СПОСОБЫ И СИСТЕМЫ МОНИТОРИНГА СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ И ПАТОЛОГИИ ОРГАНОВ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6809 C12Q1/6881 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Системы, способы и композиции, предложенные в настоящем документе, относятся к способам извлечения локус-специфических сигналов числа копий вкДНК из образца для мониторинга состояния здоровья, диагностики или клеточного профилирования и анализа. В частности, системы, способы и композиции относятся к способам анализа внеклеточной ДНК (вкДНК) в образце для определения относительного вклада типа ткани или клеток в суммарную вкДНК в образце. В способах, предложенных в настоящем документе, используются сиквенс-специфические сигналы покрытия, интенсивности или числа копий вкДНК и не предусматривается прямое определение статуса метилирования на вкДНК.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] В последние годы внеклеточная ДНК (вкДНК) начала рассматриваться в качестве перспективного источника для выявления биомаркеров для диагностики заболеваний. В частности, вкДНК плода и интактные клетки плода могут попадать в кровоток матери. Следовательно, анализ этого генетического материала плода может сделать возможным раннее неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ). Ключевой проблемой при проведении НИПТ на вкДНК плода является то, что она обычно смешана с вкДНК матери, и поэтому анализ вкДНК затруднен необходимостью учета материнского генотипического сигнала. Кроме того, анализ вкДНК пригоден в качестве диагностического инструмента для обнаружения и диагностики рака.

[0003] Текущие протоколы для получения библиотеки для секвенирования из образца внеклеточной нуклеиновой кислоты (например, образца плазмы) обычно включают выделение вкДНК для подготовки библиотеки для секвенирования для проведения анализа. Однако существующие методы анализа вкДНК, будь то для НИПТ или применений в онкологии, основаны на извлечении сигнала генетических изменений из секвенирования вкДНК и поэтому ограничиваются НИПТ и онкологией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение относится к системам, способам и композициям для анализа вкДНК в образце для извлечения локус-специфических сигналов числа копий вкДНК для количественной оценки ткане- и/или клеточноспецифических долей вкДНК в образце.

[0005] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам анализа внеклеточной ДНК (вкДНК) в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления образец получен от человека с вероятной гибелью клеток, повреждением ткани или заболеванием. В некоторых вариантах осуществления гибель клеток или повреждение ткани/органа включает тупую травму, такую как травма головы, токсическое действие лекарственного средства на печень или почки, заболевания, которые сопровождаются повреждением органов, например, повреждение сердца при кардиомиопатиях, повреждение почек при заболеваниях почек, повреждение печени при заболеваниях печени или гибель бета-клеток при диабете. В некоторых вариантах осуществления гибель клеток или повреждение ткани/органа включает рак или беременность, при которых имеет место чрезмерная гибель клеток или скорость обновления клеточной популяции.

[0006] В некоторых вариантах осуществления способы включают получение биологического образца, содержащего вкДНК, где указанная вкДНК содержит множество фрагментов вкДНК, каждый из которых соответствует одному или более типам ткани или клеток; количественную оценку каждого фрагмента вкДНК для создания полногеномного или целевого (локус-специфического) профиля вкДНК, где указанный полногеномный профиль вкДНК содержит множество сигналов числа копий, каждый из которых (включая покрытие или интенсивность) соответствует фрагменту вкДНК; и сравнение указанного полногеномного профиля сигналов числа копий вкДНК с набором референсных профилей сигналов числа копий для определения или количественной оценки источников повреждения клеток, повреждения ткани или повреждения органа. В некоторых вариантах осуществления способ необязательно включает обогащение образца вкДНК методом “pull down“ или ПЦР с получением обогащенной вкДНК.

[0007] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам мониторинга развития повреждения ткани или органа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК); количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля сигналов числа копий вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и сравнение указанного полногеномного профиля сигналов числа копий вкДНК с набором профилей известных сигналов числа копий здоровых субъектов или чистых типов тканей. В некоторых вариантах осуществления количественную оценку проводят без ПЦР или обогащения. В некоторых вариантах осуществления разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с состоянием у субъекта, связанным с повреждением ткани или органа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0008] На ФИГ. 1 показан график, иллюстрирующий профили сигналов вкДНК ткани почек и крови вдоль целевых участков хромосомы. Ткане-/клеточноспецифический сигнал извлекают с использованием методов неотрицательного матричного разложения из сигналов числа копий вкДНК плазмы пациентов с заболеванием почек, полученных с помощью секвенирования вкДНК. Целевые области анализируют с помощью мультиплексной ПЦР на образцах вкДНК.

[0009] На ФИГ. 2 показан график, демонстрирующий результаты прогнозирования почечной недостаточности у пациентов на основе количественных оценок доли вкДНК почек в плазме крови.

[0010] На ФИГ. 3A и 3B показаны графики зависимости от времени доли ДНК из ткани почек в группе реципиентов трансплантата почки. На ФИГ. 3A показана расчетная почечная доля вкДНК донорской почки, а на ФИГ. 3B показана расчетная почечная доля вкДНК собственной почки пациента. Как на ФИГ. 3A, так и на 3B показана зависимость статистически значимых изменений от времени, и характер изменений во времени согласуется с биомедицинскими процедурами, о проведении которых известно для этих пациентов.

[0011] На ФИГ. 4 показана доля компонента вкДНК ободочной кишки при различных заболеваниях, причем доля для болезни Крона оказалась значительно выше, чем при других проанализированных заболеваниях.

[0012] На ФИГ. 5 показана блок-схема, иллюстрирующая процесс оценки образцов вкДНК для количественной оценки вкДНК ткани.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] В следующем подробном описании изобретения приводится ссылка на сопроводительные графические материалы, являющиеся его частью. В графических материалах одинаковые символы, как правило, обозначают схожие компоненты, если из контекста не следует иное. Иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании изобретения, графических материалах и формуле изобретения, не имеют ограничительного характера. Могут быть использованы другие варианты осуществления и могут быть внесены другие изменения, без отклонений от сущности или объема объекта изобретения, представленного в настоящем документе. Ясно, что аспекты настоящего изобретения, как в целом описано в настоящем документе и проиллюстрировано на графических материалах, могут быть скомпонованы, заменены, объединены, разделены и спроектированы в самых различных конфигурациях, все из которых явным образом предусмотрены в настоящем документе.

[0014] Варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, относятся к анализу фрагментов нуклеиновой кислоты в образце для определения того, сколько фрагментов нуклеиновой кислоты происходит из различных частей генома различных частей организма субъекта. Более конкретно, системы, способы и композиции, предложенные в настоящем документе, относятся к анализу популяций вкДНК в образце для определения относительного количества вкДНК из различных частей генома различных частей организма субъекта. Таким образом, системы, способы и композиции относятся к количественной оценке тканевого происхождения вкДНК и могут использоваться для целого ряда применений, характеризующихся повышенной гибелью клеток или повышенными генетическими изменениями, в том числе, например, для мониторинга развития заболевания, мониторинга состояния здоровья органов или тканей, диагностики или обнаружения заболеваний, определения эффективности или токсичности лекарственных средств или мониторинга состояния здоровья новорожденных.

[0015] В одном из вариантов осуществления биологический образец, о котором известно, что он содержит вкДНК, такой как плазма крови, берут у субъекта с подозрением на наличие определенного типа повреждения органа или повышенной скорости обновления клеточной популяции. На вкДНК в указанном биологическом образце проводят анализ полногеномной последовательности (WGS), чтобы выявить области генома, которые могут демонстрировать больше или меньше вкДНК, чем у типичного субъекта. Например, если субъект страдает повреждением печени или почечной недостаточностью, можно ожидать увидеть больше вкДНК, происходящей из печени или почек, по сравнению с контрольной популяцией исходного уровня. После завершения анализа последовательности ее подвергают сравнению с помощью различных протоколов машинного обучения, искусственного интеллекта или других протоколов для выявления различий в вкДНК, полученной от субъекта, по сравнению с контролем исходного уровня. В одном из вариантов осуществления часть анализа может включать количественную оценку относительных долей вкДНК из различных тканей субъекта и нормальных контролей исходного уровня. В некоторых вариантах осуществления количественная оценка может включать одно или оба из определения набора референсных профилей ткани и количественной оценки долей вкДНК ткани в образце вкДНК на основе полногеномных данных о покрытии вкДНК.

