СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДЕКСА АВИДНОСТИ АУТОАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ГИДРОГЕЛЕВЫХ БИОЧИПАХ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/543 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения индекса авидности аутоантител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные белки - аутоантигены. Определение авидности аутоантител может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа.

Уровень техники

Аутоантитела (аутоАТ) - это антитела, вырабатываемые иммунной системой и направленные против одного или нескольких собственных белков человека -аутоантигенов (аутоАГ).

При развитии аутоиммунных заболеваний (АИЗ), таких как, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото и многих других, в сыворотке крови могут быть выявлены аутоантитела против различных аутоантигенов. При этом аутоАТ могут быть обнаружены до клинической манифестации заболевания (Landegren N. et al. Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Sci Rep.20166:20104. doi: 10.1038/srep20104). Тем не менее, выявление аутоАТ играет роль вспомогательного, но не абсолютного диагностического критерия для АИЗ, поскольку аутоАТ могут присутствовать у здоровых людей и пациентов с неаутоиммунными заболеваниями. В частности, доля здоровых лиц в популяции с положительными тестами на аутоАТ к тиреопероксидазе, основному антигену ткани щитовидной железы, может достигать 26% (Prummel MF, Wiersinga WM. Thyroid peroxidase autoantibodies in euthyroid subjects. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2005. 19(1): 1-15. doi: 10.1016/j.beem.2004.11.003). У части пациентов при длительно протекающем аутоиммунном заболевании можно наблюдать отсутствие выявляемых аутоАТ (Wilmot-Roussel Н. et al. Factors associated with the presence of glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 autoantibodies in patients with long-standing type 1 diabetes.Diadetes Metab. 2013 39(3): 244-9. doi: 10.1016/j.diabet.2013.01.002). Кроме того, частота выявления аутоАТ резко увеличивается в пожилом возрасте (Bastard Р. et al. Autoantibodies neutralizing type I IFNs are present in ~4% of uninfected individuals over 70 years old and account for ~20% of COVID-19 deaths. Sci Immunol. 2021 6(62): eabl4340. doi: 10.1126/sciimmunol.abl4340).

Для мультиплексного выявления аутоантител в образцах сыворотки крови человека разработан ряд подходов, включая анализ с использованием нитроцеллюлозных мембран или тест-полосок (Line immunoassay, Satoh М. et al. The uses and misuses of multiplex autoantibody assays in systemic autoimmune rheumatic diseases. Front Immunol. 2015. 6:181. doi: 10.3389/fimmu.2015.00181), микросфер со связанными аутоантигенами (мультиплексные панели MILLIPLEX® на основе платформы Luminex®, Merck, Германия, https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/product-supporting/milliplex/multiplex-analysis-of-autoantibodies) и белковых микрочипов с иммобилизованными аутоантигенами (Патент РФ 2781976, дата публикации 21.10.2022 г.; Savvateeva E.N. et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes, Int J Mol 5ci. 2021. 22(11):5502. doi: 10.3390/ijms22115502; Kuzumi A. et al. Comprehensive autoantibody profiling in systemic autoimmunity by a highly-sensitive multiplex protein array. Front Immunol 2023. 14: 1255540. doi: 10.3389/fimmu.2023). Принимая во внимание встречаемость ряда аутоАТ у здоровых людей, такие методы могут обладать низкой специфичностью при использовании в качестве диагностического теста.

