Фосфониевые соли на основе алантолактона, обладающие противоопухолевой активностью, и способ их получения Российский патент 2024 года по МПК C07D307/92 A61K31/365 A61P35/00 

Группа изобретений относится к области органической химии и фармакологии, в частности, к новым соединениям - фосфониевым солям на основе природного сесквитерпенового лактона - алантолактона, их способу получения и применения в качестве противоопухолевых средств в отношении аденокарциномы предстательной железы и аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека, в фармакологии, медицине и ветеринарии.

Далее заявителем представлены термины и определения, использованные в заявленном техническом решении:

Сесквитерпеновые лактоны (CЛ) - один из многочисленных классов природных соединений, характерной особенностью строения которых являются три конденсированных изопреновых звена и лактонное кольцо.

Сесквитерпеновые лактоны являются большим классом природных соединений преимущественно растительного происхождения, относящихся к подклассу терпеноидов и проявляющих широкий спектр биологической активности, что представляет значительный интерес в терапии различных заболеваний [Y.Cai, K.Gao, B.Peng, Z.Xu, J.Peng, J.Li, X.Chen, S.Zeng, K.Hu, Y.Yan. Alantolactone: A natural plant extract as a potential therapeutic agent for cancer. Front. Pharmacol. 2021. Vol. 12. Art. No. 781033]. Особенное внимание сесквитерпеновые лактоны привлекают своей противоопухолевой активностью в отношении клеток лейкемии, меланомы, остеосаркомы, рака поджелудочной железы, кишечника, молочной железы, яичников, предстательной железы, печени, почек, центральной нервной системы и легких [B.Kovacs, J.Hohmann, B.Csupor-Löffler, T.Kiss, D.Csupor. A comprehensive phytochemical and pharmacological review on sesquiterpenes from the genus Ambrosia. Heliyon. 2022. Vol. 8(7). Art. No. e09884]. В настоящее время подробно исследуются молекулярные механизмы и сигнальные пути, посредством которых различные представители терпеноидов реализуют свое терапевтическое действие [S.Kamran, A.Sinniah, M.A.M.Abdulghani, M.A.Alshawsh. Therapeutic potential of certain terpenoids as anticancer agents: A scoping review. Cancers. 2022. Vol. 14 (5). P. 1100; C.Bailly. Anticancer targets and signaling pathways activated by britannin and related pseudoguaianolide sesquiterpene lactones. Biomedicines. 2021. Vol. 9 (10). P. 1325]. Литературные данные показывают, что сесквитерпеновые лактоны, и в частности алантолактон, способны индуцировать программируемую клеточную гибель (апоптоз) опухолевых клеток, что является одним из подходов в терапии опухолевых заболеваний [G.Babaei, S.G.-G.Aziz, M.R.Bazl, M.H.K.Ansari. A comprehensive review of anticancer mechanisms of action of Alantolactone. Biomed. Pharmacother. 2021. Vol. 136. Art. No. 111231]. Одной из установленных мишеней, на которые действует алантолактон, является фактор транскрипции NF-κB, который принимает участие в апоптозе, клеточной пролиферации, ангиогенезе, метастазировании, инвазиии, а также модулирует иммунные и воспалительные реакции, влияя на рост раковых клеток [M.Soukhtanloo, E.Mohtashami, A.Maghrouni, H.Mollazadeh, S.H.Mousavi, M.K.Roshan, S.-A.Tabatabaeizadeh, A.Hosseini, M.Vahedi, M.Jalili-Nik, A.R.Afshari. Natural products as promising targets in glioblastoma multiforme: a focus on NF-κB signaling pathway. Pharmacol. Reports. 2020. Vol. 72 (2). P. 285]. Было обнаружено, что АЛТ способствует апоптозу клеток при остром лимфобластном лейкозе и раке желудка, а также ингибирует миграцию клеток рака молочной железы и значительно задерживает клеточную пролиферацию клеток HeLa путем ингибирования активации NF-κB [W.He, P.Cao, Y.Xia, L.Hong, T.Zhang, X.Shen, P.Zheng, H.Shen, Y.Zhao, P.Zou. Potent inhibition of gastric cancer cells by a natural compound via inhibiting TrxR1 activity and activating ROS-mediated p38 MAPK pathway. Free Radic. Res. 2019. Vol. 53(1). P. 104]. СЛ демонстрируют также противовоспалительное действие [H.-S.Lim, S.-E.Jin, O.-S.Kim, H.-K.Shin, S.-J.Jeong. Alantolactone from Saussurea lappa exerts antiinflammatory effects by inhibiting chemokine production and STAT1 phosphorylation in TNF-α and IFN-γ-induced in HaCaT cells. Phytother. Res. 2015. Vol. 29 (7). P. 1088]. В ряде работ показано, что СЛ, модифицированные по α-метиленовой группе, проявляли даже более высокий уровень противовоспалительной активности по сравнению с исходными соединениями, в отношении экспрессии TNF-α, IL-1β и IL-6 in vitro в мышиных нейтрофилах [R.Chib, B.A.Shah, N.Anand, A.Pandey, K.Kapoor, S.Bani, V.K.Gupta, Rajnikant, V.K.Sethi, S.C.Taneja. Psilostachyin, acetylated pseudoguaianolides and their analogues: Preparation and evaluation of their anti-inflammatory potential. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011. Vol. 21 (16). P. 4847].

Алантолактон содержится во многих растительных объектах, относящихся к семейству Asteraceae, что делает его доступной многообещающей платформой для создания лекарственных агентов. Однако, несмотря на широкий спектр противоопухолевого действия, применение алантолактона ограничено. Фрагмент α-метилен-γ-лактона, принимающий непосредственное участие в реализации токсичности сесквитерпенового лактона в отношении опухолевых клеток, способен также вступать в реакции присоединения по типу Михаэля с белками крови, содержащими сульфгидрильные группы, что снижает биодоступность алантолактона, вызывает быструю опсонизацию и препятствует достижению его эффективных концентраций в крови. Таким образом, для успешного применения сесквитерпеноидов, и в частности алантолактона, необходимо повысить эффективность их проникновения через клеточную мембрану опухолевых клеток и исключить возможность протекания реакции присоединения по типу Михаэля с белками крови. Данные задачи могут быть решены химической модификацией. Введение объемных заместителей вблизи экзо-метилиденовой группы способно создавать стерические препятствия для реакции присоединения по типу Михаэля, что в совокупности с повышением липофильности будет способствовать проникновению СЛ через клеточную мембрану, тем самым усиливая цитотоксичность. [A.Ghantous, H.Gali-Muhtasib, H.Vuorela, N.A.Saliba, N.Darwiche. What made sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials? Drug Discov. Today. 2010. Vol. 15 (15/16). P. 668].

Известен ряд производных сесквитерпеновых лактонов, которые могут быть рассмотрены в качестве аналогов предлагаемого изобретения с общими признаками.

Известно изобретение «Донор сероводорода на основе кольцевой структуры α-метилен-гамма-лактона, способ его получения и способ применения» [CN111303095A 19.06.2020], сущностью которого является димерное трисульфидное производное сесквитерпенового лактона - партенолида - формулы А1, полученное взаимодействием полисульфида натрия и партенолида в присутствии фосфорной кислоты и ацетата натрия при 0°C. Соединение А1 проявляет противоопухолевую активность в отношении клеточной линии рака шейки матки HeLa (IC₅₀ 4.01 μМ) и рака легкого A549 (IC₅₀ 32.80 μМ).

