Штамм Trichothecium roseum HPL21/2.2 - гиперпаразит возбудителя парши яблони Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания биопрепарата для защиты яблони от парши.

В настоящее время при разработке микробиологических препаратов для растениеводства исследователи отдают предпочтение тем штаммам микроорганизмов, которые обладают выраженной комплексной биологической активностью.

Известны различные штаммы грибов, которые обладают гиперпаразитической активностью в отношении фитопатогенных грибов, многие из которых относятся к роду Trichoderma. Например, в условиях in vitro был показан паразитизм нескольких штаммов грибов рода Trichoderma в отношении возбудителей корневой гнили яблони {Fusarium sporotrichioides Sherb.) и инфекционного усыхания генеративных органов винограда (F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg, F. oxysporum Schlecht.) [Юрченко Е.Г., Якуба Г.В., Насонов А.И., Савчук Н.В., Астапчук И.Л., Буровинская М.В. Анализ скрининга аборигенных штаммов-антагонистов Trichoderma spp.для использования в биотехнологиях контроля новых заболеваний яблони и винограда в Краснодарском крае // Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия. 2022. Т. 34. С. 158-165]. Недостаток данных штаммов: не изучено их действие на возбудителя парши яблони.

Известен штамм Trichoderma viride Pers. ex. S.F. Gray 16 [Патент РФ №2170511], проявляющий гиперпаразитическую активность против широкого спектра возбудителей болезней растений, относящихся к родам Fusarium, Helminthosporium, Rhizoctonia, Pythium, Sclerotinia, Alternaria, Verticillium и др. Также известен штамм Trichoderma asperellum OPF-19, который подавляет рост и развитие многих фитопатогенных грибов, таких, как Ascochyta pisi, Cercospora beticola, Claviceps purpurea, Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Passalora fulva, Verticillum dahliae, как за счет продукции антифунгальных метаболитов, так и за счет способности к гиперпаразитизму [Патент РФ №2634415]. Общим недостатком двух данных штаммов является отсутствие данных о их гиперпаразитической активности в отношении возбудителя парши яблони.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Trichoderma viride штамм ТК-10, используемого в составе биопрепарата Триходермин [Патент РФ №93050147]. Недостатком препарата является отсутствие информации о механизме антагонистической активности данного штамма против Venturia inaequalis, а также о длительности и сложности его культивирования, неизвестно количество пересевов, что удорожает процесс, или снижает качество биопрепарата.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение штамма гриба, обладающего гиперпаразитической активностью в отношении возбудителя парши яблони Venturia inaequalis (Cook) G. Winter.

Технический результат достигнут путем получения штамма гриба Trichothecium roseum HPL21/2.2. Штамм депонирован во Всероссийской биоресурсной коллекции полезных микроорганизмов в области генетических технологий для сельского хозяйства Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии» (ФГБНУ ВНИИСХМ, Санкт-Петербург, Россия), под номером RCAM05940.

Специфика штамма заключается в высокой гиперпаразитической активности в отношении фитопатогена Venturia inaequalis. Также для штамма отмечается повышенная конкурентоспособность, скорость роста и активное спороношение.

Штамм Trichothecium roseum HPL21/2.2 был выделен из белого мицелиального налета на конидиальных поражениях парши яблони на листьях сорта яблони Джонаголд, найденных во время маршрутных обследований промышленного садового насаждения в ст. Новомалороссийская, Выселковский район, Краснодарский край, 13.08.2021.

Штамм получен путем перенесения части воздушного мицелия гиперпаразита энтомологической иглой с пораженного пятна парши без поверхностной стерилизации листа на картофельно-глюкозный агар (КГА) в 3-кратной повторности. Рост колонии длился 7 дней при температуре 25°С. Далее отбирали культуры с постоянными морфолого-культуральными характеристиками, отслеживали однородность колонии по характеру воздушного и субстратного мицелиев. Чистые культуры, содержащие стерильные секторы, отличающиеся по цвету или структуре от исходной культуры, отбраковывали.

Штамм стабильно сохраняет морфологические и культуральные свойства, и гиперпаразитическую активность в течение 10 пересевов.

Для штамма присущи следующие морфолого-культуральные характеристики.

Колонии умеренно быстрорастущие, плоские, вначале белые, но с возрастом становятся розовыми или оранжевыми. Для структуры воздушного и субстратного мицелия характерна зональность в виде концентрических зон. При росте на картофельно-глюкозном агаре (КГА) при 25°С в естественных световых условиях день-ночь размер колонии на 7-е сутки инкубации составлял 65 мм (фиг. 1).

Конидиеносцы гриба длинные, неразветвленные, несут конидии. Конидии размером 8-10×12^-18 мкм, двухклеточные, гладкие, слегка шероховатые, толстостенные, от прозрачных до светлоокрашенных, грушевидной или булавовидной формы, с базальным рубцом (фиг. 2). Место их прикрепления к конидиофору заметно усечено. Они расположены бок о бок и образуют вытянутую группу.

Микроорганизм идентифицирован методом секвенирования гена, кодирующего 18S рРНК. Таксономическая принадлежность штамма Trichothecium roseum HPL21/2.2 была определена с использованием анализа последовательности рДНК-ITS.

