Фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты, обладающие противоопухолевой активностью Российский патент 2023 года по МПК C07F9/54 A61K31/66 A61P35/00 

Изобретение относится к области органической химии, в частности к новым фосфониевым солям на основе гликозидов лупанового тритерпеноида – бетулиновой кислоты, содержащих фрагменты D-глюкопиранозы и L-рамнопиранозы формулы 1 – 2, которые могут найти применение в фармакологии и медицине в качестве противоопухолевых средств:

Далее заявителем представлены термины и определения, использованные в заявленном техническом решении:

Гликозиды – органические соединения, состоящие из углеводного и неуглеводного компонентов.

Лупановый тритерпеноид (тритерпеноид) – соединение класса терпенов, образующихся в результате конденсации шести изопреновых единиц.

Вторичные метаболиты – органические вещества, синтезируемые организмом, но не участвующие в росте, развитии или репродукции.

Тритерпеноиды образуют важную группу вторичных метаболитов растений, которые обладают рядом ценных биологических и фармакологических свойств, представляющих значительный интерес в лечении различных заболеваний [S. Alakurtti, T. Mäkelä, S. Koskimies, J. Yli-Kauhaluoma. Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin. Eur J Pharm Sci. 2006. Vol.29(1). P.5-8; S. M. Kamble,   S. N. Goyal, C. R. Patil. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 2014. Vol.63. P.33370-33382]. Тритерпеноиды проявляют цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека и животных, что было продемонстрировано на примере таких клеточных линий как A-549 (аденокарцинома легкого), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), LNCaP и PC-3 (аденокарцинома предстательной железы) и др. [M. H. Ghante, P. G. Jamkhande. Role of Pentacyclic Triterpenoids in Chemoprevention and Anticancer Treatment: An Overview on Targets and Underling Mechanisms. J Pharmacopuncture. Vol.22(2). P.60-63; W.Zhang, X.Men, P.Lei. Review on anti-tumor effect of triterpene acid compounds. J.Can Res Ther. 2014. Vol.10. Suppl S1:14-9]. Тритерпеноиды и, в частности, бетулиновая (3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-овая) кислота вызывают программируемую клеточную гибель (апоптоз) опухолевых клеток, индукция которой является одним из основных подходов к лечению опухолевых заболеваний [F. B. Mullauer, J. H. Kessler, J. P. Medema. Betulinic acid induces cytochrome c release and apoptosis in a Bax/Bak-independent, permeability transition pore dependent fashion. Apoptosis. 2009. Vol.14. P.191-202]. Наряду с противоопухолевым действием бетулиновая кислота ингибирует воспалительные процессы, вовлеченные в развитие опухолей, например, посредством влияния на активность фактора транскрипции NF-κB, нарушение регуляции которого вызывает воспаление [R. Checker , S. K. Sandur, D. Sharma, R. S. Patwardhan, S. Jayakumar, V. Kohli, G. Sethi, B. B. Aggarwal, K. B. Sainis. Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid, a triterpenoid antioxidant, is mediated through suppression of NF-kappaB, AP-1 and NF-AT. PloS One. 2012. Vol.7(2). P. e31318]. Таким образом, проанализированные литературные данные свидетельствуют, что тритерпеноиды и, в частности, бетулиновая кислота, обладают фармакологическими свойствами, такими как противоопухолевая и противовоспалительная, что делает их перспективными веществами для терапии раковых заболеваний.

Известно, что фармакологические и медицинские применения бетулиновой кислоты ограничены из-за низкой растворимости в воде (0.02 мкг/мл) [S. Jäger, K. Winkler, U.Pfüller, A.Scheffler. Solubility studies of oleanolic acid and betulinic acid in aqueous solutions and plant extracts of Viscum album L. Planta Med. 2007. Vol.73(2). P.159-161], а также пониженного цитотоксического действия в отношении опухолевых клеток [W. Jiang, X. Li, S. Dong, H.Zhou. Betulinic acid in the treatment of tumor diseases: Application and research progress. 2021. Vol.142.P.3-5]. Анализ литературных источников свидетельствует о необходимости химической модификации бетулиновой кислоты и других тритерпеноидов для преодоления вышеуказанных недостатков [M. Ali-Seyed, I.Jantan, K.Vijayaraghavan, S. N. Abbas Bukhari. Betulinic Acid: Recent Advances in Chemical Modifications, Effective Delivery, and Molecular Mechanisms of a Promising Anticancer Therapy. Chem Biol Drug Des. 2016. Vol.87. P.524-527]. Таким образом, из представленного выше следует, что для успешного применения тритерпеноидов, и в частности, бетулиновой кислоты, в медицине в терапии опухолевых заболеваний необходимо повысить их растворимость в физиологических средах и повысить эффективность избирательного проникновения через мембрану опухолевых клеток, что может быть достигнуто химической модификацией их структуры.

Известен ряд химически модифицированных тритерпеноидов, которые могут быть рассмотрены в качестве аналогов предлагаемого изобретения с общими признаками.

