Способ прогнозирования риска летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения у больных плоскоклеточным раком легкого Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 G01N33/577 G16H50/30 C12Q1/6806 C12Q1/6869 C12Q1/6876 C12Q1/6886 C12N15/11 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у больных для прогнозирования развития его летального исхода в течение 4-х лет.

Рак легкого (РЛ) в течение последних десятилетий является самым часто выявляемым онкологическим заболеванием и ведущей причиной смерти. В 2012 г. было зарегистрировано 1,8 млн новых случаев РЛ (см. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M. et al. GLOBOCAN 2012 cancer incidence and mortality worldwide: IARC cancerbase No. 11. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2013. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx?cancer=lung), что составляет около 1,2 млн погибших от этого заболевания (см. Jemal A., Bray F., Center M.M., Ferlay J., Ward E., Forman D. Global cancer statistics // CA Cancer J. Clin. 2011. Vol. 61 (2). P. 69-90. doi: 10.3322/caac.20107), причем показатель летальности на первом году с момента установления диагноза - один из самых высоких среди всех злокачественных опухолей (см. Cancer care in Russia in 2012 / Ed. by А.D. Kaprin, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. М., 2013. P. 20-95. [in Russian]).

Более 80 % случаев РЛ составляют немелкоклеточные морфологические варианты, в числе которых выделяют плоскоклеточный, железистый и крупноклеточный рак (см. Visbal A.L., Leighl N.B., Feld R., Shepherd F.A. Adjuvant chemotherapy for early stage non-small cell lung cancer // Chest. 2005. Vol. 128. P. 2933-2943. doi: 10.1378/chest.128.4.2933).

Немелкоклеточный рак легкого представляет собой один из подтипов рака легкого, который отличается от мелкоклеточного рака легкого (МРЛ) видом опухолевых клеток под микроскопом. В НМРЛ входят следующие гистологические формы рака легкого: аденокарцинома (АК), плоскоклеточный рак (ПКР) и крупноклеточный (недифференцированный) рак. Все они диагностируются одинаково, но имеют особенности лечения.

Известны различные способы прогнозирования течения НМРЛ, основанные на исследовании не только клинико-патологических, но и некоторых дополнительных лабораторных характеристик опухоли, а также различных локальных и системных показателей.

Известен «Способ прогнозирования распространенности и течения опухолевого процесса у больных раком легкого» (см. Патент RU № 2214605, опубл. 20.10.2003 г., Бюл. № 29). Сущность изобретения состоит в том, что до начала лечения определяют в моче содержание гормона эпифиза мелатонина, и, если его показания превышают 8,0 нмоль/сут, констатируют высокую степень распространенности опухолевого процесса и плохой прогноз течения заболевания, что определяет соответствующий вид лечения, а при уровне мелатонина меньше 8,0 нмоль/сут отмечают небольшую распространенность опухолевого процесса и благоприятный прогноз. Технический результат заключается в том, что показатель уровня мелатонина может характеризовать ближайший или отдаленный прогноз заболевания.

Недостатками данного способа является то, что авторы предложили данный способ только для операбельных больных.

Известен «Способ прогнозирования эффективности лечения больных раком легкого» (см. Патент RU №2526120 опубл. 20.08.2014, Бюл. № 23), включающий биохимическое исследование, отличающийся тем, что в течение суток после операции и периоперационной аутохимиоиммунотерапии в плазме крови больного определяют активность α-1-протеиназного ингибитора и при ее повышении на 28% и более по отношению к общепринятой норме прогнозируют эффективность лечения, а при изменении менее 28%, отсутствии изменений или снижении показателя относительно нормы прогнозируют неэффективность лечения.

Недостатками данного способа является невозможность его применить для операбельных больных.

