Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе целлюлазы, иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме Российский патент 2025 года по МПК C12N11/02 C12N9/42 

Целлюлаза (КФ 3.2.1.4) - фермент класса гидролаз, расщепляющий β(1,4)-гликозидные связи в целлюлозе с образованием глюкозы или целлобиозы [Sajith S, Priji Р, Sreedevi S, Benjamin S (2016) An Overview on Fungal Cellulases with an Industrial Perspective. J Nutr Food Sci 6: 461. doi:10.4172/2155-9600.1000461].

Промышленное производство целлюлаз предназначено для нескольких применений, таких как бумажная и целлюлозная промышленность, переработка бумаги и удаление краски [Lee K. С.et al. Evaluation of enzymatic deinking of non-impact ink laser-printed paper using crude enzyme from Penicillium rolfsii c3-2 (1) IBRL // Applied biochemistry and biotechnology. - 2017. - Т. 181. - C. 451-463., Pathak P., Bhardwaj N. K., Singh A. K. Production of crude cellulase and xylanase from Trichoderma harzianum PPDDN10 NFCCI-2925 and its application in photocopier waste paper recycling // Applied biochemistry and biotechnology. -2014. - T. 172. - C. 3776-3797]; экстракция и осветление соков, производство добавок и загустителей для пищевой промышленности [Raju P. S., Bawa A. S. Food additives in fruit processing // Handbook of fruits and fruit processing. - 2006. - C. 145-170]; кормов для животных [Sathya Т. A., Khan M. Diversity of glycosyl hydrolase enzymes from metagenome and their application in food industry //Journal of food science. - 2014. - T. 79. - №. 11. - C. R2149-R2156]; разложение остатков для повышения плодородия почвы [Han W., Не М. The application of exogenous cellulase to improve soil fertility and plant growth due to acceleration of straw decomposition // Bioresource Technology. - 2010. - T. 101. - №. 10. - C. 3724-3731] и разработка целлюлозного биоэтанола [Siqueira J. G. W. et al. Current advances in on-site cellulase production and application on lignocellulosic biomass conversion to biofuels: a review //Biomass and Bioenergy. - 2020. - T. 132. - C. 105419].

В активный центр целлюлазы из Aspergillus niger входят Glu160 и Glu267 [Yan J. et al. Functional and structural analysis of Pichia pastoris-expressed Aspergillus niger 1, 4-β-endoglucanase // Biochemical and biophysical research communications. - 2016. - T. 475. - №. 1. - C. 8-12]. Оптимальные условия для осуществления ферментативной реакции - рН 4-5, температура 40-45°С [Mustafa А. Н. et al. Cellulase immobilized on silica coated magnetic nanoparticles for improved stability and reusability // AIP conference proceedings. - AIP Publishing, 2022. - T. 2610. - №. 1.; Okada G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger // Agricultural and biological chemistry. - 1985. - T. 49. - №. 5. - C. 1257-1265.; Hurst P. L. et al. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger // Biochemical Journal. - 1977. - T. 165. - №. l. - C. 33-41].

Области использования иммобилизованных ферментов в промышленности постоянно расширяются, что имеет высокое значение для развития биотехнологических процессов. Одним из основных преимуществ такого подхода является возможность повышения стабильности и времени полужизни ферментов, что позволяет сократить затраты на производство и улучшить качество конечного продукта. Иммобилизация ферментов позволяет создать удобную для конкретного технологического процесса форму биокатализатора. Иммобилизованный фермент обладает высокой устойчивостью к различным условиям производства, что делает его идеальным для применения в различных отраслях промышленности, включая пищевую, легкую и химическую. Благодаря возможности многократного использования иммобилизованных ферментов, процессы производства становятся более эффективными и экономически выгодными. Важным аспектом применения иммобилизованных ферментов является возможность осуществления биотехнологических процессов в условиях высоких температур без потери каталитической активности [Sheldon R. A., van Pelt S. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how // Chemical society reviews. - 2013. - T. 42. - №. 15. - C. 6223-6235].