В настоящее время предполагается, что аутоАТ состоят из политональной смеси, различающейся по сродству к аутоАГ. Одной из дополнительных характеристик для гетерогенной группы определяемых аутоАТ, которая может быть получена при иммуноанализе, является величина силы связывания антител со своим антигеном-мишенью, возникающей в результате многомерных аффинных взаимодействий. Такая сила связывания называется функциональной аффинностью или авидностью AT и широко применяется при диагностике инфекционных заболеваний с целью различения первичной и хронической форм (Correa V.A. et al. Modified ELISA for antibody avidity evaluation: The need for standardization. J. 2021. 44(4): 433-438. doi: 10.1016/j.bj.2020.10.009). В настоящее время высказываются предположения, что при аутоиммунных заболеваниях авидность аутоАТ может оказывать влияние на их патогенность (Oostindie S.C. et al. Avidity in antibody effector functions and biotherapeutic drug design. Nat Rev Drug Discov. 2022. 21(10): 715-735. doi: 10.1038/s41573-022-00501-8). Основная доля исследований, направленных на изучение авидности аутоАТ при АИЗ, сосредоточена на системных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и антифосфолипидный синдром (Yuan W. et al. Clinical evaluation of total and high-avidity anti-dsDNA antibody assays for the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Lupus. 2019. 28(12): 1387-1396. doi: 10.1177/0961203319877243; Zeng Y. et al. Assessment of a high-avidity IgG ANAs for the diagnosis and activity prediction of systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatal. 2020. 39(9): 2619-2629. doi: 10.1007/s10067-020-05040-4; FialovÁ L. et al. Avidity of anti-phospholipid antibodies in relation to their levels. Cent Eur J Immunol. 2020. 45(2): 136-143. doi: 10.5114/ceji.2020.97901). Ряд исследований был посвящен изучению авидности аутоАТ при целиакии (Westerlund A. et al. Affinity maturation of immunoglobulin A anti-tissue transglutaminase autoantibodies during development of coeliac disease. Clin Exp Immunol. 2007. 148(2): 230-40. doi: 10.1111/j.l365-2249.2007.03336.x.; Gelderman K.A. et al. Serum autoantibodies directed against transglutaminase-2 have a low avidity compared with alloantibodies against gliadin in coeliac disease. Clin Exp Immunol 2014. 177(1): 86-93. doi: 10.1111cei.l2302) и сахарном диабете 1 типа (СД1). Данные, известные из литературных источников по авидности аутоАТ при других АИЗ, например щитовидной железы (ЩЖ), крайне ограничены (Zhang Y. et al. Avidity of thyroglobulin antibody in sera from patients with Hashimoto's thyroiditis with different thyroid functional status. Clin Exp Immunol. 2010. 161(1): 65-70. doi: 10.1111/j.l365-2249.2010.04155.x; Silva L.M. et al. Determination of IgG Subclasses and Avidity of Antithyroid Peroxidase Antibodies in Patients with Subclinical Hypothyroidis. Horm Res Paediatr. 2003, 59, 118-124, doi: 10.1159/000069069.).

Авидность антител можно измерить различными иммунологическими методами, в том числе, с помощью модифицированной процедуры иммуноферментного анализа (ИФА), который является наиболее распространенным иммунологическим методом анализа из-за своей простоты и доступности. Характеристикой авидности антител является индекс авидности (ИА), рассчитываемый по формуле:

Для дестабилизации комплекса «антиген-антитело» могут быть использованы изменение рН, ионной силы раствора, и различные денатурирующие агенты, в частности, хаотропные, такие как мочевина и гуанидина тиоцианат. Хаотропные агенты дестабилизируют водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. После инкубации иммобилизованного на твердой фазе антигена с сывороткой, с помощью подобранной концентрации хаотропных агентов можно элюировать антитела, слабо связанные с антигеном. Таким образом, можно выявить антитела с высокой авидностью. ИА как количественную характеристику авидности антител можно рассматривать как информативный биологический параметр развития патологии или инфекции.

Предложены мультиплексные иммунологические методы определения индекса авидности антител к вирусу папилломы человека (Brady A.M. et al. Description of a novel multiplex avidity assay for evaluating HPV antibodies. J Immunol Methods. 2017. 447: 31-36. doi: 10.1016/j.jim.2017.04.004) и для дифференциации подклассов иммуноглобулинов G к возбудителю малярии (Ssewanyana I. et al. Impact of a Rapid Decline in Malaria Transmission on Antimalarial IgG Subclasses and Avidity. Front Immunol. 2021. 11: 576663. doi: 10.3389/fimmu.2020.576663). В то же время, аналогичные разработки в отношении ИА аутоантител, характеризующих развитие АИЗ, пока не описаны.

Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа определения индекса авидности аутоантител на основе мультиплексного иммуноанализа, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокой специфичностью и информативностью в отношении аутоантител, выявляемых в сыворотке крови человека.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения является способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Способ предусматривает стадии параллельной инкубации образца сыворотки крови на двух идентичных гидрогелевых биочипах с образованием иммунных комплексов между иммобилизованным аутоАТ и аутоАТ из сыворотки крови, обработку одного из биочипов хаотропным агентом, детекцию иммунных комплексов в элементах биочипов с использованием вторичных флуоресцентно-меченных антител, регистрацию флуоресцентных сигналов биочипов для определения наличия аутоантител в сыворотке крови с последующим расчетом индекса авидности выявленных аутоантител по значениям сигналов от соответствующих элементов каждого из биочипов.

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах.

Способ включает следующие стадии:

а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки - аутоантигены, специфичные к аутоантителам, каждый - в группе из четырех отдельных элементов, контрольных элементов, содержащих иммуноглобулин человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;

б) параллельную инкубацию образца сыворотки крови человека на двух идентичных биочипах и взаимодействие образца сыворотки с элементами биочипов с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;

в) обработку одного из биочипов хаотропным агентом;

г) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;

д) регистрацию флуоресцентной картины биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов биочипа, в которых на стадии (г) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения;

е) выявление аутоантитела в сыворотке крови в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов группы элементов биочипа с соответствующим иммобилизованным аутоантигеном, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение;

ж) расчет индекса авидности выявленного аутоантитела, как процентного отношения результирующего сигнала элемента группы элементов биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом.

В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризацией, и содержащими иммобилизованные белки -аутоантигены.

В другом воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (в) один из биочипов обрабатывают хаотропным агентом, используя в качестве такового мочевину в концентрации не менее 5 моль/л.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. Схема проведения мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови с использованием двух гидрогелевых биочипов для выявления аутоантител и расчета индекса авидности. Обозначения: PBS - фосфатно-солевой буфер (phosphate buffered saline), 5М Urea - мочевина в концентрации 5 моль/л (хаотропный агент), Ab* -флуоресцентно-меченные антивидовые антитела.

Фигура 2. Схема гидрогелевого биочипа с иммобилизованными аутоантигенами к ткани щитовидной железы для выявления аутоантител, характеризующих аутоиммунные заболевания щитовидной железы. Иммобилизованные аутоантигены - тиреопероксидаза (ТРО), тиреоглобулин (Tg), конъюгат гормона Т3 с пероксидазой хрена (Т3), конъюгат гормона Т4 с пероксидазой хрена (Т4), карбоангидраза 2 (СА2), пендрин (PDS), пируват киназа (РК). Маркерные элементы - иммобилизованный иммуноглобулин человека (human IgG), флуоресцентный маркер Су5 (М). Элементы отрицательного контроля, не содержащие иммобилизованных белков (PBS).

Фигура 3. (А) Значения флуоресцентных сигналов элементов гидрогелевых биочипов с иммобилизованными тиреопероксидазой (ТРО) и тиреоглобулином (Tg) без обработки хаотропным агентом и после обработки. (Б) Расчет индекса авидности для аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину при анализе образца сыворотки крови от здорового донора без признаков эндокринных нарушений.

Фигура 4. Значения индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину, полученного с использованием заявленного способа и метода модифицированного ИФА в качестве референсного.

Фигура 5. Распределение значений индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе у пациентов различных когорт и здоровых носителей. (А) индексы авидности у здоровых носителей, пациентов с АИЗЩЖ и с сахарным диабетом 1 типа (СД1). (Б) индексы авидности в подгруппах пациентов с изолированным АИЗЩЖ, АИЗЩЖ в сочетании с другими аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), с СД1 и с папиллярным раком щитовидной железы (ПРЩЖ).

Фигура 6. Распределение значений индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину у пациентов различных когорт и здоровых носителей. (А) индексы авидности у здоровых носителей, пациентов с АИЗЩЖ и с СД1. (Б) индексы авидности в подгруппах пациентов с изолированным АИЗЩЖ, АИЗЩЖ в сочетании СД1, с другими АИЗ, с СД1 без признаков заболеваний щитовидной железы.

Таблица 1. Характеристики пациентов и здоровых доноров в исследуемой когорте.