[0016] Например, для полногеномных или целевых профилей числа копий вкДНК для набора образцов нормальных и/или больных субъектов получают набор референсных профилей покрытия вкДНК, и полученная линейная комбинация восстанавливает сигналы числа копий вкДНК из образцов нормальных и/или больных субъектов. Каждый референсный профиль соответствует определенному типу клеток или ткани. С помощью методов машинного обучения без учителя, таких как неотрицательное матричное разложение, могут быть разложены сигналы вкДНК от отдельных субъектов и извлечены референсные ткане- или клеточноспецифические профили, с получением тем самым референсных профилей исходного уровня. В зависимости от типа биологической жидкости преобладающие типы клеток или тканей могут различаться. Например, для плазмы основной вклад будут вносить профили сигналов белых кровяных телец. Пример анализа извлеченных профилей сигналов вкДНК ткани почек и крови вдоль целевых участков хромосомы показан на фиг. 1.

[0017] Традиционные методы анализа вкДНК требуют сиквенс-специфического детектирования, что ограничивает чувствительность анализа и не обеспечивает точных, надежных или воспроизводимых определений относительного вклада каждого типа ткани субъекта в суммарную вкДНК в биологическом образце. Например, традиционный подход не позволяет определить, сколько вкДНК в образце происходит из легких, селезенки, печени, почек и т.д. по сравнению с нормальным образцом. Ранее известные методы секвенирования вкДНК предназначались для областей применения, связанных с мониторингом состояния тканей трансплантата или раковых заболеваний. Однако такие методы требуют анализа на основе аллелей, который требует секвенирования и выявления однонуклеотидных вариаций между донором и хозяином или опухолевой и нормальной тканью. Не существует метода, который позволил бы количественно оценить состояние здоровья собственных органов субъекта на основе секвенирования вкДНК, матричной гибридизации или аналогичных методов.

[0018] Кроме того, традиционные способы мониторинга состояния здоровья органа или ткани выполняют с помощью биопсии ткани. Биопсия ткани может использоваться для исследования и определения наличия или степени заболевания на основе конкретной ткани и может выполняться путем извлечения клеток или ткани из биоптата ткани, взятого у субъекта. Однако эти способы являются инвазивными, времязатратными, дорогими и, как правило, сопряжены с повышенным риском непредвиденных последствий для здоровья.

[0019] Системы, способы и композиции, описанные в настоящем документе, напротив, относятся к определению количества фрагментов вкДНК, происходящих из различных тканей. Кроме того, настоящие системы, способы и композиции являются неинвазивными и могут обеспечить немедленное определение динамики гибели клеток или повреждения ткани. Системы, способы и композиции, предложенные в настоящем документе, могут сделать возможным раннее обнаружение множества показаний до того, как будут обнаружены клинические симптомы или функциональное ухудшение состояния организма субъекта. Более того, эти способы не требуют выбора конкретного целевого органа, а вместо этого позволяют лицу, осуществляющему уход, обнаружить, какой орган может быть поврежден, что невозможно при использовании биопсии ткани в качестве метода скрининга. Соответственно, способы, системы и композиции могут обеспечить возможность количественной оценки и мониторинга сразу нескольких органов в одном анализе с меньшей систематической ошибкой выборки, чем методы биопсии ткани.

[0020] Если не указано иное, практическое осуществление способа и системы, раскрытых в настоящем документе, включает общепринятые методики и устройства, обычно используемые в молекулярной биологии, микробиологии, очистке белков, белковой инженерии, секвенировании белков и ДНК и областях рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Такие методики и устройства известны специалистам в данной области техники и описаны во множестве текстов и справочных материалов (см., например, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Third Edition (Cold Spring Harbor), [2001]); и Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” [1987]).

[0021] Численные диапазоны включают границы диапазонов. Подразумевается, что каждое максимальное численное ограничение, приведенное в данном описании, включает каждое более низкое численное ограничение, как если бы такие более низкие численные ограничения были явно указаны в настоящем документе. Каждое минимальное численное ограничение, приведенное в данном описании, будет включать каждое более высокое численное ограничение, как если бы такие более высокие численные ограничения были явно указаны в настоящем документе. Каждый численный диапазон, приведенный в данном описании, будет включать каждый более узкий численный диапазон, который попадает в такой более широкий численный диапазон, как если бы все такие более узкие численные диапазоны были явно указаны в настоящем документе.

[0022] Если в настоящем документе не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, общепринятое для специалиста в данной области техники. Различные научные словари, которые включают термины, включенные в настоящий документ, хорошо известны и доступны специалистам в данной области техники. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, находят применение при осуществлении или тестировании вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, некоторые методы и материалы описаны.

[0023] Термины, определенные непосредственно ниже, более полно описаны со ссылкой на описание в целом. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретной описанной методикой, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьироваться в зависимости от контекста, в котором они используются специалистами в данной области техники. В контексте настоящего документа термины в единственном числе включают множественное число, если из контекста явно не следует иное.

[0024] Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записываются слева направо в ориентации от 5'-конца к 3'-концу, а аминокислотные последовательности записываются слева направо в ориентации от аминоконца к карбоксиконцу, соответственно.

[0025] В контексте настоящего документа термины “полинуклеотид” и “нуклеиновая кислота” могут использоваться взаимозаменяемо и могут относиться к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, эти термины включают одно-, двух- или многоцепочечные ДНК или РНК. Примеры полинуклеотидов включают ген или фрагмент гена, внеклеточную ДНК (вкДНК), полногеномную ДНК, геномную ДНК, фрагмент эпигеномной, геномной ДНК, экзон, интрон, матричную РНК (мРНК), регуляторную РНК, транспортную РНК, рибосомную РНК, некодирующую РНК (нкРНК), такую как PIWI-взаимодействующая РНК (piRNA), малая интерферирующая РНК (siRNA) и длинная некодирующая РНК (днкРНК), короткую шпилечную (кшРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), микро РНК (мкРНК), малую ядрышковую РНК (мякРНК) и вирусную РНК, рибозим, кДНК, рекомбинантный полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмиду, вектор, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, нуклеиново-кислотный зонд, праймер или амплифицированную копию любого из вышеперечисленного. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, включая нуклеотиды с неприродными основаниями, нуклеотиды с модифицированными природными основаниями, такими как аза- или деазапурины. Полинуклеотид может состоять из определенной последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (A); цитозина (C); гуанина (G); и тимина (T). Также может присутствовать урацил (U), например, в качестве природной замены тимина, когда полинуклеотид представляет собой РНК. Урацил также может использоваться в ДНК. Термин “последовательность нуклеиновой кислоты“ может относиться к буквенному представлению полинуклеотида или любой молекулы нуклеиновой кислоты, включая природные и неприродные основания.

[0026] Термин “донорская ДНК“ (дДНК) относится к молекулам ДНК, происходящим из клеток донора трансплантата. В различных реализациях дДНК содержится в образце, полученном от реципиента, получившего трансплантированную ткань или орган от донора.

[0027] Циркулирующая внеклеточная ДНК или просто внеклеточная ДНК (вкДНК) представляют собой фрагменты ДНК, которые не локализованы в клетках и свободно циркулируют в кровотоке или других биологических жидкостях. Известно, что вкДНК имеет различное происхождение, в некоторых случаях из ДНК донорской ткани, циркулирующей в крови реципиента, в некоторых случаях из опухолевых клеток или пораженных опухолью клеток, в других случаях из ДНК плода, циркулирующей в крови матери. Другие неограничивающие примеры включают вкДНК, происходящую из собственной ткани или органов этого же организма, например, из почек, легких, головного мозга и сердца. Уровни тканеспецифической вкДНК могут увеличиваться или уменьшаться при гибели клеток, повреждении тканей или повреждении органов, включая, например, тупую травму, такую как травма головы, токсическое действие лекарственного средства на печень или почки, заболевания, которые сопровождаются повреждением органов, например, повреждение сердца при кардиомиопатиях, повреждение почек при заболеваниях почек, повреждение печени при заболеваниях печени и гибель бета-клеток при диабете. Примеры также включают рак и беременность, при которых имеет место чрезмерная гибель клеток или скорость обновления клеточной популяции.

[0028] В целом вкДНК является фрагментированной и включает только небольшую часть генома, которая может отличаться от генома индивидуума, от которого получена вкДНК. Точный механизм биогенеза вкДНК неизвестен. Согласно широко распространенному мнению вкДНК возникает в результате апоптотической или некротической гибели клеток, однако есть также свидетельства, указывающие на активное высвобождение вкДНК из живых клеток. Как правило, вкДНК происходит из разных типов клеток, и в зависимости от клеточного происхождения и состояния здоровья полногеномный профиль вкДНК субъекта может варьироваться.

[0029] Термин “нециркулирующая’’ геномная ДНК’’ (гДНК) или “клеточная ДНК“ используются для обозначения молекул ДНК, локализованных в клетках и часто включающих полный геном.