Правильный выбор носителя является одним из условий успешной иммобилизации фермента. Корректный выбор носителя может значительно увеличить продолжительность активного функционирования фермента, повысить его каталитическую активность и специфичность действия, а также позволяет использовать энзимный препарат многократно. Одним из перспективных типов носителей гидролитических ферментов, которые могут быть использованы для иммобилизации, являются ионообменные материалы [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. - Т. 5, №5. - С. 704-711].

Использование ионообменных носителей имеет множество преимуществ, таких как легкое восстановление носителя, низкая стоимость и высокая доступность носителей данной категории на рынке [Woudenberg-van Oosterom М. et al. Immobilised P-galactosidases and their use in galactoside synthesis //Journal of Molecular Catalysis A: Chemical. - 1998. - T. 134. - №. 1-3. - C. 267-274., Tomotani E. J., Vitolo M. Catalytic performance of invertase immobilized by adsorption on anionic exchange resin //Process Biochemistry. - 2006. - T. 41. -№. 6.-C. 1325-1331].

В целях изучения особенностей взаимодействия целлюлазы с ионообменными матрицами был проведен молекулярный докинг [Холявка М.Г. и др. Изучение in silico особенностей и механизмов адсорбции целлюлазы из Aspergillus niger на синтетических полимерах //Сорбционные и хроматографические процессы. - 2022. - Т. 22. - №. 5. - С. 760-773]. Анализ in silico показал перспективность применения ионообменных материалов в качестве носителей для иммобилизации целлюлазы, однако, в данной работе не были использованы экспериментальные методы исследования для подтверждения расчетных данных.

Ионообменные материалы могут содержать как положительно, так и отрицательно заряженные группы, поэтому они могут быть как катионитами, так и анионитами. [Xiaodi Guo; Rong-Kun Chang; Munir A. Hussain (2009). Ion-exchange resins as drug delivery carriers, 98(11), 3886-3902. doi:10.1002/jps.21706]. Ионообменные волокна обладают рядом преимуществ, включая высокую степень очистки, быструю скорость адсорбции и регенерации, которые превышают аналогичные показатели у сыпучих материалов в 10-15 раз. Они также обладают высокой обменной емкостью, химической стойкостью и способностью сохранять свою эффективность после многократной регенерации. Волокно ВИОН КН-1 является катионообменным, карбоксилсодержащим хемосорбционным слабокислотным материалом со сложной трехмерной структурой. Данный полимер обладает высокой обменной емкостью карбоксильных групп, высокой скоростью адсорбции, устойчивостью к влаге, гидрофильностью и большой поверхностью контакта. Технология производства ВИОН КН-1 хорошо изучена и легко масштабируется на заводах по производству полиакрилонитрильного волокна, что делает его доступным для широкого применения [Peregudov Y. S., Bondareva L. P., Niftaliev S. I. Complete purification of water from metal cation with a fibrous ion exchanger //Physicochemical problems of adsorption, structure, and surface chemistry of nanoporous materials. - 2021. - C. 230-231].

Процедура иммобилизации ферментов на ионообменных носителях довольно проста по сравнению с другими методами иммобилизации. В основном в процесс вовлечены ионные и электростатические взаимодействия между заряженной поверхностью белков и противоположно заряженными ионами волокна. Основным недостатком этого подхода является тот факт, что ферменты могут высвободиться из носителя во время реакции, если значение рН изменится или ионная сила увеличится, поэтому для снижения интенсивности процессов десорбции фермента рекомендуется этап перекрестного сшивания (обычно с глутаровым альдегидом) [Pessela В. С.et al. Immobilization-stabilization of an a-galactosidase from Thermus sp. strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: selection of the optimal immobilization strategy //Enzyme and microbial technology. - 2008. - T. 42. - №. 3. - C. 265-271].

На данный момент на рынок введен ферментный препарат ЦеллоЛюкс®-Е, совмещающий в своем составе целлюлазу, β-глюканазу и ксиланазу. Применяется для повышения усвояемости кормов с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов (пшеница, рожь, ячмень, овес, подсолнечный шрот и жмых, отруби и др.) для моногастричных животных.

Иммобилизация целлюлазы была описана в патенте RU 2388822 С2. Способ заключается в растворении пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10,0, добавлении к фильтрату раствора целлюлазы, с активностью не ниже 50 ед/г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4,0-4,5 при перемешивании, затем выпавшие в осадок частицы, содержащие целлюлазу, отделяют и высушивают.

Однако в предложенном методе в качестве носителя для иммобилизации была выбрана карбоксиметилцеллюлоза, которая может деградировать под действием целлюлазы.

Существует метод иммобилизации, описанный в SU 925108 А1, заключающийся в прибавлении к носителю раствора целлюлазы в ацетатном буфере со значением рН 4,8. После инкубации раствор фильтруют. Промывку осуществляют троекратно 1 М раствором NaCl и двукратно ацетатным буфером. Отличительной особенностью метода является использование в качестве полимерного носителя хитина, активированного n-бензохиноном.

Предложенный метод подразумевает связывание фермента с носителем ковалентными связями, что может существенно повлиять на конформацию фермента и его активность. Кроме того, n-бензохинон, использующийся для активации хитина, является токсичным веществом, что ограничивает применение созданного гетерогенного биокатализатора.

В патенте RU 2634239 С2 описан способ повышения стабильности целлюлазы путем создания композиции, включающей следующие компоненты: целлюлаза, полимер (полимеры) для контроля примесей, причем полимер для контроля примесей может представлять собой катионный фиксирующий полимер (полимеры), антиклейкий полимер (полимеры) и их смеси, стабилизатор белка-целлюлазы и усилитель активности целлюлазы.

Однако данный способ технически сложен, что может оказать значительное влияние на воспроизводимость результатов и стоимость итогового катализатора.

Патент US 3915797 А содержит информацию о создании водонерастворимых анионообменных матриц путем кватернизации пиридиновых колец сополимеров винилпиридина или его производных и использовании в качестве матрицы для иммобилизации. Другой важной характеристикой является тот факт, что фермент и носитель связаны путем не просто ионной адсорбции, а с образованием ковалентной связи, так как изобретение опирается на сополимеры, использующие винилпиридин или его производные в качестве основного компонента.

Тем не менее, сам синтез соединений является трудоемким, что может негативно сказываться на масштабировании данного процесса, тогда как предлагаемый нами способ предполагает адсорбцию ферментов на коммерчески доступных носителях, что позволит легко масштабировать процесс.

В патенте CN 101555473 А был описан метод иммобилизации целлюлазы на полимерном носителе Eudragit L-100. Eudragit L-100 диспергируют в дистиллированной воде, рН регулируют до значения 11.0 с помощью 2 М NaOH. После полного растворения значение рН доводят до 6,5 с помощью 2М HCl. Затем раствор Eudragit L-100 с рН 6,5 активируют последовательным добавлением активаторов EDC и NHS с последующей инкубацией 30 мин при комнатной температуре. Затем в раствор носителя добавляют фермент и инкубируют в течение 3-6 часов при комнатной температуре при медленном перемешивании. После этого значение кислотности раствора доводят до 3,6 с помощью 3 М уксусной кислоты. Полученный раствор центрифугируют. Супернатант удаляют, а осадок растворяют в ацетатном буфере с рН 5,5.

В публикации Joshi N. et al. [Faujasite Na-X zeolite as a novel carrier for cellulase immobilization and application in biomass saccharification // Biochemical Engineering Journal. - 2023. - T. 198. - C. 109017] был описан способ иммобилизации целлюлазы на матрице цеолита путем ковалентного связывания с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. К 0,3 г суспензии активированного носителя в 2 мл цитратного буфера (0,05М, рН 4,8) добавляют 3 ед. фермента целлюлазы и оставляют на ночь при 10°С при постоянном встряхивании со скоростью 150 об/мин. После инкубации суспензию центрифугируют при 6000. Осадок дважды промывают цитратным буфером для удаления несвязавшегося фермента.

В патенте RU 2602901 С2 предлагается способ использования субстрата, содержащего соединения, предназначенные для иммобилизации функциональных молекул. Каждое соединение содержит цепочку, включающую функциональную группу, связанную с субстратом. При этом субстрат содержит дополнительную эпоксид со держащую группу, соединенную с цепочкой. Плотность эпоксидсодержащих групп, способных вступать в реакцию с функциональной молекулой, увеличивается, и, следовательно, количество точек иммобилизации, доступных для иммобилизации вещества, также увеличивается.

Способы, предложенные в данных публикациях основаны на связывании фермента с предварительно активированной подложкой с помощью ковалентных связей, что может вызвать затруднения при необходимости освободить фермент из матрицы, в то время как предлагаемый нами способ позволит избежать данной проблемы благодаря использованию иммобилизации с помощью адсорбционных сил.

В работе Daoud F., Kaddour S., Sadoun Т. Immobilization of Aspergillus niger cellulase on ionic exchangers-isothermal and kinetic studies //Journal of the Algerian Chemical Society/Journal de Societe Algerienne de Chimie. - 2009. - T. 19. - №. 2 был описан метод иммобилизации целлюлазы. В работе были использованы ионообменные смолы Amberlite IRA 400 и Amberlite IRC 50. Перед использованием смолу сначала промывали дистиллированной водой, затем активировали 1 М раствором соляной кислоты и 1 М раствором гидроксида натрия для анионной смолы и 1 М раствором гидроксида натрия и 1 М раствором соляной кислоты для катионной смолы, а затем снова промывали дистиллированной водой и буфером с заданным значением рН - фосфатным буфером для анионной смолы и ацетатным буфером для катионной смолы. Иммобилизацию целлюлазы на ионообменных смолах Amberlite IRA 400 и Amberlite IRC 50 проводили путем инкубирования 10 мл раствора фермента с 0,5 г сухой смолы при перемешивании суспензии. После этого иммобилизованный препарат фильтровали и промывали теми же буферными растворами. Концентрация раствора фермента составила 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 3 г/л.

Недостатком предложенного способа является возможная неполная отмывка смол от примесей и от несвязанной целлюлазы. Заявляемое изобретение включает только иммобилизованную целлюлазу и полностью отмытую от ее неиммобилизованной формы. В предлагаемом нами методе подготовка ионообменных смол осуществляется троекратно в повышающихся концентрациях растворов соляной кислоты и гидроксида натрия с промежуточным промыванием дистиллированной водой для наиболее полного очищения от возможных примесей. Также предлагаемый способ позволяет увеличить количество циклов ферментативного катализа иммобилизованной целлюлазы до 7 циклов. Кроме того, в публикации описаны свойства ионообменных смол, которые уступают волокнам по скорости сорбции и осмотической стабильности, что делает их менее эффективными для применения в условиях многократного смачивания и высыхания, например, при циклических процессах сорбции-регенерации, что особенно важно в отношении целлюлазы, применяемой в циклах производства биотоплива [Varshney D. Synthetic ion exchange materials and their analytical applications: past, present and future //Solid State Phenomena. - 2003. - T. 90. - C. 445-450].

В качестве прототипа был использован метод, описанный в работе Taha A. S. J. [Different methods and carriers for immobilization cellulase from Trichoderma viride and its remaining activity // Pharmaceutical & Biological Evaluations. - 2017. - T. 4. - C. 9-13]. В качестве носителей для иммобилизации использовались ионообменные волокна ВИОН КН-1 и ионообменные смолы АМ-21-А, которые были кондиционированы и переведены в нужную форму. Согласно методу, 5 г носителя оставляли на ночь при комнатной температуре в 50 мл ацетатного буфера (рН 4,5). Затем к суспензии добавляли 5 мл фермента и перемешивали с помощью электрической мешалки в течение 1,5 часов при 25°С, а затем центрифугировали в течение 5 минут.

Также была осуществлена ковалентная иммобилизация с помощью глутарового альдегида. 2,5 г смолы с 20% раствором глутарового альдегида в соотношении 1:1 были оставлены на ночь при комнатной температуре в закрытой емкости. После этого носитель промывали дистиллированной водой, добавляли 2,5 мл раствора фермента (рН 4,5) и инкубировали в течение суток в закрытом сосуде. Иммобилизованный препарат, полученный в ходе сорбции и ковалентной иммобилизации, промывали ацетатным буфером до отсутствия белка в промывных водах.

Для усиления каталитической активности целлюлазы также был использован модифицированный глутаральдегидный метод. Опыт проводили по следующей методике: к 2 г анионита добавляли 45 мл 4%-ного раствора янтарного ангидрида в хлороформе и кипятили с обратным холодильником в течение 4,5 часов, далее смесь инкубировали еще 16 часов при комнатной температуре. Смолу промывали хлороформом и сушили на воздухе, затем добавляли 10 мл тионилхлорида, и кипятили с обратным холодильником в течение 30 минут. К промытому толуолом и высушенному носителю по каплям добавляли 20 мл этилендиамина, поддерживая температуру 20°С, и смесь выдерживали 20 часов, промывали 10 раз дистиллированной водой, 5 раз - раствором аммиака (3%), а затем - водой. К ионообменнику добавляли 10 мл раствора глутарового альдегида (2%) и перемешивали магнитной мешалкой в течение 3 часов при 50°С. Смолу отделяли от раствора и промывали. Активность фермента определяли с помощью спектрофотометра по методу Мандельса и соавт.

Недостатком предложенного способа является тот факт, что автором был использован метод ковалентной иммобилизации, следствием которого является прочное связывание и невозможность отделить фермент от носителя для повторного использования. Кроме того, ковалентная модификация вызывает стерические затруднения и, как следствие, сниженную активность. Также автор не использует метод диализа для исключения влияния неиммобилизованного фермента на общий результат. В результате измерений и последующих вычислений активность иммобилизованной целлюлазы при использовании методов адсорбции, ковалентной иммобилизации и модифицированного метода составила 35, 55, 75% процентов от активности неиммобилизованной (свободной) целлюлазы, соответственно. При описании адсорбционного метода иммобилизации целлюлазы авторы не указывают используемые ими концентрации фермента и соотношение фермент:носитель. Мы же в свою очередь подобрали оптимальное для данной целлюлазы соотношение фермент.носитель - 200 мг целлюлазы на 1 г ионообменного волокна.

В предлагаемой нами методике описан способ иммобилизации с помощью адсорбции на поверхности носителя, что предотвращает значительные конформационные изменения молекулы целлюлазы. Также в предлагаемом способе биокатализатор промывается с помощью диализа в целлофановом мешочке с диаметром пор 25 кДа, что исключает влияние несвязавшейся целлюлазы на значения каталитической активности иммобилизованного препарата.

Кроме того, одним из ключевых отличий от прототипа является использование целлюлазы из другого продуцента, причем промышленно доступной, т.е. коммерческого препарата, а именно: в заявляемом изобретении предлагается применять целлюлазу из Aspergillus niger, в прототипе - из Trichoderma viride. По результатам сравнения в программе Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) целлюлаза из Aspergillus niger структурно (по аминокислотной последовательности) существенным образом отличается от всех пяти ферментов из базы NCBI (National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), проявляющих целлюлазную активность: их номера в базе следующие: АСХ42576.1 (https://wwvv.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACX42576.1, ACZ06578.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACZ06578.1), АСС59774.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACC59774.1) Q76FP5.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q76FP5.1), Р19355.2 (https.V/www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P19355.2).

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении на основе целлюлазы, выделенной из Aspergillus niger, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора, способного эффективно проводить катализ до 6 циклов включительно, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) целлюлазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, с удельной активностью 61% от исходной активности свободной целлюлазы, что выше, чем в прототипе, в котором при сорбционной иммобилизации сохраняется лишь 35% активности целлюлазы, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с высокими скоростями.

Иммобилизация в большинстве случаев приводит к снижению каталитической активности фермента, но при этом переводит фермент из разряда гомогенных растворимых катализаторов в разряд гетерогенных со всеми вытекающими отсюда технологическими преимуществами: 1) возможность отделить ферментный препарат от реакционной среды, получить продукт, не загрязненный энзимом; 2) остановить реакцию в любой момент времени; 3) использовать катализатор повторно; 4) проводить процесс катализа непрерывно (например, в проточных реакторах); 5) регулировать скорости катализируемой реакции (или выход продукта); 6) перспектива изменять свойства фермента: его специфичность (особенно в отношении макромолекулярных субстратов), зависимость активности от рН среды; 7) стабильность к денатурирующим воздействиям и долговечность препарата; 8) упрощение и удешевление производственных циклов. Значительны также и экологические преимущества иммобилизованных ферментных препаратов: сокращаются количество отходов, а также число «нестандартных» операций, например, когда из-за нестерильности среды большие объемы кулыуральной жидкости сливаются в канализацию [Биотехнология. В 8 кн. // под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. - Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов, Н.С. Егоров, К. Мартинек, В.В. Можаев, В.Д. Самуилов, Ю.Л. Хмельницкй. - М.: Высш. шк., 1987. - 159 с.; Биотехнология: теория и практика. Учебное пособие для вузов. / Н.В. Загоскина [и др.] - М.: Оникс, 2009. - 496 с.; Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак - М.: Мир, 2002. - 589 с.; Егорова Т.А. Основы биотехнологии / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. - М.: Академия, 2006. - 207 с.].

Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе целлюлазы, иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающем выдерживание катионообменного волокна ВИОН КН-1 в Н-форме в течение 12 ч при комнатной температуре в 0,1 М ацетатном буферном растворе с рН=4,5, адсорбционную иммобилизацию целлюлазы в 0,1 М ацетатном буферном растворе с рН=4,5 на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме в процессе инкубации целлюлазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение 1,5 часов, отделение внешнего раствора от целлюлазы, иммобилизованной на катионообменнике, центрифугированием в течение 5 минут, промывку образовавшегося биокатализатора; согласно изобретению, перед иммобилизацией целлюлазы, выделенной из Aspergillus niger, катионообменник в Н-форме выдерживают в 0,1 М ацетатном буферном растворе, из расчета, что на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, отделяют волокно от буфера декантацией, а затем иммобилизацию ведут путем добавления к 1 г, выдержанного в буфере, катионообменного волокна 20 мл раствора целлюлазы в 0,1 М ацетатном с рН=4,5 буфере в концентрации целлюлазы 10 мг/мл, затем осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной на катионобменнике целлюлазы проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин и последующей декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной целлюлазы.

Фиг. 1. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль) препаратов целлюлазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменном волокне.

Фиг. 2. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах целлюлазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменном волокне.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах целлюлазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменном волокне.

Фиг. 4. Динамика изменения значений активности иммобилизованной целлюлазы в зависимости от количества проведенных циклов гидролиза. Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования была выбрана целлюлаза, выделенная из Aspergillus niger фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служила карбоксиметилцеллюлоза («Sigma-Aldrich»). В качестве носителей для иммобилизации было рассмотрено ионообменное волокно ВИОН КН-1 (ООО «ЛИРСОТ»).

Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменного волокна помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем волокна в нарастающей концентрации 0,5-3,0 М до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали волокно дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0,1-0,25 М, после которой волокно отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в Н-форму [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - №6 - С. 31-42].

Иммобилизация целлюлазы осуществлялась адсорбционным методом. К 1 г катионообменного волокна, предварительно кондиционированного и переведенного в Н-форму, добавлялось 20 мл 0,1 М ацетатного буфера с рН 4,5, после чего образцы инкубировались 12 ч при комнатной температуре. Затем лишняя жидкость отбиралась декантацией, и к выдержанному в буфере волокну добавлялось 20 мл раствора целлюлазы в 0,1 М ацетатном буфере с рН 4,5 в концентрации 10 мг/мл. Полученная суспензия перемешивалась на электрической мешалке на протяжении 1,5 ч со скоростью 250 об/мин при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной целлюлазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.

Содержание белка в иммобилизованных препаратах целлюлазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Определение каталитической активности целлюлазы проводили по динитросалициловому реактиву (ДНС-реактиву) [Miller G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar //Analytical chemistry. - 1959. - T. 31. - №. 3. - C. 426-428]. Реакционную смесь объемом 500 мкл, содержащую 50 мг препарата и 500 мкл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,5, инкубировали 20 минут при температуре 37°С в присутствии 500 мкл 1% карбоксиметилцеллюлозы в качестве субстрата. Остановка реакции проводилась добавлением 1 мл динитросалицилового реактива и последующей инкубацией образцов 5 мин при 90°С. Такая высокая температура необходима для развития стабильной красно-коричневой окраски, связанной с восстановлением динитросалициловой кислоты до 3-амино-5-нитросалициловой кислоты в присутствии редуцирующих Сахаров. Количество редуцирующих Сахаров определялось спектрофотометрически (UV-2401PC, Shimadzu, Япония) при длине волны 540 нм по калибровочному графику, построенному по глюкозе.

1%-ный ДНС-реактив готовили следующим образом: 2,5 г ДНС растворяли в 150 мл воды, затем добавляли 4 г NaOH, дожидались полного растворения веществ. После этого к раствору добавлялась сегнетова соль (калий-натрий виннокислый) в количестве 75 г, и раствор доводился до 250 мл [Coughlan М. P., Moloney А. P. Isolation of 1, 4-β-d-glucan 4-glucanohydrolases of Talaromyces emersonii // Methods in enzymology. - Academic Press, 1988. -T. 160. - C. 363-368].

Активность целлюлазы выражали в мкмоль редуцирующих Сахаров, выделившихся в результате гидролиза карбоксиметилцеллюлозы за 1 мин в расчете на 1 мг белка.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты отражены на фиг. 1-3. На фиг. 1 отображены значения общей каталитической активности целлюлазы - свободной (принята за 100%) и иммобилизованной на ионообменном волокне ВИОН КН-1. Фиг. 2 демонстрирует значение содержания белка в указанном препарате, которое составило 13% от общего количества целлюлазы, использованной для иммобилизации (принято за 100%). На фиг. 3 указаны значения удельной ферментативной активности препаратов целлюлазы, полученные путем деления значений общей каталитической активности на значения белка в пробе, мг. Значение для препаратов целлюлазы, иммобилизованной на волокне ВИОН КН-1, составило 61% от удельной активности свободного фермента (принята за 100%). Результаты измерения каталитической активности свидетельствуют об успешной иммобилизации целлюлазы на представленном носителе.

Фиг. 4 демонстрирует стабильность ферментного препарата в зависимости от количества проведенных циклов катализа. Значение активности целлюлазы в первом цикле принята за 100%. Иммобилизованная целлюлаза способна эффективно проводить катализ до 6 циклов включительно.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе целлюлазы, выделенной из Aspergillus niger и иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающий выдерживание катионообменника в 0,1 М ацетатном буферном растворе, отделение волокна от буфера декантацией и добавление к 1 г выдержанного в буфере катионообменного волокна 20 мл раствора целлюлазы в концентрации 10 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере с рН=4,5, затем инкубируют при перемешивании, отделяют внешний раствор от иммобилизованной на катионобменнике целлюлазы центрифугированием с последующей декантацией внешнего раствора. Промывают биокатализатор двукратно с помощью диализа в целлофановом мешочке с диаметром пор 25 кДа до отсутствия в растворе целлюлазы. Изобретение обеспечивает повышение удельной активности препаратов иммобилизованной целлюлазы. 4 ил.

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе целлюлазы, иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающий выдерживание катионообменного волокна ВИОН КН-1 в Н-форме в течение 12 ч при комнатной температуре в 0,1 М ацетатном буферном растворе с рН=4,5, адсорбционную иммобилизацию целлюлазы в 0,1 М ацетатном буферном растворе с рН=4,5 на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме в процессе инкубации целлюлазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение 1,5 ч, отделение внешнего раствора от целлюлазы, иммобилизованной на катионообменнике, центрифугированием в течение 5 мин, промывку образовавшегося биокатализатора, отличающийся тем, что перед иммобилизацией целлюлазы, выделенной из Aspergillus niger, катионообменник в Н-форме выдерживают в 0,1 М ацетатном буферном растворе из расчета, что на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, отделяют волокно от буфера декантацией, а затем иммобилизацию ведут путем добавления к 1 г выдержанного в буфере катионообменного волокна 20 мл раствора целлюлазы в 0,1 М ацетатном с рН=4,5 буфере в концентрации целлюлазы 10 мг/мл, затем осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной на катионобменнике целлюлазы проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин и последующей декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5 из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной целлюлазы.