Частичная последовательность ITS 1, внутреннего транскрибируемого спейсера 1 штамма Trichothecium roseum HPh21/2.2:

Проведенные исследования выявили 100%-е сходство с изолятами, обозначенными как Trichothecium roseum штамм TY200-03 (МТ093263), штамм YT-1 (MN882763), штамм MF1221 (МН243426), штамм МНТ-2-1 (МШ72207)идр.

Реализация использования штамма Trichothecium roseum HPL21/2.2 как гиперпаразита для защиты яблони от парши.

Пример 1. Оценка гиперпаразитических свойств штамма Trichothecium roseum HPL21/2.2 в отношении возбудителя парши яблони Venturia inaequalis в условиях in vitro.

Антагонизм штамма Trichothecium roseum HPL21/2.2 к Venturia inaequalis оценивали с использованием подхода агаровых блоков. Чашку Петри диаметром 90 мм с КГА инокулировали блоком агара с мицелием фитопатогена. При этом агаровый блок располагали на расстоянии 20 мм от одного из краев чашки. Для получения колонии V. inaequalis диаметром 10-30 мм, посев инкубировали в течение 30 суток при 20°С в темноте. Другую чашку Петри с аналогичной питательной средой инокулировали блоком агара с мицелием штамма HPL21/2.2. Для получения колонии гиперпаразита диаметром 30 мм посев инкубировали в течение 7 суток при комнатной температуре в условиях естественного освещения (день-ночь). Далее из чашки со свежим 7-м суточным посевом Trichothecium roseum стерильным пробковым буром из края колонии вырезали блок диаметром 5-6 мм и переносили в чашку Петри с 30-ти суточной культурой V. inaequalis, помещая инокулянт на расстоянии 30 мм от колонии фитопатогена. В качестве контроля выступала чашка Петри с 30-ти суточным посевом возбудителя парши яблони, но к которой не помещали агаровый блок с Т. roseum. Контрольные и опытные чашки с культурами помещали в термостат при 25°С. Оценку роста мицелия сращиваемых культур проводили на 7-е сутки после инокуляции агаровым блоком гиперпаразита. Варианты эксперимента повторяли в 4-х кратной повторности.

По окончании эксперимента отмечали нарастание антагониста на колонию патогена (гиперпаразитическая зона).

Пример 2. Оценка гиперпаразитических свойств штамма Trichothecium roseum HPL21/2.2 в отношении возбудителя парши яблони Venturia inaequalis в условиях in vivo.

Пять чашек Петри диаметром 90 мм со средой КГА засевали агаровыми блоками с мицелием штамма HPL21/2.2 и инкубировали при комнатной температуре в условиях естественного освещения (день-ночь). Через десять дней к полученным культурам Т. roseum добавляли 20 мл стерильной воды и соскребали воздушный мицелий со спорами паразита с использованием стерильного скальпеля с поверхности агаризованной среды. Далее полученные суспензии конидий и мицелия из пяти чашек Петри объединяли и фильтровали через четыре слоя марли. Концентрацию спор в полученной суспензии определяли с помощью камеры Горяева и доводили до 1*10⁶ конидий/мл. Листья яблони со свежими симптомами поражения паршой, имеющие вид темно-оливковых пятен, отбирали в саду. По два листа пораженными участками вверх помещали в чашки Петри со смоченным диском фильтровальной бумаги для создания условий влажной камеры. Далее эти листья опрыскивали суспензией спор Т. roseum с использованием распылителя для комнатных цветов, так, чтобы листья были покрыты каплями небольшого размера. Чашки с инокулированными листьями накрывали крышками и инкубировали в термостате при 20°С около двух недель. Эксперимент повторяли на десяти листьях. Через 2 недели инкубации на пятнах парши наблюдали белый налет грибной природы. Гиперпаразит был повторно изолирован на среде КГ А. Для этого мицелий гиперпаразита с поверхности пораженного пятна парши переносили кончиком стерилизованной в пламене горелки гистологической иглы на свежую среду КГА уколом в центр чашки Петри. Посев инкубировали в течение 7-ми суток при комнатной температуре в условиях естественного освещения (день-ночь). После этого наблюдали развитие культуры Trichothecium roseum HPL21/2.2 с характерным воздушным мицелием розового или оранжевого цвета с зональной структурой, как описано выше.

Полученный штамм гриба обладает гиперпаразитическими свойствами против парши яблони и характеризуется повышенной конкурентоспособностью, высокой скоростью роста и активным спороношением: обеспечивает за 7 дней нарастание мицелия на колонию V. inaequalis, допускает 10 пересевов без потери активности и на 100% подавляет возбудителя парши.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм микроскопического гриба Trichothecium roseum HPL21/2.2, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05940. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к возбудителю парши яблони Venturia inaequalis и может быть использован для создания биопрепарата для защиты яблони от парши. Изобретение позволит повысить качество плодов яблони, урожайность; уменьшить пестицидный прессинг на окружающую среду и повреждающее действие фунгицидов на деревья. 2 ил.

Штамм гриба Trichothecium roseum HPL21/2.2, депонированный во Всероссийской биоресурсной коллекции полезных микроорганизмов в области генетических технологий для сельского хозяйства ФГБНУ ВНИИСХМ, под регистрационным номером RCAM05940 для защиты яблони от парши.