[0030] Биномиальное распределение - это дискретное распределение вероятностей количества “успехов“ в последовательности из n независимых экспериментов, в каждом из которых задается вопрос “да-нет“, и каждый имеет свой собственный булевозначный результат: случайная величина, содержащая один бит информации: положительный (с вероятностью p) или отрицательный (с вероятностью q=1 - p). Для одного испытания, т.е. n=1, биномиальное распределение является распределением Бернулли. Биномиальное распределение часто используется для моделирования количества успехов в выборке размера n, взятой с заменой из популяции размера N. Если случайная переменная X следует биномиальному распределению с параметрами n ∈ N и p ∈ [0,1], случайная переменная X записывается как X ~ B(n, p).

[0031] Распределение Пуассона, обозначаемое в настоящем документе как Pois(), представляет собой дискретное распределение вероятностей, которое выражает вероятность заданного числа событий, происходящих в фиксированном интервале времени и/или пространстве, если эти события происходят с известной средней частотой и независимо времени, прошедшего с последнего события. Распределение Пуассона также можно использовать для числа событий в других заданных интервалах, таких как расстояние, площадь или объем. Вероятность наблюдения k событий в интервале согласно распределению Пуассона определяется уравнением:

где λ представляет собой среднее число событий в интервале или частоту событий, также называемую параметром частоты, e равно 2,71828 - число Эйлера или основание натуральных логарифмов, k принимает значения 0, 1, 2,… и k! представляет собой факториал k.

[0032] Гамма-распределение - это двухпараметрическое семейство непрерывных распределений вероятностей. Обычно используются три различных параметризации: с параметром формы k и параметром масштаба θ; с параметром формы α=k и обратным параметром масштаба β=1/θ, называемым параметром скорости; или с параметром формы k и средним параметром μ=k/β. В каждой из этих трех форм оба параметра являются положительными действительными числами. Гамма-распределение - это распределение вероятностей максимальной энтропии для случайной переменной X, для которой E[X]=kθ=α/β фиксировано и больше нуля, а E[ln(X)]=ψ(k)+ln(θ)=ψ(α) - ln(β) фиксировано (ψ представляет собой дигамма-функцию).

[0033] Термин ''образец'' в настоящем документе относится к образцу, обычно получаемому из биологической жидкости, клетки, ткани, органа или организма, содержащему нуклеиновую кислоту или смесь нуклеиновых кислот, и может называться в настоящем документе биологическим образцом. Такие образцы включают, не ограничиваясь перечисленным, мокроту/жидкость ротовой полости, амниотическую жидкость, кровь, фракцию крови или образцы тонкоигольной биопсии (например, хирургической биопсии, тонкоигольной биопсии и т.д.), мочу, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость и тому подобное. Хотя образец часто берут у человека (например, пациента), анализы можно использовать для образцов от любого млекопитающего, включая, не ограничиваясь перечисленным, собак, кошек, лошадей, коз, овец, крупный рогатый скот, свиней и т.д. Образец можно использовать непосредственно в том виде, в котором он был получен из биологического источника, или после предварительной обработки, чтобы изменить характер образца. Например, такая предварительная обработка может включать получение плазмы из крови, разбавление вязких жидкостей и т.д. Способы предварительной обработки могут также включать, не ограничиваясь перечисленным, фильтрацию, осаждение, разбавление, дистилляцию, смешивание, центрифугирование, замораживание, лиофилизацию, концентрирование, амплификацию, фрагментацию нуклеиновой кислоты, инактивацию мешающих компонентов, добавление реагентов, лизирование и т.д. Если такие способы предварительной обработки используются в отношении образца, такие способы предварительной обработки обычно таковы, что представляющая интерес нуклеиновая кислота(ы) остается в тестируемом образце, иногда в концентрации, пропорциональной концентрации в необработанном тестируемом образце (например, а именно, образеце, который не подвергался никакому подобному способу(ам) предварительной обработки). Такие “обработанные“ или “переработанные“ образцы по-прежнему считаются биологическими “тестируемыми“ образцами в отношении описанных в настоящем документе способов.

[0034] Термин “биологическая жидкость“ в настоящем документе относится к жидкости, взятой из биологического источника, и включает, например, кровь, сыворотку, плазму, мокроту, смывную жидкость, спинномозговую жидкость, мочу, сперму, пот, слезы, слюну и тому подобное. В контексте настоящего документа термины ''кровь'', ''плазма'' и ''сыворотка'' явным образом охватывают их фракции или обработанные части. Точно так же, если образец взят из биоптата, мазка тампоном, мазка и т.д., ''образец'' явным образом включает обработанную фракцию или часть, полученную из биоптата, мазка тампоном, мазка и т.д.

[0035] Образец может быть получен от субъекта в случае, когда желательно контролировать состояние здоровья ткани или органа, диагностировать или обнаружить заболевание или иным образом проанализировать образец, полученный от субъекта. В контексте настоящего документа термин ''субъект'' относится к животному, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. ''Животное'' включает холоднокровных и теплокровных позвоночных и беспозвоночных, таких как рыбы, моллюски, рептилии и, в частности, млекопитающие. ''Млекопитающее'' включает, не ограничиваясь перечисленным, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, собак, кошек, овец, коз, коров, лошадей, приматов, таких как обезьяны, шимпанзе и человекообразные обезьяны, и, в частности, людей. Субъект может представлять собой субъекта, страдающего или подозреваемого на наличие рака, генетического нарушения, повреждения органа или повреждения ткани, или другого заболевания или нарушения, мониторинг которого можно осуществлять. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой реципиента органа, такого как субъект, который является реципиентом трансплантата органа. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет вероятное повреждение органа из-за хронического заболевания или тупой травмы.

[0036] Варианты систем, способов и композиций относятся к получению образца от субъекта и мониторингу, обнаружению, оценке, прогнозированию или диагностике заболевания или расстройства у указанного субъекта, мониторингу повреждения ткани или органа у субъекта или оценке или количественной оценке тканевого происхождения нуклеиновой кислоты. Заболевания могут включать, например, раковые заболевания, генетические нарушения, органоспецифические расстройства или другие заболевания или расстройства, которые характеризуются повышенной вкДНК в различных областях генома в зависимости от тканевого происхождения и/или типа заболевания.

[0037] В контексте настоящего документа термин ''референсный геном'' относится к любой определенной известной последовательности генома, частичной или полной, любого организма, которая может быть использована для сравнения выявленных у субъекта последовательностей. ''Геном'' относится к полной генетической информации организма или вируса, выраженной в последовательностях нуклеиновых кислот.

[0038] Некоторые варианты осуществления способов, систем и композиций, предложенных в настоящем документе, относятся к одновременной количественной оценке относительных вкладов нескольких типов тканей или клеток в образец вкДНК на основе полногеномных сигналов числа копий (CN) вкДНК. В зависимости от предполагаемого применения образец вкДНК может быть получен из биологического образца, например, из крови, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости или любых других типов биологических жидкостей из организма человека. Полногеномные сигналы покрытия, числа копий или интенсивности вкДНК могут быть получены путем подсчета молекул ДНК на основе секвенирования, например, с помощью любых технологий секвенирования или технологий количественной оценки числа копий ДНК на основе гибридизации. В некоторых вариантах осуществления перед измерением сигнала числа копий вкДНК может быть подвергнута направленной ПЦР или анализу обогащения или полногеномной амплификации. В любом из вариантов осуществления могут быть использованы различные методы амплификации, включая, например, неспецифическую амплификацию целого генома, например, методы полногеномной амплификации (WGA), такие как MDA (амплификация с множественным замещением), или высоконаправленную ПЦР-амплификацию нескольких или одной выбранной области размером, например, несколько кб.

[0039] При наличии покрытия вкДНК из биологического образца или набора биологических образцов из любой из систем или способов, описанных в настоящем документе, могут быть количественно оценены относительные доли различных тканей. В некоторых вариантах осуществления количественная оценка может включать одно или оба из определения набора референсных профилей ткани и количественной оценки доли вкДНК ткани в образце вкДНК на основе полногеномных или целевых данных о покрытии вкДНК.

[0040] Например, для полногеномных профилей числа копий вкДНК для набора нормальных образцов получают набор референсных профилей покрытия вкДНК, так что полученные линейные комбинации соответствуют профилям числа копий вкДНК из нормальных образцов. В то время как профиль числа копий вкДНК крови соответствует смеси сигналов от нескольких типов клеток или тканей, референсный профиль соответствует конкретному типу клеток или ткани. С помощью методов машинного обучения без учителя, таких как неотрицательное матричное разложение, может быть разложен набор сигналов вкДНК плазмы и извлечены референсные профили с получением тем самым набора референсных профилей исходного уровня. В зависимости от типа биологической жидкости преобладающие типы клеток или тканей могут различаться. Например, для плазмы основной вклад будут вносить профили сигналов белых кровяных телец.

