КОМБИНИРОВАННЫЙ ТРАНСПЛАНТАТ ДЕРМАЛЬНОГО МАТРИКСА С МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАН С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2014 года по МПК A61K35/36 C12N5/775 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть применено для лечения обширных травматических дефектов в хирургии, травматологии и комбустиологии.

Основным методом лечения обширных травматических дефектов является первичная хирургическая обработка (ПХО) раны с последующей, отсроченной кожно-пластической операцией для закрытия дефекта кожи [Алексеев А.А., Светухин A.M., Кузнецов В.А. Современная стратегия и тактика лечения ожогов, ожоговой болезни и обширных гнойных ран. Последипломное образование на современном этапе. - M. - 2000. - c. 277-284].

Для закрытия раны применяют аутодермопластику (АДП) расщепленным лоскутом. Однако результаты АДП в гнойной хирургии остаются неудовлетворительные, что связано с неполной регенерацией кожи и формированием рубца [Губин М.А., Эктов В.Н., Лакатош К.О. Ранние реконструктивно-пластические операции в лечении больных, перенесших термическую травму головы и шеи: Человек и его здоровье. - Курск. - 2000. - Вып, 3. - с.83-84]. Подчеркнем, что при АДП требуется получить кожный лоскут с интактной поверхности тела пациента, что создает дополнительные трудности.

Развитие клеточных технологий открывает новые возможности лечения ран с использованием различных клеток, в том числе мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК). В клинической практике используют аллогенные или аутологичные клетки. Тип используемых клеток определяется предполагаемой тактикой лечения, обусловленной характером патологического процесса. Для стимулирования регенерации за счет резидентных прогенеторных клеток применяют биологически активные факторы, выделяемые из аутологичных или аллогенных клеток при их разрушении in situ или in vitro. В частности, эффективность методики показана в лечении пограничных ожогов, когда сохранен источник регенерации кожи, для стимуляции которого используют аллофибробласты.

При дефиците резидентных прогенеторных клеток выполняют их аутотрансплантацию из интактных областей, например, костного мозга (КМ).

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ лечения Ожеговых ран IIIa степени, разработанный в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, заключающийся в наложении на ожоговую рану повязки, содержащей аллофибробласты [Патент №2320349 «Способ лечения Ожеговых ран» от 27.03.08]. Для ускорения процесса регенерации стимулировали сохранившиеся в дериватах кожи прогенеторные клетки. Стимуляцию клеток выполняют аппликацией на рану биологической повязки, состоящей из перфорированного гидрофобного кремнийорганического полимерного основания, покрытого человеческим коллагеном типа I, с прикрепленными на ней аллофибробластами клеточной линии М-22, полученными в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова. Повязку изготавливают в условиях культурального блока. На расположенную на дне чашки Петри гидрофобную прозрачную перфорированную кремнийорганическую пленку «Карбосил-П», покрытую человеческим коллагеном типа I, переносят аллогенные диплоидные фибробласты клеточной линии М-22 пассажа №15-25. Плотность посева составляет 5,0-7,5×10⁴ клеток на 1 см². Культивирование проводят при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 100% влажности. В качестве культуральной среды используют среду Игла MEM, содержащую 15% сыворотки эмбрионов коров и α-глутамин. В течение 18-24 часов на поверхности полимерного основания фибробласты формируют монослой. На кремнийорганической пленке «Карбосил-П» осуществляют перенос аллофибробластов на рану.

Трансплантация аллофибробластов, согласно способу-прототипу, осуществляется в сроки от момента поступления до 6-х суток после травмы. Оптимальным является наложение этой повязки при поступлении больного в приемное отделение. Перед трансплантацией проводят тщательный туалет ожоговой раны, удаляют с раневой поверхности инородные тела, десквамированный эпидермис, наложения фибрина. Обрабатывают рану раствором антисептика, на ожоги IIIa степени накладывают повязки с аллофибробластами, которые фиксируют влажно-высыхающей марлевой повязкой.

