Композиция пробиотического средства на основе штаммов бактериальных культур Pediococcus acidilactici VKM B-3708D (Pediococcus acidilactici 385,) Lacticaseibasillus paracasei VKM B-3709D (Lacticaseibasillus paracasei CTR079) и Weisella cibaria VKM B-3710D (Weisella cibaria 079_18), предназначенного для профилактики и терапии антибиотико-ассоциированной инфекции и терапии функциональных заболеваний кишечника Российский патент 2024 года по МПК A61K9/19 A61K35/744 A61K35/747 A61P1/00 A61P1/12 A61P31/00 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности и представляет собой композицию из смеси пробиотических штаммов, которая может быть использована в производстве лекарственных средств и биологически активных добавок в качестве пробиотика, при этом пробиотические штаммы составляют в итоге готовый пробиотический препарат, предназначенный для профилактики и терапии антибиотико-ассоциированной инфекции и терапии функциональных заболеваний кишечника, а также для терапии и профилактики патологических состояний в качестве средства для коррекции микробиоты кишечника.

Уровень техники

Известна фармацевтическая композиция для терапии воспалительных заболеваний слизистых оболочек кишечника на основе штамма Lactobacillus brevis 47f, проявляющей местную противовоспалительную активность (Патент РФ 2675110). Изобретение обеспечивает восстановление архитектоники эпителия тонкой и толстой кишки, восстановление пролиферации клеток эпителия слизистой оболочки кишечника, продуцирование антиоксидантных веществ, приводящих к снижению уровня процессов свободнорадикального окисления, что помогает предотвратить развитие воспалительного процесса.

Также известна биологически активная пищевая добавка для профилактики воспалительного заболевания кишечника и функциональных кишечных расстройств и способ ее получения, состоящая из штаммов Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus rhamnosus (Патент РФ 2018124574), а также нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, включая микрокристаллическую целлюлозу, лактозу и нутрицевтически приемлемую соль стеариновой кислоты.

Известна также пробиотическая композиция на основе штамма Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM13434) в сочетании со штаммом Lactobacillus plantarum HEAL9 (DSM15312) и ее применение, предназначенная для профилактики и/или лечения аутоиммунитета при целиакии (CDA) или для профилактики и/или лечения целиакии (CD) (Патент РФ 2763311).

Предлагаемое изобретение отличается от известных тем, что содержит новые штаммы микроорганизмов, которые выделены из кишечной микрофлоры людей под номерами соответствующими индивидуальному пациенту Pediococcus acidilactici 385, Lacticaseibacillus paracasei CTR079 и Weissella cibaria 079 18, и депонированым во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) «Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований российской академии наук» под регистрационными номерами Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D соответственно. Технические условия заключались в подборе перспективных кандидатных штаммов композиции пробиотика, включающее в себя штаммы бактерий Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D, которые обладают пробиотическими свойствами, а также характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных, условно-патогенных, в том числе полирезистетных к антибактериальным препаратам микроорганизмов, в том числе в отношении токсинпродуцирующих штаммов Clostridioides difficile, адгезивными свойствами и антибиотикорезистентностью к нескольким лекарственным препаратам, что является перспективным для использования предложенной композиции для коррекции микробиоты кишечника при антибиотикотерапии, а также для терапии и профилактики состояний, возникающих при нарушении состава и функционального состояния микробиоты кишечника, например, при дисбиозах, антибиотик-ассоциированной диарее, воспалительных заболеваниях кишечника и др.

Достигаемым техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является применение новых штаммов микроорганизмов, выделенных из естественного биотопа кишечника человека для профилактики и терапии антибиотико-ассоциированной инфекции и функциональных заболеваний кишечника.

