ВАКЦИНА ПРОТИВ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПАТОГЕНА, НЕ СОДЕРЖАЩАЯ СЫВОРОТКИ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/02 

Область Техники

Настоящее изобретение относится к вакцине, более конкретно к вакцинам для рыб. Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей антиген внутриклеточного патогена. Настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, которые содержат мало или по существу не содержат альбумин или сыворотку. Настоящее изобретение также относится к предотвращению или уменьшению деформаций позвоночника в форме «вышивка крестом» у животных за счет использования вакцин, содержащих антиген внутриклеточного патогена и содержащих мало или совсем не содержащих альбумин или сыворотку.

Уровень техники

Пороки развития позвоночника возникают у рыб в условиях разведения, а также у диких особей, и были признаны проблемой еще в 1981 году. Деформации позвоночника распознаются у индивидуумов с аномальной формой тела, часто более короткой и более сжатой, чем обычно, и с появлением горба. Часто возникновение полностью не распознается до размера вылова, поскольку серьезность повреждений, по-видимому, увеличивается во время выращивания в морской воде. Эта проблема наносит экономический ущерб рыбоводам и может также нанести ущерб благополучию животных. Рыбы с деформациями позвоночника, такие как лосось, форель, треска, палтус, морской окунь и морской лещ, плавают неэффективно, менее способны добывать пищу, подвергаются большему риску нападения хищников и более восприимчивы к физиологическому дисбалансу, в дополнение к занижению сортности при убое. Также деформированная рыба может вызвать технические проблемы с оборудованием для филетирования.

Деформации костей могут появляться как на ранних, так и на поздних стадиях жизни, и было высказано предположение, что это состояние имеет многофакторную этиологию. Было показано, что факторы окружающей среды, такие как высокая температура во время инкубации икры и в фазе пресной воды, могут вызывать деформации позвоночника. Пищевые и микробные факторы также были связаны с пороками скелета у различных видов рыб. Указание на то, что вакцины представляют собой фактор риска развития деформаций позвоночника, было впервые дано в эпидемиологическом исследовании в 1998 году, но небольшое количество групп, доступных для сравнения, ограничивало какие-либо достоверные выводы.

Существуют разные типы пороков развития позвоночника, которые можно отличить друг от друга с помощью рентгена. Наиболее заметной особенностью на рентгенограммах тел позвонков лосося является рентгеноконтрастная симметричная X-образная структура. Позвоночные столбы без признаков деформации показывают гомогенную форму и размер тел позвонков по всему позвоночнику (см. фиг. 1А). Witten et al. (Aquaculture 295 (2009), p6-14) выделяют 20 различных типов деформаций. В некоторых случаях межпозвонковое пространство уменьшается при слиянии позвонков или без него, или межпозвонковое пространство увеличивается. В других случаях позвонки сдавлены и могут измениться по форме. Кроме того, позвонки могут срастаться до некоторой степени или полностью. Кроме того, один или более позвонков могут смещаться по вертикали. При определенной деформации позвоночника межпозвонковое пространство полностью разрушается, и это также известно как «позвонки в форме вышивки крестом», см., например, фиг. 1B.

Целью настоящего изобретения является уменьшение деформаций позвоночника у животных, предпочтительно рыб. Другой целью изобретения является снижение частоты и/или тяжести состояния позвонков в форме «вышивки крестом», особенно у рыб.

Неожиданно было обнаружено, что одна или более целей могут быть достигнуты с помощью вакцинной композиции, содержащей небольшое количество или даже по существу не содержащей белка альбумина. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что одна или более целей могут быть достигнуты с помощью вакцинной композиции, содержащей низкое количество или даже по существу не содержащей сыворотки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 5% об./об. сыворотки.

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 5% об./об. сыворотки, и где патоген представляет собой вирус, внутриклеточную бактерию или внутриклеточный паразит.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 0,5 г/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л нативного альбумина.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточный патоген представляет собой вирус. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления патоген представляет собой вирус рыбы, предпочтительно, патоген представляет собой вирус лосося. Соответственно, вирус по изобретению и/или по его вариантам осуществления может быть выбран из группы, содержащей альфа-вирус лосося (SAV), иридовирус леща Красного моря (RSIV), вирус инфекционного гемопоэтического некроза (IHNV), вирус вирусной геморрагической септицемии (VHSV), вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), вирус проточного сома (CCV), вирус весенней виремии карпа (SVCV), вирус нервного некроза (NNV), вирус геморрагического заболевания у белого амура (GCHDV), вирус озера тилапия (TLV), морской аквабирнавирус (MABV), вирус эпизоотического гемопоэтического некроза (EHNV), реовирус рыб (PRV) и вирус кардиомиопатии (CMV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцинная композиция не содержит вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления патоген представляет собой альфа-вирус лосося (SAV).

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточной бактерии, где композиция содержит менее чем 5% об./об. сыворотки.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточной бактерии, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточной бактерии, где композиция содержит менее чем 0,5 г/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточной бактерии, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л нативного альбумина.

Подходящая внутриклеточная бактерия выбрана из группы, содержащей Piscirickettsia, Franciscella, Chlamidia, Rickettsia, Coxiella. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточная бактерия представляет собой внутриклеточную бактерию рыб. Подходящая внутриклеточная бактерия выбрана из группы, содержащей Piscirickettsia и Franciscella. Подходящей внутриклеточной бактерией является Piscirickettsia salmonis, или Francisella philomiragia, или Francisella tularensis.

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного паразита, где композиция содержит менее чем 5% об./об. сыворотки.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного паразита, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного паразита, где композиция содержит менее чем 0,5 г/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного паразита, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л нативного альбумина.