Известно изобретение «N-метилпиперазиновое производное сесквитерпенового лактона и соли на его основе, и применение N-метилпиперазинового производного сесквитерпенового лактона и его соли в приготовлении лекарственных средств» [CN112724109A 30.04.2021], сущностью которого являются N-метилпиперазиносодержащие производные сесквитерпеновых лактонов, михелиолида и партенолида, формулы А2-А3, полученные взаимодействием непредельного лактона с N-метилпиперазином в присутствии карбоната калия в среде дихлорметана. Соединения А2-A3 проявили цитотоксичность в отношении клеток глиобластомы U118-MG со значениями IC₅₀ 88.5 и 28.4 μМ, соответственно.

Известно изобретение «Производное партенолида, его фармацевтическая композиция, способ получения и применение» [CN 112876495 A 01.06.2021], сущностью которого являются сложноэфирные производные партенолида общей формулы A4, полученные после предварительного гидроксилирования партенолида и его последующей этерификации, формулы А4, где R = 2-нитрофуранил, антрахинонил, хинолинил, хромонил, N-метиленурацил, Ar-S-(CH₂)_n-, Ar-O-(CH₂)_n-, N,N-бис(хлорэтиламино)-2-бензимидазолил. Соединения A4 проявили противоопухолевую активность в отношении клеточных линий рака толстой кишки HCT116, печени HepG2, желудка BGC823, легких PC9 и глиобластомы U87-MG со значениями IC₅₀ 1.02÷52.57 μМ.

Известно изобретение по патенту «Способы изготовления и назначение деривата sphaelactone и его композитные лекарства» [RU2537319C2 10.01.2015], сущностью которого являются производные михелиолида, а именно диметиламино-производное формулы А5, эфирное производное формулы А6 и эпоксидированное производное формулы А7, которые проявили противоопухолевую активность, в том числе на клеточной линии рака простаты PC-3 со значениями IC₅₀ 8.7÷17.5 μМ.

Известно изобретение «Производное михелиолида, способ получения и его применение» [CN 104211669 A, 17.12.2014], сущностью которого являются производные михелиолида формулы А8, полученные реакцией кросс-сочетания сесквитерпенового лактона с галогенаренами в присутствии триэтиламина и ацетата палладия. Соединения А8 проявили противоопухолевую активность in vitro в отношении раковых линий клеток, в том числе - карциномы предстательной железы DU-145 со значениями IC₅₀ 32 ÷ 131 μM.

Известно изобретение «Противораковые и противовоспалительные соединения партенолида» [WO 2012145678 A1, 26.10.2012], сущностью которого являются производные сесквитерпеновых лактонов, в частности производные партенолида А9 - А12, полученные взаимодействием производных партенолида с диметиламином, обладающие цитотоксичностью в отношении карциномы предстательной железы DU-145 со значениями IC₅₀ 10.1, 24.9, 16.1 и 13.6 μМ, соответственно.

Общим недостатком изобретений-аналогов CN 111303095 A, CN 112724109 A, CN 112876495 A, RU 2537319 C2, CN 104211669 A, WO 2012145678 A1 является невысокое цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, что ограничивает их практическое применение. Пониженная цитотоксичность обусловлена тем, что описанные методики модификации сесквитерпеноидов направлены в основном на повышение растворимости производных в водных средах, но это не способствует их направленному воздействию на опухолевые клетки, которое необходимо для индукции апоптоза. Таким образом, анализ недостатков технического результата в целом, изобретений-аналогов CN 111303095 A, CN 112724109 A, CN 112876495 A, RU 2537319 C2, CN 104211669 A, WO 2012145678 A1 свидетельствует о необходимости введения в структуру сесквитерпеноидов функциональных групп, обеспечивающих целевое проникновение в опухолевые клетки.

Из исследованного заявителем уровня техники выявлены аминированные производные алантолактона формулы А13 и его оксида формулы А14, обладающие противоопухолевой активностью в отношении ряда клеточных линий, в частности рака желудка (MGC-803), рака толстой кишки (HCT-116), рака молочной железы (MDA-MB-231), рака яичников (S-OV-3), рака шейки матки (HeLa), рака легкого (A549), рака печени (PLC, HepG2), меланомы (A375) человека со значениями IC₅₀ 2.5 ÷ 68.8 μМ, полученные взаимодействием соответствующих терпеноидов с гидрохлоридом диметиламина в присутствии карбоната калия c последующей обработкой фумаровой кислотой, - выбранное в качестве прототипа изобретение «Производное алантолактона и его соли» [CN 106496169 A, 15.03.2017], наиболее близкие по структуре и назначению к заявленному техническому решению.

Преимуществом прототипа по сравнению с приведенными выше аналогами является повышенная цитотоксичность по отношению к опухолевым клеточным линиям человека, что достигается за счет присутствия азотсодержащей функциональной группы.

Недостатком прототипа является то, что в структуре указанных соединений отсутствует векторный фрагмент, обеспечивающий адресную доставку соединений в опухолевые клетки, что может быть причиной невысоких значений цитотоксичности соединений А11-А14. Техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в расширении ассортимента противоопухолевых средств на основе сесквитерпеновых лактонов и способов их получения, обладающих большей цитотксичностью в отношении раковых клеток по сравнению с известными аналогами.

Техническим результатом являются новые противоопухолевые средства, расширяющие арсенал средств указанного назначения и способов их получения, обеспечивающие адресную доставку соединений в опухолевые клетки, способные эффективно приводить к апоптозу по внутреннему митохондриальному пути, тем самым подавляя рост раковых клеток.

Указанная техническая проблема решается, и технический результат достигается новыми соединениями - заявляемыми фосфониевыми солями на основе алантолактона формулы I:

Техническая проблема также решается, и технический результат достигается применением заявляемых фосфониевых солей на основе алантолактона формулы I, в качестве соединений, обладающих противоопухолевой активностью.

Кроме того, техническая проблема решается, и технический результат достигается заявляемым способом получения фосфониевых солей на основе алантолактона формулы I, включающим взаимодействие в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном соотношении алантолактона формулы II

с P-H-фосфониевыми солями формулы III a-f,

полученными взаимодействием в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном количестве при комнатной температуре трифторметансульфоновой кислоты и триарилфосфинов формулы IVa, IVe, IVf

или при кипячении трифторуксусной кислоты и триарилфосфинов формулы IVb, IVc, IVd

с последующим выделением целевого продукта переосаждением петролейным эфиром и высушиванием в вакууме.

Изобретение реализуется следующим образом.

При получении и выделении заявляемых соединений используют коммерчески доступные реактивы и растворители: дихлорметан (ООО «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >99%), диэтиловый эфир (ООО «Кузбассоргхим», г. Кемерово, Россия, чистота >98%), бензол (АО «ЭКОС-1», Москва, Россия, чистота >99%), ацетон (Компания «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >98%), хлороформ (База №1 ООО «Химреактив», Москва, Россия, чистота >99,5%), этилацетат (Компания «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >99%), петролейный эфир (Компания «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >95%), силикагель КСКГ фракция менее 0.063 мм (ООО «ХромЛаб», г. Люберцы, Московская область, Россия), силикагель КСКГ фракция 0.063-0.125 мм (ООО «ХромЛаб», г. Люберцы, Московская область, Россия), пластины Sorbfil (ООО «ИМИД», Москва, Россия), магний (ООО «ОКТАНТ», Санкт-Петербург, Россия), хлорид фосфора (III) (ООО «РусХим», Москва, Россия), хлорид кальция (ООО «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >98%), хлорид аммония (ООО «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >99%), сульфат натрия (ООО «ТатХимПродукт», Казань, Россия, чистота >99%), бромбензол (ООО «РусХим», Москва, Россия, чистота <99%), 4-броманизол (Acros Organics CAS: 104-92-7), 3-иодтолуол (Alfa Aesar, CAS: 625-95-6), 4-бромтолуол (Alfa Aesar, CAS: 106-38-7), о-иодтолуол (Alfa Aesar CAS: 615-37-2), дистиллированная вода (полученная методом дистилляции на дистилляторе ДЭ-10, модель 789, соответствующая ФС 42-2619-97 «Вода очищенная» и ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная»).