Известно описанное Michael Majores, Anne Schindler, Angela Fuchs, Johannes Stein, Lukas Heukamp, Peter Altevogt and Glen Kristiansen Membranous CD24 expression as detected by the monoclonal antibody SWA11 is a prognostic marker in non-small cell lung cancer patients // BMC Clinical Pathology (2015) 15:19 DOI 10.1186/s12907-015-0019-z выявление высокой экспрессии CD24 с помощью ИГХ-метода у больных НМРЛ с более короткой выживаемостью. Авторами приводятся суммарные и раздельные данные по ПКР и АК и делается заключение, что только при суммарном учете больных высокая экспрессия СD24 статистически значимо прогнозирует низкую общую выживаемость (Ме 21 мес. против 57 мес., р<0,005), причем следует учитывать только мембранную экспрессию маркера. При АК высокая экспрессия СD24 позволяет прогнозировать метастазирование в лимфатические узлы, что, конечно, тоже является фактором неблагоприятного прогноза, однако, различия ОВ оказались статистически незначимыми.

Настоящее изобретение относится к новому способу прогнозирования риска летального исхода при ПКР.

Задачей изобретения является разработка прогностических алгоритмов риска летального исхода для больных ПКР, получавших только химиолучевое лечение, путем определения исходного содержания в биоптатах опухолей экспрессии биомаркеров DSC3 методом ИГХ и метилирования генов DAPK молекулярно-генетическими методами.

Техническим результатом изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать риск летального исхода у больных плоскоклеточным раком, получавших только химиолучевое лечение.

Технический результат достигается тем, что определяют в биоптате больных до начала химиолучевого экспрессии десмоколлина 3 DSC3 иммуногистохимическим методом и уровня метилирования гена DAPK молекулярно-генетическим методом с последующим расчётом риска летального исхода с помощью метода логистической регрессии по формуле:

Р2=expZ2/1+expZ2, где Z2= 0,66*Х1 - 0,31*Х2 - 20,2,

Р2 - риск летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения,

Z2 - множественный линейный коэффициент регрессии,

Х1 - метилирование DAPK,

Х2 - экспрессия белка DSC3 в опухолевой ткани,

0,66; 0,31; 20,2 - коэффициенты, и при Р2 выше 0,37 определяют риск летального исхода как высокий.

Настоящее изобретение является новым, т.к. неизвестно из современной патентной и научной литературы и относится к способу прогнозирования риска летального исхода у больных НМРЛ, не получавших хирургического лечения, и включает следующие этапы: получение образцов биоматериала (биоптаты опухолей, взятые до лечения), выявление в них биомаркера DSC3 методом ИГХ и метилирования гена DAPK молекулярно-генетическими методами, динамическое наблюдение за пациентами с определением их выживаемости после проведенного консервативного лечения, которое выполнялось в соответствии со стандартами.

Для лучшего понимания способа приводим фигуры.

Фигура 1. Автоматизированный расчет риска летального исхода у больного З. с плоскоклеточным раком легких.

Фигура 2. Автоматизированный расчет риска летального исхода у больного К. с плоскоклеточным раком легких.

Способ осуществляют следующим образом.

В биоптатах больных немелкоклеточным раком легкого: плоскоклеточный рак перед началом химиолучевого лечения молекулярно-генетическими методами оценивали уровень метилирования гена DAPK, и иммунногистохимическим методом - экспрессию белка DSC3.

Методика определения количественного CpG-метилирования.

Выделение тотальной ДНК из срезов FFPE-блоков опухолевой ткани легкого проводили подходящим для этой задачи набором (например, «ExtractDNA FFPE», Евроген, Россия). Выделенную ДНК обрабатывали в реакции бисульфитной конверсии при помощи соответствующего набора (например, EpiJET Bisulfite Conversion Kit, ThermoScientific, USA) согласно рекомендациям производителя.

Образцы бисульфит-конвертированной ДНК амплифицировали в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1x ПЦР-буфер,0,2 mМ dNTPs, 2 mМ MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,4 mkM прямого и обратного праймеров. Последовательности праймеров приведены в таблице 1. Дизайн праймеров был осуществлен в программе MethPrimer 2.0. Амплификацию проводили на термоциклере по следующей программе: 1 цикл денатурация: 950С 5 мин.; 45 циклов: - 950С 20с; 550С 20с; 720С 20с; 1 цикл: 720С 10 мин.