[0041] Аналогичным образом, для полногеномных профилей числа копий вкДНК для набора образцов пациентов с известным повреждением органа или определенным заболеванием, связанным с повреждением органа, может быть использовано полуконтролируемое машинное обучение для извлечения профилей тканеспецифической или специфичной для заболевания вкДНК в дополнение к референсным профилям исходного уровня. Полученные референсные профили исходного уровня могут быть использованы для учета исходной части сигнала вкДНК из образцов пациентов, а затем из неучтенных сигналов покрытия вкДНК получают дополнительные референсные профили тканей.

[0042] Подход без учителя и полуконтролируемый подход может быть дополнительно объединен с методом машинного обучения с учителем, основанным на глубинной нейронной сети, для прогнозирования профилей покрытия вкДНК для типов тканей или клеток, для которых ограничен доступ к релевантным образцам вкДНК. Метод глубокого обучения может быть использован для прогнозирования профиля покрытия вкДНК для типа клеток при наличии эпигенетических сигналов для данного типа клеток в качестве входных характеристик, включая, например, сигналы доступности ДНКазы, сигналы гистоновых меток и сигналы метилирования геномной ДНК.

[0043] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления набор референсных профилей ткани используют для количественной оценки ткани в представляющих интерес образцах. Для профиля покрытия вкДНК доли ткани могут быть количественно оценены путем линейного проецирования наблюдаемых профилей покрытия вкДНК на известные референсные профили.

[0044] Варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, могут быть использованы для целого ряда применений, включая, например, мониторинг состояния здоровья органов, мониторинг токсичности лекарственных средств, спортивную медицину, диагностику и обнаружение заболеваний, онкологию, неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) и мониторинг состояния здоровья новорожденных или исследования патогенеза заболеваний.

[0045] В области мониторинга состояния здоровья органов варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для мониторинга нескольких органов, таких как, например, почка, легкое или сердце, и для мониторинга и диагностики до и после заболевания на основе одного анализа крови. Описанные в настоящем документе варианты осуществления включают недорогой универсальный анализ крови, направленный на основные органы, позволяющий осуществлять раннее обнаружение и предотвращение тяжелой недостаточности органов, в том числе для стратегии мониторинга групп высокого риска. Например, мониторинг состояния здоровья почек у пациентов, страдающих волчанкой или диабетом; мониторинг состояния здоровья сердца для лиц с семейной историей кардиомиопатии; или мониторинг состояния здоровья нескольких органов для пациентов с сепсисом. Кроме того, степень тяжести травмы (тупой травмы), например, головы или в области грудной клетки/легких, непросто определить, если не наблюдаются серьезных функциональных последствий. Варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, позволяют осуществлять количественный мониторинг степени тяжести травмы и информировать о необходимости ранних медицинских вмешательств.

[0046] В области мониторинга токсичности лекарственных средств варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для мониторинга гепатотоксичности или нефротоксичности отпускаемых по рецепту лекарственных средств у отдельно взятого пациента, что позволяет индивидуализировать медицину и в режиме реального времени корректировать схемы приема лекарственных средств для отдельных пациентов, или измерять гепатотоксичность или нефротоксичность новых лекарственных средств в ходе клинических исследований.

[0047] В области спортивной медицины варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для мониторинга величины повреждения тела из-за интенсивных тренировок, что позволяет рационально настроить график тренировок спортсмена и предотвратить синдром перетренированности. Установлено, что уровень внеклеточной ДНК увеличивается при выполнении упражнений. Для спортсменов синдром перетренированности (СПТ) - частое состояние, когда они постоянно стремятся к пределу своих возможностей. После возникновения СПТ на восстановление может уйти от нескольких дней до нескольких недель, а в некоторых случаях спортсмен может никогда не восстановиться. Подход к количественной оценке мышечной вкДНК и, следовательно, раннему выявлению и предотвращению СПТ имел бы большое значение для спортсмена для достижения оптимального результата тренировки.

[0048] В области диагностики и обнаружения заболеваний варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для мониторинга или анализа заболеваний, которые трудно диагностировать или которые часто диагностируются неправильно, например, синдрома раздраженного кишечника, воспалительного заболевания кишечника, целиакии, фибромиалгии, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, волчанки, синдрома поликистозных яичников, аппендицита, болезни Крона, язвенного колита или идиопатических миопатий. Некоторые из этих заболеваний обычно надежно диагностируются только с помощью биопсии ткани. Многие заболевания в настоящее время диагностируются с помощью биопсии тканей, например, целиакия. Есть много заболеваний, для которых не существует диагностических маркеров или отсутствуют хорошие диагностические маркеры, например, синдром хронической усталости. Варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, позволяют осуществлять мониторинг, обнаружение, оценку, прогнозирование или диагностику этих и других заболеваний и расстройств. Например, варианты осуществления систем и способов могут быть использованы для определения долей компонента определенной ткани для выявления определенного заболевания. Как показано на фиг. 4, например, показана доля компонента вкДНК ободочной кишки при различных заболеваниях, причем доля для болезни Крона значительно выше, чем при других проанализированных заболеваниях.

[0049] В области онкологии варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для количественной оценки тканевого происхождения вкДНК и определения происхождения раковой ткани, а также мутаций из одного анализа полногеномной последовательности (WGS) вкДНК. WGS включает всю последовательность (включая все хромосомы) генома зародышевой линии субъекта.

[0050] В области НИПТ и мониторинга состояния здоровья новорожденных варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для определения и мониторинга состояния здоровья матери и измерения иммунного ответа матери на плод. Некоторые варианты осуществления относятся к прогнозированию выкидыша и преждевременных родов. Некоторые варианты осуществления относятся к мониторингу, исследованию, диагностике или прогнозированию патологий новорожденных, таких как недоразвитость органов, желтуха, генетические нарушения или другие патологии новорожденных, посредством секвенирования вкДНК плазмы новорожденных.

[0051] В области исследования патогенеза заболеваний варианты осуществления систем, способов и композиций могут быть использованы, например, для простой и недорогой количественной оценки тканевого происхождения, чтобы позволить исследователям проводить продольные исследования для понимания патогенеза многих заболеваний путем составления профиля динамики и взаимодействий между несколькими человеческими органами.

[0052] Соответственно, некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам и системам для количественной оценки вкДНК у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение биологического образца, о котором известно, что он содержит вкДНК, такого как плазма крови, у субъекта, имеющего определенный типа рака или подозреваемого на его наличие. В контексте настоящего документа термин ''рак'' относится ко всем типам рака или новообразования, или злокачественных опухолей, встречающихся у млекопитающих, в особенности у людей, включая лейкозы, саркомы, карциномы и меланому. Примерами раковых заболеваний являются рак головного мозга, молочной железы, шейки матки, ободочной кишки, головы и шеи, почки, легкого, немелкоклеточный рак легкого, меланома, мезотелиома, рак яичника, саркома, рак желудка, матки и медуллобластома. Дополнительные раковые заболевания могут включать, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легкого, первичные опухоли головного мозга, рак желудка, рак ободочной кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, предраковые поражения кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполовых путей, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак предстательной железы.

[0053] В некоторых вариантах осуществления анализ полногеномной последовательности (WGS) проводят на вкДНК в биологическом образце для выявления областей, которые могут демонстрировать повышенные или пониженные количества вкДНК по сравнению с количествами вкДНК у здорового пациента или по сравнению с уровнями вкДНК в разрезе здоровых пациентов. Например, если пациент страдает повреждением печени или раком печени, можно ожидать увидеть повышенные уровни вкДНК, идентифицированные как происходящие из печени, по сравнению с уровнями вкДНК из печени из контрольной популяции исходного уровня. Уровни определенного типа вкДНК могут быть определены из уровня суммарной вкДНК с помощью различных алгоритмов, приведенных в настоящем документе, включая анализ с помощью различных алгоритмов машинного обучения, искусственного интеллекта или других алгоритмов для определения уровней и отличий определенной внДНК у субъекта по сравнению с контролем исходного уровня, или для определения и сравнения уровней и отличий нескольких типов вкДНК, полученных из нескольких типов тканей. В некоторых вариантах осуществления анализ вкДНК включает количественную оценку относительных долей вкДНК из различных тканей субъекта и нормальных контролей исходного уровня. В некоторых вариантах осуществления количественная оценка может включать одно или оба из определения набора референсных профилей ткани и количественной оценки доли вкДНК ткани в образце вкДНК на основе полногеномных данных о покрытии вкДНК. Контроли исходного уровня могут включать контрольные образцы здоровых субъектов из совокупности образцов, включая образцы из различных географических регионов, от субъектов разных возрастов, этнической принадлежности, расы или пола, чтобы установить надлежащий исходный уровень.