Известно изобретение по патенту WO2009067891A1 «Водорастворимые тритерпен-фенольные соединения, имеющие противоопухолевую активность, и способ их получения», сущностью являются водорастворимые фенольные тритерпеновые соединения формулы А1, полученные на основе хинонметидных производных тритерпеноидов и содержащие сульфогруппу в положении С-6, обладающие противоопухолевой активностью:

где R² = H, C₁-C₁₂ алкил или C₁-C₁₂ ацил; M = Na, K, NH₄ или Ca; R¹ = H или C₁-C₁₂ алкил; R³ и R⁴ представляют собой H или OH, или R³ представляет собой H, а R⁴ представляет собой (O=), или атомы углерода в положениях 7 и 8, где расположены R⁴ и R³, соответственно, образуют двойную связь.

Известно изобретение по патенту CN102532246B «Производное олеаноловой кислоты, а также способы его получения и применения», сущностью является амидное производное олеаноловой кислоты формулы А2, полученное путем ковалентного присоединения к олеаноловой кислоте короткоцепочечного амина, обладающее противоопухолевой активностью:

В совокупности молекулярная масса короткоцепочечного амина составляет 20-200.

Известно изобретение по патенту CN101928322B «Урсоловая кислота, модифицированная моноэфирами полиолов с противораковой активностью», сущностью являются производные урсоловой кислоты формулы А3, где R¹ представляет собой гидроксил, ацетокси, сукцинилокси или полиол, монозамещенный сукцинилокси, R² представляет собой гидроксил или полиол. Получены модификацией урсоловой кислоты галогенпроизводными полиоловых моноэфиров, обладают цитотоксической активностью в отношении клеток рака печени человека HepG2, клеток нейробластомы человека SH-SY5Y, рака толстой кишки человека HT-29, рака желудка человека BGC-823 и AGS:

Общим недостатком изобретений-аналогов WO2009067891A1, CN102532246B, CN101928322B является пониженное цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, что ограничивает практическое применение. Пониженная цитотоксичность связана с тем, что структура применяемых в известных изобретениях модификаторов, хотя и повышает растворимость тритерпеноидов в водных средах, но не обеспечивает их нацеленного воздействия на митохондрии, нарушение работы которых способствует запуску апоптоза в опухолевых клетках. Таким образом, анализ недостатков технического результата в целом, изобретений-аналогов WO2009067891A1, CN102532246B, CN101928322B свидетельствует о необходимости введения в структуру модифицированных тритерпеноидов наряду с фрагментами, обеспечивающими растворимость в водных средах, также функциональные группы, обеспечивающие целевое проникновение в опухолевые клетки.

Одним из наиболее действенных модификаторов противоопухолевых соединений является катион трифенилфосфония (ТФФ), обладающий способностью не только повышать растворимость липофильных соединений, но транспортировать их пропорционально величине мембранных потенциалов внутрь клетки и далее в митохондрии. ТФФ помогает избирательно нацеливать соединения на опухолевые клетки, поскольку последние часто имеют повышенные мембранные потенциалы в сравнении с нормальными клетками [D.C. Rideout , T. Calogeropoulou, J.S. Jaworski, R.Dagnino Jr, M.R. McCarthy. Phosphonium salts exhibiting selective anti-carcinoma activity in vitro. Anticancer Drug Des. 1989. Vol.4(4). P.265-270].

Из исследованного заявителем уровня техники выявлены ТФФ производные тритерпеноидов, полученные на основе галогеналкиловых эфиров бетулиновой кислоты – изобретение по патенту RU 2665922 «Фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты, обладающие цитотоксической активностью в отношении аденокарциномы предстательной железы», наиболее близкие по структуре и назначению заявленному техническому изобретению, выбранные в качестве прототипа. Сущностью являются фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты формулы А4-А9, обладающие цитотоксичностью в отношении аденокарциномы простаты:

Преимуществом прототипа по сравнению с приведенными выше аналогами является направленное воздействие на митохондрии и повышенная цитотоксическая активность в отношении опухолевых клеток вызывающих аденокарциному простаты, указанная цель достигается за счет присутствия ТФФ группы в производных бетулиновой кислоты.

Недостатком прототипа является то, что применяемый в его структуре искусственный модификатор (ТФФ) обеспечивает только физико-химический принцип накопления соединений в опухолевых клетках, в частности – аденокарциномы простаты (посредством электродвижущей силы мембранных потенциалов) и не обеспечивает биологического распознавания опухолевой клетки, которое позволило бы повысить эффективность клеточной доставки и цитотоксического действия соединений в отношении клеток с опухолевым фенотипом.

Таким образом, основными недостатками ТФФ производных бетулиновой кислоты по прототипу RU2665922 являются пониженные клеточное проникновение и цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток (вследствие отсутствия биологически распознающего компонента).

Техническим результатом заявленного технического решения является создание новых фосфониевых солей на основе гликозидов бетулиновой кислоты, преодолевающих вышеуказанные недостатки прототипа, повышающих клеточное проникновение и цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток (вследствие наличия биологически распознающего компонента – фрагментов D-глюкопиранозы и L-рамнопиранозы).

Сущностью заявленного технического решения являются фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты формулы 1-2:

.

Фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты по п.1, обладающие противоопухолевой активностью.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 – Фиг. 3.

На Фиг.1 приведена Таблица 1, в которой представлены значения цитотоксических концентраций гликозидных производных, содержащих фрагменты D-глюкопиранозы (1) и L-рамнопиранозы (2), по данным теста на жизнеспособность с использованием индикатора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид)) в отношении опухолевых клеток (аденокарцинома предстательной железы PC-3, аденокарцинома кишечника Caco-2, аденокарцинома молочной железы MCF-7). Данные представлены в виде полумаксимальных ингибирующих концентраций (IC₅₀, мкМ).

Результаты, представленные в Таблице 1 показывают, что соединения 1 и 2 обладают высокой цитотоксичностью в отношении раковых линий клеток PC-3, CaCo-2 и MCF-7 со значениями IC₅₀ 0.35÷2.0 мкМ. При этом соединение 1 обладает более низкими значениями IC₅₀ в сравнении с соединением А-7. Таким образом, соединение 1 по цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток превосходит прототип.

На Фиг. 2 приведена Таблица 2, в которой показаны значения среднеканальной флуоресценции красителя TMRE (тетраметилродамин, этиловый эфир) для клеток РС-3, обработанных гликозидными производными, содержащими фрагменты D-глюкопиранозы (1) и L-рамнопиранозы (2), и прототипом (А-7), по данным проточной цитофлуориметрии.

Результаты, представленные в Таблице 2 показывают значительное снижение флуоресценции индикатора TMRE в опухолевых клетках РС-3 под действием соединений 1 и 2, что свидетельствует о значительном снижении трансмембранного потенциала (деполяризации) митохондрий. При этом эффект соединений 1 и 2 существенно превосходит таковой для соединения А-7. Таким образом, соединения 1 и 2 по эффективности снижения мембранного потенциала митохондрий превосходят прототип.

На Фиг.3 приведена Таблица 3, в которой представлены значения обнаруженных концентраций гликозидных производных, содержащих фрагменты D-глюкопиранозы (1) и L-рамнопиранозы (2), и прототипа (А-7) в лизате клеток PC-3, предварительно обработанных соединениями, по данным хромато-масс-спектрометрического анализа.

Результаты, представленные в Таблице 3 демонстрируют, что соединения 1 и 2 характеризуются значительно более высокими клеточными концентрациями в сравнении с соединением А-7. Таким образом, соединения 1 и 2 по эффективности проникновения в опухолевые клетки превосходят прототип.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Известно, что модификация противоопухолевых соединений биологически распознающим природным компонентом лежит в основе улучшения их клеточной доставки. Для решения этой задачи могут быть использованы углеводные (гликозидные) группы, способные транспортироваться в опухолевые клетки специфическими мембранными транспортерами, такими как – глюкоза. При этом следует принять во внимание, что подобные транспортеры, как правило, более активны в опухолевых клетках, чем в нормальных клетках [K. Adekola, S.T. Rosen, M. Shanmugam. Glucose transporters in cancer metabolism. Curr Opin Oncol. 2012. Vol.24(6). P.652-654].

Технический результат достигается созданием заявленных фосфониевых солей на основе гликозидов бетулиновой кислоты формулы 1 – 2, получаемых по схеме 1, а именно, посредством взаимодействия С-28 бромгексилового эфира бетулиновой кислоты (3) с трихлорацетимидатными производными сахаров (D-глюкопиранозы (4) и L-рамнопиранозы (5) в среде CH₂Cl₂ в присутствии триметилсилилтрифлата с последующим взаимодействием с трифенилфосфином в среде ацетонитрила.

На заключительном этапе проводится удаление защитных бензоильных групп в гликозильном фрагменте действием поташа в метаноле.

Заявленные фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты характеризуются повышенным клеточным проникновением и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток (вследствие наличия биологически распознающего компонента).

Далее заявителем представлена детальная последовательность (схема 1) синтеза заявленного технического решения.

Схема 1

Исходный С-28 бромгексиловый эфир бетулиновой кислоты (3) синтезирован по известной методике: [J.-H. Liu, J. Tang, Z.-F. Zhu, L. Chen. Design, synthesis, and anti-tumor activity of novel betulinic acid derivatives. J Asian Nat Prod Res. 2014. Vol.16. P. 34-42].

Изобретение иллюстрируется примерами 1–5 по получению заявленных соединений 1 – 2, и обеспечивают доказательную базу, подтверждённую экспериментально противоопухолевой активности, внутриклеточной концентрации и изменению мембранного потенциала митохондрий.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения, начиная с синтеза соединений 1 и 2 из галогенгексилового эфира бетулиновой кислоты (Примеры 1 и 2), демонстрирующие легкость синтеза в 3 стадии и доступность используемых субстратов. Пример 3 демонстрирует превосходство соединения 1 прототипа по цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. Пример 4 демонстрирует превосходство соединений 1 и 2 прототипа по эффективности снижения мембранного потенциала митохондрий. Пример 5 демонстрирует превосходство соединений 1 и 2 прототипа по эффективности внутриклеточного накопления.

Пример 1. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(β-D-глюкопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оата бромида – соединения 1.

1. Получение 3β-O-(2,3,4,6-тетра-O-бензоил-β-D-глюкопиранозил-28-O-(6-бромгексил) бетулината (6).

Раствор эфира бетулиновой кислоты (3) (206 мг, 0.28 ммоль) и 2,3,4,6-тетра-О-бензоил-β-D-глюкопиранозилтрихлорацетимидата (4) (154 мг, 0.25 ммоль) в дихлорметане (15 мл) перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре с молекулярными ситами (4 Å, 300 мг) в атмосфере аргона, затем охлаждали до -40°С и добавляли раствор триметилсилилтрифлата (0.15 ммоль) в дихлорметане (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч и реакцию останавливали добавлением Et₃N (0.5 мл). Смесь концентрировали и остаток очищали колоночной хроматографией (петролейный эфир/EtOAc, 4:1) с получением соединения (6) (203 мг, 68%); т.пл. 100 °C, [α]²⁰_D +11.8 (с 1.0, CHCl₃), ИК (KBr) ν_max: 2943, 2868, 1730, 1602, 1452, 1376, 1315, 1266, 1177, 1155, 1107, 1094, 1069, 1027, 975, 910 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.62, 0.68, 0.76, 0.87, 0.94 (с, 15H, H^23-27), 1.73 (с, 3H, H³⁰), 3.0 (м, 1H, H¹⁹), 3.0 (дд, 1H, J = 10.6, 4.5 Гц, H-3), 3.43 (т, J = 6.8 Гц, 2H, CH₂Br), 4.0 (м, 2H, С(O)OCH₂), 4.16 (м, 1H, H^5'), 4.5 (дд, 1H, J = 12, 6.7 Гц, H^6'), 4.6 (дд, 1H, J = 12, 3.5 Гц, H^6'), 4.65 (с, 1H, H_А²⁹), 4.76 (с, 1H, H_В²⁹), 4.86 (д, 1H, J = 8 Гц, H^1'), 5.56 (т, 1H, J = 8 Гц, Н^2'), 5.59 (1H, J = 9.6 Гц, Н^4'), 5.91 (1H, J = 9.6 Гц, Н^3') 7.2-8.0 (м, 20H, H_Ar). Найдено: C, 70.0; H, 7.1; Br, 6.7 %, Вычислено для C₇₀H₈₅BrO₁₂: C, 70.2; H, 7.15; Br, 6.7 %.

2. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(2,3,4,6-тетра-O-бензоил-β-D-глюкопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оата бромида (8).

К раствору соединения (6) (191 мг, 0.16 ммоль) в 10 мл сухого ацетонитрила (10 мл) в атмосфере аргона добавляли трифенилфосфин (168 мг, 0.64 ммоль) и смесь перемешивали с обратным холодильником в течение 12–18 ч до завершения реакции (контроль по ТСХ). Ацетонитрил удаляли при пониженном давлении, осадок промывали горячим петролейным эфиром (3 × 5 мл) и растворяли в этилацетате. К реакционной смеси добавляли петролейный эфир (10 мл). Образовавшийся осадок промывали диэтиловым эфиром (3 мл) и сушили в вакууме, получая чистый (8). (198 мг, 85%); т.пл. 126-130 °C, [α]²⁰_D +11 (с 0.6, CHCl₃), ИК (KBr) ν_max: 2920, 2869, 1727, 1602, 1586, 1452, 1439, 1377, 1315, 1266, 1177, 1070, 1027, 975 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.6, 0.7, 0.7, 0.8, 0.9 (с, 15H, H^23-27), 1.70 (с, 3H, H³⁰), 2.9 (м, 1H, H¹⁹), 3.0 (дд, 1H, J = 11.6, 4.4 Гц, H³), 3.88 (м, 2H, CH₂P), 4.0 (м, 2H, С(O)OCH₂), 4.15 (м, 1H, H^5'), 4.5 (дд, 1H, J = 12, 6.7 Гц, H^6'), 4.6 (дд, 1H, J = 12, 3.5 Гц, H^6'), 4.62 (с, 1H, H_А²⁹), 4.72 (с, 1H, H_В²⁹), 4.8 (д, 1H, J = 8 Гц, H^1'), 5.56 (т, 1H, J = 8 Гц, Н^2'), 5.58 (1H, J = 9.6 Гц, Н^4'), 5.9 (1H, J = 9.6 Гц, Н^3'), 7.2-8.0 (м, 35H, H_Ar); ЯМР ¹³C (CDCl₃, 100 МГц): δ 14.6, 15.3, 16.0, 16.1, 18.3, 19.3, 20.9, 22.6, 22.6, 22.7, 22.75 (d, J = 49.5 Гц, CH₂-P), 25.5, 25.77, 27.4, 27.9, 28.3, 29.6, 29.9, 30.0, 30.6, 32.1, 34.3, 37.0, 37.1, 38.2, 38.7, 38.8, 40.7, 42.4, 47.0, 49.4, 50.5, 55.3, 56.5, 63.7, 70.3, 71.9, 72.1, 72.9, 90.6 (C³), 103.2 (C^1'), 109.4 (C²⁹), 118.5 (d, J = 85.8 Гц, C^ipso), 128.3-135.0 (C_Ar), 150.57, 165.0, 165.3, 165.8, 166.0, 176.2; ЯМР ³¹P (CDCl₃, 162 МГц): δ 25.0; MALDIMS m/z 1381.2 [M-Br]⁺; Найдено: 72.3; H, 6.9; Br, 5.4 % Вычислено для C₈₈H₁₀₀BrO₁₂P: C, 72.4; H, 6.9; Br, 5.5 %

3. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(β-D-глюкопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оата бромида (1).