Подходящий внутриклеточный паразит выбран из группы, содержащей Apicomplexa, Microsporidia и Trypanosoma. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточный паразит представляет собой Apicomplexa или Microsporidia. Подходящие простейшие представляют собой Coccidia, Cryptosporidia Octosporella и Isospora.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,8 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,05 г/л, более предпочтительно менее чем 0,01 г/л альбумина.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, более предпочтительно менее чем 10 мг/л, даже более предпочтительно менее чем 1 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,1 мг/л, даже более предпочтительно менее чем 50 мкг/л, более предпочтительно менее чем 10 мкг/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,8 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,05 г/л, более предпочтительно менее чем 0,01 г/л нативного альбумина.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 4% (об./об.) сыворотки, более предпочтительно менее чем 3% (об./об.) сыворотки, более предпочтительно менее чем 2,5% ( об./об.) сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 2% (об./об.) сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 1,5% (об./об.) сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 1,2% (об./об.) сыворотки, более предпочтительно менее чем 1% (об./об.) сыворотки, более предпочтительно менее чем 0,8% (об./об.) сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,5% (об./об.) сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 0,4% (об./об.) сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,3% (об./об.) сыворотки, более предпочтительно менее чем 0,2% (об./об.) сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 0,1% (об./об.) сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,05% (об./об.) сыворотки.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления сыворотку получают из источника из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овцы, курицы, козы, лошади, ягненка, новорожденного теленка, свиньи, кролика. Сыворотка может быть модифицирована.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления сыворотка представляет собой фетальную телячью сыворотку, фетальную бычью сыворотку или сыворотку новорожденного теленка.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, для использования для предотвращения, лечения или уменьшения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном, и для предотвращения, избежания или снижения частоты возникновения деформации позвоночника в форме «вышивки крестом» у животного, где композиция содержит менее чем 5% об./об. сыворотки.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, для использования для предотвращения, лечения или уменьшения заболевания, вызываемого внутриклеточным патогеном, и для предотвращения, избежания или снижения частоты возникновения деформации позвоночника в форме «вышивки крестом» у животного, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л альбумина.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, для использования для предотвращения, лечения или уменьшения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном, и для предотвращения, избежания или снижения частоты возникновения деформации позвоночника в форме «вышивки крестом» у животного, где композиция содержит менее чем 0,5 г/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, для использования для предотвращения, лечения или уменьшения заболевания, вызываемого внутриклеточным патогеном, и для предотвращения, избежания или снижения частоты возникновения деформации позвоночника в форме «вышивки крестом» у животного, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л нативного альбумина.

Животное предпочтительно представляет собой рыбу. Внутриклеточный патоген предпочтительно представляет собой патоген рыб. Внутриклеточный патоген предпочтительно представляет собой альфа-вирус лосося (SAV).

Подробное описание изобретения

Подписи к чертежам

Фигура 1: Рентгенограмма нормальных позвонков (A) и позвонков с патологией «вышивка крестом» (B)

Фигура 2: рыба с патологией «вышивки крестом», определенная рентгеном. Категории указаны по количеству пораженных позвонков. Результаты для рыб на диете без β-глюкана (A-C1-A-C6) и для рыб на диете с β-глюканом (B-C1-B-C6).

Фигура 3 Результаты ИФА на фермах, где не наблюдались деформации позвоночника (1-4), и на фермах, где наблюдались деформации позвоночника (5-10). Значок * указывает на значительную разницу между результатами ИФА.

Фигура.4. Результаты ИФА для групп вакцинации эксперимента 1, C1, C2, C5 и C6.

Фигура 5: Вестерн-блоттинг сыворотки рыб, положительных в отношении деформации позвоночника, и рыб, отрицательных в отношении деформации позвоночника.

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей мало или даже не содержащей сыворотки. Внутриклеточные патогены, такие как вирусы, внутриклеточные бактерии и внутриклеточные паразиты для вакцины, выращиваются в клетках, которые растут в среде, которая часто дополняется сывороткой.

Сыворотки животных - как бычьи, так и не бычьи - используются в клеточных культурах, наиболее широко используемой является фетальная бычья сыворотка (FBS). Сыворотка содержит факторы роста и очень низкие уровни антител, что делает ее универсальной для различных применений в культуре клеток. В сыворотке содержится более 1000 компонентов, таких как FBS, включая белки, электролиты, липиды, углеводы, гормоны, ферменты и другие неопределенные компоненты, которые необходимы во многих условиях культивирования для поддержки роста клеток. Сыворотка обычно используется в концентрации 5-10% в среде. Сыворотка представляет собой натуральный продукт, ее состав не определен и варьируется от партии к партии.

Сыворотка - это жидкая фракция коагулированной крови. Она обеднена клетками, фибрином и факторами коагуляции крови. Сыворотка отличается от плазмы тем, что антикоагулянт никогда не добавляется в кровь после ее забора у животного. Сыворотку можно приготовить путем центрифугирования до тех пор, пока сгусток и оставшиеся клетки крови не будут отделены от жидкой фазы. Затем сыворотку можно удалить и хранить замороженной до дальнейшей обработки. Первой стадией процесса получения фетальной бычьей сыворотки является забор крови из бычьего плода после извлечения плода из забитой коровы. Кровь собирают в стерильных условиях в стерильный контейнер или пакет для крови и затем коагулируют. Обычный метод забора крови представляет собой пункцию сердца, при которой игла вводится в сердце. Это сводит к минимуму опасность заражения сыворотки микроорганизмами от самого плода и окружающей среды. Затем ее центрифугируют для удаления фибринового сгустка и оставшихся клеток крови из прозрачной желтой (соломенной) сыворотки. Сыворотку замораживают перед дальнейшей обработкой, которая необходима для того, чтобы сделать сыворотку пригодной для культивирования клеток.

Вторая стадия обработки включает фильтрацию, как правило, с использованием цепочки фильтрации, где конечная фильтрация представляет собой тройные стерильные мембранные фильтры 0,1 микрометра. После обработки у известного коммерческого поставщика сыворотки стерилизованная фетальная бычья сыворотка подвергается строгому контролю качества. FBS содержит сложный набор белковых компонентов, которые необходимы многим клеткам для роста, поэтому она успешно используется в культивировании клеток.

Сыворотка может быть получена от животных, таких как крупный рогатый скот, овца, курица, коза, лошадь, ягненок, новорожденный теленок, птица, свинья, рыба или кролик. Предпочтительной сывороткой является бычья сыворотка, а наиболее предпочтительной является фетальная телячья сыворотка, фетальная бычья сыворотка или сыворотка новорожденного теленка. Сыворотка может быть модифицирована.

Фетальная бычья сыворотка

Фетальную бычью сыворотку (FBS), также известную как эмбриональная телячья сыворотка (FCS), получают, как описано выше, из крови плодов здоровых, предродовых самок крупного рогатого скота, которые прошли до- и/или послеубойное ветеринарное обследование. Кровь плода собирают в асептических условиях с помощью сердечной пункции, что снижает риск микробного заражения и образующихся эндотоксинов. Иногда FBS стерилизуют фильтрованием и могут подвергать одному или более процессам модификации. Примерами являются диализованный вариант, очищенный на активированном угле, со сверхнизким уровнем IgG, ES-клетки, MSC и истощенный по экзосомам.

Сыворотка новорожденного теленка

Сыворотка новорожденного теленка (NBCS) определяется как жидкая фракция коагулированной крови, полученная от здоровых, забитых телят в возрасте менее чем 20 дней, признанных пригодными для употребления в пищу человеком в ходе до- и/или послеубойного осмотра.

Донорская бычья сыворотка (также известная как донорская телячья сыворотка)

Донорская бычья сыворотка (DBS) определяется как жидкая фракция коагулированной крови, полученной от здорового крупного рогатого скота в возрасте 12 месяцев и старше из контролируемых донорских стад, состояние здоровья которых подтверждается регулярными проверками компетентными, уполномоченными ветеринарами.

Бычья сыворотка (также известная как взрослая бычья или телячья сыворотка)

Бычья сыворотка определяется как жидкая фракция коагулированной крови, полученной от здорового забитого крупного рогатого скота в возрасте 12 месяцев и старше, признанного в ходе до- и/или послеубойного осмотра пригодным для употребления в пищу человеком.

Глобулярный белок, бычий сывороточный альбумин (BSA), является основным компонентом фетальной бычьей сыворотки. Богатое разнообразие белков в эмбриональной бычьей сыворотке поддерживает культивируемые клетки в среде, в которой они могут выживать, расти и делиться.

Авторы изобретения обнаружили, что рыба, вакцинированная вакцинами, содержащими бычью сыворотку, которые происходят из питательной среды компонента внутриклеточного патогенного, имеет гораздо более высокий риск развития деформаций позвоночника в форме «вышивка крестом», чем рыбы, вакцинированные вакцинами без сыворотки. Кроме того, было обнаружено, что сыворотка вакцинированной рыбы с ферм, где были обнаружены деформации позвоночника, была реактивна в отношении культуральной среды, в которой вырос компонент внутриклеточного патогена вакцины. В отличие от этого сыворотки от вакцинированных рыб с ферм, где не наблюдались деформации позвоночника, не были реактивны или были очень слабо реактивны в отношении питательной среды.

Следовательно, вакцины по настоящему изобретению и/или их варианты осуществления содержат настолько мало сыворотки, насколько возможно, и предпочтительно совсем не содержат сыворотки. Предпочтительно вакцина содержит менее чем 5% сыворотки, предпочтительно менее чем 4% сыворотки, более предпочтительно менее чем 3% сыворотки, более предпочтительно менее чем 2,5% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 2% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 1,5% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 1,2% сыворотки, более предпочтительно менее чем 1% сыворотки, более предпочтительно менее чем 0,8% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,5% сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 0,4% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,3% сыворотки, более предпочтительно менее чем 0,2% сыворотки, еще более предпочтительно менее чем 0,1% сыворотки, даже более предпочтительно менее чем 0,05% сыворотки. Еще более предпочтительно вакцина содержит менее чем 0,01% сыворотки или даже менее чем 0,005% или даже меньше, а наиболее предпочтительно по существу не содержит сыворотки. Сыворотку можно удалить из внутриклеточного патогена, полученного из культуры, путем фильтрации, ультрацентрифугирования. Предпочтительно внутриклеточный патоген происходит из бессывороточной культуры. Способы выращивания клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами, в бессывороточной среде известны в данной области, например US9441207, US5753489, WO2001064846, US665671.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей мало или даже не содержащей альбумина. Альбумин поступает из сыворотки крови, и наиболее распространенным альбумином является бычий сывороточный альбумин (также известный как BSA или «фракция V»). Это белок сывороточного альбумина, полученный от коров. Он часто используется в качестве стандарта концентрации белка в лабораторных экспериментах. Название «Фракция V» относится к альбумину, являющемуся пятой фракцией оригинальной методики очистки Эдвина Кона, в которой использовались различные характеристики растворимости белков плазмы. Манипулируя концентрацией растворителя, pH, уровнями солей и температурой, Кон смог извлечь последовательные «фракции» плазмы крови. Этот процесс был сначала коммерциализирован с человеческим альбумином для медицинского использования, а затем адаптирован для производства BSA. Однако альбумин также может быть получен из крупного рогатого скота, овец, курицы, козы, лошади, баранины, новорожденного теленка, свиньи или кролика. Сывороточный альбумин является наиболее распространенным белком в плазме крови. Концентрация сывороточного альбумина в сыворотке составляет от 35 до 50 г/л.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,8 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,05 г/л, более предпочтительно менее чем 0,01 г/л альбумина.

Нативный альбумин представляет собой самую большую фракцию альбумина в сыворотке. Нативный альбумин не модифицирован. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,8 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,05 г/л, более предпочтительно менее чем 0,01 г/л нативного альбумина.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей небольшое количество посттрансляционно модифицированного альбумина или даже не содержащей его. У млекопитающих сывороточный альбумин подвергается посттрансляционным модификациям. Посттрансляционные модификации белков являются важными реакциями, которые существенно влияют на функцию белков в организме. В принципе их можно разделить на ферментативные и неферментативные модификации. Неферментативные реакции включают гликирование, которое играет важную роль при хронических осложнениях сахарного диабета, уремии, в процессе старения и дегенерации головного мозга.

При неферментативном гликировании белков (ранее называемом неферментативным гликозилированием) свободные аминогруппы пептидов/белков реагируют с карбонильными группами восстанавливающих сахаров без каталитического действия ферментов. Эта реакция была впервые описана Луи Майяром, который наблюдал потемнение белков при нагревании с сахаром. Первоначально казалось, что эта реакция актуальна только в пищевой химии, но в 1971 году было обнаружено, что гликирование происходит в каждом живом организме, особенно если концентрация сахара в крови повышена. Другие модификации включают цистеинилирование, S-нитрозилирование, S-перенитрозирование и S-гуанилирование, чаще всего по остаткам цистеина.

Еще одна посттрансляционная модификация - карбамилирование. Карбамилирование представляет собой неферментативную и необратимую посттрансляционную модификацию (PTM), которая в основном является результатом взаимодействия между изоциановой кислотой и аминогруппами белков. Когда это происходит на остатках лизина в полипептидных цепях, образуется ε-карбамил-лизин (т.е. гомоцитруллин). Изоциановая кислота в основном образуется в результате спонтанного разложения мочевины на аммоний и цианат, химически активные вещества, которые быстро превращаются в изоциановую кислоту. Реактивный цианат может также образовываться в результате метаболизма тиоцианата. Миелопероксидаза (MPO), полученная из нейтрофилов, катализирует окисление тиоцианата в присутствии перекиси водорода. Это происходит на участках воспаления и атеросклеротических бляшек, где тиоцианат представлен в крови.

Цитруллинирование и карбамилирование - две посттрансляционные модификации, которые приводят к образованию цитруллина и гомоцитруллина, двух близкородственных нестандартных аминокислот. Цитруллинирование аргинина катализируется пептидиларгининдезиминазами (PAD).

Посттрансляционные модификации белков происходят у здоровых людей и могут усиливаться при некоторых клинических состояниях, таких как атеросклероз, заболевание почек и воспаление.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,8 г/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, более предпочтительно менее чем 0,2 г/л, более предпочтительно менее чем 0,1 г/л, еще более предпочтительно менее чем 0,05 г/л, более предпочтительно менее чем 0,02 г/л, более предпочтительно менее чем 0,01 г/л посттрансляционно модифицированного альбумина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 мг/л, более предпочтительно менее чем 1 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,8 мг/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,2 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,1 мг/л, еще более предпочтительно менее чем 0,05 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,02 мг/л, более предпочтительно менее чем 0,01 мг/л посттрансляционно модифицированного альбумина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцина содержит менее чем 2 мкг/л, более предпочтительно менее чем 1 мкг/л, более предпочтительно менее чем 0,8 мкг/л, даже более предпочтительно менее чем 0,5 мкг/л, более предпочтительно менее чем 0,2 мкг/л, более предпочтительно менее чем 0,1 мкг/л, еще более предпочтительно менее чем 0,05 мкг/л, более предпочтительно менее чем 0,02 мкг/л, более предпочтительно менее чем 0,01 мкг/л посттрансляционно модифицированного альбумина.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина выбрана из группы, состоящей из цитруллинирования, карбамилирования, гликирования, цистеинилирования, S-нитрозилирования, S-перенитрозирования и S-гуанилирования. В предпочтительном варианте настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина выбрана из группы, состоящей из цитруллинирования, карбамилирования, гликирования, цистеинилирования. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина выбрана из группы, состоящей из цитруллинирования, карбамилирования, гликирования. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина представляет собой цитруллинирование. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина представляет собой карбамилирование. В предпочтительном варианте настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления посттрансляционная модификация альбумина представляет собой гликирование.

Альбумин может быть удален из внутриклеточного патогена, собранного из культуры, промывкой или аффинными смолами с антителами против альбумина или специфических альбуминов, осаждением солей, например, сульфатом аммония и сульфатом натрия, эксклюзионной хроматографией или центрифугированием. Также существуют специальные наборы для удаления альбмунина, такие как наборы Proteoxtract. Предпочтительно внутриклеточный патоген происходит из культуры, не содержащей альбумина. Способы выращивания клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами, в среде без альбумина или в среде с низким содержанием альбумина известны из US665671.

Антиген вакцины по настоящему изобретению происходит от внутриклеточного патогена, выращенного на клеточной культуре. Антиген может быть цельным патогеном или происходить от цельного патогена. Патоген может быть живым, убитым или аттенуированным патогеном. Происходящий от цельного патогена означает, что в какой-то момент при извлечении присутствовал цельный патоген, например в результате метода инактивации. Цельный патоген или происходящий из цельного патогена не включает плазмиды, ДНК, частицы экспрессии, частицы репликона и т. п. Субъединичные и рекомбинантные вакцины могут быть охвачены настоящим изобретением, особенно когда антиген представляет собой субъединичный или рекомбинантный белок, который продуцируется в культуре клеток или происходит от патогена, который культивируется в культуре клеток.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления антиген представляет собой вирус. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления антиген представляет собой антиген вируса рыбы, предпочтительно антиген вируса лосося.

«Рыба» относится к пелагическим рыбам, как хрящевым, так и костным, в любой климатической зоне: с холодными, умеренными или тропическими водами и живущими в пресноводной, солоноватой или соленой воде. Рыба может выращиваться в неволе как разводимая рыба, рыба для разведения или декоративная рыба. Предпочтительно рыбу выбирают из: окуня, морского окуня, снэппера, тилапии, желтохвоста, амберджека, камбалы, пангасиуса, карпа, леща, осетра, сома, угря, форели, лосося, сига, палтуса, трески, кои и золотой рыбки.

В одном варианте осуществления рыба представляет собой лососевую рыбу; предпочтительно лососевую рыбу выбирают из атлантической, стальноголовой, чавычи, кижуча, горбуши, кеты и нерки, радужной, ручейной, озерной и коричневой форели, а также гольца.

Клетки рыб, такие как клетки CHSE лосося и клетки FHMP карпа, можно выращивать в бессывороточной среде путем повторения и селекции клеток, которые хорошо растут в среде с все меньшим количеством сыворотки, до тех пор, пока в среде не останется сыворотка.

Shea and Berry (In Vitro vol 19, no. 11, (1983), p818-825) раскрывают, что ряд клеточных линий рыб можно выращивать на бессывороточной среде, включая клетки CHSE-214, и они способны поддерживать репликацию вируса-2 золотой рыбки на уровне, эквивалентном для клеток, растущих на среде с сывороткой.