Осуществление изобретения

В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека может быть успешно решена посредством проведения мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Модифицированный мультиплексный анализ, заявленный в настоящем способе, основан на непрямом методе выявления аутоАТ, в котором проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с анализируемой пробой, инкубацию с флуоресцентно-меченными вторичными антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и интерпретацию флуоресцентного изображения биочипа.

Заявленный в данном изобретении способ включает обеспечение биочипа, содержащего аутоантигены, специфичные для аутоантител, контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков. Каждый тип аутоантигенов иммобилизован в четырех одинаковых элементах, повторы используются для увеличения воспроизводимости анализа.

Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика (Gryadunov D.A. et al. The EIMB Hydrogel Microarray Technology: Thirty Years Later. Acta Naturae. 2018, v. 10 (4), p.4-18. doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18). Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на ковалентной сополимеризационной иммобилизации антигенов в гидрогелевых ячейках биочипа объемом 0,1 нл. Поскольку структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает водное окружение биологических молекул; иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и позволяет сохранить биологическую активность, таким образом данный метод по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых белков, имеющих в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, е-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.).

В заявленном способе для определения индекса авидности аутоантител используется два идентичных гидрогелевых биочипа, на каждый из которых наносят один и тот же образец анализируемой пробы. Анализируемая проба представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенную в 100 раз специальным буфером. В ходе инкубации осуществляется взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови.

После инкубации биочипов с анализируемой пробой на один из биочипов наносят хаотропный агент, дестабилизирующий комплекс «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело», на второй биочип на этой стадии добавляют фосфатно-солевой буфер (PBS), не нарушающий стабильности образованного комплекса (Фигура 1). Ковалентная иммобилизация белков в элементах гидрогелевого биочипа позволяет воздействием хаотропного агента селективно высвободить связавшиеся с иммобилизованным антигеном аутоантитела с низкой авидностью. В качестве денатурирующего белок агента могут быть использованы хаотропные агенты, такие как мочевина, тиомочевина, гуанидин хлорид, гуанидин тиоцианат и др. Для инкубации на биочипе предпочтительно использование мочевины в концентрации не менее 5 моль/л, поскольку меньшие концентрации не оказывают воздействия на стабильность комплекса «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело».

На следующем этапе на каждый из биочипов наносят раствор детектирующих антивидовых флуоресцентно-меченных антител. Предпочтительно используют конъюгаты флуоресцентного красителя Су5 с антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека. Во время инкубации ячеек биочипов с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».

После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа.

Выполняют сравнение интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными аутоантигенами и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой группы элементов n, содержащих одинаковые иммобилизованные аутоантигены, результирующее значение сигнала I_n рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В группе элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала I_ref рассчитывают как медиану значений от соответствующих сигналов элементов. Наличие аутоантитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала I_n в группы элементов биочипа, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу I_ref превышает пороговое значение. Предпочтительным является пороговое значение I_n/I_ref>2,0, характеризующее наличие аутоантител в сыворотке крови.

В случае определения аутоантитела в сыворотке крови его индекс авидности рассчитывают как процентное отношение результирующего сигнала группы элементов биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом. Индекс авидности аутоАТ определяют как процент аутоАТ, которые остались связанными с иммобилизованным антигеном после обработки хаотропным агентом.

Заявленный способ определения индекса авидности аутоантител обеспечивает возможность скрининга образцов крови пациентов на наличие различных аутоантител с одновременным установлением индекса авидности, что позволяет классифицировать такие аутоантитела на низко- и высоко-авидные и делать заключение о специфичности мультиплексного иммуноанализа.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Определение индекса авидности аутоантител к аутоантигенам ткани щитовидной железы в образце сыворотки крови с помощью гидрогелевого биочипа

Гидрогелевые биочипы изготавливают методом сополимеризационной иммобилизации по методике, описанной ранее в публикации Savvateeva E.N. et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 2021. 22, 5502. doi: 10.3390/ijms22115502.

Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления аутоантител к антигенам ткани щитовидной железы (ЩЖ) приведена на Фигуре 2. Биочип содержит иммобилизованные аутоантигены, в т.ч. тиреопероксидазу (ТРО), тиреоглобулин (Tg), конъюгат гормона Т3 с пероксидазой хрена (Т3), конъюгат гормона Т4 с пероксидазой хрена (Т4), карбоангидразу 2 (СА2), пендрин (PDS), пируват киназу (PK). Биочип также включает маркерные элементы - иммобилизованный иммуноглобулин человека (human IgG), флуоресцентный маркер Су5 (М), и элементы отрицательного контроля, не содержащие иммобилизованных белков (PBS).

Для проведения анализа образец сыворотки крови человека разводят 1:100 буфером 100 мМ Трис-HC1 с 0,1% Triton Х-100, 100 мкл вносят в реакционные камеры двух идентичных биочипов. После инкубации биочипов с образцом сыворотки крови в течение двух часов при 37°С, промежуточной отмывки (PBS, включающий 0,1% Tween 20, 20 мин) на один из биочипов наносят раствор 5М мочевины, на другой - буфер PBS, инкубируют в течение 10 мин и после проводят отмывку буфером PBS, включающим 0,1% Tween 20 в течение 20 мин. Для формирования тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело» на биочипы наносят 50 мкл коньюгата флуоресцентно-меченных антивидовых антител (Goat anti-Human IgG-Cy5 в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа)). После инкубации в течение ночи при 37°С биочипы отмывают буфером PBS с 0,01% Tween 20 в течение 30 мин, споласкивают дистиллированной водой и высушивают центрифугированием либо обдувом.

Флуоресцентные изображения биочипов получают с помощью анализатора биочипов с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва и оснащенного специализированным программным обеспечением (Lysov Y. et al. Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomed Opt. Express 2017. 8, 4798, doi:10.1364/boe.8.004798).

Проводят анализ сигналов элементов биочипа, не подвергавшегося обработке хаотропным агентом. Для каждой группы п из четырех элементов, содержащих иммобилизованный аутоантиген, вычисляют значение результирующего сигнала, как медианное значение сигналов от четырех элементов I_n. Вычисляют значение результирующего сигнала I_ref в группе элементов пустого геля 'PBS', не содержащих иммобилизованных белков, как медиану соответствующих сигналов элементов. Наличие соответствующего аутоантитела в сыворотке крови определяют, если выполняется условие I_n/I_ref≥2,0. На Фигуре 3А представлены сигналы элементов биочипа, соответствующие условию I_TPO/I_ref≥2,0, I_Tg/I_ref≥2,0 при анализе образца сыворотки крови здорового донора, не имеющего признаков патологии щитовидной железы (ультразвуковое исследование ЩЖ в норме, значение ТТГ=0,669 мМЕ/л (норма)), однако, с выявленными по результатам анализа на биочипе аутоантителами к тиреоглобулину и тиреопероксидазе.

В случае выявления аутоантител к определенному аутоантигену ткани ЩЖ, проводят анализ сигналов элементов биочипа, прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, содержащих соответствующий аутоантиген. Для каждой группы n из четырех элементов, содержащих соответствующий аутоантиген, вычисляют значение результирующего сигнала, как медианное значение сигналов от четырех элементов I_n (Фигура ЗА). Рассчитывают индекс авидности аутоантитела согласно формуле:

На Фигуре 3Б представлены значения индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину при анализе образца сыворотки крови здорового донора, не имеющего признаков патологии щитовидной железы. Значение ИА аутоАТ к ТРО составляет 20,78%, ИА аутоАТ к Tg - 23,24%.

Пример 2. Выявление аутоантител в когорте пациентов и здоровых доноров и корреляция результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе, полученных заявленным способом и референсными методами

Заявляемым способом анализируют образцы сывороток крови от когорты, включающей, суммарно, 10 условно здоровых доноров и 113 пациентов: 19 - с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗЩ), включая 11 - с тиреоидитом Хашимото, 8 - с болезнью Грейвса; 17 - с АИЗЩЖ и сахарным диабетом 1 типа (СД1); 61 - с АИЗЩЖ и другими аутоиммунными заболеваниями (болезнь Аддисона, и/или болезнь Хирата, и/или витилиго, и/или алопеция); 6 - с АИЗЩЖ и папиллярным раком щитовидной железы (ПРЩЖ); 10 - с СД1 без признаков наличия АИЗЩЖ. Характеристики когорты приведены в Таблице 1.