Суспензию (8) (146 мг, 0.1 ммоль) и K₂CO₃ (25 мг) в МеОН (5 мл) перемешивали 1 ч, затем нейтрализовали смолой Amberlyst 15 (Н⁺-форма), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (CH₂Cl₂/MeOH (100:0–100:10) с получением свободного гликозида (1) в виде аморфного порошка (83 мг, 80 %); т.пл. 95 °C, ИК (KBr) ν_max: 3402, 2940, 2868, 1720, 1639, 1558, 1452, 1439, 1390, 1376, 1317, 1267, 1243, 1131, 1113, 1054, 1026, 976, 882, 724, 691 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.82, 0.83, 0.89, 1.0, 1.05 (с, 15H, H^23-27), 1.70 (с, 3H, H³⁰), 0.7-2.2 (м, 34H, сигналы протонов бетулинового остова и протоны (CH₂)₂ фрагмента линкера), 3.0 (м, 1H, H¹⁹), 3.18 (м, 1H, H³), 3.2-3.5 (м, 5Н, H^5',2',4', CH₂-P), 3.71 (м, 1H, H^3'), 3.85 (м, 1H, H^6'), 4.0-4.1 (м, 3H, H^6', С(O)OCH₂), 4.34 (д, 1H, J = 7.7 Гц, H^1'), 4.6 (с, 1H, H_А²⁹), 4.7 (с, 1H, H_В²⁹), 7.8-7.9 (м,15H, H_Ar); ЯМР ¹³C (CDCl₃, 100 МГц): 13.0, 13.6, 15.4, 15.5, 17.9, 18.1, 19.5, 20.7, 21.4 (d, J = 51.2 Гц, CH₂-P), 22.22, 22.26, 25.25, 25.44, 25.76, 27.04, 28.14, 29.37, 29.68, 29.84, 30.31, 31.81, 34.17, 36.64, 38.42, 38.56, 38.85, 40.58, 42.15, 49.15, 50.45, 55.66, 56.55, 61.39, 63.48 (С^6'), 70.28 (С^4'), 74.28 (С^2'), 76.2 (С^3'), 76.3 (С^5'), 89.3 (C³), 105.2 (С^1'), 108.9 (C²⁹), 118.5 (д, J = 86.3 Гц, C^ipso), 130.1 (C_Ar), 133.3 (C_Ar), 135.0 (C_Ar), 150.4, 176.5; ЯМР ³¹P (CDCl₃, 162 МГц): δ 23.6. MALDIMS m/z 963.6 [M-Br]⁺; Найдено: C, 69.4; H, 8.0; Br, 7.6 %, Вычислено для C₆₀H₈₄BrO₈P: C, 69.0; H, 8.1; Br, 7.6 %,

Пример 2. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(α-L-рамнопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оат бромид – соединения 2.

1. Получение 3β-O-(2,3,4-три-O-бензоил-α-L-рамнопиранозил) 28-O-(6-бромгексил)бетулината (7).

Раствор (3) (173 мг, 0.28 ммоль) и 2,3,4-три-О-бензоил-α-L-рамнопиранозилтрихлорацетимидата (5) (154 мг, 0.25 ммоль) в дихлорметане (15 мл) перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре над молекулярными ситами (4 Å, 300 мг) в атмосфере аргона, затем охлаждали до –40 °С и добавляли раствор триметилсилилтрифлата (0.15 ммоль) в дихлорметане (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч и реакцию останавливали добавлением Et₃N (0.5 мл). Смесь концентрировали и остаток очищали колоночной хроматографией (петролейный эфир/EtOAc, 4:1) с получением (7) (194 мг, 72 %); [α]²⁰_D +64.2 (с, 0.8, CHCl₃), ИК (KBr) ν_max: 2942, 2869, 1730, 1642, 1602, 1585, 1452, 1315, 1278, 1263, 1177, 1154, 1108, 1070, 1028, 975, 711 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.91, 0.96, 0.96, 1.0, 1.01 (с, 15H, H^23-27), 1.36 (д, 3Н, J = 6.3 Гц, H^6'), 1.7 (s, 3H, H³⁰), 3.0 (м, 1H, H¹⁹), 3.2 (м, 1H, H³), 3.42 (т, J = 6.7 Гц, 2H, CH₂Br), 4.1 (м, 2H, С(O)OCH₂), 4.3 (м, 1H, H^5'), 4.6 (с, 1H, H_А²⁹), 4.7 (с, 1H, H_В²⁹), 5.1 (д, 1H, J = 1.3 Гц, H^1'), 5.67 (дд, 1Н, J = 3.2, 1.8 Гц, H^2'), 5.7 (т, 1Н, J = 10 Гц, H^4'), 5.85 (дд, 1Н, J = 10.1, 3.2 Гц, H^3'), 7.2-8.1 (м, 15Н, H_Ar); Найдено: C, 70.0; H, 7.5; Br, 7.4 %, Вычислено для C₆₃H₈₁BrO₁₀: C, 70.2; H, 7.6; Br, 7.4 %

2. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(2,3,4,-три-O-бензоил-α-L-рамнопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оата бромида (9).