Вирус PD можно культивировать на клетках CHSE-214 в бессывороточной среде. JP2003219873 раскрывает клетки CHSE-214, которые растут в суспензии и могут быть культивированы в бессывороточной среде. Также сообщалось, что другие клетки рыб могут расти в суспензии. Одним из них является способ культивирования клеток CHSE-214 (линия клеток, полученная из эмбриона королевского лосося) в растворе суспензионной культуры EMEM-S, содержащем карбоксиметилцеллюлозу (Lidgerding, Develop. Biol. Standard, 49, 233-241 (1981)), а другой представляет собой метод с использованием среды Waymouse MB752/1 без CaCl2 (Hasobe M., et al., Bull. Eur. Asso. Fish Pathol., 11, 142-144 (1991)).

JP 2003219873 раскрывает, что суспензии клеток CHSE-214 можно культивировать в бессывороточной среде, и они могут храниться при низкой температуре, такой как примерно 4 градуса по Цельсию. JP2003219873 раскрывает, что суспензионные клетки CHSE-214 можно культивировать в бессывороточной культуре с добавлением гидролизата лактальбумина в качестве заменителя сыворотки. В качестве подходящей среды использовалась среда Waymouth MB752/1 без добавления CaCl2, 14 мМ Hepes (регулировка pH с помощью NaOH), 10% водный раствор гидролизата лактальбумина 5% и канамицин 0,06 г/л. Среда имеет pH 7,4.

Бессывороточная среда является коммерчески доступной. В качестве заместителя сыворотки или альбумина можно использовать дрожжевые экстракты или гидролизаты глютена пшеницы. WO99/57246 раскрывает бессывороточную среду для культивирования клеток, полностью лишенную животных белков и липидов. Здесь белок получают из риса, сои, картофеля, кукурузы и алоэ вера, а липид получают из риса, сои, картофеля, кукурузы и алоэ вера, а также из бактерий, дрожжей и грибов.

KR20160074818 раскрывает культивирование вируса рыб, цитомегаловируса, с использованием бессывороточной среды в клеточной линии морского леща (клетки Pagrus majorfin (PMF).

Соответственно, вирусный антиген по изобретению и/или его вариантам осуществления может быть выбран из группы, содержащей альфа-вирус лосося (SAV), иридовирус леща Красного моря (RSIV), вирус инфекционного гемопоэтического некроза (IHNV), вирус вирусной геморрагическую септицемии (VHSV), вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), вирус проточного сома (CCV), вирус весенней виремии карпа (SVCV), вирус нервного некроза (NNV), вирус геморрагического заболевания у белого амура (GCHDV), вирус озера тилапия (TLV), морской аквабирнавирус (MABV), вирус эпизоотического гемопоэтического некроза (EHNV), реовирус рыб (PRV) и вирус кардиомиопатии (CMV).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вакцинная композиция не содержит вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вирусный антиген выбран из группы, содержащей альфа-вирус лосося (SAV), вирус инфекционного гемопоэтического некроза (IHNV), вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), вирус озера Тилапия (TLV), реовирус рыб (PRV), вируса кардиомиопатии (CMV) и вирус эпизоотического гемопоэтического некроза (EHNV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вирусный антиген выбран из группы, содержащей альфа-вирус лосося (SAV), вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), реовирус рыб (PRV), вирус кардиомиопатии (CMV) и вирус озера Тилапия (TLV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вирусный антиген представляет собой альфа-вирус лосося (SAV), реовирус рыб (PRV) и вирус кардиомиопатии (CMV). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления вирусный антиген представляет собой альфа-вирус лосося (SAV).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления антиген представляет собой внутриклеточную бактерию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточная бактерия выбрана из группы, содержащей Piscirickettsia, Franciscella, Chlamidia, Rickettsia, Coxiella, В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточная бактерия представляет собой внутриклеточную бактерию рыб. Подходящая внутриклеточная бактерия выбрана из группы, содержащей Piscirickettsia и Franciscella. Подходящей внутриклеточной бактерией является Piscirickettsia salmonis, или Francisella philomiragia, или Francisella tularensis.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления антиген представляет собой внутриклеточный паразит. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточный паразит выбран из группы, содержащей Apicomplexa, Microsporidia и Trypanosoma. В предпочтительном варианте осуществления изобретения и/или в его вариантах осуществления внутриклеточный паразит представляет собой Apicomplexa или Microsporidia. Подходящие простейшие представляют собой Coccidia, Cryptosporidia Octosporella и Isospora.

Вакцины часто представляют собой эмульсии. «Эмульсия» представляет собой смесь по меньшей мере двух несмешивающихся жидкостей, где одна диспергирована в другой. Обычно капли дисперсной фазы очень маленькие, их диаметр составляет несколько микрометров или меньше. Процедуры и оборудование для приготовления эмульсии в любом масштабе хорошо известны в данной области техники и, например, описаны в таких справочниках, как: «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Вакцины по настоящему изобретению могут содержать дополнительные антигены, такие как бактериальные антигены, ДНК, плазмиды, частицу репликона и т. п. Бактериальным антигеном может быть живая бактерия, убитая бактерия или аттенуированная бактерия, или бактерин.

«Вакцина» представляет собой хорошо известную композицию, обладающую лечебным действием, и включает иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. «Носитель» может быть водной фазой или самой эмульсией. «Иммунологически активный компонент» по изобретению представляет собой антиген внутриклеточного патогена. Вакцина стимулирует иммунную систему животного-мишени и вызывает защитный иммунологический ответ. Ответ может исходить от врожденной и/или приобретенной иммунной системы мишеней и может быть клеточного и/или гуморального типа.

