Способ моделирования цирроза печени в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61K31/7076 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии, может быть использовано для моделирования цирроза печени и изучения новых способов лечения данной патологии.

Постоянный рост патологии печени на протяжении последних десятилетий является серьезной проблемой как на национальном, так и на глобальном уровне [Параскив А.Л. Особенности эпидемического процесса при хроническом гепатите, циррозе печени и первичном раке печени в республике Молдова // Медицинский альманах. - 2020. - №4 (65). - С. 65-73].

На сегодняшний день более 844 млн человек в России страдают хроническими заболеваниями печени, при этом уровень смертности составляет 2 млн в год, включая 1 млн смертей в результате осложнений, вызванных циррозом печени [Жабаралиев А., Ахмадалиева У.К., Муйдинжонов Р.Б. Диагностика фиброза печени у больных хроническими гепатитами и циррозами печени // Экономика и социум. - 2019. - №12 (67). - С. 466-469].

Циррозы печени и печеночная недостаточность составляют около 30% от общего числа больных с хроническими диффузными заболеваниями печени, находящихся на лечении в специализированных стационарах, при этом по этиологии первое место от общего числа больных занимают алкогольные циррозы (около 40%), второе - вирусные (28%) [Копоть М.Ю., Федотова АА. Сравнительная оценка экспериментальных моделей цирроза печени у крыс, применяемых в изучении заболеваний печени // Известия Российской военно-медицинской академии. - 2018. - Т. 37. №1 S1-1. - С. 337-341].

Несмотря на достижения в области диагностики диффузных заболеваний печени, в том числе цирроза печени, до настоящего времени остается много нерешенных вопросов, касающихся дифференциальной диагностики ранних стадий заболевания. Уточнение диагноза на основании клинических и биохимических критериев не всегда возможно [Гульман М.И., Винник Ю.С., Жестовская С.И., Якимова В.Б., Евдокимова Е.Ю., Якимов С.В. Оценка степени фиброзирования ткани печени при хронических гепатитах и циррозе печени методом дуплексного сканирования // Сибирское медицинское обозрение. - 2005. - №2-3 (35-36). - С. 42-44]. Изложенное выше диктует необходимость разработки моделей заболевания, позволяющих уточнить клинические и лабораторные параметры его проявления на различных стадиях, апробировать варианты схем терапии.

Известен способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих [заявки RU 94026117 от 14.07.1994]. Способ осуществляют следующим образом: млекопитающих помещают в клетку, где находится открытый резервуар с 70% раствором формалина, что соответствует концентрации формалина во вдыхаемом воздухе 17,5-18,5 мг/л. Млекопитающих содержат в клетке при данной концентрации формалина во вдыхаемом воздухе в течение 5-7 месяцев, после чего по истечении 5 месяцев одну группу млекопитающих исследуют на наличие патологии печени (гепатит), а другую после 7 месяцев исследуют на наличие патологии печени (цирроз). Недостатком предложенного способа является длительный срок реализации, сложность достижения желаемого результата у всех животных.

Известен способ моделирования токсического поражения четыреххлористым углеродом в токсикологическом эксперименте [патент RU 2487421 от 10.07.2013]. Для реализации модели четыреххлористый углерод марки ХЧ (CCl4) вводят крысам-самцам перорально через день из расчета 0,1 мл на 100 г массы животного в течение 21 дня. Способ, являясь простым, доступным и безопасным, обеспечивает в короткие сроки создание модели подострого токсического поражения печени. Однако патология, вызываемая данным веществом, имеет резко специфический характер, а также отличается отсутствием выраженной степени заболевания.

Известен способ моделирования цирроза печени путем введения в желудок лабораторного животного два раза в неделю в течение месяца 50% раствора совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10% раствора этанола вместо воды для питья, [патент RU 2197018 от 20.01.2003]. Способ позволяет повысить воспроизводимость и упростить методику, приблизить срок к клиническому течению данной патологии. Основным недостатком данного способа является невозможность достижения нужного результата в короткий промежуток времени.

Разработка новых экспериментальных способов моделирования цирроза печени позволит более детально изучить патогенез и морфологическую картину заболевания, отработать современные методики лечения.

Технический результат - формирование цирроза печеночной ткани в срок до 14 суток, простота выполнения, выраженные морфологические изменения тканей печени.

Технический результат достигнут тем, что лабораторному животному, крысе линии Вистар, интраоперационно в паренхиму печени производили 10 последовательных инъекций, адеметионина в концентрации 400 мг/мл., объем каждой 0,1 мл. Каждую следующую инъекцию выполняли незамедлительно, после окончания предыдущей.

Эксперимент проводили на белых крысах линии Вистар массой 210-220 г., половозрелых самцах без признаков заболевания в полном соответствии с «Конвекцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» принятой Советом Европы (Страсбург, Франция, 1986) и согласно приказу лабораторной практики Российской Федерации МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.

Предварительные эксперименты касались определения глубины введения препарата в паренхиму печени, расстояния между инъекциями, их числа, необходимого для покрытия всей поверхности органа.