Образцы сыворотки крови анализируют заявленным способом с получением значений индекса авидности выявленных аутоантител, как приведено в Примере 1. Частота выявления аутоантител к различным аутоантигенам мультиплексным методом составляет: к ТРО - 68,3% (84/123), к Tg - 35,8% (44/123), к PDS - 0% (0/123), к Т3-1,6% (2/123), к Т4 - 8,1% (10/123), к СА2 - 0,8% (1/123), к - РК 1,6% (2/123). Для положительных хотя бы по одному аутоантителу образцов рассчитывают индексы авидности в мультиплексном анализе согласно формуле (2).

Все образцы сыворотки крови проверяют на наличие аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину референсным методом хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA). Уровень аутоАТ к ТРО определяют методом хемилюминесцентного иммуноанализа на автоматическом анализаторе ARCHITECT i2000 (Abbott, США). Уровень аутоАТ к Tg определяют методом электрохемилюминесцентного анализа на автоматическом анализаторе Cobas 6000 (Roche Diagnostics, Германия).

Для всех образцов с выявленными аутоАТ к тиреопероксидазе и тиреоглобулину по результатам анализа на биочипах также проверяют их наличие и рассчитывают значения индекса авидности референсным методом модифицированного ИФА. Используют соответствующие наборы компании «Хема-Медика» (Россия). В стандартный протокол производителя добавляют стадию инкубации с хаотропным агентом: после инкубации с образцами и отмывки добавляют по 100 мкл PBS или 5М мочевину в соответствующие лунки микропланшета и инкубируют 5 мин при 37°С, далее отмывают и проводят дальнейшие стадии без изменений. Индекс авидности аутоантител рассчитывают по формуле (1).

Сравнение результатов выявления аутоАТ к ТРО тремя методами показывает удовлетворительную корреляцию. Коэффициенты корреляции при выявлении аутоантител составляют: между CLIA и заявленным способом r=0,6255 (р<0,0001, n=121), между ИФА и заявленным способом r=0,5795 (р<0,0001, n=44), между CLIA и ИФА r=0,6286 (р<0,0001, n=42). Отсутствует положительная корреляция между значениями индекса авидности для аутоАТ к ТРО, полученными заявленным способом и референсным методом модифицированного ИФА.

Сравнение результатов выявления аутоАТ к Tg тремя методами (заявленным способом, CLIA и ИФА) демонстрирует удовлетворительную корреляцию. Коэффициенты корреляции при выявлении аутоантител составляют: между CLIA и заявленным способом r=0,6412 (р<0,0001, n=121), между ИФА и заявленным способом г=0,6417 (р<0,0001, п=44), между CLIA и ИФА r=0,6286 (р<0,0001, n=42). Обнаруживают положительную корреляцию между значениями индекса авидности аутоАТ к Tg, полученными с использованием заявленного способа и методом модифицированного ИФА г=0,6539 (р<0,001, n=34) (Фигура 4).

Пример 3. Определение значений индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе у пациентов различных когорт и здоровых доноров

Заявленным способом получают значения индекса авидности для всех образцов сыворотки крови, в которых были выявлены аутоантитела к тиреопероксидазе, включая пациентов с АИЗЩЖ (n=79) и носителей аутоАТ (n=11) из групп пациентов с СД1 и здоровых доноров. Медианы ИА аутоАТ к ТРО составляет для здоровых носителей аутоАТ 39,9%, пациентов с изолированным АИЗЩЖ 73,4%, пациентов АИЗЩЖ, сочетанной с другими АИЗ 64,8-80,6%, пациентов АИЗЩЖ с сочетанным ПРЩЖ 98,5%, и пациентов носителей аутоАТ с СД1 - 83,2% (Фигура 5). Различие в медианах ИА аутоАТ к ТРО в представленных группах является статистически значимым для групп АИЗЩЖ/ Здоровые носители (р=0,0223) и СД1/ Здоровые носители (р=0,0247), но не является таковым для групп АИЗЩЖ/ СД1 (р>0,05) (Фигура 5А). Внутри группы пациентов с АИЗЩЖ дополнительно проводят разбивку по подгруппам, исходя из изолированного АИЗЩЖ или сочетанного с другими аутоимунными эндокринными и коморбидными патологиями (АИЗЩЖ+др АИЗ; АИЗЩЖ+СД1) или сочетания аутоиммуного процесса в щитовидной железе с папиллярной карциномой (АИЗЩЖ+ПРЩЖ). Различия в медианах ИА аутоАТ к ТРО для подгрупп являются статистически незначимым (р>0,05) (Фигура 5Б).