Трифторметансульфокислота (Alfa Aesar CAS: 1493-13-6), Трифторуксусная кислота (Pallav Chemicals CAS: 76-05-1), Трифенилфосфин (Acros CAS: 603-35-0),

а также оборудование: ЯМР-спектрометр Bruker Avance-400, ИК-спектрометр Bruker Vector 22, Масс-спектрометр Bruker MALDI-TOF Ultraflex III (Bruker Daltonik, Бремен, Германия), автоматическом элементном анализаторе EuroVector EA3000 CHNS (Euro-Vector, Италия), УФ-лампа (Vilber Lourmat, Франция).

Алантолактон выделяют из корней девясила (Inula helenium L.) согласно [A.V. Semakov, S.G. Klochkov. Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, 2020, N 3, 145. (in Russ.). DOI: 10.14258/jcprm.2020034681].

Исходные соединения для синтеза заявляемых фосфониевых солей на основе алантолактона формулы I синтезируют в соответствии со следующими методиками:

дифенилбифенил - согласно методике [M. Joshaghani, E. Faramarzi, E. Rafiee, M. Daryanavard, J. Xiao, C. Baillie. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2006, V. 259, 35. doi:10.1016/j.molcata.2006.05.062];

(3-хлорфенил)дифенилфосфин согласно методике [R. Yu, X. Chen, Z. Wang. Tetrahedron Letters, 2016, V. 57, 3404. doi:10.1016/j.tetlet.2016.06.088];

три(3-метилфенил)фосфин, три(4-метилфенил)фосфин, три(4-метоксифенил)-фосфин согласно методике [Z. Liu, J.-Q. Wu, S.-D. Yang. Organic Letters, 2017, V. 19, 5434. doi:10.1021/acs.orglett.7b02710].

P-H-фосфониевые соли на основе триарилфосфинов и трифторуксусной или трифторметансульфоновой кислот получают по методике [M.E. Shemakhina, A.V. Nemtarev, R.R. Fayzullin, N.R. Khasiyatullina, L.R. Grigor’eva, V.F. Mironov. Mendeleev Communications, 2020, V. 30, N. 6, 700. DOI 10.1016/j.mencom.2020.11.003].

Синтез заявляемых соединений осуществляют по следующей схеме:

В качестве галогенуглеводородного растворителя используют, в частности, дихлорметан и хлороформ.

Синтез проводят при комнатной температуре в случае получения трифталатов и при кипячении в случае получения триацетатов в инертной среде, например, аргона или азота.

Контроль за временем прохождения реакции осуществляют спектроскопией ЯМР ³¹Р и методом ТСХ.

Спектры ЯМР регистрируют при 25°С на ЯМР-спектрометре Bruker Avance-400 (400.0 МГц, ¹Н; 100.6 МГц, ¹³С; 162 МГц, ³¹Р) в CDCl₃. Химические сдвиги представлены в м.д. (шкала δ), значения константы связи (J) даны в Гц. ИК спектры регистрируют на спектрометре Bruker Vector 22 для образцов в таблетках KBr. Масс-спектры MALDI - на спектрометре Bruker MALDI-TOF Ultraflex III (Bruker Daltonik, Бремен, Германия). В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту (5 мг/мл в метаноле). Элементный анализ выполнен на автоматическом элементном анализаторе EuroVector EA3000 CHNS (Euro-Vector, Италия). Ход реакций и чистоту продуктов контролируют методом ТСХ на пластинах Sorbfil (ООО ИМИД, РФ). Пластины для ТСХ проявляют в УФ свете. Растворители очищают и сушат по стандартным протоколам.

Далее целевой продукт выделяют - переосаждают петролейным эфиром и высушивают в вакууме. Получают продукт в виде светло-желтого порошка (Ia, Ib, Ic, Ie, If) или масла оранжевого цвета (Id) с выходом 55-98% в случае трифталатов и 25-39% в случае трифторацетатов.

Характеристики новых соединений формулы I приведены в соответствующих примерах, иллюстрирующих изобретение.

Заявляемый способ не известен из уровня техники, более того, в литературе не описано примеров присоединения Р-Н-фосфониевых солей к циклическим эфирам. Известны реакции присоединения Р-Н-фосфониевых солей (на примере трифлатов, трифторацетатов и галогенидов трифенилфосфония) к карбонильным соединениям [M.E.Shemakhina, A.V.Nemtarev, R.R.Fayzullin, N.R.Khasiyatullina, L.R.Grigor’eva, V.F.Mironov. Reaction of R-pulegone with P-H-phosphonium salts. Mendeleev Commun. 2020. Vol. 30. N 6. P. 700-702; О.В.Цепаева, А.В.Немтарев, В.Ф.Миронов. Взаимодействие О-метил-2-метилиден-3-оксолуп-20(29)-ен-28-оата с трифлатом трифенилфосфония. Журн. Орг. Химии. 2017. Т. 53. № 4. С. 614-615. (O.V.Tsepaeva, A.V.Nemtarev, V.F.Mironov. Reaction of methyl 2-methylidene-3-oxolup-20(29)-en-28-oate with triphenylphosphonium trifluoromethanesulfonate. Russ. J. Org. Chem. 2017. Vol. 53. № 4. P. 621-623)].

Изобретение иллюстрируется примерами по получению заявленных соединений формулы I с приведением характеристик, полученных физико-химическими методами.