Концентрация адеметионина была определена экспериментальным путем. При введении адеметионина в концентрации 200 мг/мл - цирротические изменения в печени отсутствовали, при введении адеметионина в концентрации 300 мг/мл и 350 мг/мл - цирротические изменения в печени были точечными, цирроз наблюдали только в месте инъекции раствора. При введении адеметионина в концентрации 400 мг/мл и более - цирротические изменения затрагивали печень в полном объеме. Таким образом, для эксперимента была выбрана минимальная концентрация адеметионина, приводившая к циррозу всей ткани печени.

Глубина введения от 2 мм до 4 мм зависит от толщины печеночной доли. В краевой зоне долей печени глубина введения составила 2 мм, что связано с возможностью прокола паренхимы печени насквозь при более глубоком введении. В области утолщения долей печени максимальная глубина введения иглы составила 4 мм. Следует отметить, что экспериментально выявлено отсутствие влияния глубины введения препарата на формирование цирроза печени. Статистически значимых различий при морфологическом анализе выявлено не было.

Необходимое и достаточное для получения эффекта расстояние между последовательными инъекциями было определено экспериментальным путем и составили 5 мм. При расстоянии между инъекциями более 5 мм при морфологическом анализе цирротические изменения в краевой зоне были по всей поверхности печени, в центральной зоне печеночных долей наблюдали лишь точечный цирроз. При инъекциях адеметионина на расстоянии 2 мм, 3 мм и 5 мм друг от друга морфологические изменения были одинаковыми, при расстоянии менее 2-х мм на трактовку картины изменений влияло наличие морфологических изменений, которые могут быть взывания механическим повреждением ткани печени крыс.

Таким образом, оптимальное расстояние между последовательными точками укола иглы были принято в 5 мм, поскольку при расстоянии 2, 3 или 4 мм для покрытия всей площади печени требовалось бо'льшее количество инъекций, что требует перерасчета общей дозы препарата и сопряжено с вероятностью проявления иный, помимо заявленных в описании нашего способа, эффектов.

Основное исследование, включающие тщательный морфологический анализ тканей, выполнено на 12 крысах. Животных разделили на 2 группы - контрольную и опытную, по 6 особей в каждой.

Операцию выполняли под внутримышечным наркозом с помощью препарата «Золетил-100» в дозе 8 мг/кг в асептических условиях. В качестве хирургического доступа использовали косой подреберный разрез от верхушки мечевидного отростка до свободного края XI ребра. В рану вводили ранорасширитель с целью визуализации всей поверхности печени. В контрольной группе животным выполняли 10 внутрипеченочных инъекций по 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия на глубину 2-4 мм, на расстоянии друг от друга 5 мм. В опытной - в паренхиму печени производили последовательно при помощи тонкой иглы инсулинового шприца 10 инъекций по 0,1 мл адеметионина в концентрации 400 мг/мл также на глубину 2-3 мм, на расстоянии друг от друга 5 мм. Каждая последующая инъекция выполнена незамедлительно сразу после предыдущей, после чего рану послойно ушивали.

Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки после операции, проводили микроскопическую оценку печеночной ткани.

Морфологический анализ включал в себя идентификацию ретикулярных и коллагеновых волокон в строме печени с помощью гистохимических протоколов (окрашивание по Массону-Голднеру, импрегнация серебром).

Идентификацию ретикулярных волокон в строме печени выполняли с помощью гистохимических протоколов (импрегнация серебром). При оценке количества ретикулярных волокон в строме печени на 14-е сутки отмечали значительное увеличение данного показатели при внутрипеченочном введении адеметионина. Количество ретикулярных волокон на 30 полей зрения, что эквивалентно единице площади 314,44 см³, в опытной группе превышало значения контрольной более чем в 2 раза и составило - 12484,00±64,72 ед, в контрольной группе - 5004,38±88,79 ед.

В контрольной группе наблюдали равномерно сформированную ретикулярную сеть (фиг. 1). В опытной группе отмечали утолщение ретикулярных волокон, увеличение числа их пересечений друг с другом с формированием плотной ретикулярной сети, следует отметить, что наибольшее количество ретикулярных волокон располагалось по периферии печеночных долек (фиг. 2).

С целью выявления изменений качества и количества коллагеновых волокон при окраске по Массону-Голднеру оценивали расположение, размер и количество коллагеновых волокон в строме печени. В опытной группе отмечали увеличение количества и утолщение коллагеновых волокон (фиг. 4), в сравнении с контрольной группой (фиг. 3). Наибольшее количество коллагеновых волокон в группе исследования отмечали по периферии печеночных долек, формирование периваскулярного фиброза (фиг. 4, элемент 3), кроме того, ближе к периферии печеночных долек были отмечены единичные очаги замещения печеночной ткани скоплением коллагеновых волокон.

Полученные результаты морфологического анализа позволяют констатировать возможность моделирования цирроза печени путем внутрипеченочного введения адеметионина.

Крыса №1, контрольная группа, самец линии Вистар, возраст - 3 месяца, масса - 212 гр.

Выполнение операции.

