Способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии и набор тестов для его реализации Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской генетике и может быть использовано в онкологии для определения чувствительности опухоли к воздействию радиотерапии.

Более 95% случаев злокачественных новообразований головы и шеи приходится на плоскоклеточную форму рака гортани (РГ). Одним из основных методов его лечения является радиационная терапия [Рожнов В.А., Андреев В.Г., Гордон К.Б., Гулидов И.А., Акки Э.Д. Современные методы лечения рецидивного неоперабельного плоскоклеточного рака гортани (Обзор литературы). Сибирский онкологический журнал. 2016; 15(2): С. 90]. Однако при появлении рецидива чувствительность клеток опухоли к осуществляемому лечению существенно снижается. Постлучевой фиброз мягких тканей шеи провоцирует нарушение кровообращения, что негативно влияет на чувствительность опухоли к терапии [Choe K.S., Haraf D.J., Solanki A., Cohen Е.Е., Seiwert T.Y., Stenson K.M., Blair E.A., Portugal L., Villaflor V.M., Witt M.E., Vokes E.E., Salama J.K. Prior chemoradiotherapy adversely impacts outcomes of recurrent and second primary head and neck cancer treated with concurrent chemotherapy and reirradiation // Cancer. 2011. Vol. 117 (20). P. 4672]. Поэтому на результат лучевой терапии большое влияние оказывает первоначальная чувствительность опухолевых клеток. Данные о резистентности опухоли позволят своевременно скорректировать тактику проводимого лечения.

Одним из способов определения чувствительности опухоли основан на гистологическом исследовании биоптата. Как правило, забор пробы осуществляют после проведения четвертого сеанса лучевой терапии, которая проводится дробно-протяженным методом [Патент РФ 2349916 С1, опубликован: 20.03.2009, Бюл. N 8]. Если обнаружен патоморфоз III-IV степени, то опухоль имеет высокую степень чувствительности к облучению. Наличие патоморфоз I-II степени показывает, что опухоль является радиорезистентной. Данный способ делает возможным прогнозирование резистентности опухоли в ранние сроки, что позволяет при обнаружении ее устойчивости к лучевой терапии своевременно прибегнуть к операции. Недостаток данного способа заключается в отсутствие возможности определить чувствительность опухоли к радиотерапии до ее начала.

Известно, что первичные изменения при воздействии облучения приходятся на ДНК клетки. Такие повреждения запускают каскад реакций, которые вызывают апоптоз, остановку клеточного цикла и репарацию ДНК. Данные процессы контролируются работой сотни генов [Menendez D., Inga A., Resnick М.А. 2010. Potentiating the р53 network. Discovery medicine. 10(50): P 94]. Способ по определения чувствительности опухолей к лучевой терапии на основании изменений копийности генов обладает высокой чувствительностью и специфичностью [Патент РФ RU 2728428 C1 по МПК C12Q 1/686, G01N 33/00, опубл. 2020 г.]. Регистрация результатов занимает от 4-5 часов и производится в конце исследования. Недостаток данного способа заключается в том, что основная роль в клеточном ответе на стрессовое воздействие принадлежит эпигенетическим модификациям генома, а именно изменениям экспрессии микроРНК [Mendell J.T., Olson E.N. 2012. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148(6): P1174.].

Предполагаемое изобретения направлено на решение задачи повышения точности и достоверности оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к воздействию облучения.

Заявляется способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии, включающий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий определить уровень экспрессии микроРНК, который описывают протоколами подготовки проведения ПЦР и полученных результатов, причем проведение ПЦР включает приготовление раствора с использованием набора, включающего пробирку со смесью лиофилизированных 22 праймеров для 11 микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом, а протокол ПЦР включает в себя программу амплификации: 1 цикл предварительной денатурации ДНК при 95°С, длительностью 300 с; 35 циклов денатурации при 95°С, длительностью 10 с; 35 циклов отжига праймеров при 60°С по 20 с. каждый; 35 циклов элонгации при 72°С длительностью 10 с, протокол полученных результатов включает в себя описание подобранных для 11 микроРНК 11 пар праймеров - прямого и обратного, при этом к указанным 11 микроРНК отнесены hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, где вывод о наличии резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии делается на основе изменений в экспрессии данных микроРНК.

2. Набор реагентов для оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии, включающий пробирку со смесью лиофилизированных 22 праймеров для 11 микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со смесью random-праймеров пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном изобретении, изложенных в формуле изобретения.

Оценку резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии проводили следующим образом.

Для проведения анализа используем методом полимеразной цепной реакции, который позволяет обеспечить выделение тотальной РНК из биологического материала пациента. Принцип выделения РНК основан на кислой фенольной экстракции по Хомчинскому [Chomczynski, Piotr & Sacchi, Nicoletta. (1987). Single-Step Method Of RNA Isolation By Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chlorform Extraction. Analytical biochemistry. 162. 156-9.10.1006/abio.1987.9999]. Выделенную тотальную РНК используют в качестве матрицы для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в процессе обратной транскрипции по стандартному протоколу.