[0054] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам анализа внеклеточной ДНК (вкДНК) в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение биологического образца, содержащего вкДНК; обогащение указанного образца вкДНК с получением обогащенной вкДНК, где указанная обогащенная вкДНК содержит множество фрагментов вкДНК, каждый из которых соответствует определенному типу ткани или клеток; количественную оценку каждого фрагмента вкДНК для создания полногеномного профиля вкДНК, где указанный полногеномный профиль вкДНК содержит множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК; и сравнение указанного полногеномного профиля вкДНК с профилем известных сигнатур числа копий вкДНК для определения повреждения клеток, повреждения ткани или повреждения органа.

[0055] В некоторых вариантах осуществления биологический образец может представлять собой любой биологический образец, имеющий или предположительно имеющий профиль вкДНК. Таким образом, биологический образец может представлять собой любой образец, взятый или полученный от субъекта, например, биологическую жидкость, полученную от субъекта. Таким образом, например, биологический образец может представлять собой или может быть получен из крови, плазмы, сыворотки, мочи, спинномозговой жидкости, слюны, лимфатической жидкости, внутриглазной жидкости, стекловидной влаги, кохлеарной жидкости, слез, молока, мокроты, вагинальных выделений или любой их комбинации.

[0056] В некоторых вариантах осуществления обогащение представляющей интерес нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, например, обогащение вкДНК в образце, может включать любые подходящие методы обогащения. В некоторых вариантах осуществления обогащение вкДНК может включать обогащение с помощью инвертированных молекулярных зондов, улавливания из раствора, зондов для анализа методом ‘’pull down’’, наборов приманок, стандартной ПЦР, мультиплексной ПЦР, гибридной ловушки, расщепления эндонуклеазами, гиперчувствительности к ДНКазе I и избирательной циркуляризации. Обогащение может быть достигнуто за счет негативной селекции нуклеиновых кислот путем удаления нежелательного материала. Этот вид обогащения включает в себя техники ''футпринтинга'' или ''вычитающей'' гибридной ловушки. В первом случае целевой образец защищен от нуклеазной активности за счет защиты белка или одно- и двухцепочечными структурами. Во втором случае удаляются нуклеиновые кислоты, связывающие зонды-приманки. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает амплификацию вкДНК. В некоторых вариантах осуществления амплификация включает ПЦР-амплификацию или полногеномную амплификацию.

[0057] В некоторых вариантах осуществления количественная оценка нуклеиновой кислоты, такая как количественная оценка вкДНК, может включать любой метод, подходящий для определения количества нуклеиновой кислоты или фрагмента нуклеиновой кислоты в образце. Таким образом, например, количественная оценка может включать секвенирование вкДНК с использованием подсчета молекул ДНК на основе секвенирования или проведение количественной оценки ДНК на основе гибридизации.

[0058] В некоторых вариантах осуществления каждый сигнал числа копий характеризует относительный вклад вкДНК из определенного типа ткани или клеток. Число копий в контексте настоящего документа относится к полногеномному покрытию вкДНК в образце на основе сигналов, полученных путем подсчета молекул ДНК, например, с помощью любых технологий секвенирования или технологий количественной оценки числа копий ДНК на основе гибридизации.

[0059] В некоторых вариантах осуществления тип ткани представляет собой любой тип ткани, в отношении которого требуется осуществлять мониторинг, анализ, измерение, или повреждение которого имеет место или подозревается. В некоторых вариантах осуществления тип ткани представляет собой почечную, мышечную, сердечную, сосудистую, печеночную, головного мозга, глазную, легочную, жировую, железистую, костную, костномозговую, хрящевую, кишечную, желудочную, кожную или мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления тип клеток представляет собой клетки крови, нейроны, клетки почки, эпителиальные клетки, клетки внеклеточного матрикса или иммунные клетки, или любые комбинации клеток. Например, способ может включать измерение или мониторинг одного или нескольких типов тканей или органов у субъекта. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полногеномный профиль вкДНК представляет собой количественную оценку количества вкДНК из нескольких органов для обеспечения оценки состояния здоровья органов. В некоторых вариантах осуществления количественную оценку всех фрагментов вкДНК проводят одновременно. В контексте настоящего документа ''одновременный'' относится к действию, которое происходит в одно и то же время или по существу в одно и то же время. Таким образом, одновременная количественная оценка относится к анализу множества фрагментов вкДНК в одном анализе в одно и то же время или по существу в одно и то же время. Соответственно, варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к универсальному анализу крови, представляющему собой один анализ, где осуществляется или может осуществляться мониторинг нескольких органов в одном анализе. Например, количественная оценка вкДНК ткани может быть проведена на нескольких тканях или одной ткани. Одним из примеров может быть количественная оценка долей вкДНК почек. Как показано на фиг. 2, доля почек выше у пациентов с почечной недостаточностью, и количественная оценка, описанная в настоящем документе, позволяет прогнозировать почечную недостаточность.

[0060] В некоторых вариантах осуществления образец периодически получают от субъекта и анализируют для мониторинга состояния здоровья с течением времени, так что исходный образец анализируют в первый момент времени, а второй образец анализируют во второй момент времени, и оценивают различия в профиле вкДНК, чтобы получить свидетельства изменений профиля вкДНК. Такой анализ может предоставить информацию, касающуюся улучшения или ухудшения состояния определенных типов тканей с течением времени. Например, такие способы могут быть использованы для мониторинга трансплантата органа, для мониторинга токсичности лекарственных средств, для мониторинга схем лечения, для мониторинга состояния здоровья различных органов или тканей с течением времени, для мониторинга состояния здоровья матери на разных стадиях беременности, для мониторинга состояния здоровья новорожденных во время беременности и до родов или после родов, или для других подходящих оценок. Таким образом, некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к мониторингу трансплантата органа с течением времени. В некоторых вариантах осуществления полногеномный профиль вкДНК характеризует токсичность лекарственного средства в органе. В некоторых вариантах осуществления образец является материнским образцом, и полногеномный профиль вкДНК характеризует состояние здоровья плода. Подходящие периоды времени для мониторинга определенной ткани, органа, клетки или состояния могут зависеть от конкретной области применения и могут составлять порядка нескольких минут, например, мониторинг образца раз в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, часов, например, раз в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20 или 24 часа, дней, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 30, месяцев, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, или лет, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или более лет, или в течение периода времени в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеупомянутых значений. Например, мониторинг трансплантата почки с течением времени можно осуществлять, используя описанные в настоящем документе системы и способы. Как показано на фиг. 3A-3B, можно осуществлять мониторинг зависимости доли ДНК из ткани почек от времени для вкДНК донорской почки и вкДНК собственной почки пациента с течением времени.

[0061] В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают вычитание референсного профиля исходного уровня из полногеномного профиля вкДНК. Референсный профиль исходного уровня соответствует определенному типу клеток или ткани, присутствующему в образцах вкДНК исходного уровня, так что профиль исходного уровня может быть учтен в тестируемом образце, а изменения или отклонения от исходного уровня могут быть использованы для диагностики или обнаружения отклонений.

[0062] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам мониторинга развития рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК); количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и сравнение указанного множества сигналов числа копий с профилем известных сигналов числа копий здоровых субъектов. В некоторых вариантах осуществления разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с раковым или предраковым состоянием у субъекта. В некоторых вариантах осуществления образец обогащают суммарной вкДНК перед количественной оценкой вкДНК. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают сравнение множества сигналов числа копий с профилем известных сигналов числа копий образцов больных раком пациентов. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает кровь, плазму, сыворотку, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, лимфатическую жидкость, внутриглазную жидкость, стекловидную влагу, кохлеарную жидкость, слезы, молоко, мокроту, вагинальные выделения или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления количественная оценка включает секвенирование вкДНК с использованием подсчета молекул ДНК на основе секвенирования. В некоторых вариантах осуществления количественная оценка включает проведение количественной оценки ДНК на основе гибридизации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают обогащение вкДНК перед количественной оценкой вкДНК. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает амплификацию вкДНК посредством ПЦР-амплификации или полногеномной амплификации.

ПРИМЕРЫ

[0063] Дополнительные альтернативы более подробно раскрыты в следующих примерах, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.

Общие процедуры и методы

Извлечение

[0064] Нормальная скорость кровотока составляет около 5 литров в минуту, так что полный объем крови циркулирует один раз в минуту. Эта скорость намного выше, чем кинетика образования и деградации вкДНК, и состав вкДНК в крови человека является единообразным в течение короткого периода времени (например, менее 5 минут). В этих условиях забор крови приблизительно представляет собой пуассоновскую выборку вкДНК. Для моделирования извлечения ДНК используется либо полиномиальное распределение, либо многомерное гипергеометрическое распределение.

[0065] Процесс извлечения следует распределению Пуассона n''_l ~ Pois(n'' · Σ_t β_t · A_tl), или совместно полиномиальному распределению (n''_l) ~ Multi(Σ_t β_t · A_t, n''), где n''_l представляет собой число копий в локусе l, n'' представляет собой суммарное число копий фрагментов вкДНК, β_t представляет собой долю вкДНК из типа ткани t, и A_t представляет собой референсный профиль числа копий для типа ткани t.

ПЦР-амплификация

[0066] Процесс ПЦР аппроксимируется гамма-распределением n'_l ~ Gamma(n''_l · ρ, θ), или совместно распределением Дирихле (n'_l) / θ~ Dir(α=(n''_l · ρ)), где ρ=(1+r)/(1- r)/[1 - (1+r) ^–t], θ=[(1+r)^t - 1] · (1 - r)/(1+r), и r представляет собой эффективность ПЦР-амплификации в каждом цикле, n'_l представляет собой число молекул ДНК в локусе l после ПЦР, n' представляет собой суммарное число молекул ДНК, амплифицированных из фрагментов вкДНК.

Секвенирование

[0067] Подобно извлечению, секвенирование следует распределению Пуассона n_l ~ Pois(n · n'_l / n'), или совместно полиномиальному распределению (n_l) ~ Multi(n'_l /n', n), где n представляет собой число фрагментов, наблюдаемых при секвенировании, а n_l представляет собой наблюдаемое число копий вкДНК в данном локусе l.

Некоторые числа

[0068] Учитывая, что в обычном человеке содержится приблизительно 5000 мл крови, 1,8-44 нг/мл вкДНК плазмы соответствует 1,35-33 миллионам копий человеческих геномов. Доля ткани в 1% соответствует 13 500-330 000 копий. В качестве примера, когда 3 нг вкДНК используются в качестве входных данных для WGS-анализа вкДНК, это соответствует в общей сложности 900 копий, 9 копий 1% тканевого генома и 0,9 копий 0,1% тканевого генома.

Пример 1 - Моделирование совокупного профиля сигналов вкДНК

[0069] В следующем примере демонстрируется вариант осуществления моделирования совокупного профиля сигналов вкДНК.

[0070] Не принимая во внимание переменные извлечения и ПЦР, модель S сигналов вкДНК представляет собой (n_l) ~ Multi(Σ_t β_t · A_t, n). Учитывая большое количество сгруппированных данных (или локусов), которые приблизительно равномерно распределены, оно близко к распределению Пуассона: n_l ~ Pois(n · Σ_t β_t · A_t). Учитывая известные профили ткани A, неизвестными являются только доли ткани B=(β_t), которые могут быть вычислены путем численной оптимизации.

[0071] Модель PS сигнала вкДНК представляет собой гамма-пуассоновское (отрицательное биномиальное) распределение nl ~ NB(n''l…ρ, p=n · θ / (n'+n · θ)). Если n'=n'' · ρ · θ, n''_l=n'' · Σ_t β_t · A_tl, и без учета вариабельности при извлечении, получаем n_l ~ NB(n'' · ρ · Σ_t β_t · A_tl, n / (n'' · ρ+n)). Когда n<n'' · ρ, оно приблизительно представляет собой n_l ~ Pois(n · Σ_t β_t · A_tl), что совпадает с моделью S.

[0072] Объединение стадий E и P в одно распределение Дирихле (n'_l) / θ ~ Dir(n'' · α · 1/(1+1/ρ)), или n'_l ~ Gamma(n'' · α · ρ/(1+ρ), (1+ρ) θ). Распределение Дирихле используется для оценки неизвестного полиномиального распределения вероятностей. В частности, оно расширяет бета-распределение на несколько измерений и обеспечивает плавный переход между предыдущим распределением и наблюдаемым распределением, а также позволяет контролировать скорость этого перехода.

[0073] При объединении стадий извлечения, ПЦР и секвенирования модель EPS сигнала вкДНК представляет собой (n_l) ~ DM(n'' / (1+1/ρ) · α, n) или (n_l) ~ DM(n'' · α · (1+r)/2, n), где DM представляет собой полиномиальное распределение Дирихле. Учитывая большое количество сгруппированных данных (или локусов), которые приблизительно равномерно распределены, оно близко к отрицательному биномиальному распределению: n_l ~ NB(n'' · α · ρ/(1+ρ), (1+ρ) θ n / [(1+ρ) θ n+n’] или n_l ~ NB(n''·α_l·(1+r)/2, n / [n+n''·(1+r)/2]. Среднее значение и дисперсия μ=n · α_l, δ²=n · α_l · [n/ n'' · (1/ρ+1)+1]. Когда n<n'', например, для 30x WGS с>1 нг входной вкДНК, n_l приближается к распределению Пуассона n_l ~ Pois(n · α_l). В таблице 1 представлен список статистических моделей, используемых в количественной оценке вкДНК, где α_l=Σ_t β_t · A_tl и α=Σ_t β_t · A_t.

Таблица 1

Зависимая модель Независимая модель Компонент E (n''_l) ~ Multi(α, n'') n ''_l ~ Пуа (n'' ·α_l) Компонент P (n’_l) / θ ~ Dir((n''_l · ρ)) n'_l ~ Gamma(n''_l · ρ, θ) Компонент S (n_l) ~ Multi((n'_l / n'), n) n_l ~ Pois(n · n'_l / n') Модель S (n_l) ~ Multi(α, n) n_l ~ Pois(n · α_l) Модель PS (n_l) ~ DM(n'' · ρ · α, n) n_l ~ NB(n'' · ρ · α_l, n/(n'' · ρ+n)) или n_l ~ Pois(n · α_l), если n<n'' · ρ. Модель EPS (n_l) ~ DM(n''/(1+1/ρ) · α, n), n_l ~ NB(n''·α_l·ρ/(1+ρ), n/[n+n''·ρ/(1+ρ)] или
n_l ~ Pois (n · α_l), если n<n''.

[0074] Модель PS сигнала вкДНК представляет собой гамма-пуассоновское (отрицательное биномиальное) распределение n_l ~ NB(n''_l · ρ, p=n · θ / (n'+n · θ)). Если n'=n'' · ρ · θ, n''_l=n'' · Σ_t β_t · A_tl, и без учета вариабельности при извлечении, получаем n_l ~ NB(n'' · ρ · Σ_t β_t · A_tl, n / (n'' · ρ+n)). Когда n<n'' · ρ, оно приблизительно представляет собой n_l ~ Pois(n · Σ_t β_t · A_tl), что совпадает с моделью S.

Мультипликативное обновление

[0075] Модель Пуассона n_l ~ Pois(n · α_l) эквивалентна неотрицательной матричной факторизации с дивергенцией KL в качестве стоимости. Для вычисления β_t применяется алгоритм мультипликативного обновления β_st ← β_st · Σ_l A_tl · r_sl / (β⋅A)_sl / Σ_l A_tl, основанный на алгоритме неотрицательной матричной факторизации (NMF), описанном в Lee and Seung, 2001.

Итеративная взвешенная линейная регрессия

[0076] Для отдельно взятого образца с расчетной долей ткани β₀ взвешенная линейная регрессия с функцией стоимости определяется как E(β; β₀, A)=1/2 · Σ_l [(r_l - (β⋅A)_l)²/ (β₀⋅A)_l]. Эта взвешенная линейная регрессия решается (β₀, A), затем β ← r ⋅W^-1⋅A^T (A⋅W^-1⋅A^T)^-1, где W=diag(β₀⋅A), обеспечивая дальнейший алгоритм итеративного обновления. Разница между этой и обычной линейной регрессией E=1/2 · Σ_l [(r_l - (β⋅A)_l)² заключается во взвешивании, основанном на W=diag(α)=β ⋅ A_L.

Выведение модели EPS

[0077] Дано (n'_l) / θ ~ Dir((n''_l · ρ)) и (n''_l) ~ Multi(α, n''), и закон общей дисперсии задан следующим образом:

E((n'_l) / θ)=α,

var((n'_l) / θ)=var(n''_l/ n'')+E(n''_l · ρ (n'' · ρ- n''_l · ρ)/ [(n'' · ρ)²(n'' · ρ+1)].

~=var(n''_l/ n'')+E(n''_l / n'' (1 - n''_l / n'')/ [n''· ρ]).