Технический результат изобретения достигается тем, что предлагаемая композиция пробиотического средства представляет собой лиофилизаты изолированных из кишечного биотопа человека живых клеток пробиотических штаммов бактериальных культур Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D, высушенных на лиофильной сушке в защитной среде, например, в сахаро-желатиновой среде или в среде с добавлением 20% обезжиренного молока, представляющая собой кристаллическую или пористую массу беловато-серого или желтовато-бежевого цвета различной интенсивности со специфическим запахом и содержащая не менее 5,0×10⁸ КОЕ/см³ или не менее 5×10⁹ КОЕ каждого из перечисленных пробиотических штаммов в 1 терапевтической дозе пробиотического средства. 1 терапевтическая доза пробиотического средства состоит из 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D, 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Pediococcus acidilactici VKM В-3708D и 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Weissella cibaria VKM B-3710D. Так же в композицию к 2 см² высушенного лиофилизата пробиотических штаммов бактериальных культур добавляют наполнитель, содержащий по меньшей мере один из следующих компонентов: мукоадгезивный компонент, связующий компонент, разрыхлитель, стабилизатор, и помещают в кишечнорастворимую капсулу, например, желатиновую капсулу №3.

Для защиты микроорганизмов от воздействия желудочного сока лиофилизат расфасовывают в кишечнорастворимые капсулы, например, в количестве 1 терапевтическая доза фармацевтической субстанции в 1 желатиновую капсулу №3. Предварительно к лиофилизату фармацевтической субстанции добавляют наполнитель капсул, содержащий по меньшей мере один из следующих компонентов: мукоадгезивный компонент, связующий компонент, разрыхлитель, стабилизатор.

Внедрение таких средств в практику здравоохранения позволит увеличить число благоприятных клинических исходов заболеваний, повысит качество жизни пациентов и снизит расходы на альтернативные варианты терапии, например, такие как антицитокиновая терапия, антибактериальная терапия и др. Применение профилактических и терапевтических средств на основе патентуемых штаммов позволит избежать применения антибактериальной терапии, что имеет большое значение в борьбе с распространяющейся антибиотикорезистентностью патогенов.

Возможность использовать в составе фармацевтической композиции вспомогательные компоненты расширяет возможности способа, повышает биодоступность и стабильность препаратов на основе фармацевтической композиции.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1

Характеристика штамма Pediococcus acidilactici 385 (Pediococcus acidilactici VKM B-3708D)

Pediococcus acidilactici 385 - грамположительные сферические клетки расположены парами. Неподвижные. Неспорообразующие факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы. Колонии гладкие, беловато-серые, на кровяных средах не дают гемолиза. Глюкозу сбраживают до образования газа. Основной ферментативный продукт - лактат. Метаболизируют р-нитрофенил-β-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид, Р-нирофенил-фосфат, трегалозу. Не ферментируют: р-нитрофенил-α-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид, р-нитрофенил-α-D-фукопиранозид, бис-р-нирофенил-фосфат, о-нитрофенил-β-D-Глюкопиранозид. р-нитрофенил-α-β-маннопиранозид, L-лейцин-β-нафтиламид, L-лизин-(3-нафтиламид (кислота), L-пролин-β-нафтиламид, L-триптофан-β-нафтиламид, DL-метионин-β-нафтиламид, глицилглицин-р-нафтиламид, L-аргинин-β- афтиламид, L-лизин-β-нафтиламид (щелочь), L-пирролидонил-р-нафтиламид, уреазу, индол. Каталазотрицательные. Нитрат не восстанавливают, цитохромов не содержат. Резистентны к цефепиму, метронидазолу, цефтаролину, клиндамицину, ванкомицину, цефтазидим/авибактаму, тидезолиду, ципрофлоксацину, линезолиду, амоксиклаву; чувствителен к дорипенему, бензилпенициллину. Обладают высокой антагонистической активностью в отношении полирезистентных штаммов микроорганизмов (Clostridium perfringens hem+, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp., Proteus mirabilis, Escherichia coli hem+, Shigella zonne), а также в отношении 96% клинических штаммов Clostridioides difficile. Валидация принадлежности роду Pediococcus по Сэнгеру - амплификацияфрагмента гена 16S:

Культивирование штамма проводят на агаре для роста анаэробных бактерий (CONDA, Италия). Посевы инкубируют в условиях анаэробного бокса в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10%; Н₂ - 10%) в течение 48 часов).