Вакцина обеспечивает «защиту» «от инфекции или заболевания» за счет снижения в вакцинированной мишени тяжести последующей инфекции, например, путем уменьшения количества патогенов или сокращения продолжительности репликации патогена в мишени и уменьшения количества, интенсивности или тяжести поражений, вызванных бактериальной инфекцией. Кроме того, или, следовательно, вакцина эффективна для уменьшения или облегчения (клинических) симптомов заболевания, которое может быть вызвано такой инфекцией или репликацией, или ответом мишени на эту инфекцию или репликацию. Справочник по таким заболеваниям и клиническим признакам: «The Merck veterinary manual» (10-е изд., 2010 г., изд. C.M. Kahn, ISBN: 091191093X. Такая вакцина в просторечии называется вакциной «против» конкретной бактерии или «бактериальной вакциной».

Чтобы вакцина была иммунологически эффективной, она должна содержать достаточное количество антигена. Сколько ее должно быть - либо уже известно по родственным вакцинам, либо это может быть легко определено, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации и (в случае животного-мишени) контрольной инфекции, например путем мониторинга признаков заболевания, клинических показателей или повторного выделения патогена у мишеней и сравнения этих результатов с реакцией на вакцинацию, наблюдаемой у имитационно вакцинированных животных.

Вакцина по изобретению может использоваться в качестве профилактического, метафилактического или терапевтического лечения.

Вакцина по изобретению может служить в качестве эффективной первичной вакцинации, за которой впоследствии можно следить и усиливать бустерной вакцинацией той же или другой вакциной.

Вакцина по изобретению предотвращает, уменьшает или избегает деформации позвоночника и, в особенности, деформации позвоночника в форме «вышивка крестом», у вакцинированных животных. Уменьшение, предотвращение или избегание деформаций позвоночника сравнивается с животными, которых обрабатывали вакциной, содержащей те же антигены, но вместе с более чем 5% сыворотки или более чем 2,5 г/л альбумина.

Вакцина по изобретению может дополнительно содержать другие соединения, такие как дополнительный антиген или микроорганизм, цитокин или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG и т. д.

Вакцину по изобретению можно преимущественно комбинировать с одним или более дополнительными антигенами, например происходящими из микроорганизма, патогенного для животного-мишени. Такой дополнительный антиген может сам быть инфекционным микроорганизмом, инактивированным или субъединицей. Дополнительный антиген может состоять из биологической или синтетической молекулы, такой как белок, углевод, липополисахарид, липид или молекула нуклеиновой кислоты.

Для вакцинации жвачных животных дополнительный антиген патогена выбирается из одного из следующих: Pasteurella, Escherichia, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, микоплазмы, Moraxella, Bacillus, Brucella, Clostridia, Mannheimia, Haemophilus, Francisella, Fustorephilus Arcanobacteria), Actinomyces, Clostridium, Coxiella, Campylobacter, Erysipelothrix, Leptospira, Listeria, Burkholderia, Nocardia, Mycoplasma, Bacteroides и Chlamydia.

Для вакцинации свиней дополнительный антиген патогена выбирается из одного из следующих: Mycoplasma, Lawsonia, Escherichia, Brachyspira, Streptococcus, Salmonella, Clostridium, Actinobacillus, Pasteurella, Haemophilus, Erysipelothrix, Leptospira, Burkteocholderia.

Для вакцинации домашней птицы дополнительный антиген патогена выбирается из одного из следующих антигенов: Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, дополнительный птичий патоген, Haemophilus, Pasteurella, Erysipelothrix, Mycoplasma, дополнительный микопатоген, Clostococcus , Listeria, Riemerella, Bordetella и Clostridium.

Для вакцинации животного водного происхождения дополнительный антиген от патогена выбирается из одного из следующих: Aeromonas, Vibrio, Moritella, Edwardsiella, Francisella, Flexibacter, Pasteurella, Cytophaga, Coryneabacteria, Renibacteria, Arthrobacter, Flavobacteria, Fusarium, Baciniaillus, Mycobacteria, Neorickettsia, Listonella, Flexibacter, Piscirickettsia, Streptococcus, Shewanella, Pseudomonas, Photobacteria, Clostridium, Tenacibaculum, Lactococcus, Leucothrix и Nocardia.

«Введение» вакцины по изобретению человеку или животному-мишени может быть выполнено с использованием любого возможного метода и пути. Обычно оптимальный путь введения определяется типом применяемой вакцины, а также характеристиками мишени и бактериального заболевания, для защиты от которого она предназначена. В зависимости от того, основана ли вакцина согласно настоящему изобретению на эмульсии «масло в воде» или «вода в масле», могут применяться различные методы введения. Например, в качестве эмульсионной вакцины типа «масло в воде» вакцина по изобретению может вводиться энтерально или через слизистые оболочки, то есть посредством глазных капель, капель в нос, перорально, энтерально, ороназальных капель, спрея. Другая возможность - это метод массового введения, как например посредством питьевой воды, грубодисперсного распыления, распыления, вместе с пищей и т. д.

Предпочтительным путем введения для способа вакцинации по изобретению является парентеральный путь.

«Парентеральное» относится к введению через кожу, например, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным, подслизистым или подкожным путем.

Само собой разумеется, что оптимальный путь введения вакцины по изобретению будет зависеть от специфики вакцины, которая используется, и от конкретных характеристик мишени. Квалифицированный специалист вполне способен выбрать и оптимизировать такой путь и способ введения.

Объем дозы вакцины по изобретению, например при парентеральном введении это объем, приемлемый для человека или животного-мишени, и может, например, составлять от примерно 0,01 до примерно 10 мл. Предпочтительно одна доза составляет от 0,05 до 1 мл, более предпочтительно одна доза составляет от 0,1 до 0,5 мл.

При внутримышечном введении объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,5 до примерно 3 мл, более предпочтительно от 1 до 2 мл.

При внутрикожном введении объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,1 до примерно 0,5 мл, более предпочтительно примерно 0,2 мл.

Для вакцин рыб объем дозы вакцины по изобретению, например при парентеральном введении этот объем является приемлемым для рыбы-мишени и может, например, составлять от примерно 0,001 мл до примерно 5 мл. Предпочтительно одна доза имеет объем от 0,01 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,02 мл до 1 мл, более предпочтительно от 0,05 мл до 0,5 мл.

При внутримышечном введении объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,01 мл до примерно 3 мл, более предпочтительно от 0,05 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,1 мл до 0,5 мл.

Способ, время и объем введения жидкой вакцинной композиции по изобретению предпочтительно интегрировать в существующие графики вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться человеку или животному-мишени, чтобы снизить стресс для мишени и уменьшить затраты труда. Эти другие вакцины можно вводить одновременно, совместно или последовательно, способом, совместимым с их зарегистрированным применением.

Следовательно, в одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный антиген.

Изобретение относится к лечению рыб. Изобретение относится к лечению заболевания, вызываемого альфа-вирусом лосося (SAV).

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 5% сыворотки.

Изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей антиген внутриклеточного патогена, где композиция содержит менее чем 2,5 г/л альбумина.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где внутриклеточный патоген представляет собой вирус, внутриклеточную бактерию или внутриклеточный паразит.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где альбумин представляет собой посттрансляционно модифицированный альбумин или нативный альбумин.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где антиген происходит от патогена рыб, предпочтительно это антиген патогена лосося.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген представляет собой вирус, предпочтительно выбранный из группы, содержащей альфа-вирус лосося (SAV), иридовирус леща Красного моря (RSIV), вирус инфекционного гемопоэтического некроза (IHNV), вирус вирусной геморрагическую септицемии (VHSV), вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), вирус проточного сома (CCV), вирус весенней виремии карпа (SVCV), вирус нервного некроза (NNV), вирус геморрагического заболевания у белого амура (GCHDV), вирус озера тилапия (TLV), морской аквабирнавирус (MABV), вирус эпизоотического гемопоэтического некроза (EHNV), реовирус рыб (PRV) и вирус кардиомиопатии (CMV).

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген представляет собой внутриклеточную бактерию, предпочтительно выбранную из группы, содержащей Piscirickettsia, Franciscella, Chlamidia, Rickettsia, Coxiella.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген представляет собой внутриклеточный паразит, предпочтительно выбранный из группы, содержащей Apicomplexa и Trypanosoma.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген не является вирусом инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV).

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген представляет собой убитый, живой или живой аттенуированный внутриклеточный патоген.

Изобретение, кроме того, относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген был выращен на культуре клеток.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где патоген представляет собой цельный патоген или происходит от цельного патогена.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где вакцина содержит менее чем 0,5 г/л нативного альбумина или посттрансляционно модифицированного альбумина.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где вакцина содержит менее чем 0,5% сыворотки.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где сыворотку, нативный альбумин или посттрансляционно модифицированный альбумин получают от крупного рогатого скота, овцы, курицы, козы, лошади, ягненка, новорожденного теленка, свиньи, или кролика.

Изобретение, кроме того, относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где сыворотка представляет собой фетальную телячью сыворотку.

Изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где посттрансляционная модификация альбумина выбрана из группы, состоящей из цитруллинирования, карбамилирования, гликирования, цистеинилирования, S-нитрозилирования, S-перенитрозирования и S -гуанилирования.

Изобретение также относится к вакцине по любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, для использования в способе лечения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном у животного, и уменьшения, предотвращения или избежания деформации позвоночника в форме «вышивки крестом», у указанного животного.

Изобретение также относится к способу лечения или предотвращения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном у животного, и уменьшения, предотвращения или избежания деформации позвоночника в форме «вышивки крестом», у указанного животного, где указанный способ включает стадии введения больному животному эффективного количества вакцины по любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе.

Изобретение также относится к применению вакцины по любому из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, при производстве лекарственных средств для лечения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном у животных, и уменьшения, предотвращения или избежания деформации позвоночника в форме «вышивки крестом», у указанного животного.

Изобретение относится к лечению рыб. Изобретение относится к лечению заболевания, вызываемого альфа-вирусом лосося (SAV).

Далее изобретение будет описано с помощью следующих, не ограничивающих, примеров.

Примеры

1. Пример 1

Тесты проводились с разными вакцинами с разными антигенами. Все вакцины были масляно-эмульсионными.

Таблица 1: вакцины

Группа Вакцина Объем дозы на рыбу (мл) +/- сыворотка/альбумин C1 Инактивированный SPDV (вирус болезни поджелудочной железы лосося) ≥75% RPP
Инактивированный вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) серотипа Sp ≥1,5 единиц ИФА
Инактивированный Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida ≥10,7 log2 ИФА-единиц,
Инактивированный Vibrio salmonicida ≥90 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O1 ≥75 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O2a ≥75 RPS,
Инактивированная Moritella viscosa ≥5,8 log2 ИФА-единиц.
Адъювант; минеральное масло 0,1 Компонент SPDV содержал сыворотку C2 Инактивированный вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) серотипа Sp ≥1,5 единиц ИФА
Инактивированный Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida ≥10,7 log2 ИФА-единиц,
Инактивированный Vibrio salmonicida ≥90 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O1 ≥75 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O2a ≥75 RPS,
Инактивированная Moritella viscosa ≥5,8 log2 ИФА-единиц.
Адъювант; минеральное масло 0,1 Без сыворотки C3 Инактивированный SPDV (вирус болезни поджелудочной железы лосося) ≥75% RPP
Инактивированный Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida ≥10,7 log2 ИФА-единиц,
Инактивированный Vibrio salmonicida ≥90 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O1 ≥75 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O2a ≥75 RPS,
Инактивированный Moritella viscosa ≥5,8 log2 ИФА-единиц.
Адъювант; минеральное масло 0,1 Компонент SPDV содержал сыворотку примерно 6%. C4 Инактивированный SPDV (вирус болезни поджелудочной железы лосося) ≥75% RPP
Инактивированный вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) серотипа Sp ≥1,5 единиц ИФА
Инактивированный Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida ≥10,7 log2 ИФА-единиц,
Инактивированный Vibrio salmonicida ≥90 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O1 ≥75 RPS,
Инактивированный Vibrio anguillarum серотипа O2a ≥75 RPS,
Адъювант; минеральное масло 0,1 Компонент SPDV содержал сыворотку примерно 6%. C5 * Инактивированный Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida RPS ≥80, инактивированный Listonella anguillarum серотипа O1 RPS ≥75,
Инактивированный Listonella anguillarum серотипа O2a RPS ≥75,
Инактивированный Vibrio salmonicida RPS ≥90,
Инактивированный Moritella viscosa RPS ≥60, I
Инактивированный вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) серотипа Sp 0,2 AU,
Адъювант: минеральное масло
Инактивированный SPDV (вирус болезни поджелудочной железы лосося), RPS ≥80%
Адъювант: минеральное масло; Сорбитанолеат Полисорбат 80 0,05+0,05 Компонент IPNV и SPDV, содержащий сыворотку C6 физиологический раствор Стерильный 0,9% NaCl во флаконе 0,1 Без сыворотки