К раствору соединения (7) (172 мг, 0.16 ммоль) в 10 мл сухого ацетонитрила (10 мл) в атмосфере аргона добавляли трифенилфосфин (168 мг, 0.64 ммоль) и смесь перемешивали с обратным холодильником в течение 12–18 ч до завершения реакции (контроль по ТСХ). Ацетонитрил удаляли при пониженном давлении, осадок промывали горячим петролейным эфиром (3 х 5 мл) и растворяли в этилацетате. К реакционной смеси добавляли петролейный эфир (10 мл). Образовавшийся осадок промывали диэтиловым эфиром (3 мл) и сушили в вакууме, получая чистый (9) (178 мг, 83%); т.пл. 118 °C, [α]²⁰_D +2.3 (с 0.8, CHCl₃), IR (KBr) ν_max: 2925, 2868, 1728, 1641, 1602, 1586, 1452, 1439, 1377, 1315, 1262, 1216, 1177, 1110, 1070, 1028, 975, 883, 859, 802, 755, 712, 690 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.88, 0.90, 0.94, 0.97, 1.06 (с, 15H, H^23-27), 1.37 (д, 3Н, J = 6.3 Гц, H^6'), 1.7 (с, 3H, H³⁰), 0.7-2.3 (м, 34H, протоны бетулинового остова и протоны (CH₂)₂ фрагмента линкера), 3.0 (м, 1H, H¹⁹), 3.2 (м, 1H, H³), 3.94-3.99 (м, 2H, CH₂P), 4.0 (м, 2H, С(O)OCH₂), 4.3 (м, 1H, H^5'), 4.6 (с, 1H, H_А²⁹), 4.7 (с, 1H, H_В²⁹), 5.1 (д, 1H, J = 1.3 Гц, H^1'), 5.65-5.66 (м, 1Н, H^2'), 5.7 (т, 1Н, J = 10 Гц, H^4'), 5.84 (дд, 1Н, J = 10.0, 3.1 Гц, H^3'), 7.25-8.13 (м, 30Н, H_Ar); ЯМР ¹³C (CDCl₃, 100 МГц): 14.7, 16.0, 16.2, 16.4, 17.5, 18.3, 19.3, 20.9, 22.67, 22.70, 22.8 (d, J = 49.6 Гц, CH₂-P), 25.55, 25.66, 25.78, 28.3, 28.4, 29.6, 29.9, 30.0, 30.7, 30.9, 32.1, 34.3, 37.0, 37.05, 38.2, 38.7, 39.1, 40.7, 42.4, 47.05, 49.4, 50.5, 55.5, 56.5, 63.8, 66.8 (C^5'), 70.2 (C^3'), 71.3 (C^2'), 72.0 71.3 (C^4'), 90.0 (C³), 99.75 (C^1'), 109.5 (C²⁹), 118.4 (d, J = 85.6 Гц, C^ipso), 128.2-135.0 (C_Ar), 150.6, 165.6, 165.7, 165.8, 176.1; ЯМР ³¹P (CDCl₃, 162 МГц): 24.9; MALDI-MS m/z 1261.3 [M – Br]⁺; Найдено: C, 72.4; H, 7.1; Br, 5.9 %, Вычислено для C₈₁H₉₆BrO₁₀P, C, 72.6; H, 7.2; Br, 6.0 %.

3. Получение 6-трифенилфосфониогексил 3β-O-(α-L-рамнопиранозил)луп-20(29)-ен-28-оата бромида (2).