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 года «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» вид Pediococcus acidilactici не значится, а значит может быть использован в качестве пробиотического штамма.

Пример 2

Характеристика штамма Weissella cibaria 079_18 (Weissella cibaria VKM B-3710D)

Weissella cibaria 079_18 - грамотрицательные, прямые или слегка изогнутые палочки, подвижные, имеют жгутики, не образуют эндоспор, внутри клеток накапливают поли-гидроксибутират. Оксидаза- и каталазотрицательные. Хемоорганотрофы. Менахинон не образуют. Метабилизируют β-нафтиламид, L-лизин-β-нафтиламид (щелочь), L-аргинин-β-нафтиламид, D-L-метионин-β-нафтиламид. Не ферментируют: р-нитрофенил-β-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-α-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-β-ацетил--D-глюкозаминид, р-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид, о-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид, р-нитрофенил-α-D-фукопиранозид, р-нитрофенил-α-D-маннопиранозид, L-лизин-β-нафтиламид(кислота), глицилглицин-β-нафтиламид, глицин-β-нафтиламид, бис-р-нирофенил-фосфат, L-пирролидонил-β-нафтиламид. Резистентны к метронидазолу, ванкомицину и чувствителен к цефепиму, цефтаролину, клиндамицину, цефтазидиму/авибактаму, дорипененму, тидезолиду, ципрофлоксацину, линезолиду, бензилпенициллину, амоксиклаву. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении полирезистентных штаммов микроорганизмов (Clostridium perfringens hem+, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp., Proteus mirabilis, Escherichia coli hem+, Shigella zonne), а также в отношении клинических штаммов Clostridioides difficile. Валидация принадлежности роду Weissella по Сэнгеру - амплификация фрагмента гена 16S:

которая была использована для построения филогенетического дерева (Фиг. 2).

Культивирование штамма проводят на агаре для роста анаэробных бактерий Brucella agar с 5% бараньих эритроцитов (CONDA, Италия). Посевы инкубируют в условиях анаэробного бокса в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10%; Н₂ - 10% в течение 48 часов).

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 года «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» вид Weissella cibaria не значится, а значит может быть использован в качестве пробиотического штамма.

Пример 3

Характеристика штамма Lacticaseibacillus paracasei (Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D) Lacticaseibacillus paracasei CTR079 - грамположительные, микроаэрофилы, неподвижные палочковидные бактерии, в мазках, окрашенных по методу Грама, имеет форму палочек с закругленными концами, расположены одиночно или собраны в цепочки, различной длины от 0,7-1,1 до 3,0-8,0 мкм. Клетки по форме напоминают прямые палочки с четкими контурами и прямыми или слегка закругленными полюсами. Длина основной массы клеток составляет (1,0-1,5) мкм, диаметр (0,6-0,8) мкм. Образуют колонии белого цвета, небольшого размера, гладкие, непрозрачные, выпуклые, сферические. Изображение представлено на фиг. 1. Оксидаза- и каталазотрицательные. Хемоорганотрофы. Менахинон не образуют. Метабилизируют β-нафтиламид, L-лизин-β-нафтиламид (щелочь), L-аргинин-β-нафтиламид, D-L-метионин-β-нафтиламид, трегалозу. Не ферментируют: р-нитрофенил-β-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-α-D-галактопиранозид, р-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид, р-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид, о-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид, р-нитрофенил-α-D-фукопиранозид, р-нитрофенил-α-D-маннопиранозид, L-лизин-β-нафтиламид(кислота), глицилглицин-β-нафтиламид, глицин-β-нафтиламид, бис-р-нирофенил-фосфат, L-пирролидонил-β-нафтиламид. Резистентны к цефепиму, метронидазолу, цефтаролину, клиндамицину, ванкомицину, цефтазидиму, тидезолиду, ципрофлаксоцину, линезолиду. Чувствительны к дорипенему, бензилпенициллину, амоксиклаву. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении полирезистентных штаммов микроорганизмов (Clostridium perfringens hem+, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp., Proteus mirabilis, Escherichia coli hem+, Shigella zonne), а также в отношении клинических штаммов Clostridioides difficile. Активность кислотообразования, определенная титриметрическим методом, при выращивании в среде MRS-1 составляла не ниже 200°Т по Тернеру (°Т).