Пример 1. Получение трифлатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарилфосфония (соединений Ia, Ie, If). К раствору трифторметансульфоновой кислоты (150 мг, 1.01 ммоль) в дихлорметане (5 мл) небольшими порциями при охлаждении водой добавляли соответствующий триарилфосфин (1.01 ммоль) в атмосфере аргона, перемешивали 20 мин при комнатной температуре, затем добавляли раствор алантолактона (230 мг, 1.01 ммоль) в дихлорметане (5 мл) и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Пример 2. Получение трифлатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарилфосфония (соединений Ia, Ie, If). К раствору трифторметансульфоновой кислоты (150 мг, 1.01 ммоль) в дихлорметане (5 мл) небольшими порциями при охлаждении водой добавляли соответствующий триарилфосфин (1.01 ммоль) в атмосфере азота, перемешивали 20 мин при комнатной температуре, затем добавляли раствор алантолактона (230 мг, 1.01 ммоль) в дихлорметане (5 мл) и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Пример 3. Получение трифлатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарилфосфония (соединений Ia, Ie, If). К раствору трифторметансульфоновой кислоты (150 мг, 1.01 ммоль) в хлороформе (5 мл) небольшими порциями при охлаждении водой добавляли соответствующий триарилфосфин (1.01 ммоль) в атмосфере аргона, перемешивали 20 мин при комнатной температуре, затем добавляли раствор алантолактона (230 мг, 1.01 ммоль) в хлороформе (5 мл) и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Трифлат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)трифенилфосфония (Ia). Получен из трифенилфосфина с выходом 630 мг (98%) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.13) в виде порошка желтого цвета, т. пл. 94°С. ИК спектр (KBr) ν_max: 2930, 1764, 1440, 1262, 1224, 1157, 1112, 1030, 997 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (1, d₁), δ 1.07 (дд, 1H, J = 13.3 и 2.9, H¹), 1.14 (д, 3H, J = 7.5, H¹⁵), 1.18 (c, 3H, H¹⁴), 1.40 (дм, 1H, J = 13.7, H²), 1.48 (дм, 1H, J = 15.4, H⁹), 1.50-1.63 (м, 3H, H¹, H³), 1.68-1.83 (м, 1H, H²), 2.01 (дд, 1H, J = 15.0 и 3.1, H⁹), 2.43-2.53 (м, 1H, H⁴), 3.10-3.20 (м, 1H, H¹¹), 3.32-3.50 (м, 2H, H⁷, H¹³), 3.57-3.70 (м, 1H, H¹³), 4.83 (дд, 1H, J = 4.8 и 2.3, H⁸), 5.05 (д, 1H, J = 2.7, H⁶), 7.64-7.89 (м, 15H, H_Ar); (1, d₂), δ 1.01 (д, 3H, J = 7.5, H¹⁵), 1.11 (с, 3H, H¹⁴), 1.22-1.28 (м, 2H, H⁹), 1.42-1.60 (м, 5H, H¹, H², H³, накладывается на сигналы H¹ и H³ диастереомера d₁), 1.70-1.85 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 2.19-2.30 (м, 1H, H⁴), 2.51-2.58 (м, 1H, H⁷, накладывается на сигнал H⁴ диастереомера d₁), 2.85-2.91 (м, 1H, H¹¹), 3.33-3.51 (м, 2H, H⁷, H¹³, накладывается на сигналы H⁷ и H¹³ диастереомера d₁), 4.00-4.10 (м, 1H, H¹³), 4.57 (д, 1H, J = 3.0, H⁸), 5.28 (уш. с, 1H, H⁶), 7.46-7.64 (м, 15H, H_Ar). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_C м.д., J Гц): (1, d₁), δ_C 16.79, 20.29 (д, J = 56.4, С¹³), 23.44, 28.83, 32.68, 33.15, 38.36, 38.45, 41.36 (д, J = 3.6, С⁷), 42.10, 42.34, 78.52, 113.55, 118.11 (д, J = 87.3, С^ipso), 120.65 (CF₃, J = 320.6), 130.64 (C_Ar), 133.92 (C_Ar), 135.34 (C_Ar), 153.37, 176.55 (д, J = 7.8, С¹²); (1, d₂), δ_С 16.79, 22.48, 23.31 (д, J = 53.4, С¹³), 28.82, 32.82, 33.15, 38.06, 38.36, 41.88, 42.02, 42.92, 78.23, 113.55, 117.47 (д, J = 86.7, С^ipso), 128.98 (C_Ar), 132.20(C_Ar), 132.95 (C_Ar), 150.43, 176.88 (д, J = 3.6, С¹²). Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_Р 24.6 (1, d₁) и 23.6 м.д. (1, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 495.4 [M⁺]. Найдено: C, 63.1; H, 5.8; P, 4.7; S, 4.7 %. Вычислено для C₃₄H₃₆F₃O₅PS: C, 63.3; H, 5.6; P, 4.8; S, 5.0 %.

Трифлат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)(3-хлорфенил)дифенилфосфония (Ie). Получен из дифенил(3-хлорфенил)фосфина с выходом 370 мг (55%) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.2) в виде порошка светло-желтого цвета, т. пл. 110°С. ИК спектр (KBr) ν_max: 2925, 1763, 1439, 1261, 1224, 1158, 1134, 1030, 997 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (5, d₁), δ 1.17-1.26 (м, 1H, H¹, накладывается на сигналы H¹⁵ и H¹⁴), 1.20 (д, 3H, J = 7.6, H¹⁵), 1.24 (c, 3H, H¹⁴), 1.47 (дм, 1H, J = 14.0, H²), 1.50-1.58 (м, 1H, H⁹), 1.57-1.66 (м, 3H, H¹, H³), 1.79-1.90 (м, 1H, H²), 2.06 (дм, 1H, J = 13.6, H⁹), 2.57-2.67 (м, 1H, H⁴), 3.20-3.32 (м, 1H, H¹¹), 3.42-3.58 (м, 2H, H¹³, H⁷), 3.98-4.10 (м, 1H, H¹³), 4.88 (м, 1H, H⁸), 5.31 (с, 1H, H⁶), 7.39-7.92 (м, 14H, H_Ar); (5, d₂), δ 1.17-1.26 (м, 1H, H¹, накладывается на сигналы H¹, H¹⁴ и H¹⁵ диастереомера d₁), 1.06 (д, 3H, J = 6.9 Гц, H¹⁵), 1.16 (с, 3H, H¹⁴), 1.47 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 1.50-1.66 (м, 4H, H⁹, H¹, H³, накладывается на сигналы H⁹, H¹ и H³ диастереомера d₁), 1.79-1.90 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 2.06 (дм, 1H, H⁹, накладывается на сигнал H⁹ диастереомера d₁), 2.25-2.35 (м, 1H, H⁴), 3.20-3.32 (м, 1H, H¹¹, накладывается на сигнал H¹⁰ диастереомера d₁), 3.77-3.85 (м, 2H, H¹³, H⁷), 4.16-4.25 (м, 1H, H¹³), 4.71 (с, 1H, H⁸), 5.27-5.36 (м, 1H, H⁶, накладывается на сигнал H⁶ диастереомера d₁), 7.39-7.92 (м, 14H, H_Ar, накладывается на сигналы H_Ph диастереомера d₁). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_С м.д., J Гц): (5, d₁), δ_С 16.99, 21.21 (д, J = 55.6, С¹³), 23.68, 29.01, 32.87, 33.38, 38.59, 39.08 (д, J = 9.3, С¹¹), 41.81, 42.34, 42.62, 79.12, 114.25, 118.17 (д, J = 87.7, С^ipso), 118.42 (д, J = 87.5, С^ipso), 120.70 (CF₃, J = 320.3), 128.92 (С_Ar), 130.74 (С_Ar), 132.33 (С_Ar), 134.16 (С_Ar), 134.19 (С_Ar), 135.33 (С_Ar), 135.46 (С_Ar), 136.79 (С_Ar), 153.37, 176.91 (д, J = 3.6, С¹²); (5, d₂), δ_C 16.99, 21.09 (д, J = 59.7, С¹³), 23.68, 29.88, 33.00, 33.03, 38.27, 39.17, 42.06, 42.44, 43.20, 79.12, 114.25, 117.81 (д, J = 85.1, С^ipso), 118.65 (д, J = 87.7, С^ipso), 130.30 (С_Ar), 130.95 (С_Ar), 133.18 (С_Ar), 133.9-134.41 (м, С_Ar), 135.29 (С_Ar), 135.13 (С_Ar), 135.81 (С_Ar), 153.37, 176.91. Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_Р 25.3 (5, d₁) и 24.6 м.д. (5, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 529.3 [M⁺]. Найдено: C, 59.89; H, 5.41; Cl, 5.10; P, 4.31; S, 4.56 %. Вычислено для C₃₄H₃₅ClF₃O₅PS: C, 60.13; H, 5.19; Cl, 5.22; P, 4.56; S, 4.72 %.

Трифлат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)(4-фенилфенил)дифенилфосфония (If). Получен из дифенил(4-фенилфенил)фосфина с выходом 570 мг (78 %) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.22) в виде порошка светло-желтого цвета, т. пл. 114°С. ИК спектр (KBr) ν_max: 2928, 1764, 1439, 1261, 1224, 1156, 1114, 1031, 997 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (6, d₁), δ 1.15-1.36 (м, 1H, H¹, накладывается на сигнал H¹⁵), 1.20 (д, 3H, J = 7.4, H¹⁵), 1.24 (с, 3H, H¹⁴), 1.46 (дм, 1H, J = 13.4, H²), 1.51-1.65 (м, 4H, H⁹, H¹, H³), 1.76-1.92 (м, 1H, H²), 2.07 (дд, 1H, J = 15.0 и 3.5, H⁹), 2.53-2.64 (м, 1H, H⁴), 3.24-3.38 (м, 1H, H¹¹), 3.42-3.58 (м, 2H, H⁷, H¹³), 3.98 (тд, 1H, J = 14.8 и 4.5, H¹³), 4.88 (с, 1H, H⁸), 5.28 (д, 1H, J = 3.0, H⁶), 7.62-8.02 (м, 19H, H_Ar); (6, d₂), δ 1.05 (д, 3H, J = 7.4, H¹⁵), 1.17 (с, 3H, H¹⁴), 1.39-1.50 (м, 1H, H⁹), 1.42-1.60 (м, 5H, H¹, H², H³, накладывается на H¹, H³ диастереомера d₁), 1.68-1.85 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 2.07 (м, 1H, H⁹, накладывается на сигнал H⁹ диастереомера d₁), 2.52-2.64 (м, 1H, H⁴, накладывается на сигнал H⁴ диастереомера d₁), 3.08-3.14 (м, 1H, H¹¹), 3.66-3.85 (м, 3H, H⁷, H¹³), 4.67 (c, 1H, H⁸), 5.19 (c, 1H, H⁶), 7.40-7.60 (м, 19H, H_Ar). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_С м.д., J Гц): (6, d₁), δ_С 16.95, 20.82 (д, J = 56.1, С¹³), 23.58, 28.96, 32.83, 33.31, 38.59, 38.76 (д, J = 7.8, С¹¹), 41.81 (д, J = 4.3, С⁷), 42.26, 42.54, 78.78, 114.02, 116.49 (д, J = 89.3, С^ipso), 118.76 (д, J = 85.2, С^ipso), 120.78 (CF₃, J = 320.3), 127.62 (С_Ar), 129.02 (C_Ar), 129.38 (C_Ar), 130.62 (C_Ar), 133.89 (C_Ar), 134.44 (C_Ar), 135.29 (C_Ar), 138.61 (C_Ar), 148.06 (C_Ar), 150.56 (C_Ar), 153.28, 176.80 (д, J = 6.3, С¹²); (6, d₂), δ_C 17.06, 22.60, 23.70 (д, J = 53.2, С¹³), 28.91, 32.99, 33.23, 38.23, 38.69, 42.17, 42.43, 43.20 (д, J = 4.2, С⁷), 78.47, 114.02, 115.68 (С^ipso, J = 88.5), 118.76 (С^ipso, J = 85.2), 127.34 (С_Ar), 128.75 (С_Ar), 129.32 (С_Ar), 130.73 (С_Ar), 132.28 (С_Ar), 132.80 (С_Ar), 135.48 (С_Ar), 138.56 (С_Ar), 148.27 (С_Ar), 150.73 (С_Ar), 154.09, 176.91 (д, J = 8.7, С¹²). Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_P 23.7 (6, d₁) и 22.8 м.д. (6, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 571.4 [M⁺]. Найдено: C, 66.28; H, 5.98; P, 4.01; S, 4.05 %. Вычислено для C₃₉H₄₀F₃O₅PS: C, 66.66; H, 5.59; P, 4.30; S, 4.45 %.

Пример 4. Получение трифторацетатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарил фосфония (соединений Ib, Ic, Id). К раствору соответствующего триарилфосфина (1.42 ммоль) в дихлорметане (10 мл) по каплям добавили трифторуксусную кислоту (0.54 мл, 7.10 ммоль), перемешивали 20 мин, после чего добавили раствор алантолактона (330 мг, 1.42 ммоль) в дихлорметане (5 мл), полученную реакционную смесь нагревали при кипении 2 часа. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Пример 5. Получение трифторацетатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарил фосфония (соединений Ib, Ic, Id). К раствору соответствующего триарилфосфина (1.42 ммоль) в дихлорметане (10 мл) в атмосфере азота по каплям добавили трифторуксусную кислоту (0.54 мл, 7.10 ммоль), перемешивали 20 мин, после чего добавили раствор алантолактона (330 мг, 1.42 ммоль) в дихлорметане (5 мл), полученную реакционную смесь нагревали при кипении 2 часа. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Пример 6. Получение трифторацетатов (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)триарил фосфония (соединений Ib, Ic, Id). К раствору соответствующего триарилфосфина (1.42 ммоль) в хлороформе (10 мл) в атмосфере аргона по каплям добавили трифторуксусную кислоту (0.54 мл, 7.10 ммоль), перемешивали 20 мин, после чего добавили раствор алантолактона (330 мг, 1.42 ммоль) в хлороформе (5 мл), полученную реакционную смесь нагревали при кипении 2 часа. Фосфониевую соль переосаждали петролейным эфиром и высушивали в вакууме.

Трифторацетат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)три(4-метоксифенил)фосфония (Ib). Получен из трис(4-метоксифенил)фосфина с выходом 390 мг (39 %) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.14) в виде порошка светло-желтого цвета, т. пл. 64°С. ИК спектр (KBr) ν_max: 2924, 2853, 1767, 1594, 1463, 1377, 1268, 1183, 1113, 1023 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (2, d₁), δ 1.06-1.09 (м, 1H, H¹), 1.09 (д, 3H, J = 7.5, H¹⁵), 1.15 (с, 3H, H¹⁴), 1.37 (дм, 1H, J = 13.8, H²), 1.46 (д, 1H, J = 13.0, H⁹), 1.48-1.57 (м, 5H, H¹, H³), 1.69-1.82 (м, 1H, H²), 1.99 (дд, 1H, J = 15.0 и 3.3, H⁹), 2.37-2.45 (м, 1H, H⁴), 2.88 (с, 1H, H¹¹), 3.22-3.34 (м, 2H, H⁷, H¹³), 3.34-3.45 (м, 1H, H¹³), 3.88 (с, 9H, H¹⁶), 4.77 (с, 1H, H⁸), 4.89 (д, 1H, J = 3.2, H⁶), 7.15 (дд, 6H, J = 8.9 и 2.9, H_Ar), 7.60 (дд, 6H, J = 12.2 и 8.6 Гц, H_Ar); (2, d₂), δ 1.01 (д, 3H, J = 7.6, H¹⁵), 1.11 (c, 3H, H¹⁴), 1.33-1.42 (м, 1Н, H⁹, накладывается на сигнал H⁹ диастереомера d₁), 1.45-1.60 (м, 5H, H¹, H², H³ накладывается на сигналы H¹, H² и H³ диастереомера d₁), 2.17-2.30 (м, 1Н, H⁹), 2.53 (дт, 1H, J = 14.1, 6.8 Гц, H⁴), 2.74 (с, H¹¹), 3.22-3.45 (м, 3H, H⁷, H¹³, накладывается на сигналы H⁷ и H¹³ диастереомера d₁), 3.81 (с, 9H, H¹⁶), 4.59 (д, 1H, J = 3.3 Гц, H⁸), 5.11 (с, 1H, H⁶), 6.94 (дд, 6H, J = 8.8, 2.3 Гц, C_Ar), 7.66 (дд, 6H, J = 12.2 и 8.8 Гц, C_Ar). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_C м.д., J Гц): (2, d₁), δ_C 16.69, 20.84 (д, J = 58.5, С¹³), 23.15, 28.65, 32.58, 33.09, 38.02 (д, J = 4.2, С¹¹), 38.45, 40.96 (д, J = 1.8, С⁷), 41.92, 42.27, 55.84, 78.11, 108.21 (д, J = 95.4, С^ipso), 113.13 (С⁶), 116.00 (CF₃, J = 290.4), 116.36 (С_Ar), 135.30 (С_Ar), 153.53, 165.04 (C_Ar), 176.21 (д, J = 10.8, С¹²); (2, d₂), δ 16.78, 22.34, 24.61 (д, J = 56.4, С¹³), 28.65, 32.74, 32.85, 38.02, 38.45, 41.82, 42.05, 42.89 (д, J = 3.4, С⁷), 55.84, 77.78, 108.07 (д, J = 95.2, С^ipso), 113.13, 116.25 (С_Ar), 135.46 (С_Ar), 150.49, 164.96, 176.79 (д, J = 10.3, С¹²), 160.12 (СОО, J = 37.1). Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_Р 22.0 (2, d₁) и 21.3 м.д. (2, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 585.3 [M⁺]. Найдено: C, 65.02; H, 5.77; P, 4.09 %. Вычислено для C₃₆H₄₂O₅P: C, 65.32; H, 6.06; P, 4.43 %.