Операцию выполняли под внутримышечным наркозом с помощью препарата «Золетил-100» в дозе 8 мг/кг в асептических условиях. В качестве хирургического доступа использовали косой подреберный разрез от верхушки мечевидного отростка до свободного края XI ребра. В рану вводили ранорасширитель с целью визуализации всей поверхности печени. Животному выполняли 10 внутрипеченочных инъекций по 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. После чего рану послойно ушивали.

Животное вывели из эксперимента на 14-е сутки после операции, проводили микроскопическую оценку печеночной ткани.

Оценка результатов.

Морфологический анализ включал в себя идентификацию ретикулярных и коллагеновых волокон в строме печени с помощью гистохимических протоколов - окрашивание по Массону-Голднеру, импрегнация серебром (фиг. 1, 3).

Идентификацию ретикулярных волокон в строме печени выполняли с помощью гистохимических протоколов (импрегнация серебром) на 14-е сутки.

Количество ретикулярных волокон на 30 полей зрения (314,44 см³) составило - 4994 ед. Утолщения ретикулярных волокон не отмечали, ретикулярная сеть была характерна для здоровой печени.

С целью выявления изменений качества и количества коллагеновых волокон при окраске по Массону-Голднеру оценивали расположение, размер и количество коллагеновых волокон в строме печени. Толщина и расположение коллагеновых волокон было типично для здоровой печени.

Крыса №7, опытная группа, самец линии Вистар, возраст - 3 месяца, масса - 217 гр. Выполнение операции.

Операцию выполняли под внутримышечным наркозом с помощью препарата «Золетил-100» в дозе 8 мг/кг в асептических условиях. В качестве хирургического доступа использовали косой подреберный разрез от верхушки мечевидного отростка до свободного края XI ребра. В рану вводили ранорасширитель с целью визуализации всей поверхности печени. Животному в паренхиму печени производили 10 инъекций по 0,1 мл адеметионина в концентрации 400 мг/мл. После чего рану послойно ушивали.

Животное вывели из эксперимента на 14-е сутки после операции, проводили микроскопическую оценку печеночной ткани.

Оценка результатов.

Морфологический анализ включал в себя идентификацию ретикулярных и коллагеновых волокон в строме печени с помощью гистохимических протоколов - окрашивание по Массону-Голднеру, импрегнация серебром (фиг. 2, 4).

Идентификацию ретикулярных волокон в строме печени выполняли с помощью гистохимических протоколов (импрегнация серебром). При оценке количества ретикулярных волокон в строме печени на 14-е сутки отмечали значительное увеличение данного показателя. Количество ретикулярных волокон на единицу площади (314,44 см³) составило - 12501 ед. У животного отмечали утолщение ретикулярных волокон, учащение их пересечений друг с другом с формированием плотной ретикулярной сети, следует отметить, что наибольшее количество ретикулярных волокон располагалось по периферии печеночных долек.

С целью выявления изменений качества и количества коллагеновых волокон при окраске по Массону-Голднеру оценивали расположение, размер и количество коллагеновых волокон в строме печени. У животного отмечали увеличение количества и утолщение коллагеновых волокон. Наибольшее количество коллагеновых волокон наблюдали по периферии печеночных долек, отмечали формирование периваскулярного фиброза.

Описание к фигурам:

Фигура 1. Крыса №1, контрольная группа, морфологическая картина ретикулярных волокон печени. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Методика: импрегнация серебром. х20

1 - неутолщенные ретикулярные волокна, характерные для здоровой структуры ткани печени.

Фигура 2. Крыса №7, опытная группа, морфологическая картина ретикулярных волокон печени. 14 сутки. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Методика: импрегнация серебром. х20

2 - утолщенные ретикулярные волокна.

3 - зона со сформированной неравномерной, плотной ретикулярной сетью.

Фигура 3. Крыса №1, контрольная группа морфологическая картина коллагеновые волокон печени. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Методика: окрашивание по Массону-Голднеру. х20

4 - неутолщенные коллагеновые волокна, характерные для здоровой структуры ткани печени.

Фигура 4. Крыса №7, опытная группа, морфологическая картина коллагеновых волоки печени. 14 сутки. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Методика: окрашивание по Массону-Голднеру. х20

5 - периваскулярный фиброз.

6 - утолщенные коллагеновые волокна.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для моделирования цирроза печени. Крысам линии Вистар интраоперационно вводят в паренхиму печени адеметионин. Производят 10 последовательных инъекций на глубину 2-3 мм, на расстоянии между точками введения препарата 5 мм. Препарат вводят в дозе 0,1 мл в концентрации 400 мг/мл. Способ обеспечивает более простое выполнение формирования модели цирроза печеночной ткани в срок до 14 дней, что в свою очередь позволяет детально изучить патогенез и морфологическую картину заболевания и отработать современные методики лечения. 4 ил., 1 пр.

Способ моделирования цирроза печени в эксперименте, включающий использование крыс линии Вистар и интраоперационное введение препарата в паренхиму печени, отличающийся тем, что производят 10 последовательных инъекций по 0,1 мл адеметионина в концентрации 400 мг/мл на глубину 2-3 мм, на расстоянии между точками введения препарата 5 мм.