Валидация принадлежности роду Lactobacillus по Сэнгеру амплификация фрагмента гена 16S:

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 года «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» вид Lactobacillus paracasei не значится, а значит может быть использован в качестве пробиотического штамма.

Пример 4

Анализ антагонистической активности пробиотических штаммов.

Для оценки антагонистической активности использовалась разработанная (Патент на изобретение RU 2670585 С1, 23.10.2018) комбинированная система культивирования (КСК). Результаты оценивались по степени задержки роста тестируемой культуры. Результаты представлены в табл. 1. На основании данных, представленных в табл. 1, можно сделать вывод о том, что у штаммов, отобранных в качестве кандидатных пробиотических штаммов предлагаемого изобретения, определяется высокая активность в отношении токсигенных штаммов Clostridioides difficile и панрезистентных штаммов микроорганизмов, выделенных от пациентов с гнойно-воспалительными осложнениями после перенесенных оперативных вмешательств и являющихся этиологическими агентами гнойно-воспалительных процессов. Пробиотически активные штаммы проявляли высокую антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов.

Пример 5

Анализ антагонистической активности пробиотических штаммов

Было произведено секвенирование полных геномов бактериальных штаммов Lactobacillus paracasei CTR079, Pediococcus acidilactici 385, Weissella cibaria 079 18, входящих в композицию. Использовали модифицированный протокол для выделения ДНК из бактериальных монокультур на основе Qiagen blood and tissue kit (Qiagen, Нидерланды). Библиотеки готовили с использованием набора реактивов Nextera Flex library prep kit (Illumina, США). Секвенирование проводили с использованием системы MiSeq (Illumina, США) и набора реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) (Illumina, США). Контроль качества полученных библиотек проводился с помощью Tapestation 4150 (Agilent Technologies, США), с наборами HighSense DNA Kit (Agilent Technologies, США) согласно протоколу производителя (Фиг. 3).

Секвенирование ДНК образцов проводилось на платформе Illumina MiSeq (Illumina, США) с применением метода парно-концевого чтения (длина прочтения 2×300). Данные секвенирования были проанализированы с помощью fastQC для оценки качества полученных прочтений. На основе этой информации была выработана стратегия фильтрации и очистки прочтений с помощью Trimmomatic, а также удаление дубликатов при помощи FastUniq.

Сборку контигов проводили с использованием модифицированного алгоритма Spades. Контроль качества сборки осуществлялся путем последовательного применения инструментов Mauve и Quast.

Для предсказания устойчивости штаммов к антибиотикам был проведен поиск сигнатурных генов устойчивости к антибиотикам в нескольких базах данных (CARD, ResFinder, MEGARES). Было обнаружено несколько генов, ассоциированных с устойчивостью к линкозамидам и фторхинолонам (Табл. 3).

Поиск генных кластеров, гомологичных известным кластерам, отвечающим за антагонизм (бактериоцинов и активных пептидов), проводили при помощи пакета Bagel4 (DOI: 10.1093/nar/gkt391). Кроме того, проводили геномный майнинг потенциальных потенциальных кластеров бактериоцинов и вторичных метаболитов с использованием сервера Anti-SMASH (doi: 10.1093/nar/gkab335). Данные приведены в табл. 4.

Пример 6

Оценка совместимости пробиотических штаммов

Проведена оценка совместимости пробиотических штаммов Lactobacillus paracasei CTR079, Pediococcus acidilactici 385 и Weissella cibaria 079_18 (Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D).

Была исследована в условиях in vitro антагонистическая активность монокультур пробиотических штаммов в отношении друг друга. Антагонистическая активность тест-штаммов относительно друг друга оценивалась в рамках разработанной ad hoc, методики, базирующейся на принципе двухэтапного культивирования микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы.

