бесклеточный лиофилизированный продукт, полученный путем измельчения, гомогенизации и децеллюлеризации из пуповины 0,05% раствором додецилсульфата натрия, удаления остатков детергента, солюбилизации раствором пепсина, нейтрализации пепсина, лиофилизации и стерилизации. На поверхность раны, покрытую аутотрансплантатом, помещают 1,0 г бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека однократно или через интервал от 3 до 7 суток после очередной хирургической обработки раны. Изобретение обеспечивает адсорбцию раневого экссудата, ускорение эпителизации и приживления аутодермотрансплантата. 12 ил., 2 пр.

Способ заживления ран, включающий применение бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека и аутодермотрансплантата, отличающийся тем, что используют бесклеточный лиофилизированный продукт, полученный путем измельчения, гомогенизации и децеллюлеризации из пуповины 0,05% раствором додецилсульфата натрия, удаления остатков детергента, солюбилизации раствором пепсина, нейтрализации пепсина, леофилизации и стерилизации; на поверхность раны, покрытую аутотрансплантатом, помещают 1,0 г бесклеточного лиофилизированного продукта из пуповины человека, однократно или через интервал от 3 до 7 суток после очередной хирургической обработки раны.