Трифторацетат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)три(4-метилфенил)фосфония (Ic). Получен из трис(4-метилфенил)фосфина с выходом 180 мг (28%) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.15), в виде порошка светло-желтого цвета, т. пл. 62°С. ИК спектр (KBr) ν_max: 2930, 1769, 1600, 1455, 1194, 1143, 1113, 1038, 990 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (3, d₁), δ 1.12-1.19 (м, 1H, H¹ накладывается на сигнал C¹⁵H), 1.15 (д, 3H, H¹⁵, J = 7.3), 1.22 (с, 3H, H¹⁴), 1.44 (дм, 1H, H², J = 14.0), 1.51 (дм, 1H, H⁹, J = 14.7), 1.54-1.64 (м, 4H, H¹, H³), 1.74-1.88 (м, 1H, H²), 2.06 (д, 1H, H⁹, J = 11.8), 2.47-2.60 (м, 1H, H⁴), 2.50 (с, 9H, H¹⁶), 3.01-3.10 (м, 1H, H¹¹), 3.30-3.43 (м, 2H, H¹³), 3.54 (тд, 1H, H⁷, J = 16.2 и 7.0), 4.80 (с, 1H, H⁸), 5.05 (с, 1H, H⁶), 7.50 (м, 6H, H^Ar), 7.61 (дд, 6H, H^Ar, J = 12.6 и 7.9); (3, d₂), δ 1.05 (д, 3H,H¹⁵, J = 7.6), 1.11 (с, 3H, H¹⁴), 1.15-1.19 (м, 1H, H⁹, накладывается на сигнал H¹⁵), 1.25-1.35 (м, 2H, H⁹), 1.48-1.65 (м, 5H, H¹, H², H³, накладывается на сигналы H¹ и H³ диастереомера d₁), 2.02-2.11 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 2.43 (с, 9H, H¹⁶), 2.45-2.59 (м, 1H, H⁴, накладывается на сигнал H⁴ диастереомера d₁), 3.92 (с, 1H, H¹¹), 3.48-3.62 (м, 1H, H¹³, накладывается на сигнал H¹³ диастереомера d₁), 3.94-4.05 (м, 1H, H¹³), 4.10-4.18 (м, 1H, H⁷), 4.64 (с, 1H, H⁸), 5.19 (с, 1H, H⁶), 7.50-7.54 (м, 6H, H^Ar, накладывается на сигналы H^Ar диастереомера d₁), 7.67 (дд, 6H, C^Ar, J = 13.0 и 7.9). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_С м.д., J Гц): (3, d₁), δ_C 16.91, 20.68 (д, J = 57.5, С¹³), 21.94, 23.39, 28.89, 32.79, 33.31, 38.56 (д, J = 6.1, С¹¹), 38.65, 41.48 (д, J = 3.3, С⁷), 42.22, 42.48, 78.51, 113.43, 114.93 (д, J = 90.0, C^ipso), 116.04 (CF₃, J = 289.7), 131.43 (C_Ar), 133.57 (C_Ar), 146.98 (C_Ar), 153.67, 176.47 (д, J = 8.2, С¹²); (3, d₂), δ_С 16.98, 20.99 (д, J = 53.5, С¹³), 21.79, 22.56, 28.89, 32.95, 33.03, 38.27, 38.56, 42.02, 42.27, 43.07 (д, J = 3.7, С⁷), 78.18, 113.43, 114.53 (д, J = 90.7, C^ipso), 129.59 (C_Ar), 132.34 (C_Ar), 146.89 (C_Ar), 150.65, 176.77 (д, J = 7.9, С¹²), 160.28 (СОО, J = 37.5). Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_Р 23.5 (3, d₁) и 22.6 м.д. (3, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 537.4 [M⁺]. Найдено: C, 70.01; H, 6.77; P, 4.21 %. Вычислено для C₃₈H₄₂F₃O₄P: C, 70.14; H, 6.51; P, 4.76 %.