Комбинированная система культивирования (КСК) конструировалась следующим образом: изготовленная традиционным способом пластинка агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-arapa) или Brucella agar с 5% бараньих эритроцитов, заключенная в рабочее пространство пластиковой вентилируемой чашки Петри диаметром 90 мм однократного применения, рассекалась стерильным скальпелем строго по диаметру чашки, после чего одна из двух половин агаровой пластинки удалялась, и освободившееся, таким образом, пространство заливалось расплавленным MRS-агаром до уровня, однозначно заданного толщиной пластинки первоначального агара.

Данные по антагонистической активности тестируемых штаммов представлены в табл. 5.

По результатам изучения межштаммовых взаимоотношений исследуемые штаммы не обладали антагонистической активностью друг против друга, таким образом их возможно использовать при создании комбинированного пробиотического средства.

Пример 7

Оценка устойчивости пробиотических штаммов к действию желудочного сока

Для определения использовали образцы 48-часовой культуры пробиотических штаммов микроорганизмов, которую суспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида до получения мутности бактериальной взвеси 1McF и по 1 мл полученной суспензии добавляли к 9 мл желудочного сока. После 30 и 120 минут инкубации при температуре (37±1)°С в анаэробной атмосфере определяли количество жизнеспособных клеток, используя метод десятикратных разведений с высевом по 100 мкл на соответствующие питательные среды с последующим учетом колоний после 48-ми часов инкубации при температуре (37±2)°С в анаэробных атмосферных условиях.

Результаты оценки устойчивости пробиотических штаммов к действию желудочного сока представлены в таблице 6. Установлено, что количество жизнеспособных клеток в контрольных образцах без добавления желудочного сока составляло не менее 10⁹ КОЕ/мл. После инкубации в желудочном соке в течение 30 минут достоверного снижения количества жизнеспособных бактериальных клеток не наблюдали.

После 120 минут инкубации взвеси бактериальных клеток с желудочным соком было отмечено снижение показателя КОЕ/мл на 1 порядок.

Таким образом, результаты эксперимента показывают высокий уровень устойчивости штаммов, входящих в состав патентуемой композиции, к действию желудочного сока, что означает высокий уровень сохранности количественного состава данных пробиотических штаммов при прохождении через кислую среду желудка.

Пример 8

Исследование эффективности композиции пробиотического средства для терапии антибиотик-индуцированной диареи

Исследование было выполнено на инбредных мышах линии С57 В1/6. Протокол индукции антибиотико-ассоциированной инфекции подразумевал трехдневный курс внутримышечного введения клиндамицина (1 раз в день) по 1 мг, что провоцировало нарушение микрофлоры кишечника. С развитием первичных клинико-морфологических проявлений заболевания животным была перорально введена культура Clostridium difficile в дозе 1*10⁶ м.к. в объеме 0,5 см³ (достаточной для обеспечения колонизации кишечного тракта с последующим отягощением патологического процесса). С момента развития у подопытных животных признаков нарушения деятельности ЖКТ (2-3 сутки) было начато введение ГЛФ в количестве 2 терапевтических дозы/сутки в течение 7 суток ежедневно.

На фоне воспроизведения острой модели у животных наблюдалось снижение подвижности, животные становились более вялыми, развивалась сильная диарея. Шерсть приобретала неестественно грязный цвет, теряла блеск и становилась взъерошенной. При наружном осмотре у большинства инфицированных животных наблюдалось воспаление глаз, в том числе с нагноением. На фоне развития диареи развивалось обезвоживание и истощение. При прогоне животных по клетке у отдельных особей фиксировалось затрудненное, поверхностное дыхание и одышка. При осмотре животных во время сна или покоя у отдельных особей фиксировалось подергивание конечностей и нарушение координации. У большинства животных во время наблюдения фиксировались болезненные отклики во время пальпации области брюшка.