Приготовление раствора для проведения ПЦР проводится в микроцентрифужной пробирке. Количество пробирок рассчитывается из количества исследуемых образцов плюс один положительный и один отрицательный контроль. Лиофилизорованные праймеры предварительно ресуспендируются в 50 мкл очищенной воды. В пробирке смешиваются 4 мкл 2,5 х реакционной смеси, 0,5 мкл смеси праймеров, 0,4 мкл 25 тМ MgCl₂, 3 нг исследуемого образца (для положительного контроля добавляется 3 нг образца, для отрицательного контроля в пробирку ничего не добавляется). Раствор доводится до объема 20 мкл очищенной водой после чего добавляют 10 мкл минерального масла. Пробирки с растворами помещаются в ДНК-амплификатор. Для проведения ПЦР разработана следующая программа амплификации: 1 цикл предварительной денатурации ДНК при 95°С, длительностью 300 с; 35 циклов денатурации при 95°С, длительностью 10 с; 35 циклов отжига праймеров при 60°С по 20 с; 35 циклов элонгации при 72°С длительностью 10 с.

МикроРНК отобраны на основе динамики их экспрессии при помощи высокопроизводительной системы секвенирования MiSeq System (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Система по завершению работы предоставляла файлы FASTQ, данные которых обрабатывались с использованием сервисов GenXPro omiRas.

Экспрессию микроРНК определяли по log2fc отношению сумм нормализованных экспрессий микроРНК в эксперименте к контрольному значению. Подобран индивидуальный порог, который позволяет определить чувствительность к воздействию облучения ионизирующего излучения. Интервал от -1 до 1 (при p<0.05) идентифицируется, как норма. Остальные значения являются признаком повышенной/заниженной экспрессии.

Доказано, что радиорезистентность является комплексным явлением и связано не только с изменением экспрессии генов и мутациями, но также и с изменениями в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов на уровне микроРНКома. У больных плоскоклеточным раком горла с плохим прогнозом течения заболевания обнаружена повышенная концентрация в плазме крови и сверхэкспрессия в образцах ткани следующих микроРНК: hsa-miR-128-3р, hsa-miR-16-5р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-371a-5p; и сниженная концентрация следующих микроРНК: hsa-let-7e-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-203a, hsa-miR-24-3р, hsa-miR-324-3р, hsa-miR-93-3р в сравнении с группой здоровых пациентов и группой онкологических больных с благоприятным прогнозом течения заболевания. Нарушения в экспрессии микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-16-5р, hsa-miR-20а-5р, hsa-miR-210, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-371a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-203a, hsa-miR-24-3р, hsa-miR-324-3р, hsa-miR-93-3р может влиять на радиорезистентность раковых клеток через разрегулированние следующих сигнальных путей: EGFR, PI3K / АКТ, NF-kB, RAS-MAPK, TGF-P и JAK-STAT, ATM, IL8 / АКТ, PTEN, WNT2B, а также отдельных белковых молекул NDFIP1, RHEB и PPP2R5A. На основе полученных данных отобраны ключевые микро-РНК (hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p).

Нуклеотидные последовательности исследуемых генов взяты из банка данных нуклеотидных последовательностей Американского Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).

Таким образом, предложенное изобретение обеспечивает возможность проведения анализа резистентности опухоли плоскоклеточного РГ по уровню экспрессии 11 микроРНК (hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5р. hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p), используя любой доступный метод регистрации результата. Используя тест можно зарегистрировать интенсивность экспрессии ключевых микроРНК, что позволит сказать о наличии/отсутствии устойчивости опухоли РГ к радиотерапии. Тем самым повышается точность и достоверность оценки резистентности опухоли плоскоклеточного РГ к воздействию облучения.

Вышеизложенное описание свидетельствует о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:

- средство, воплощающее заявленное изобретение, при его осуществлении относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано в онкологии;

- для заявленного генетического теста в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов;

- средство, воплощающее заявленное изобретение при осуществлении, способно обеспечить повышение точности и достоверности оценки резистентности опухоли плоскоклеточного РГ к воздействию облучения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии. Способ включает метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий определить уровень экспрессии микроРНК, который описывают протоколами подготовки проведения ПЦР и полученных результатов. Проведение ПЦР включает приготовление раствора с использованием набора, включающего пробирку со смесью лиофилизированных 22 праймеров для 11 микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p. Технический результат заключается в повышении точности и достоверности оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к воздействию облучения. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии, включающий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий определить уровень экспрессии микроРНК, который описывают протоколами подготовки проведения ПЦР и полученных результатов, причем проведение ПЦР включает приготовление раствора с использованием набора, включающего пробирку со смесью лиофилизированных 22 праймеров для 11 микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом, а протокол ПЦР включает в себя программу амплификации: 1 цикл предварительной денатурации ДНК при 95°С, длительностью 300 с; 35 циклов денатурации при 95°С, длительностью 10 с; 35 циклов отжига праймеров при 60°С по 20 с. каждый; 35 циклов элонгации при 72°С длительностью 10 с, протокол полученных результатов включает в себя описание подобранных для 11 микроРНК 11 пар праймеров - прямого и обратного, при этом к указанным 11 микроРНК отнесены hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, где вывод о наличии резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии делается на основе изменений в экспрессии данных микроРНК.

2. Набор реагентов для оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии, включающий пробирку со смесью лиофилизированных 22 праймеров для 11 микроРНК hsa-miR-128-3р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-34c-5p, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом.