Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме Российский патент 2024 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для реакций трансэтерификации и гидролиза молочного жира.

Применение гидролитических ферментов в пищевой промышленности и медицине помогло усовершенствовать многие существующие способы производства продуктов питания и лекарственных препаратов.

Липаза (КФ 3.1.1.3) - сериновая эстераза, которая катализирует гидролиз сложноэфирных связей триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот.Липазы широко доступны и повсеместно присутствуют в тканях животных и растений, а также в различных микроорганизмах. Активный центр липазы является частью каталитической триады, которая включает Ser-His-Asp/Glu и ксианионное отверстие. Во многих липазах доступ к активному центру контролируется lid-доменом, образованным поверхностной петлей. Домен lid претерпевает конформационное изменение в присутствии ингибитора [Е. D. Yushkova, Е. A. Nazarova, А. V. Matyuhina et al. Application of Immobilized Enzymes in Food Industry // Journal of agricultural and food chemistry Microb Cell Fact. - 2019. V. 67, №42. - P. 11553-11567].

Большинство липаз проявляют высокую активность при рН 4,0-8,0. На каталитическую способность липазы могут влиять ионы некоторых металлов и органические растворители. Chromobacterium viscosum, и Rhizophus sp.продуцируют внеклеточные липазы, активные при кислом рН, а P. nitroaeducens - щелочную липазу активную при сильнощелочном рН. Оптимальная температура для большинства липаз составляет от 30 до 50°С. Фермент обладает высокой субстратной специфичностью [Tian-Tian Liu, Xiao-Tian Liu, Qing-Xi Chen, Yan Shi. Lipase Inhibitors for Obesity: A Review // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2020. V. 128.-P. 110314-110323].

Липазы находят широкое применение в промышленности в реакциях трансэтерификации и гидролиза, а также в фармацевтических препаратах. Они также используются в целлюлозно-бумажной промышленности для удаления смолы из получаемой целлюлозы при изготовлении бумаги, в пищевой промышленности в качестве биосенсоров для количественного определения триацилглицерина при производстве жиров, масел и безалкогольных напитков [Payel Choudhury, Biswanath Bhunia. Industrial application of lipase: a review // Biopharm Journal. - 2015. V. 1, №2. - P. 41-47].

Ограничением для использования растворимых ферментов является их относительная нестабильность. Одним из основных средств повышения времени полужизни ферментов является их иммобилизация на полимерных носителях. В результате повышается стабильность ферментов к денатурирующим воздействиям внешней среды, что способствует многократному применению энзиматических препаратов в фармацевтической и пищевой промышленности. К соединениям, используемым в качестве нерастворимых носителей белков, предъявляются высокие требования: с одной стороны, молекула фермента после иммобилизации не должна претерпевать какие-либо структурно-функциональные изменения, с другой - она должна быть прикреплена к матрице необратимо. В качестве полимеров для иммобилизации фермента можно использовать ионообменные волокна [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5. - С.704-711].

Химическими называются волокна, полученные в результате переработки природных или синтетических высокомолекулярных соединений. Химические волокна обладают рядом ценных и уникальных свойств, не присущих натуральным волокнам. Они обладают высокой прочностью, хорошей эластичностью, легкостью, несминаемостью и рядом других свойств, которые позволяют расширить область их применения [Камалова Э.Р., Камалов Р.В., Николаенко Г.Р. Высокомолекулярные соединения и производство полимерных материалов // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 16, №23. - С.95-96].

Преимуществами ионообменных волокон является степень очистки ионита -98%, скорость сорбции и регенерации в 10-15 раз выше, чем для зернистых материалов, высокая обменная емкость. Иониты обладают селективностью, устойчивостью к действию кислот и щелочей, что способствуют их применение в медицине [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5. - С.704-711].

Волокнистые иониты обладают высокой удельной поверхностью, что позволяет увеличивать скорость и полноту «улавливания» сорбируемого вещества, малым сопротивлением фильтрующего слоя, что делает их перспективными хемосорбентами. Данные свойства способствуют их использованию в качестве матриц для разработки гетерогенных катализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Иониты обладают высокой селективностью, устойчивостью к действию кислот и щелочей, что способствуют их применение в медицине [Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Волокнистые хемосорбенты вион как перспективные матрицы для иммобилизации инулиназы из Aspergillus ficuum II Вестник ВГУ. - 2019. Т.7. - С. 3-7].

Волокнистый хемосорбент ВИОН КН-1 - представляет собой слабокислотное катионнообменное хемосорбционное карбоксилсодержащее волокно с трехмерной сеткой, полученное на основе полиакрилонитрильного волокна. Функциональными группами катионита ВИОН КН-1 являются карбоксильные группы - COO- (Н+ - или Na+ -формы) [Абдулхакова З.З., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. -2013. Т.1, №11. - С.31-39]. Для него характерна высокая скорость сорбции, высокоразвитая поверхность, высокая гигроскопическая устойчивость и гидрофильность [Патент RU 2677873, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019].

Волокнистый хемосорбент ВИОН АН-1 представляет собой низкоосновное анионообменное волокно. Волокнистый хемосорбент ВИОН АН-1 получен формованием сополимеров акрилонитрила с 2-метил-5-винил-пиридином [Абдулхакова З.З., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 1, №11. - С. 31-39]. Функциональные группы хемосорбента способны не только к анионному обмену, взаимодействию с кислотами и щелочами, но и сорбции ионов переходных металлов за счет донорно-акцепторного взаимодействия вакантных орбиталей последних и неподеленных s2-гибридных электронных пар атомов азота пиридинового ядра хемосорбента [Бычковская Г.И., Валова В.Д. Потенциометрическое исследование комплексообразующих свойств волокнистого хемосорбента ВИОН АН-1 // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. Т.10,№1.-С.86-92].

Волокна ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 очищают и дезинфицируют рану путем нейтрализации токсических веществ в ее области, нормализуют значения рН анализируемой среды. Применение материала эффективно при терапии пролежней и гнойных ран, позволяет сократить сроки лечения. ВИОНы обладают антибактерицидными и антигрибковыми свойствами [Патент RU 2677873, МПК А61К 38/48, А61К 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019].

В последнее время волокнистые сорбенты нашли широкое применение в защите окружающей среды от токсичных выбросов. Емкость сорбента определяет количество сорбционного материала, необходимого для данной конкретной цели [Абдулхакова 3.3., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 1, №11. -С.31-39].

Существуют способы ферментативной переэтерификации/этерификации, в которых использованы липазы, иммобилизованные на гидрофобных смолах, в присутствии водных растворов [Патент RU 2573929 С9, МПК, С12Р 7/64, C12N 9/20, CUC 3/10, опубл. 10.06.2016, Бюл. №16]. Изобретение относится к ферментативному способу получения сложных алкилэфиров жирных кислот для применения в области производства продуктов питания. В способе используют ферменты, иммобилизованные на гидрофобной смоле, смешанной с источником жирных кислот и спиртом, в присутствии водного раствора. Безусловно при использовании гидрофобных смол происходят незначительные потери ферментативной активности, но использование наиболее гидрофильных сорбентов, такие как ионообменные волокна, позволят получить более активные биокатализаторы.

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе иди подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.

В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.

Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные волокна не растворимы в воде.

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.

Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.

Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.

Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине. ~

В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковал ентной модификации.

Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler M., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гидролазной (лйпазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.

Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN108148827A, CN101712951A, CN106867989A, JPH01273588A, JPH03160992A, US5273898A, WO2015081879A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO2008084470A2, CN102839166A], Lewatit, Dowex [US5292649A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN114657169A], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO2008139455A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO2009069116A2]. Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.

Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 А1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.

В качестве прототипа служил способ, описанный в патенте [US5292649A], согласно которому 1 г макропористой слабокислотной катионообменной смолы Lewatit CNP 80 производства Bayer AG смешивали с 50 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-и-толуолметосульфоната и 10 мл воды. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре, при этом значение рН доводили до 4-5 добавлением 6 М HCl. После стабилизации значения рН полученную реакционную смесь тщательно промывали для удаления избытка 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-и-толуолметосульфоната. Затем к смеси добавляли 2 мл 1/15 М буфера Mcllvaine с рН 4 и 50 мкл раствора липазы (1450 единиц) и полученную смесь оставляли на ночь в прохладной комнате для проведения реакции. В результате была получена липаза, иммобилизованная на Lewatit CNP 80.

В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, равной 20184 мкмоль/мг, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника, в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; согласно изобретению в качестве носителя используют катионообменник ВИОН КН-1, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменного волокна ВИОН КН-1 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.

Пример реализации способа

В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные волокна ВИОН АН-1, ВИОН КН-1 фирмы ООО «ЛИРСОТ» со следующими характеристиками: линейная плотность волокна - 0,4-0,7 текс, длина волокна - 52±8 мм, удельная разрывная нагрузка - не менее 5,0 сН/текс, удлинение при разрыве - 20-45%, полная статическая обменная емкость по 0,1 нормальной HCl для ВИОН АН - не менее 1,8 мг-эквивалент/г, полная статическая обменная емкость по 0,1 нормальной HCl для ВИОН КН - не менее 3,5 мг-эквивалент/г.

Для подготовки ионообменных волокон к иммобилизации их помещали в дистиллированную воду. После набухания обрабатывали растворами HCl переменной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 1,0; 0,5 моль/л), процесс проводили в статических условиях. После отмывки дистиллированной водой осуществляли попеременную четырехкратную обработку 1 моль/л растворами NaOH и НС1 с промежуточной промывкой дистиллированной водой. Каждый этап составлял не менее 20 мин. После очистки ионообменные волокна ВИОН КН-1 переводили в Н-форму, а ВИОН АН-1 - в ОН-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре до постоянной массы и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. -161 с].

Иммобилизацию липазы на матрице ионообменных волокон осуществляли адсорбционным методом. 1 г предварительно кондиционированных ионообменных волокон в Н-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М фосфатного буфера с рН 5,8. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8 в концентрации 1 мг/мл добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 грамма полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм

Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза трйглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис.к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С.- Воронеж, 2011. - 162 с]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.

Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:

где - количество жирных кислот, мкмоль;

- содержание белка в препарате, мг;

- время гидролиза, мин. Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты отражены на фиг.1-3.

Высокие значение содержания белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя), а также общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот) наблюдались при ее иммобилизации адсорбционным методом на ионообменных волокнах ВИОН АН-1 и ВИОН КН-1 (фиг.1, 2). Однако наибольшую удельную активность показали препараты липазы, иммобилизованной с помощью адсорбционного метода на матрице ВИОН КН-1 (фиг.3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на ионообменном волокне ВИОН КН-1.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на ионообменных волокнах. Способ предусматривает адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; при этом перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии ионообменных волокон ВИОН КН-1 в буфере 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью, расширить число носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы. 3 ил., 1 пр.

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на ионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора, отличающийся тем, что в качестве носителя используют катионообменник ВИОН КН-1, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменных волокон ВИОН КН-1 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и предшествующего ей выдерживания ионообменника используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.