Количественное метилирование CpG-сайтов оценивали методом пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMarkQ24 (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Постановку пиросеквенирования каждого образца проводили, как минимум, в двух повторах. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany). Значение метилирования отдельного CpG-сайта, рассчитанного как отношение содержания нуклеотидов С/Т, использовали для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %) (см. Таблица 1).

Таблица 1

Последовательности праймеров

Ген Прямой и обратный праймеры для амплификации 5' - 3' Секвенирующий праймер 5' - 3' DAPK GAGGGTAGTTTAGTAAT
[Biotin]- CTCCAACTACCCTACCA TTAGTAATGTGTTATAGG

Вывод о соответствии подтипа статусу метилирования делали, сравнивая значения Met, полученные для опухоли, с контрольным значением (см. Таблица 2).

Таблица 2

Показатели метилирования генов в НМРЛ

Наименование гена Контрольное значение Met, % ПКР DAPK 13+5,2

Для определения экспрессии молекулярных маркеров опухолевыми клетками НМРЛ использовали метод ИГХ с применением первичных моноклональных и поликлональных антител, характеристика которых представлена в таблице 3.

Таблица 3

Панель антител для ИГХ-исследования опухолей больных

антитело Клон Фирма Разведение Буфер для «демаскировки антигенов» DSC3 polyclonal Invitrogen 1:300 Antigen Retrivel Buffer,
(100x EDTA рН= 8,0) p53 DO7 Cell Marque 1:150 Antigen Retrivel Buffer,
(100x EDTA рН= 8,0)

Для визуализации результатов использовали систему детекции UltraVision Quanto Detection System HRP DAB. Оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили с применением светового микроскопа «AxioLab.A1» (Германия) при увеличении объектива ×200, х400. Экспрессия маркеров была полуколичественно проанализирована в соответствии с процентным содержанием клеток, а также интенсивностью окраски: 0; 1+ (слабая); 2+ (умеренная); 3+ (высокая). Экспрессия десмоколлина считалась положительной, если процент окрашенных клеток был более 10% и интенсивность окрашивания ≥2. Опухоль считали положительной по экспрессии мутантного белка р53 при окрашивании более 25% ядер опухолевых клеток.

Авторы исследовали парафиновые блоки биоптатов опухолей 78 больных ПКР, взятых до начала консервативного лечения, в которых был исследован спектр ряда иммуногистохимических и молекулярно-генетических показателей, и проведен их анализ при различном клиническом течении заболевания, а именно, при развитии у больных летального исхода, связанного с заболеванием, который был зарегистрирован в течение 1 года у 28 больных ПКР, в течение от 1 до 2 лет у 30 больных ПКР, до 3-х и более лет дожили 20 больных ПКР.

В биоптатах больных перед началом химиолучевого лечения ПКР молекулярно-генетическими методами оценивали степень метилирования гена DAPK и иммунногистохимическим методом - экспрессию белков DSC3. Примененные нами методы позволили оценить характер межклеточных взаимодействий, подвижность опухолевых клеток, потенциал их инвазивности, склонность к эпителиально-мезенхимальному переходу.

Методом регрессионного анализа Кокса выявляли сопряжение между полученными показателями и выживаемостью пациентов. Летальный исход больных в течение 4 лет от начала противоопухолевого лечения ранжировали как 1, его отсутствие как 0. Летальность и выживаемость являются альтернативными признаками. Бинарное кодирование исхода предполагает использование логистической регрессии при описании взаимосвязи между реализацией критического события и генетическими предикторами. Регрессионный метод статистического анализа Кокса позволил оценить выраженность такой ассоциации и прогностическую значимость уровня экспрессии изучаемых белков и метилирования генов в отношении риска летального исхода.

В результате регрессионного анализа Кокса из 14 исследованных факторов, указанных выше, у 4 была выявлена способность статистически значимо прогнозировать риск неблагоприятного (летального) исхода в течение 4-х лет после операции. При ПКР предикторами явились метилирование гена DAPK и низкой экспрессии в опухоли белка DSC3.