Трифторацетат (эудесм-5-ен-12,8-олид-13-ил)три(3-метилфенил)фосфония (Id). Получен из трис(3-метилфенил)фосфина с выходом 230 мг (25 %) (соотношение диастереомеров d₁ : d₂ = 1.0 : 0.16), в виде масла оранжевого цвета. ИК спектр (KBr) ν_max: 2929, 2872, 1766, 1681, 1454, 1416, 1203, 1134, 1037, 995 см^-1. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц, δ м.д., J Гц): (4, d₁), δ 1.12 (дд, 1H, J = 13.7, 3.2, H¹), 1.17 (д, 3H, J = 7.5, H¹⁵), 1.23 (с, 3H, H¹⁴), 1.45 (дт, 1H, J = 13.5 и 3.3, H²), 1.52 (дм, 1H, J = 14.7, H⁹), 1.55-1.63 (м, 3H, H¹, H³), 1.77-1.88 (м, 1H, H²), 2.08 (дд, 1H, J = 15.0 и 3.0, H⁹), 2.44-2.53 (м, 1H, H⁴, накладывается сигнал на H¹⁶), 2.46 (с, 9H, H¹⁶), 2.97 (с, 1H, H¹¹), 3.31 (дд, 1H, J = 14.6 и 7.1, H⁷), 3.51 (дт, 1H, J = 12.4 и 5.8, H¹³), 4.79 (c, 1H, H⁸), 5.06 (д, 1H, J = 2.8, H⁶), 7.47-7.67 (м, 12H, H_Ar); (4, d₂), δ 1.06 (д, 3H, J = 7.5, H¹⁵), 1.10-1.20 (м, 1H, H¹), 1.17 (c, 3H, H¹⁴), 1.41-1.66 (м, 5H, H¹, H², H³, накладывается на сигналы H¹ и H³ диастереомера d₁), 1.77-1.88 (м, 1H, H², накладывается на сигнал H² диастереомера d₁), 2.07-2.12 (м, 1H, H⁹, накладывается на сигнал H⁹ диастереомера d₁), 2.40 (с, 9H, H¹⁶), 2.44-2.53 (м, 1H, H⁴, накладывается на сигналы H¹⁶ и H⁴ диастереомера d₁), 2.85 (с, 1H, H¹¹), 3.59-3.71 (м, 2H, H⁷, H¹³), 3.85-3.98 (м, 1H, H¹³), 4.60 (д, 1H, J = 2.6, H⁸), 5.18 (с, 1H, H⁶), 7.36-7.53 (м, 12H, H_Ar). Спектр ЯМР ¹³C-{¹H} (CDCl₃, 100.6 МГц, δ_С м.д., J Гц): (4, d₁), δ_С 16.54, 19.61 (д, J = 57.8, С¹³), 21.14, 22.93, 28.50, 32.45, 32.97, 37.87 (д, J = 4.0, С¹¹), 38.44, 41.03, 41.80, 42.07, 78.12, 112.72, 115.42 (CF₃, J = 288.4), 117.47 (д, J = 86.5, С^ipso), 130.44 (C_Ar), 130.42 (C_Ar), 133.19 (C_Ar), 136.37 (C_Ar), 141.12 (C_Ar), 153.77, 175.97 (д, J = 11.1, С¹²), 159.61 (СОО, J = 38.8); (4, d₂), δ_С 16.55, 21.14, 22.16, 23.68 (д, J = 54.2, С¹³), 28.50, 32.58, 32.78, 37.88, 38.00, 41.62, 41.80, 42.68, 77.71, 112.72, 117.10, 128.58 (C_Ar), 129.18 (C_Ar), 132.29 (C_Ar), 133.58 (C_Ar), 138.76 (C_Ar), 150.63, 176.74 (д, J = 11.2, С¹²). Спектр ЯМР ³¹P-{¹H} (CDCl₃, 162.0 MГц): δ_Р 23.3 (4, d₁) и 22.5 м.д. (4, d₂). Спектр МАЛДИ: m/z 537.5 [M⁺]. Найдено: C, 69.97; H, 6.84; P, 4.17 %. Вычислено для C₃₈H₄₂F₃O₄P: C, 70.14; H, 6.51; P, 4.76 %.

Заявленные соединения исследованы на цитотоксичность в отношении нормальных клеток печени человека (Chang liver) и в отношении раковых клеточных линий. Предлагаемые соединения проявляют активность в отношении раковых линий аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu-80 и карциномы предстательной железы DU-145.

Цитотоксичность соединений формулы I оценивали с помощью МТТ-теста (с использованием индикатора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия) по методике, описанной в [O.V.Tsepaeva, A.V.Nemtarev, T.N.Pashirova, M.V.Khokhlachev, A.P.Lyubina, S.K.Amerkhanova, A.D.Voloshina, V.F.Mironov. Novel triphenylphosphonium amphiphilic conju-gates of glycerolipid type: synthesis, cytotoxic and antibacterial activity, and targeted cancer cell delivery. RSC Med. Chem., 2023, Vol. 14, P. 454; V.F.Mironov, A.V.Nemtarev, O.V.Tsepaeva, M.N.Dimukhametov, I.A.Litvinov, A.D.Voloshina, T.N.Pashirova, E.A.Titov, A.P.Lyubina, S.K.Amerhanova, A.T.Gubaidullin, D.R.Islamov. Rational Design 2-hydroxypropylphosphonium Salts as Cancer Cell Mitochondria-targeted Vectors. Synthesis, Structure and Biological Properties. Molecules. 2021. Vol. 26. P. 6350].

Использовали линии опухолевых клеток: аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu-80 из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия), карциномы предстательной железы человека DU-145 из клеточного репозитория CLS Cell Lines Service (Эппельхайм, Германия); культуру клеток печени человека (Chang liver) из коллекции и НИИ вирусологии РАМН (Москва). Исследования проводили в диапазоне концентраций (1-100 мкМ).

Заявленное техническое решение иллюстрируется таблицами 1 и 2 и фигурой.

В Таблице 1 представлены значения цитотоксических концентраций фосфониевых производных алантолактона I по данным теста на жизнеспособность с использованием индикатора МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия) в отношении опухолевых клеток (аденокарцинома двенадцатиперстной кишки HuTu-80, карцинома предстательной железы DU-145). Данные представлены в виде полумаксимальных ингибирующих концентраций (IC₅₀, мкМ - которая вызывает гибель 50% клеток в тестируемой популяции). Расчет IC₅₀, концентрации тестируемого соединения, вызывающей подавление роста клеток на 50%, производился с помощью программы: MLA - «Quest Graph ™ IC₅₀ Calculator». AAT Bioquest, Inc, 23 December, 2021, https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator, дата обращения 18.10.2022. Цитотоксическое действие заявляемых соединений в отношении раковых и нормальных клеточных линий оценивают в сравнении с действием известных, применяемых в настоящее время, противоопухолевых препаратов Доксорубицин и 5-Фторурацил.

Значения таблицы 1 свидетельствуют, что заявленные соединения проявляют цитотоксичность в отношении вышеуказанных опухолевых клеток.

Так, значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) составили в отношении:

- аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80 для Ia - 2.2 мкМ, Ib - 5.9 мкМ, Iс - 5.5 мкМ, Id - 9.6 мкМ, Ie - 2.1 мкМ, If - 0.40 мкМ; для препаратов сравнения Доксорубицина (DOX) и 5-Фторурацила - 65.2 мкМ и 0.2 мкМ соответственно;

- карциномы предстательной железы DU-145 для Ia - 8.2 мкМ, Ib - 3.5 мкМ, Iс - 1.6 мкМ, Id - 2.9 мкМ, Ie - 3.4 мкМ, If - 3.3 мкМ; для препарата сравнения Доксорубицин (DOX) 0.3 мкМ.

Представленные в табл. 1 результаты показывают, что соединения формулы I обладают высокой цитотоксичностью в отношении раковых линий клеток HuTu-80, DU-145 со значениями IC₅₀ 0.4÷9.6 мкМ. При этом соединения формулы I обладают более низкими значениями IC₅₀ (1.6÷8.1 мкМ) в отношении клеток DU-145 по сравнению с соединениями А9-A12 (10.1-24.9 мкМ). Таким образом, соединения формулы I по цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток превосходят аналоги и прототип.

Среди заявляемых соединений выявлены соединения-лидеры, продемонстрировавшие в отношении опухолевых клеток наибольшую активность Ic - в отношении карциномы предстательной железы DU-145, If - аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80.

Данные показывают, что все заявляемые соединения проявляют активность только в значительных концентрациях в отношении культуры клеток печени человека (Chang liver).

Также в таблице 1 представлены данные по селективности (SI) заявляемых средств и препаратов сравнения. Селективность соединений в отношении раковых клеток является важным критерием оценки цитотоксического действия. Для ее оценки рассчитывают индекс селективности (SI) как отношение между значением IC₅₀ для нормальных клеток и значением IC₅₀ для раковых клеток. Соединения с SI≥3 можно считать селективными [M.Ayoup, Y. Wahby, H. Abdel-Hamid, E. Ramadan, M. Teleb, M. Abu-Serie, A. Noby, Design, synthesis and biological evaluation of novel a-acyloxy carboxamides via Passerini reaction as caspase 3/7 activators, Eur. J. Med. Chem. 168 (2019) 340-356. DOI: 10.1016/j.ejmech.2019.02.051].