=α (1-α) / n''+α / [n''· ρ] - (var(n''_l / n'')+α²) / [n''· ρ])

=α (1-α) / n''+α / [n''· ρ] - (α (1-α) / n''+α²) / [n''· ρ])

=α (1-α) {1 / n'' (1 - 1/[n''· ρ])+1/ [n''· ρ]}

~=α (1-α) {1 / n''+1/ [n''· ρ]}

=α (1-α) / [n'' · 1/(1+1/ρ))]

[0078] Это совпадает с Dir(n'' · α · 1/(1+1/ρ)). Учитывая n''_l ~ Pois(n'' · α_l) и n'_l ~ Gamma(n''_l · ρ, θ), закон общей дисперсии дает:

E((n'_l))=n'' · α_l · ρ · θ,

var((n'_l))=var(n''_l · ρ · θ)+E(n''_l · ρ θ²)

=n'' · α_l· ρ (1+ρ) θ²

[0079] Это совпадает с Gamma(n'' ⋅ α ⋅ ρ/(1+ρ), (1+ρ) θ).

n · n'_l / n' ~ Gamma(n'' ⋅ α ⋅ ρ/(1+ρ), (1+ρ) θ n / n')

n_l ~ Pois(n ⋅ n'_l / n')

n_l ~ NB(n'' ⋅ α ⋅ ρ/(1+ρ), (1+ρ) θ n / [(1+ρ) θ n+n']

n_l ~ NB(n'' ⋅ α ⋅ ρ/(1+ρ), (1+ρ) n / [(1+ρ) n+n'' ⋅ ρ]

Пример 2 - Определение профиля вкДНК ткани

[0080] Следующий пример демонстрирует варианты осуществления способа определения референсного профиля вкДНК ткани.

[0081] Для расчета тканеспецифических или специфических для типа клеток профилей сигналов вкДНК могут быть использованы две взаимодополняющие стратегии. Первый метод заключается в использовании машинного обучения без учителя, основанного на наборе образцов, содержащих представляющую интерес ткань/клетку в различных долях. Второй метод заключается в использовании машинного обучения с учителем путем прогнозирования профилей сигналов вкДНК, происходящей из данной ткани/клетки, на основе эпигенетических профилей геномной ДНК (гДНК) или профилей экспрессии генов данного типа ткани/клеток.

Машинное обучение без учителя

[0082] В методе машинного обучения с учителем используется неотрицательное матричное разложение для разложения сигнала смеси вкДНК и извлечения тканеспецифических профилей покрытия вкДНК. Модель Пуассона n_l ~ Pois(n · α_l) эквивалентна неотрицательному матричному разложению с дивергенцией Кульбака-Лейблера (KL) в качестве стоимости. Дивергенция KL - это мера того, как одно распределение вероятностей отличается от референсного распределения вероятностей. Для данного набора данных достаточного размера и тканевого состава представляющего интерес типа ткани алгоритм NMF за авт. Lee and Seung 2001 применяется для расчета долей ткани в каждом образце, а также для установления профилей вкДНК ткани. Тканевая доля ткани t в образце s рассчитывается с помощью β_st (β_st · Σ_l A_tl · r_sl / (β⋅A)_sl / Σ_l A_tl, где сигнал вкДНК в локусе l для типа ткани t рассчитывается с помощью A_tl ← A_tl · Σ_s β_st · r_sl / (β⋅A)_sl / Σ_s β_st, где (представляет собой умножение матриц, r_sl представляет собой долю прочтений, покрывающих локус l в образце s.

Машинное обучение с учителем

[0083] Существует два связанных ограничения алгоритма без учителя. Во-первых, для этого требуются образцы от субъектов, находящихся в определенных физиологических или патологических условиях, например, для изучения профиля вкДНК почек требуется доступ ко множеству образцов вкДНК от пациентов с повышенным повреждением почек. Во-вторых, для типов тканей с небольшими популяциями клеток или типов клеток, которые встречаются редко, доля сигнала вкДНК крови, привносимая такими клетками, может быть очень маленькой. Таким образом, требуется большее количество образцов вкДНК, чтобы эффективно изучить профили сигналов вкДНК для таких типов тканей или клеток. Эти ограничения можно преодолеть с помощью больших наборов данных. Однако на практике большие наборы данных могут помешать широкому применению количественной оценки вкДНК тканей на основе WGS для всех типов тканей.

[0084] По этим причинам может быть использовано машинное обучение с учителем, которое прогнозирует тканеспецифические профили числа копий вкДНК на основе эпигенетических данных или данных экспрессии из образцов клеток определенной ткани. Машинное обучение с учителем не требует доступа к образцам вкДНК от пациентов с определенным повреждением органов, а вместо этого использует только выделенные клетки ткани из образцов нормальных или больных субъектов. В этих методах применяется глубинная нейронная сеть, а точнее, рекуррентная нейронная сеть или сверточная нейронная сеть на одномерных данных секвенирования для прогнозирования профилей вкДНК. Входные характеристики для нейронных сетей включают полногеномную доступность ДНКазы, метилирование ДНК, метилирование гистонов, профили ацетилирования гистонов или профили экспрессии генов для данного типа ткани. Прогноз на основе машинного обучения представляет собой полногеномный профиль числа копий вкДНК для представляющей интерес ткани.

[0085] Перекрестная проверка как внутри ткани, так и между тканями используется для обучения и оценки моделей машинного обучения. Более конкретно, тканеспецифические эпигенетические данные подготавливаются в качестве входных характеристик, а расчетные профили покрытия вкДНК ткани (из алгоритмов без учителя) подготавливаются как целевые. Для перекрестной проверки внутри ткани сохраняется подмножество локусов в геноме для проверки, а другие локусы используются для обучения. Для перекрестной проверки между тканями референсные профили вкДНК для определенных типов клеток, таких как клетки крови, используются для обучения, а референсные профили вкДНК для дополнительных типов клеток, таких как клетки почек или легких, используются для проверки.

Пример 3 - исследования вкДНК

[0086] Следующий пример демонстрирует варианты осуществления исследований для анализа вкДНК в образце от субъекта.

Пилотное исследование

[0087] Плазменная ДНК от 10 пациентов с терминальной почечной недостаточностью (ТПН) и 10 нормальных контролей, соответствующих по возрасту, полу и массе тела, были получены и изучены. Для каждого образца был проведен 30x WGS. Было получено присутствие сильных сигналов вкДНК, которые могут надежно дифференцировать ТПН по сравнению с нормальными контролями. Кластерный анализ и анализ главных компонент (PCA) показывают, что ТПН и нормальные образцы образуют отдельные группы. Для нормальных контролей определенные доли почек составили <0,5%.

Исследование смеси

[0088] Для трех пар случай-контроль были приготовлены смеси синтетических вкДНК путем смешивания ТПН с контрольной вкДНК посредством последовательных разведений. Для каждой пары случай-контроль восемь смесей со 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5625% и 0,78125% вкДНК ТПН разбавляли контрольной вкДНК. С помощью этого набора данных были определены аналитические характеристики количественной оценки тканей. Исследование смеси показало, что расчетная доля почек линейна по отношению к истинной доле почек, и что доля почек может быть точно определена (CV (коэффициент вариации) <20%) для до 0,5%.

[0089] Один вариант осуществления для проверки изображен на блок-схеме на фиг. 5, которая иллюстрирует процесс оценки образцов вкДНК для количественной оценки вкДНК ткани. Как показано на фиг. 5, первая когорта может включать контрольных и больных субъектов, которые подвергаются подготовке библиотеки, 30x WGS, а затем анализируются. Части продукта WGS подвергаются выявлению биомаркеров, тогда как другие части подвергаются проверке сигнала или алгоритмов WGS. Вторая когорта может представлять собой когорту синтетических смесей, включая, например, множество образцов от пациентов с диабетом, волчанкой, артериальной гипертензией, заболеваниями почек (такими как хроническая болезнь почек (ХБП) или поликистоз почек (ПКП)), контрольные образцы или образцы от других субъектов. Смеси подвергаются анализу ампликонов, секвенированию и применению алгоритмов для определения характеристик способов количественной оценки ткани (включая определение предела количественного определения (LOQ) или предела обнаружения LOD) и линейности способов) или диагностики заболевания (включая определение чувствительности и специфичности способов).

Полное исследование

[0090] После исследования смеси собирают около 200 образцов пациентов с диабетом на различных стадиях хронической болезни почек (ХБП) и подвергают 30x WGS вкДНК. Результаты показывают, что расчетная доля почек может надежно дифференцировать пациентов с ранней стадией ХБП от пациентов с терминальной стадией ХБП, что расчетная доля почек может надежно дифференцировать пациентов с ранней стадией ХБП от пациентов с диабетом без ХБП, и что расчетная доля почек коррелирует со степенью тяжести заболевания почек.

Исследование различных органов

[0091] Собирают пять образцов крови у пациентов с сердечной недостаточностью или повреждением легких (например, кистозным фиброзом) или нормальных контролей и подвергают 30x WGS вкДНК. Результаты демонстрируют, что пациенты с сердечной недостаточностью, повреждением легких или заболеванием почек имеют различающиеся между собой профили сигналов вкДНК, и они отличаются от нормальных контролей, и что доли вкДНК сердца и доли вкДНК легких могут быть количественно оценены.