При оценке поведенческих реакций у мышей было установлено, что все животные сохраняют двигательную активность, с отсутствием каких-либо нарушении нервной или двигательной активности, не имеющей отличий в контрольной и опытных группах. Проведенное исследование показало отсутствие негативного влияния испытуемого ГЛФ на динамику набора массы лабораторных животных. Исследования влияния испытуемого ГЛФ на гематологические показатели, в том числе биохимические показатели крови, выявили, что при приеме 2 ТД ГЛФ в течение 7 дней наблюдается эффективность ГЛФ как терапевтического средства против антибиотик-индуцированной диареи.

Пример 9

Исследование эффективности композиции пробиотического средства для профилактики антибиотик-индуцированной диареи

Исследование было выполнено на инбредных мышах линии C57BL/6. ГЛФ животным вводили перорально ежедневно в количестве 1, 2 или 3 терапевтических дозы в зависимости от группы. Длительность курса составляла 7 или 14 дней. Через 24 часа после окончания курса ГЛФ моделировали антибиотик-индуцированную диарею. Протокол индукции антибиотико-ассоциированной инфекции подразумевал трехдневный курс внутримышечного введения клиндамицина (1 раз в день) по 1 мг, что провоцировало нарушение микрофлоры кишечника. С развитием первичных клинико-морфологических проявлений заболевания животным была перорально введена культура Clostridium difficile в дозе 1*10⁶ м.к. в объеме 0,5 см³ (достаточной для обеспечения колонизации кишечного тракта с последующим отягощением патологического процесса).

Оценка клинического состояния лабораторных животных не выявила негативных эффектов, оказываемых ГЛФ на организм мышей. На фоне профилактического применения ГЛФ курсом 14 дней была обеспечена 100% сохранность опытных групп животных, вне зависимости от применяемой дозировки, что говорит о эффективной колонизации пробиотических штаммов кишечника животных. Также стоит отметить, что у животных на фоне профилактического применения ГЛФ курсом 14 дней развивались признаки заболевания, но в менее выраженной форме.

При оценке поведенческих реакций было установлено, что все животные сохраняют двигательную активность, с отсутствием каких-либо нарушении нервной или двигательной активности, не имеющей отличий в контрольной и опытных группах. Изучение поведенческих реакций инбредных мышей линии C57BL/6 в период окончания применения ГЛФ показало, что двухкратная и трехкратная доза препарата курсом 14 дней является эффективной для профилактики ААД.

При оценке количественного и качественного состава микробиоты лабораторных животных установлено снижение выделения патогена и количества выявляемых микроорганизмов при 14-дневном курсе применения ГЛФ. Наилучший эффект возникал при применении 2 и 3 ТД в течение 14 дней, что подтверждалось исследованиями крови и оценкой количества зонулина в фекалиях животных.

Таким образом, подтверждена эффективность препарата для профилактики антибиотико-ассоциированной диареи при использовании двух или трех терапевтических доз ежедневно (одна в течение курса длительностью 14 суток).

Пример 10

Исследование эффективности композиции пробиотического средства для терапии функциональных заболеваний кишечника.

Исследование было выполнено на инбредных мышах линии С57 В1/6. В качестве модели функционального заболевания был выбран синдром раздраженного кишечника, индуцированный нарушением микрофлоры кишечника. Индукцию проводили путем перорального введения животным 3,5% раствора декстрансульфат натриевой соли (ДСН) с молекулярной массой 40 кДа на основе стерильного физиологического раствора в течение 1 суток (поилка с обычной питьевой водой заменялась на раствор ДСН). На второй день животных подвергали воздействию стресса путем лишения воды на 2 часа и снижением температуры содержания на 1 час (до 12-15°С). Сразу после окончания второго этапа животных внутрижелудочно инфицировали патогенной культурой Salmonella enteritidis (штамм «Исаченко») в дозе 1*10⁶ м.к. в объеме 0,5 см³ и 1,0 см³ для крыс (обозначенный штамм обладает высокой инфицирующей способностью для грызунов). С момента развития у подопытных животных признаков нарушения деятельности ЖКТ (1-3 сутки для мышей, 2-4 сутки для крыс) начинали введение ГЛФ в предусмотренных дозировках и курсах.

