Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тиреоглобулину Советский патент 1991 года по МПК G01N33/534 

Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к радиоиммунологическому определению аутоантител (аутоАТ) к тиреоглобулину ЛТ) в сыворотке крови человека. Определение аутоАТ к ТГ используется для диагностики аутоиммунных тиреоидных заболеваний - тиреоидита Хашимото, диффузного токсического зоба, идиопатической микседемы.

Целью изобретения является упрощение способа за счет использования для построения калибровочной кривой в качестве стандартных растворов аутоАТ к ТГ растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека.

Используют калибровочные кривые, получаемые с помощью заявляемого способа при использовании в качестве стандарт- ных растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека, и растворов аутоАТ к ТГ; совпадение калибровочных кривых свидетельствует о возможности использования растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека в качестве стандартных. Используют данные по восп- роизводимости результатов измерений концентраций аутоАТ к ТГ в сыворотке крови и результаты определения концентрации аутоАТ к ТГ в сыворотке крови здоровых лиц

о

00

ю

VI

о

и больных аутоиммунными тиреоидными ч-чРюлрваниями.

Пример. Для проведения радиоиммунологического определения аутоАТ к ТГ в сыворотке крови человека используются следующие реагенты: 125 I-TT с удельной активностью 3-6 мкКи/мкг и иммунореак- тивностью (связывание при избытке AT к ТГ) не менее 85%; препарат 125 I-ТГ разбавляют 0,05 М натрийфосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,1 % бычий сывороточный альбумин (БСА) и 0,02% NaNa, до такой концентрации, чтобы в 100 мкл содержалось 7-10 нг меченогсгТГ.

Стандартные растворы ауто к ТГ - в качестве стандартных растворов используются растворы кроличьих антител к ТГ, конъюгированныхсиммуноглобулинами человека, в сыворотке крови человека, эквивалентные следующим концентрациям аутоАТ кТГ: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 10; 25 мкг/мл.

Иммуносорбент - 10% раствор козьих AT к иммуноглобулинам человека, иммобилизованных на бактериальной стенке золотистого бтафиллококка.

Буферный раствор - 0,05 М натрийфос- фатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1% БСА и 0,02% МаЫз.

Проведение анализа.

1.Пробирки для анализа (в дубликатах) маркируют следующим образом: Т - общая активность I-ТГ, Вн - неспецифически связанный 125 I-ТГ, Ci-Сб - стандартные растворы аутоАТ к Yr соответственно 0,5- 25 мкг/мл, Сх исследуемые пробы сыворотки крови,

2.В пробирки Вн вносят по 10 мкл стан- .дартного раствора О мкг/мл. В пробирки

Ci-Cs вносят по 10 мкл соответствующих стандартных растворов. В пробирки Сх - вносят по 10 мкл исследуемых сывороток крови.

Исследуемую сыворотку крови с концентрацией аутоАТ к TF более 25 мкг/мл необходимо развести нулевым стандартным раствором (0 мкг/мл).

3.Во все пробирки, кроме Т, вносят по 100 мкл буферного раствора.

4.Во все пробирки вносят по 100 мкл 125 I-ТГ.

5.Пробирки закрывают пробками, содержимое каждой пробирки перемешивают на вихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 2 ч при 37°С.

6.Во все пробирки, кроме Т, вносят по 250 мкл иммуносорбента. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают на вихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 1,5 ч при комнатной температуре.

7.Все пробирки, кроме Т, центрифуш- руют при 1500 2000 g в течение 15 минут

8.Удаляют надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса, избегая захватывания осадка,

9.Во все пробирки, кроме Т, вносят по 1 мл буферного раствора, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают на вихревом смесителе и центрифугируют пробирки согласно п. 7.

10.Удаляют надосадочную жидкость согласно п. 8.

11.Все пробирки помещают в гамма- счетчик и измеряют скорость счета I в

каждой пробирке в течение 1 мин.

Расчеты и графические построения. Находят средние арифметические значения скоростей счета для каждой пары пробирок, Из полученных значений скоростей счета, кроме значения скорости счета для пробирок Т, вычитают среднее арифметическое значение скорости счета в пробирках

/Юн

Вн (неспецифически связанный I-ТГ)- На основании полученных значений скоростей

счета (В) рассчитывают величину В- 100/Т для каждого стандартного раствора и исследуемой пробы.

Строят калибровочную кривую в полулогарифмических координатах, откладывая на оси ординат (линейная) значения В

100/Т, а по оси абсцисс (логарифмическая)

- значения концентраций аутоАТ к ТГ в

мкг/мл в соответствующих стандартных

растворах. Для исследуемых проб на основании соответствующих значений В 100/Т определяют по калибровочному графику концентрацию аутоАТ к ТГ.

Упрощение известного способа дости гается использованием для построения ка

либровочной кривой в качеств стандартных растворов кроличьих AT.к ТГ. конъюгированных с иммуноглобулинами че ловека, т.е. доступных в больших количест вах компонентов. Доступность стандартных

растворов делает возможным широкое при менение заявляемого способа.

Заявляемый способ также как и извест ный способ характеризуется высокой точно

стью, о чем свидетельствуют низкие значения коэффициента вариации результа тов определения концентрации аутоАТ к ТГ Результаты определения аутоАТ к ТГ в сы воротках крови здоровых лиц и больны/

аутоиммуными тиреоидными заболевания ми с помощью заявляемого способа соот ветствуют данным литературы t свидетельствуют о возможности примене ния способа в медицинской практике.

Формула изобретения

Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тиреоглобулину путем инкубации сыворотки крови с раствором меченого йодом - 125 тиреогло- булина, внесения в инкубационную смесь антител к иммуноглобулинам человека, повторной инкубации, центрифугирования, отделения осадка и его радиометрии с по0

следующим определением концентрации аутоантител к тиреоглобулину по калибре вочной кривой, построенной при использо вании стандартных растворов антител к тиреоглобулину, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, в качестве стандартных растворов антител используют растворы кроличьих антител к тиреоглобулину, конъюгированных с иммуноглобулинами человека.