Исследование различных трансплантатов

[0092] Собирают пять образцов крови от пациентов с трансплантатами легких или сердца и подвергают 30x WGS вкДНК. Результаты демонстрируют, что пациенты с трансплантатами сердца или легких имеют различающиеся картины, и что расчетные доли легких или доли сердца линейно коррелируют с долями донорских органов на основе генетических вариантов.

[0093] Термин ''содержащий'' в настоящем документе является синонимом терминов ''включающий'', ''содержащий'' или ''характеризующийся'' и является включительным или открытым, и не исключает дополнительных, не перечисленных элементов или стадий способа.

[0094] Приведенное выше описание раскрывает несколько методов и материалов согласно настоящему изобретению. Данное изобретение допускает модификации методов и материалов, а также изменения способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области техники после прочтения данного описания или практического осуществления изобретения, раскрытого в настоящем документе. Следовательно, предполагается, что данное изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем документе, но охватывает все модификации и альтернативные варианты, входящие в истинный объем и сущность изобретения.

[0095] Все цитируемые в настоящем документе источники, включая, не ограничиваясь перечисленным, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и литературные ссылки, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки и, таким образом, являются частью данного описания. В той степени, в которой публикации и патенты или патентные заявки, включенные посредством ссылки, противоречат раскрытию, содержащемуся в описании, данное описание заменяет и/или имеет преимущественную силу над любым таким противоречащим материалом.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ анализа внеклеточной ДНК (вкДНК) в биологическом образце, включающий: получение биологического образца, содержащего вкДНК; выделение вкДНК из указанного образца с получением очищенной вкДНК, где указанная очищенная вкДНК содержит множество фрагментов вкДНК, причем каждый из фрагментов соответствует определенному типу ткани или клеток; количественную оценку указанных фрагментов вкДНК для создания полногеномного профиля числа копий вкДНК, где указанный полногеномный профиль числа копий вкДНК содержит множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК; и сравнение указанного полногеномного профиля числа копий вкДНК с набором известных сигнатур вкДНК для определения повреждения клеток, повреждения ткани или повреждения органа. Также описан способ мониторинга развития заболевания у субъекта, включающий: получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК); количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и сравнение указанного множества сигналов числа копий вкДНК с набором известных сигналов числа копий здоровых субъектов, где разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с развитием заболевания у указанного субъекта. Раскрыт способ мониторинга состояния здоровья тканей и органов у субъекта, включающий: получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК); количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и сравнение указанного множества сигналов числа копий вкДНК с набором известных сигналов числа копий здоровых субъектов, где разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с изменением состояния здоровья органа у указанного субъекта. Изобретение позволяет извлекать локус-специфические сигналы числа копий из образцов внеклеточной ДНК для идентификации тканеспецифических профилей числа копий вкДНК и позволяет количественно оценивать доли ткани в образцах вкДНК. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Способ анализа внеклеточной ДНК (вкДНК) в биологическом образце, включающий:

получение биологического образца, содержащего вкДНК;

выделение вкДНК из указанного образца с получением очищенной вкДНК, где указанная очищенная вкДНК содержит множество фрагментов вкДНК, причем каждый из фрагментов соответствует определенному типу ткани или клеток;

количественную оценку указанных фрагментов вкДНК для создания полногеномного профиля числа копий вкДНК, где указанный полногеномный профиль числа копий вкДНК содержит множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК; и

сравнение указанного полногеномного профиля числа копий вкДНК с набором известных сигнатур вкДНК для определения повреждения клеток, повреждения ткани или повреждения органа.

2. Способ по п. 1, где биологический образец включает кровь, плазму, сыворотку, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, лимфатическую жидкость, внутриглазную жидкость, стекловидную влагу, кохлеарную жидкость, слезы, молоко, мокроту, вагинальные выделения или любую их комбинацию.

3. Способ по п. 1, где количественная оценка включает секвенирование вкДНК с использованием подсчета молекул ДНК на основе секвенирования.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий обогащение представляющими интерес фрагментами вкДНК.

5. Способ по п. 1, где количественная оценка включает проведение количественной оценки ДНК на основе гибридизации.

6. Способ по п. 1, где выделение включает обогащение на основе размера для исключения гДНК и обогащения фрагментами вкДНК.

7. Способ по п. 1, где обогащение включает амплификацию вкДНК.

8. Способ по п. 7, где амплификация включает ПЦР-амплификацию или полногеномную амплификацию.

9. Способ по п. 1, где каждый сигнал числа копий характеризует относительный вклад вкДНК из определенного типа ткани или клеток.

10. Способ по п. 1, где тип ткани представляет собой почечную, мышечную, сердечную, сосудистую, печеночную, головного мозга, глазную, легочную, жировую, железистую, костную, костномозговую, хрящевую, кишечную, желудочную, кожную или ткань мочевого пузыря.

11. Способ по п. 1, где тип клеток представляет собой клетки крови, нейроны, клетки почки, эпителиальные клетки, бета-клетки или иммунные клетки.

12. Способ по п. 1, где полногеномный профиль вкДНК используют для количественной оценки количеств вкДНК из нескольких органов для обеспечения оценки состояния здоровья органа или нескольких органов.

13. Способ по п. 1, где образец периодически получают от субъекта и анализируют для мониторинга состояния здоровья с течением времени.

14. Способ по п. 13, дополнительно включающий мониторинг трансплантата органа с течением времени.

15. Способ по п. 1, где полногеномный профиль вкДНК свидетельствует о токсичности или эффективности лекарственного средства в органе.

16. Способ по п. 1, где образец является материнским образцом, и где полногеномный профиль вкДНК характеризует здоровье плода.

17. Способ по п. 1, где одновременно количественно оценивают несколько органов путем проецирования полногеномного профиля вкДНК на набор референсных профилей вкДНК, соответствующих различным типам тканей и клеток.

18. Способ по п. 1, дополнительно включающий вычитание референсного профиля исходного уровня из полногеномного профиля вкДНК.

19. Способ мониторинга развития заболевания у субъекта, включающий:

получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК);

количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и

сравнение указанного множества сигналов числа копий вкДНК с набором известных сигналов числа копий здоровых субъектов,

где разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с развитием заболевания у указанного субъекта.

20. Способ по п. 19, где образец обогащают суммарной вкДНК перед количественной оценкой вкДНК.

21. Способ по п. 19, дополнительно включающий сравнение множества сигналов числа копий с профилем известных сигналов числа копий образцов больных пациентов.

22. Способ по п. 19, где биологический образец включает кровь, плазму, сыворотку, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, лимфатическую жидкость, внутриглазную жидкость, стекловидную влагу, кохлеарную жидкость, слезы, молоко, мокроту, вагинальные выделения или любую их комбинацию.

23. Способ по п. 19, где количественная оценка включает секвенирование вкДНК с использованием подсчета молекул ДНК на основе секвенирования.

24. Способ по п. 19, где количественная оценка включает проведение количественной оценки ДНК на основе гибридизации.

25. Способ по п. 19, где заболевание выбрано из сердечной недостаточности, повреждения легких, диабета, болезни Крона или заболевания почек.

26. Способ по п. 25, где обогащение включает амплификацию вкДНК посредством направленной амплификации или полногеномной амплификации.

27. Способ мониторинга состояния здоровья тканей и органов у субъекта, включающий:

получение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит внеклеточную ДНК (вкДНК);

количественную оценку вкДНК в указанном образце для получения полногеномного профиля вкДНК, содержащего множество сигналов числа копий, каждый из которых соответствует фрагменту вкДНК определенного типа клеток или типа ткани; и

сравнение указанного множества сигналов числа копий вкДНК с набором известных сигналов числа копий здоровых субъектов,

где разница между сигналом числа копий в образце и известными сигналами числа копий коррелирует с изменением состояния здоровья органа у указанного субъекта.

28. Способ по п. 27, где образец обогащают суммарной вкДНК перед количественной оценкой вкДНК.

29. Способ по п. 27, дополнительно включающий сравнение множества сигналов числа копий с профилем известных сигналов числа копий образцов от пациента, имеющего неудовлетворительное состояние здоровья ткани или органа.

30. Способ по п. 27, где биологический образец включает кровь, плазму, сыворотку, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, лимфатическую жидкость, внутриглазную жидкость, стекловидную влагу, кохлеарную жидкость, слезы, молоко, мокроту, вагинальные выделения или любую их комбинацию.

31. Способ по п. 27, где количественная оценка включает секвенирование вкДНК с использованием подсчета молекул ДНК на основе секвенирования.

32. Способ по п. 27, где количественная оценка включает проведение количественной оценки ДНК на основе гибридизации.

33. Способ по п. 27, где обогащение включает амплификацию вкДНК посредством направленной амплификации или полногеномной амплификации.