Способ-прототип лечения ожоговой раны имеет следующие недостатки: ограниченные показания к применению только при пограничных ожогах IIIa степени; малое количество аллофибробалстов на 1 см² повязки и короткая продолжительность их жизни в ране (не более 2-3 суток), что не позволяет достаточно эффективно стимулировать регенеративные процессы в условиях глубоких ран, когда отсутствуют резидентные стволовые клетки.

Аутологичные клетки в ране сохраняют свою жизнеспособность в течение длительного времени, обладая способностью замещать резидентные стволовые клетки и стимулируя регенерацию. ДМ является оптимальным биосовместимым носителем, по сравнению с кремнийорганической пленкой.

Таким образом, для лечения пациентов с обширными травматическими дефектами мягких тканей имеется необходимость разработки технологии создания нового комбинированного трансплантата с аутологичными ММСК, применимого на разных этапах лечения.

Технический результат достигается применением технологии получения комбинированного трансплантата: дермального матрикса с аутологичными ММСК, обеспечивающего заживление ран кожи и мягких тканей, за счет ускорения процессов регенерации.

Способ получения комбинированного трансплантата (КТ)

Технология получения КТ включает несколько этапов и осуществляется в условиях культурального блока с обеспечением стерильности и биологической безопасности получаемого трансплантата.

1 этап Получение дермального матрикса

Дермальный матрикс изготавливают из расщепленной кожи человека, заготовленной от донора-трупа, толщиной до 1 мм. Забор кожного лоскута производится в операционной при помощи дискового дерматома с соблюдением правил асептики и антисептики.

Изготовление дермального матрикса разделено на 3 этапа: разделение дермы и эпидермиса, девитализация дермы, обеспечение биосовместимости матрикса. ДМ представляет собой пластину белого или светло-бежевого цвета, состоящую из коллагеновых и эластиновых волокон без клеток и клеточных структур.

2 этап. Получение аутологичных ММСК костного мозга (КМ).

У пациента под местной анестезией или наркозом в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики из крыла подвздошной кости заготавливают КМ. Троакаром прокалывают мягкие ткани, пунктируют кость. К троакару присоединяют шприц объемом 20.0 мл, содержащий 5000 ME гепарина, с помощью которого собирают миелоаспират. Заготавливают 20-40 мл КМ. Не позднее 2-х часов миелоаспират доставляют в культуральный блок. В культуральном блоке из КМ на градиенте плотности Лимфолит р=1.077 выделяют ядросодержащие клетки. Клетки помещают в культуральные флаконы для получения пластикадгезивных клеток. Прикрепившиеся к пластику клетки культивируют 3-4 пассажа в среде ДМЕМ с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки, для получения культуры ММСК. После третьего пассажа в суспензии ММСК определяют фенотип и количество поврежденных клеток. Клеточный материал пригоден для изготовления КТ в случае, если он биобезопасен, содержит 80-95% неповрежденных клеток и более 80% клеток с фенотипом CD105⁺CD90⁺CD45^-CD34^-. В случае признания культуры ММСК пригодной для изготовления КТ, из нее готовят суспензию в культуральной среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с концентрацией клеток не менее 1 млн/мл. Для изготовления КТ используют 1 млн ММСК на 5 см² ДМ.

3 этап. Создание комбинированного трансплантата ДМ с ММСК КМ.

В условиях культурального блока с обеспечением стерильности трансплантат ДМ площадью 25-30 см² помещают в стерильную чашку Петри, соответствующего размера. В чашку Петри на ДМ пипеткой наносят суспензию клеток (ММСК) с концентрацией клеток 1 млн/мл, из расчета 1 млн ММСК на 5 см² ДМ (например, 5 мл суспензии, содержащей не менее 5-6 млн ММСК). Для колонизации ДМ ММСК трансплантат помещают в СО₂-инкубатор при температуре 37°С и 5% концентрации СО₂ в воздухе на 24 часа. Клеточный компонент КТ оценивают витальным окрашиванием флуоресцентным красителем. С сохранением стерильности на КТ пипеткой наносят стерильный флуоресцентный краситель, окрашивающий живые клетки без их повреждения. С помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают количество прикрепившихся клеток. КТ должен содержать на своей поверхности 750-1500 тыс клеток на 1 см².