Пример 4. Определение значений индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину у пациентов различных когорт и здоровых доноров

Заявленным способом получают значения индекса авидности для всех образцов сыворотки крови, в которых были выявлены аутоантитела к тиреоглобулину, включая пациентов с АИЗЩЖ (n=35) и носителей аутоАТ (n=9) из групп пациентов с СД1 и здоровых доноров. Медианы ИА аутоАТ к Tg составляет для здоровых носителей аутоАТ 29,9%, пациентов с изолированным АИЗЩЖ 52,6%, пациентов АИЗЩЖ, сочетанной с другими АИЗ 81,4-85,9% и пациентов носителей аутоАТ с СД1 - 92,7% (Фигура 6). Различие в медианах ИА аутоАТ к Tg в представленных группах является статистически значимым для групп АИЗЩЖ/ Здоровые носители (р=0,0071) и СД1/ Здоровые носители (р=0,0201), но не является таковым для групп АИЗЩЖ/ СД1 (р>0,05) (Фигура 6А). При этом медианы ИА аутоАТ к Tg пациентов с СД1 отличаются от пациентов с изолированным АИЗЖ без коморбидных патологий (р=0,0452). Различия в медианах ИА аутоАТ к Tg среди подгрупп пациентов с АИЗЩЖ являются статистически незначимы (р>0,05) (Фигура 6Б).

Таким образом, заявленное изобретение, направленное на определение индекса авидности аутоантител в сыворотке крови с использованием гидрогелевых биочипов, позволяет дифференцировать, например, низкоавидные аутоантитела к тиреоглобулину и тиреопероксидазе у здоровых носителей без признаков заболеваний щитовидной железы от аутоантител у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ и, наконец, от высокоавидных аутоантител к тиреоидным белкам у больных с нетиреоидной аутоиммунной патологией, в частности с сахарным диабетом 1 типа. Определение авидности аутоантител, предложенное в настоящем изобретении, может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.

Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения индекса авидности аутоантител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные белки - аутоантигены. Способ включает стадии инкубации на биочипе образца сыворотки крови с образованием комплексов иммобилизованных аутоантигенов с аутоантителами, добавления хаотропного агента на биочип и детекции комплексов «иммобилизованный аутоантиген - аутоантитело» с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G. Индекс авидности аутоантитела рассчитывают как процентное отношение флуоресцентного сигнала элемента биочипа, содержащего соответствующий аутоантиген, при анализе, включающем стадию обработки хаотропным агентом, к флуоресцентному сигналу элемента биочипа, полученному без такой обработки. Способ позволяет определять индекс авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах. Определение авидности аутоантител может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах, включающий:

а) обеспечение гидрогелевого биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки - аутоантигены, специфичные к аутоантителам, каждый - в группе из четырех отдельных элементов, контрольных элементов, содержащих иммуноглобулин человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;

б) параллельную инкубацию образца сыворотки крови человека на двух идентичных гидрогелевых биочипах и взаимодействие образца сыворотки с элементами гидрогелевых биочипов с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;

в) обработку одного из гидрогелевых биочипов хаотропным агентом;

г) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген-аутоантитело-антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;

д) регистрацию флуоресцентной картины гидрогелевого биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов гидрогелевого биочипа, в которых на стадии (г) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения;

е) выявление аутоантитела в сыворотке крови в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов группы элементов гидрогелевого биочипа с соответствующим иммобилизованным аутоантигеном, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение;

ж) расчет индекса авидности выявленного аутоантитела как процентного отношения результирующего сигнала элемента группы элементов гидрогелевого биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген, и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что гидрогелевый биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации.

3. Способ по п. 1, в котором на стадии (в) в качестве хаотропного агента используют мочевину в концентрации не менее 5 моль/л.