Суспензию соединения (9) (134 мг, 0.1 ммоль) и K₂CO₃ (25 мг) в MeOH (5 мл) перемешивали в течение 1 ч, затем нейтрализовали смолой Amberlyst 15 (H⁺-форма), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (CH₂Cl₂/MeOH (100:10–100:0) с получением (2) в виде аморфного порошка (66 мг, 65 %); т.пл. 110 °C, [α]²⁰_D –2 (с 0.4, CHCl₃), ИК (KBr) ν_max: 3395, 2934, 2870, 1719, 1639, 1439, 1385, 1318, 1262, 1113, 1051, 984, 904, 807, 774, 691 см^–1; ЯМР ¹H (CDCl₃, 400 МГц): δ 0.75, 0.81, 0.88, 0.92, 0.97 (с, 15H, H^23-27), 1.28 (д, 3Н, J = 6.1 Гц, H^6'), 1.70 (с, 3H, H³⁰), 0.7-2.36 (м, 34H, протоны бетулинового остова и протоны (CH₂)₂ фрагмента линкера), 2.9 (м, 1H, H¹⁹), 3.07 (дд, 1Н, J = 11.0, 4.7 Гц, H³), 3.46 (т, 1Н, J = 9.8 Гц, H^4'), 3.75-3.94 (м, 3Н, H^3',5',2'), 3.96 (м, 2Н, CH₂P), 4.0 (м, 2H, С(O)OCH₂), 4.6 (с, 1H, H_А²⁹), 4.7 (с, 1H, H_В²⁹), 4.8 (с, 1H, H^1'), 7.7-7.9 (м, 15Н, H_Ar); ЯМР ¹³C (CDCl₃, 100 MHz): 14.5, 15.8, 16.0, 17.0, 18.1, 19.0, 20.8, 22.41, 22.45, 22.57, 22.6 (д, J = 51.3 Гц, CH₂-P), 25.37, 25.41, 27.9, 28.3. 29.54, 29.58, 30.0, 30.16, 30.5, 32.0, 34.24, 36.8, 37.0, 38.3, 38.6, 38.95, 40.66, 42.34, 47.0, 50.3, 55.4, 56.55, 63.46, 68.13 (C^5'), 70.97 (C^3'), 71.46 (C^2'), 72.84 (C^4'), 89.13 (C³), 102.5 (C^1'),109.5 (C²⁹), 117.8 (д, J = 91.3 Гц, C^ipso), 130.6 ( C_Ar), 133.3 ( C_Ar), 135.5 ( C_Ar), 150.4, 176.5; ЯМР ³¹P (CDCl₃, 162 МГц): 23.5; MALDI-MS m/z 947.6 [M – Br]⁺; Найдено: C, 71.9; H, 8.2; Br, 7.7%, Вычислено для C₆₀H₈₄BrO₇P: C, 70.0; H, 8.2; Br, 7.7%.

Пример 3. Исследование цитотоксической активности соединений 1 – 2.

Цитотоксическую активность соединений 1 – 2 оценивали на микропланшетном анализаторе Infinite 200 PRO (TECAN) с помощью теста на жизнеспособность с использованием индикатора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий бромид)), реагирующего с жизнеспособными клетками с образованием окрашенного продукта [O.V. Tsepaeva, A.V. Nemtarev, T.I. Abdullin, L.R. Grigor’eva, T.I. Salikhova. S.A. Khozyainova, V.F. Mironov. Synthesis, anticancer, and antibacterial activity of betulinic and betulonic acid c-28-triphenylphosphonium conjugates with variable alkyl linker length. Anticancer agents in Med. Chem. 2020. Vol. 20(3). P. 286-300].

Использовали линии опухолевых клеток: аденокарцинома молочной железы человека MCF-7, аденокарцинома предстательной железы человека PC-3, колоректальная аденокарцинома человека CaCo-2. Клетки культивировали в питательной среде DMEM c добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови, 4.5 г/л глюкозы, 4 мМ L-глутамина, пенициллин+стрептомицин 100 ЕД/мл в стерильных условиях. Клетки культивировали в CO₂-инкубаторе при 37°С.

Исходные растворы соединений готовили в диметилсульфоксиде с последующим разбавлением до рабочих концентраций в изотоническом растворе. Клетки культивировали в присутствии тестируемых соединений в течение 72 ч и оценивали их жизнеспособность относительно контрольных необработанных клеток (жизнеспособность 100%). Определяли полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC₅₀), т.е. концентрации, ингибирующие жизнеспособность клеток на 50%, с помощью программы GraphPad Prizm (Фиг. 1).

Результаты демонстрируют, что соединение 1 обладает более низкими значениями IC₅₀, а соединение 2 – сопоставимыми значениями IC₅₀ в сравнении с соединением А-7 (Таблица 1 на Фиг. 1). Следовательно, из заявленных соединений, по меньшей мере, соединение 1 превосходит по своей цитотоксической активности прототип. Результаты Примера 3 следует рассматривать в совокупности с данными Примера 4 (Таблица 2 на Фиг. 2).

Пример 4. Изучение влияния соединений 1 – 2 на трансмембранный потенциал митохондрий.

Анализ производили методом проточной цитофлуориметрии, позволяющим регистрировать флуоресценцию отдельных клеток в суспензии, на приборе Guava easyCyte 8HT (Merck Millipore) с использованием тетраметилродамина, этилового эфира (TMRE) – флуоресцентного индикатора трансмембранного потенциала митохондрий.

Выращенные клетки РС-3 диссоциировали с помощью раствора трипсин-ЭДТА, промывали изотоническим раствором и суспендировали с плотностью 1×10⁶ клеток в 1 мл. Суспензию клеток смешивали с заявленными соединениями в конечной концентрации 30 мкМ и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Для анализа трансмембранного потенциала митохондрий обработанные таким образом клетки окрашивали TMRE в конечной концентрации 0.1 мкM в течение 20 мин при 37°C. В качестве сигнала регистрировали флуоресценцию TMRE в клетках (Фиг. 2), величина которой прямо пропорциональна трансмембранному потенциалу митохондрий.