Описание КТ.

Комбинированный трансплантат представляет собой дермальный матрикс, полученный из донорского слоя дермы путем удаления клеток, с фиксированными к его поверхности аутологичными ММСК в количестве не менее 750-1500 тыс на 1 см². По внешнему виду КТ представляет собой кожную пластину площадью 25-30 см², толщиной 0,4-0,6 мм. При микроскопии на поверхности ДМ визуализируются прикрепленные клетки.

Методика использования.

Способ применяется в лечении ран, требующих пластику в отсроченном периоде.

Противопоказаниями к применению метода являются:

- гемоконтактные инфекции

- злокачественные заболевания крови

- снижение комплаентности пациента (деменция и другие психические заболевания)

- гнойно-септические осложнения

- переломы костей таза.

Для расчета, требуемого для отсроченной пластики количества КТ при ПХО, оценивают площадь раны. КТ изготавливают в количестве, достаточном для полного закрытия раны.

В перевязочной в стерильных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики у пациента снимают повязку с раны. Рану трехкратно обрабатывают стерильными марлевыми тампонами, смоченными 5% водным раствором хлоргексидина, промокают стерильным сухим марлевым тампоном. С целью предотвращения контаминации раны, кожу вокруг раны трехкратно обрабатывают 0,5% спиртовым раствором хлоргексидина, избегая его попадания в рану. После обработки раны стерильный КТ в стерильном лотке перфорируют по всей поверхности скальпелем с частотой 1 перфорация 5 мм на 1 см², для создания путей оттока раневого отделяемого, укладывают на дно раны клетками вниз, моделируют по ране таким образом, чтобы края КТ выступали за края раны не более чем на 0,1-0,3 см. После чего фиксируют стерильной марлевой повязкой.

Сравнительное клинико-экспериментальное подтверждение эффективности КТ.

В клинической практике нами применялся ДМ в качестве временного биологического покрытия у 7 пациентов с обширными травматическими дефектами кожи. При использовании ДМ отмечены следующие положительные аспекты:

- не требует частой смены, что позволяет избегать ежедневных перевязок, субъективно пациентами отмечено снижение болевого синдрома;

- под ДМ создается благоприятная для заживления микросреда, матрикс выполняет барьерную функцию и препятствует контаминации раны;

- после снятия дно раны покрыто яркими мелкозернистыми грануляциями, что препятствует формированию гипертрофических рубцов.

Однако не было замечено объективной разницы в сроках заживления ран при использовании ДМ и при лечении традиционным методом.

Для подтверждения эффективности КТ была проведена серия опытов на мышах.

Экспериментальное исследование проведено на 27 беспородных белых мышах. Все животные были одного возраста (3-5) месяцев. Вес особи составлял 25-30 г. Мышей содержали на обычном рационе вивария. После нанесения раны каждая мышь находилась в отдельной клетке.

Животные были разделены на 3 группы в зависимости от применяемой методики лечения. Под наркозом мышам на освобожденном от шерсти участке спины ножницами иссекали фрагмент кожи диаметром около 10 мм до фасции. Для предотвращения контракции раны края подшивали к полихлорвиниловому (ПВХ) кольцу диаметром 12 мм. Таким образом, площадь раневого дефекта составляла около 2% поверхности тела.

В группе 1 на дно раны укладывали стерильный марлевый тампон, смоченный 5% водным раствором хлоргексидина.

В группе 2 на дно раны укладывали ДМ.

В группе 3 на дно раны укладывали ДМ с прикрепленными к его поверхности аутологичными ММСК (КТ).

Повязки для улучшения контакта с раной подшивали отдельными швами, укрывали марлевым тампоном, который подшивали к ПВХ кольцу.

Вывод животных из эксперимента производили на 3, 7, 14 сутки. Рану с повязкой иссекали, оценивали макроскопическим и гистологическим методом (степень зрелости грануляционной ткани, полнота эпителизации раневой поверхности).

Макроскопическая оценка

При выводе из эксперимента у всех особей нагноения в области раны не наблюдалось. У животных первой группы заживления нет, дно раны покрыто грануляциями. Во второй группе дно раны покрыто струпом, плотно фиксированным на ране. У животных третьей группы отмечено полное заживление раны.

Гистологическая оценка

Окрашенные гемотоксилином-эозином и по методу Ван Гизон гистологические препараты исследовали при увеличении ×100.

В 1-й группе при использовании стерильного марлевого тампона, смоченного 5% водным раствором хлоргексидина, на 3 сутки в дне раны наблюдаются некротические изменения, сосуды подлежащих тканей расширены, полнокровны, с явлениями лейкостаза и лейкодиапедеза, краевая эпителизация слабо выражена. На 7 сутки на поверхности раны формируется массивный струп, наблюдается разрастание краевого эпителиального пласта с частичным врастанием под струп, в дне раны клеточно-тканевой детрит, по периферии формируется незрелая грануляционная ткань. К 14 суткам все дно раны заполнено незрелой грануляционной тканью, эпителизация раневой поверхности неполная. В грануляционной ткани большое количество полимофрно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ), макрофагов и тонкостенных сосудов.

Таким образом, к 14 суткам в данной группе полного заживления раневого дефекта не наблюдается. Сохраняется выраженная воспалительная инфильтрация, сформировавшаяся грануляционная ткань незрелая. Продолжается заживление раны за счет краевой эпителизации.

Во 2 группе на 3 сутки ДМ полностью закрывает рану и превращается в гомогенную оксифильную массу. ДМ инфильтрирован нейтрофилами в месте контакта с раной. В дне раны слабая воспалительная инфильтрация нейтрофилами и макрофагами, появляются единичные фибробласты, новообразованные сосуды отсутствуют. Наблюдается слабое разрастание краевого эпителиального пласта с гипертрофией кератиноцитов. На 7 сутки ДМ превращается в струп. Дно раны заполнено незрелой грануляционной тканью с большим количеством фибробластов и умеренным количеством ПЯЛ и макрофагов. Присутствует большое количество новообразованных тонкостенных сосудов. Отмечается незначительный рост краевого эпителиального пласта под струп. На 14 сутки отмечается выраженный рост эпителиального пласта под струп. В грануляционной ткани сохраняется большое количество тонкостенных сосудов. Отмечается слабая инфильтрация ПЯЛ и макрофагами, преобладают фибробласты.

Таким образом, полного заживления раневого дефекта не наблюдается. Сформировавшаяся грануляционная ткань умеренно зрелая. Продолжается заживление раны за счет выраженной краевой эпителизации.

В 3 группе на 3 сутки КТ полностью закрывает рану, превращается в гомогенную оксифильную массу. КТ инфильтрирован нейтрофилами в месте контакта с раной, под него начинает прорастать краевой эпителий, в ране отмечается слабая воспалительная инфильтрация, появляются новообразованные тонкостенные сосуды, наблюдается активная миграция фибробластов. На 7 сутки отмечается значительный рост регенерирующего эпителиального пласта под КТ, превратившийся в струп, грануляционная ткань умеренно-зрелая с большим количеством полнокровных вертикально ориентированных тонкостенных сосудов, из клеточных элементов преобладают фибробласты, присутствует умеренное количество лейкоцитов. На 14 сутки раневое покрытие отсутствует, произошла полная эпителизация раневой поверхности, эпителий слабо прикреплен к подлежащей ткани, на его поверхности начинает формироваться микрорельеф, в грануляционной ткани снижается количество клеточных элементов и тонкостенных сосудов, хотя они по прежнему вертикально ориентированы, сохраняется небольшое количество ПЯЛ, толщина формирующегося рубца значительно меньше, чем в первой группе.

Таким образом, при использовании КТ наблюдается ускорение созревания грануляционной ткани по сравнению с другими группами. Воспалительная инфильтрация слабая. Наблюдается полное закрытие дефекта новообразованным эпителием.

Во всех группах заживление раневого дефекта происходило за счет краевой эпителизации. Наилучший результат наблюдался в третьей группе, где у всех мышей произошла полная эпителизация, что указывает на более высокие темпы регенерации по сравнению с 1 и 2 группами.

Использование КТ позволяет стимулировать процессы регенерации раны и сокращает сроки эпителизации. При использовании КТ отмечалось сокращение фазы воспаления, однако наблюдалось ускорение созревания грануляционной ткани, что говорит о выделении факторов роста аутологичными ММСК, содержащимися в КТ. Таким образом, сокращение фазы воспаления и выделения факторов роста аутологичными клетками позволяет добиться ускорения эпителизации.

Предложенный способ получения и использования КТ перспективен для применения в клинической практике, в частности для восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для восстановления кожного покрова с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей. Комбинированный трансплантат (КТ) представляет собой дермальный матрикс (ДМ), полученный из донорского слоя с колонизированными на его поверхности аутологичными ММСК в количестве не менее 750-1500 тыс на 1 см². Группа изобретений относится также к способу получения комбинированного трансплантата, включающему забор костного мозга у пациента, получение культуры ММСК, нанесение суспензии ММСК с концентрацией не менее 1 млн/мл на поверхность ДМ из расчета 1 млн ММСК на 5 см² ДМ. Использование данного комбинированного трансплантата обеспечивает заживление ран кожи и мягких тканей за счет ускорения процессов регенерации. 3 н. и 8 з.п. ф-лы.

1. Комбинированный трансплантат для восстановления кожного покрова, состоящий из дермального матрикса (ДМ), полученного из донорского слоя дермы, с колонизированными на его поверхности аутологичными мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК), где ММСК содержатся на поверхности комбинированного трансплантата в количестве не менее 750-1500 тыс клеток на 1 см².

2. Комбинированный трансплантат по п.1, в котором толщина ДМ составляет до 1 мм.

3. Комбинированный трансплантат по п.1, который предназначен для лечения пациентов с обширными травматическими дефектами мягких тканей.

4. Способ получения комбинированного трансплантата по п.1, включающий забор костного мозга (КМ) у пациента, получение культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК), нанесение суспензии ММСК с концентрацией клеток не менее 1 млн/мл на поверхность дермального матрикса (ДМ) из расчета 1 млн ММСК на 5 см² ДМ и колонизацию дермального матрикса мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками до достижения количества ММСК не менее 750-1500 тыс на 1 см².

5. Способ по п.4, в котором для получения ММСК из КМ на градиенте плотности Лимфолит р=1,077 выделяют ядросодержащие клетки, клетки помещают в культуральные флаконы для получения пластикадгезивных клеток, прикрепившиеся к пластику клетки культивируют 3-4 пассажа в среде ДМЕМ с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки, для получения культуры ММСК, после 3-4 пассажа оценивают пригодность культур ММСК для изготовления комбинированного трансплантата (КТ), и в случае пригодности, из нее готовят суспензию.

6. Способ по п.5, согласно которому клеточный материал пригоден для изготовления КТ в случае, если он содержит 80-95% неповрежденных клеток и более 80% клеток с фенотипом CD105⁺CD90⁺CD45^-CD34^-.

7. Способ по п.4, согласно которому суспензию готовят в культуральной среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с концентрацией клеток не менее 1 млн/мл.

8. Способ по п.4, в котором используют дермальный матрикс (ДМ), полученный путем забора кожного лоскута толщиной до 1 мм от донора-трупа, разделения дермы и эпидермиса, осуществления девитализации дермы с получением готового дермального матрикса.

9. Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей, включающий моделирование по форме раны комбинированного трансплантата по п.1, полученного способом по п.4, после чего комбинированный трансплантат перфорируют, укладывают на дно раны поверхностью, заселенной клетками, вниз и фиксируют.

10. Способ по п.8, в котором комбинированный трансплантат перфорируют по всей поверхности с частотой одна перфорация 5 мм на 1 см².

11. Способ по п.8, в котором комбинированный трансплантат (КТ) моделируют по ране таким образом, чтобы края КТ выступали за края раны не более чем на 0,1-0,3 см.