Путем логистической регрессии бинарное кодирование признака (летальный исход есть/нет) связывали математическим выражением с предикторами, установленными пошагово.

Для определения риска летального исхода у больных ПКР математическое выражение имело вид:

Р2=expZ2/1+expZ2

где Z2= 0,66*Х1 - 0,31*Х2 - 20,2

Р2 - риск летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения

Z2 - множественный линейный коэффициент регрессии

Х1 - метилирование DAPK

Х2 - экспрессия белка DSC3 в опухолевой ткани

Путем ROC анализа была найдена критическая точка Р2 для разделения риска летального исхода на низкий и высокий. При Р2 выше 0,37 включительно с диагностической чувствительностью 89% и специфичностью 90% исходный риск летального исхода рассматривали как высокий. Площадь под ROC кривой составила 0,894 ± 0,021 (z=8,9 при p<0,001), что свидетельствовало о хорошем качестве прогностической модели.

Приводим клинические примеры.

Клинический пример № 1.

Больной З., 70 лет. Плоскоклеточный рак III А стадия. В биоптате перед началом химиолучевого лечения НМРЛ экспрессия белка DSC3 в опухолевой ткани при иммуногистохимическом исследовании составила 17, а метилирование гена DAPK 28%.

По разработанной нами формуле риск летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения составил 0,001 (см. Фиг. 1). Поскольку рассчитанное значение Р2 было меньше критического (Р2 = 0,37), то отдаленный риск летального исхода ранжировали как низкий. Наблюдение за пациентом показало, что в течение 48 мес. он был жив.

Клинический пример № 2.

Больной K., 71 год. Плоскоклеточный рак легких IIIА стадии. В биоптате перед началом химиолучевого лечения НМРЛ экспрессия белка DSC3 в опухолевой ткани при иммуногистохимическом исследовании составила 13, а метилирование гена DAPK 40%. По разработанной нами формуле риск летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения составил 0,895 (см. Фиг. 2). Поскольку рассчитанное значение Р2 было меньше критического (Р2 = 0,37), то отдаленный риск летального исхода ранжировали как высокий. Пациент умер через 5 мес. от начала противоопухолевого лечения.

Таким образом, при одной и той же стадии у больных неоперабельным раком легких с учетом гистологического типа опухоли были разработаны модели, позволяющие индивидуально уточнить риск летального исхода больного в зависимости от молекулярно-генетического профиля опухоли.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет прогнозировать риск летального исхода у больных плоскоклеточным раком легкого в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения у больных плоскоклеточным раком лёгкого. В биоптате больных до начала химиолучевого лечения определяют экспрессию десмоколлина 3 (DSC3) и уровня метилирования гена DAPK. Полученные значения подставляют в формулу расчёта риска летального исхода Р2. При Р2 выше 0,37 определяют высокий риск летального исхода. Способ позволяет прогнозировать риск летального исхода у больных плоскоклеточным раком за счёт определения экспрессии DSC3 и уровня метилирования гена DAPK до начала химиолучевого лечения. 2 ил., 3 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования риска летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения у больных плоскоклеточным раком лёгкого, включающий определение в биоптате больных до начала химиолучевого лечения экспрессии десмоколлина 3 (DSC3) иммуногистохимическим методом и уровня метилирования гена DAPK молекулярно-генетическим методом с последующим расчётом риска летального исхода с помощью метода логистической регрессии по формуле:

Р2=expZ2/1+expZ2, где Z2=0,66*Х1–0,31*Х2–20,2,

Р2 - риск летального исхода в первые 4 года от начала противоопухолевого лечения,

Z2 – множественный линейный коэффициент регрессии,

Х1 – метилирование DAPK,

Х2 – экспрессия белка DSC3 в опухолевой ткани,

0,66; 0,31; 20,2 – коэффициенты, и при Р2 выше 0,37 определяют риск летального исхода как высокий.