Известно, что этот потенциал связан с митохондриальной активностью клеток и выработкой ими энергетических молекул. Значительное снижение трансмембранного потенциала (деполяризация) митохондрий нарушает жизнеспособность клеток, вызывает активацию апоптоза и служит важным показателем противоопухолевого действия ТФФ производных [O.V. Tsepaeva, A.V. Nemtarev, T.I. Abdullin, L.R. Grigor’eva, T.I. Salikhova, S.A. Khozyainova, V.F. Mironov. Synthesis, anticancer, and antibacterial activity of betulinic and betulonic acid c-28-triphenylphosphonium conjugates with variable alkyl linker length. Anticancer agents in Med. Chem. 2020. Vol. 20. P. 286; I. Antipin, D. Ponomaryov, L. Grigor'eva, T. Salikhova, R. Ali, T. Dang, O. Tsepaeva, A. Nemtarev, T. Abdullin, V. Mironov, Anti-tumor activity of triphenylphosphonium conjugates of betulinic acid and their effect on ROS level in mitochondria. Eur J Clin Inv. 2019. Vol. 49. P. 60].

Результаты демонстрируют, что соединения 1 и 2 вызывают значительное понижение флуоресценции индикатора TMRE в опухолевых клетках, которое свидетельствует о значительном понижении трансмембранного потенциала (деполяризации) митохондрий. При этом эффект соединений 1 и 2 существенно превосходит таковой для соединения А-7 (Таблица 2 на Фиг.2). Следовательно, оба заявленных соединения обладают повышенной противоопухолевой активностью по сравнению с прототипом.

Пример 5. Изучение клеточного накопления соединений 1 – 2.

Анализ клеточного проникновения соединений 1 – 2 производили методом хромато-масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографической системы Infinity 1290 (Agilent) в сочетании с трехквадрупольным масс-спектрометром, оснащенным источником ионизации электрораспылением QTRAP 6500 (ABSciex). Параметры детектирования ионизированных соединений оптимизировали с использованием программного обеспечения Analyst 1.6.2. Хроматографическое разделение соединения проводили на гидрофобной колонке Discovery HS C18 (3 мкм, 5 см × 2.1 мм) (Supelco) с подвижными фазами, состоящими из A (95% воды, 5% метанола, 5 мМ ацетата аммония) и B (50% метанола, 50% изопропанола, 5 мМ ацетат аммония).

Выращенные клетки PC-3 диссоциировали с использованием раствора трипсина и этилендиаминтетраацетата, промывали изотоническим раствором и супендировали с плотностью 1×10⁶ клеток в 1 мл. Суспензию клеток инкубировали в присутствии соединений в конечной концентрации 1 мкМ в СО₂-инкубаторе при 37°C в течение 1 ч. Обработанные клетки промывали центрифугированием далее лизировали в смеси метанол-вода в условиях ультразвуковой обработки. Лизат клеток центрифугировали, и отбирали надосадочный раствор для анализа соединений. Концентрации соединений определяли по калибровочному графику, полученному с использованием стандартных растворов соединений с известной концентрацией (Таблица 3 на Фиг. 3).

Результаты демонстрируют, что соединения 1 и 2 характеризуются значительно более высокими клеточными концентрациями, чем соединение А-7. Следовательно, заявленные соединения обладают повышенным клеточным накоплением по сравнению с прототипом. Это показывает, что дополнительная гликозидная группа в ТФФ производных бетулиновой кислоты (соединениях 1 и 2) еще более усиливает доставку соединений в опухолевые клеток. Усиливающий доставку эффект гликозидных групп (D-глюкозы и L-рамнозы), по-видимому, связан с их распознаванием мембранными транспортерами, осуществляющими активный транспорт заявленных соединений внутрь клеток. Этот эффект, по-видимому, вносит вклад в выявленную повышенную специфическую противоопухолевую активность заявленных соединений по сравнению с прототипом (Таблица 1 на Фиг. 1, Таблица 2 на Фиг. 2).

Таким образом, изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно созданы новые фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты, характеризующиеся повышенным клеточным проникновением и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток (вследствие наличия биологически распознающего компонента – фрагментов D-глюкопиранозы и L-рамнопиранозы). Заявленные соединения устраняют недостатки ТФФ производных бетулиновой кислоты по прототипу RU2665922.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью признаков и полученными техническими результатами.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалистов в данной области науки и техники, а в существующем уровне техники не были известны гликозидные производные бетулиновой кислоты заявленного состава, обладающие противоопухолевой активностью.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как заявленное техническое решение может быть реализовано в различных химических, медицинских и фармацевтических предприятиях с применением известных соединений, материалов и технологического оборудования.

Изобретение относится к области органической химии и фармацевтики, а именно к новым фосфониевым солям на основе гликозидов бетулиновой кислоты. Раскрываются фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты формулы 1–2. Изобретение обеспечивает эффективную противоопухолевую активность. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 пр.

1. Фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты формулы 1 – 2:

2. Фосфониевые соли на основе гликозидов бетулиновой кислоты по п. 1, обладающие противоопухолевой активностью.