До начала воспроизведения модели у всех животных сохранялся нормальный внешний вид, шерстный покров, характер выделений и поведенческие реакции, не отличались между различными группами. На основании зафиксированных клинических признаков было сделано заключение, что все используемые в эксперименте животные были здоровыми. На фоне воспроизведения модели у животных наблюдалось снижение подвижности, животные становились более вялыми, формировались в группы (кучковались в углу клетки). У большинства животных уже в 1-2 день после заражения развивалась диарея. Область вокруг анального отверстия у большинства животных была испачкана каловыми массами, в том числе зеленого оттенка. Шерсть приобретала неестественно грязный цвет, теряла блеск и становилась взъерошенной. Вследствие моделирования СРК у животных наблюдалось безразличие при взятии на руки, у животных фиксировали воспаления и нагноения глаз, поверхностное дыхание, одышку. Из-за потери аппетита развивалось истощение, вследствие чего снижались двигательная активность, тонус мускулатуры. Все это приводит к отклонениям в походке. При приеме ГЛФ в течение 7 и 14 дней в дозе 2 ТД и 3 ТД, возникшие отклонения и нарушения приходили в норму. Таким образом, 2 дозы ГЛФ ежедневно курсом 7 дней является эффективной схемой для терапии СРК у инбредных мышей линии С57b1/6. У экспериментальных животных было зарегистрировано достоверное снижение показателя содержания зонулина в кале при курсовом введении ГЛФ от 2 ТД в сутки, а также с 7 суток введения ГЛФ наблюдалась положительная динамика массы тела.

Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии. Предложена композиция фармацевтической субстанции пробиотической средства для профилактики и терапии антибиотико-ассоциированной диареи и заболеваний кишечника, содержащая лиофилизаты изолированных из кишечного биотопа человека живых клеток пробиотических штаммов бактериальных культур Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D, высушенных на лиофильной сушке в защитной среде, в сахаро-желатиновой среде или в среде с добавлением 20% обезжиренного молока. Полученная композиция представляет собой кристаллическую или пористую массу беловато-серого или желтовато-бежевого цвета различной интенсивности и содержит не менее 5,0×10⁸ КОЕ/см³ каждого из перечисленных пробиотических штаммов. Штаммы бактерий, входящие в состав композиции, характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных, условно-патогенных, в том числе полирезистетных к антибактериальным препаратам, микроорганизмов. Композиция позволяет увеличить число благоприятных клинических исходов заболеваний, повысить качество жизни пациентов и снизить расходы на альтернативные варианты терапии, например, такие как антицитокиновая терапия и антибактериальная терапия. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 10 пр.

1. Композиция фармацевтической субстанции пробиотического средства, предназначенного для профилактики и терапии антибиотико-ассоциированной диареи и заболеваний кишечника, содержащая лиофилизаты изолированных из кишечного биотопа человека живых клеток пробиотических штаммов бактериальных культур Pediococcus acidilactici VKM B-3708D, Lacticaseibacillus paracasei VKM B-3709D и Weissella cibaria VKM B-3710D, высушенных на лиофильной сушке в защитной среде, в сахаро-желатиновой среде или в среде с добавлением 20% обезжиренного молока, представляющая собой кристаллическую или пористую массу беловато-серого или желтовато-бежевого цвета различной интенсивности и содержащая не менее 5,0×10⁸ КОЕ/см³ каждого из перечисленных пробиотических штаммов.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что 1 терапевтическая доза пробиотического средства состоит из 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Lacticaseibacillus paracasei VKM В-3709D, 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Pediococcus acidilactici VKM B-3708D и 1 части, содержащей не менее 5×10⁹ КОЕ лиофилизата живых бактерий Weissella cibaria VKM В-3710D.

3. Композиция по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что к 2 см² высушенного лиофилизата пробиотических штаммов бактериальных культур добавляют наполнитель, содержащий по меньшей мере один из следующих компонентов: мукоадгезивный компонент, связующий компонент, разрыхлитель, стабилизатор, и помещают в кишечнорастворимую капсулу, например, желатиновую капсулу №3.