Значения селективности (SI) в отношении аденокарциномы двенадцатиперстной кишки (HuTu-80) составили для Ia - 5.1, Ie - 4.3, If - 17.5, что значительно выше, чем для препарата сравнения Доксорубицин (DOX) - 2.5; в отношении карциномы предстательной железы DU-145 для Ia - 1.4, Ib - 1.5, Iс - 2.0, Id - 2.7, Ie - 2.6, If - 2.1 - на уровне или выше для препарата сравнения Доксорубицин (DOX) - 1.7.

В Таблице 2 на примере соединений-лидеров Ic и If представлено влияние заявляемых соединений на трансмембранный потенциал (деполяризацию) митохондрий раковых клеток - указаны доли клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80, обработанных фосфониевыми солями алантолактона Ic и If в концентрациях IC₅₀ и IC₅₀/2 с нормальным митохондриальным трансмембранным потенциалом по данным проточной цитофлуориметрии.

Анализ производили методом проточной цитофлуориметрии, позволяющим регистрировать флуоресценцию отдельных клеток в суспензии, на приборе Guava easy Cyte, MERCK, США с использованием флуоресцентного красителя JC-10 из набора Mitochondria Membrane Potential Kit по методике, описанной в [O.V.Tsepaeva, A.V.Nemtarev, T.N.Pashirova, M.V.Khokhlachev, A.P.Lyubina, S.K.Amerkhanova, A.D.Voloshina, V.F.Mironov. Novel triphenylphosphonium amphiphilic conju-gates of glycerolipid type: synthesis, cytotoxic and antibacterial activity, and targeted cancer cell delivery. RSC Med. Chem., 2023, Vol. 14, P. 454; V.F.Mironov, A.V.Nemtarev, O.V.Tsepaeva, M.N.Dimukhametov, I.A.Litvinov, A.D.Voloshina, T.N.Pashirova, E.A.Titov, A.P.Lyubina, S.K.Amerhanova, A.T.Gubaidullin, D.R.Islamov. Rational Design 2-hydroxypropylphosphonium Salts as Cancer Cell Mitochondria-targeted Vectors. Synthesis, Structure and Biological Properties. Molecules. 2021. Vol. 26. P. 6350].

Доля клеток HuTu-80 с нормальным митохондриальным трансмембранным потенциалом после обработки фосфониевыми солями алантолактона Ic и If в концентрациях IC₅₀/2 и IC₅₀ составила для соединения Ic 46.6 и 7.6 % соответственно; для If - 49.7 и 19.5 % соответственно по сравнению с контролем (необработанные клетки), где доля клеток с нормальным митохондриальным трансмембранным потенциалом почти стопроцентная - 96.5 %.

Результаты, представленные в табл. 2, показывают значительное снижение доли клеток HuTu-80 с нормальным митохондриальным потенциалом под действием соединений Ic и If после 48-часовой обработки ими, которое заметно усиливается в концентрации IC₅₀, что свидетельствует о значительном снижении трансмембранного потенциала (деполяризации) митохондрий.

Полученные результаты позволяют предположить, что механизм цитотоксического действия Ic и If обусловлен индукцией апоптоза по внутреннему митохондриальному пути. Данное утверждение подтверждается результатами исследования апоптозиндуцирующего действия соединений Ic и If, проведенным методом проточной цитометрии с использованием протокола окрашивания аннексином V-Alexa Fluor 647.

На фигуре представлены диаграммы индукции апоптоза на примере клеток линии HuTu-80 - показано распределение живых, мертвых, а также клеток в раннем и позднем апоптозе (L - живые клетки; D - мертвые клетки; Ea - ранние апоптотические клетки; La - поздние апоптотические клетки) после 48-часовой инкубации с соединениями Ic и If в концентрациях IC₅₀/2 (средняя гистограмма - для Ic 2.8 мкМ, для If 0.2 мкМ), и IC₅₀ (правая гистограмма - для Ic 5.5мкМ, для If 0.4 мкМ) в сравнении с контролем - опухолевые клетки без обработки (левая гистограмма). Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 3), L - живые клетки; D - мертвые клетки; Ea - клетки в раннем апоптозе; La - клетки в позднем апоптозе [Voloshina A.D., Sapunova A.S., Kulik N.V., Belenok M.G., Strobykina I.Yu., Lyubina A.P., et al. Antimicrobial and cytotoxic effects of ammonium derivatives of diterpenoids steviol and isosteviol // Bioorg. Med. Chem. 2021. 32. 115974. DOI: 10.1016/j.bmc.2020.115974].

Представленные на фигуре результаты демонстрируют дозозависимый апоптоз с преобладанием апоптотических эффектов на поздней стадии.

Таким образом, предложены соединения, расширяющие арсенал противоопухолевых средств, - новые фосфониевые соли на основе алантолактона, характеризующиеся повышенным цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток, а также способ их получения. Механизм действия предлагаемых соединений может быть связан с индукцией апоптоза, протекающего по внутреннему митохондриальному пути, что делает их перспективными в качестве противоопухолевых агентов нового поколения. Адресная доставка соединений в опухолевые клетки подтверждается изменением митохондриального мембранного потенциала и индукцией апоптоза.

Заявленные технические решения соответствуют условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью признаков и полученными техническими результатами.

Заявленные технические решения соответствуют условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не являются очевидными для специалистов в данной области науки и техники, а в существующем уровне техники не были известны триарилфосфониевые производные алантолактона заявленного состава, обладающие противоопухолевой активностью.

Заявленные технические решения соответствуют условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как заявленные технические решения могут быть реализованы в различных химических, медицинских и фармацевтических предприятиях с применением известных соединений, материалов и технологического оборудования.

Изобретение относится к способу получения фосфониевых солей на основе алантолактона формулы I, включающий взаимодействие в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном соотношении алантолактона формулы II с P–H-фосфониевыми солями формулы III a-f, полученными взаимодействием в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном количестве при комнатной температуре трифторметансульфоновой кислоты и триарилфосфинов формулы IVa, IVe, IVf или при кипячении трифторуксусной кислоты и триарилфосфинов формулы IVb, IVc, IVd, с последующим выделением целевого продукта переосаждением петролейным эфиром и высушиванием в вакууме. В качестве галогенуглеводородного растворителя используют дихлорметан или хлороформ. В качестве инертной среды используют азот или аргон. Технический результат - способ получения фосфониевых солей на основе алантолактона, обеспечивающих адресную доставку соединений в опухолевые клетки, способных эффективно приводить к апоптозу по внутреннему митохондриальному пути, тем самым подавляя рост раковых клеток. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 пр.

,

,

1. Способ получения фосфониевых солей на основе алантолактона формулы I

включающий взаимодействие в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном соотношении алантолактона формулы II

с P–H-фосфониевыми солями формулы III a-f,

полученными взаимодействием в галогенуглеводородном растворителе в инертной среде в эквимольном количестве при комнатной температуре трифторметансульфоновой кислоты и триарилфосфинов формулы IVa, IVe, IVf

или при кипячении трифторуксусной кислоты и триарилфосфинов формулы IVb, IVc, IVd

с последующим выделением целевого продукта переосаждением петролейным эфиром и высушиванием в вакууме.

2. Способ получения фосфониевых солей на основе алантолактона по п.1, отличающийся тем, что в качестве галогенуглеводородного растворителя используют дихлорметан или хлороформ.

3. Способ получения фосфониевых солей на основе алантолактона по п.1, отличающийся тем, что в качестве инертной среды используют азот или аргон.