*: 6-валентную вакцину и вакцину с PD вводили одновременно

Сыворотку получали в процессе культивирования

Популяцию рыб подвергали сигналу «зимы» (12:12 свет: темнота) за 7 недель до вакцинации. После смолтификации (переключение на 24:0 период свет:темнота) и периода иммунизации минимум 500 градусо-дней, рыбу переводили в море. Примерно год спустя рыбу выращивали в море до созревания.

Рыбы были индивидуально помечены PIT-метками, по меньшей мере, за две недели до вакцинации. Образцы рыбы собирали перед перемещением в море и в 4 момента времени в течение периода роста в море. На образцах проводили рентгеноструктурный анализ позвоночника и измерения прочности костей. Кроме того, регистрировали длину и массу, а также побочные эффекты классической местной вакцины.

После перевода в море (0 неделя) образцы собирали на 7, 19, 31 неделях и при созревании (приблизительно 14 месяцев).

Подопытные рыбы были из одной и той же популяции и выращивались в идентичных условиях до тех пор, пока их случайным образом не распределили в разные группы вакцины (C1-C6). Группы вакцины смешивали и распределяли поровну при переносе в морские садки (70 рыб из каждой вакцинированной группы на морской садок). Идентификация групп обработки вакциной проводилась путем сканирования и регистрации предварительно имплантированной PIT-метки. Перед вакцинацией рыб подвергали анестезии. Корректную инъекционную дозу (см. объемы в Таблице 1) вводили путем внутрибрюшинной инъекции. Одновременно осуществляли инъекцию 2x 0,05 мл С5 с помощью инжектора с Y-соединением.

Фиг. 2. Деформации позвоночника в форме «вышивка крестом», определенных рентгенологически, с разбивкой по количеству пораженных позвонков. На Фигуре 2 показано, что в группах, где рыбу вакцинировали вакцинами без сыворотки (C2 и C6), деформации позвоночника в форме «вышивки крестом» не наблюдались или наблюдались очень незначительные. Напротив, все группы вакцин, в которых используется вакцина, содержащая сыворотку или альбумин, демонстрируют деформации позвоночника в форме «вышивки крестом».

2. Пример 2

Проводили испытания, чтобы увидеть, оказывает ли какой-либо эффект функциональный кормовой ингредиент. Испытывали вакцины, указанные в таблице 1, где рыбам давали рацион, обогащенный бета-глюканом, см. Таблицу 2. Эксперименты проводили, как описано в примере 1.

Таблица 2: Основные ингредиенты в диете:

диета % Рыбная мука 14,5 Концентрат соевого белка 19 пшеничная клейковина 15 пшеница 7 Бобы Hestebønner 5 Маисовый глютен 5 Рыбий жир 10,5 Рапсовое масло 15 Соевый лецитин 1 Витаминный микс 2 Минеральный микс 0,59 Мононатрийфосфат 2,5 Иттрий 0,01 Холина хлорид 0,5 Carop. Pink (10% Astax) 0,05 DL- Метионин 0,8 L-лизин 1,4 Треонин 0,2 Сумм. 100

3. Пример 3 ИФА

Были проведены эксперименты ИФА по реактивности сыворотки от рыб против среды адгезионной культуры клеток CHSE, которая используется для выращивания вируса PD. Среда для культивирования клеток содержит примерно 10% фетальной телячьей сыворотки. Сыворотки рыб с одной фермы были объединены и протестированы на реактивность против среды адгезионной культуры клеток CHSE. Были взяты образцы рыб и сыворотки.

На планшеты для ИФА наносили покрытие в виде среды для культивирования клеток CHSE в ИФА-буфере для покрытия в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали. Планшеты блокировали 0,5% BSA (рекомбинантный). Планшеты промывали и инкубировали (2 часа) с сывороткой рыб. Планшеты промывали и инкубировали (1 час) с IgG2a мыши против IgM лосося. Планшеты снова промывали и затем инкубировали (1 час) с козьим HRP-конъюгированным антителом против IgG мыши. Планшеты промывали и проявляли субстратом пероксидазы ABTS ИФА (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) и измеряли.

На Фигуре 3 показано, что сыворотки от рыб из ферм, где не наблюдались деформации позвоночника, имеют гораздо более низкую реактивность против среды адгезионной культуры клеток CHSE. В то время как сыворотки от рыб с ферм, в которых наблюдались деформации позвоночника, показали значительно более высокую реактивность против среды адгезионной культуры клеток CHSE. Односторонний Anova, непарный t-критерий и t-критерий Уелча показали все существенные различия.

На Фигуре 4 показаны результаты ИФА для групп вакцинации эксперимента 1. Здесь можно увидеть, что сыворотка от рыб, вакцинированных вакцинами, содержащими сыворотку (C1 и C5), показала значительно более высокую реактивность против среды адгезионной культуры клеток CHSE, чем сыворотка от рыб, вакцинированных вакцинами, не содержащими сыворотки (C2 и C6).

4. Пример 4 Вестерн-блоттинг.

Образцы: 5 мкг/на дорожку либо среды адгезионной культуры CHSE, либо BSA (фракция V бычьего сывороточного альбумина, 100 г; SIGMA ALDRICH CHEMIE B.V., каталожный номер: 10735086001) загружали в каждую дорожку геля SDS-PAGE. Образцы обрабатывали в течение приблизительно 1 часа, а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Whatman protran nitrocellulose 0,45 мкм). 5 минут промывали в TBS-tween (TBS-T; 20 мМ Tris·Cl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) tween 20 (Sigma)), а затем блокирование в течение 1 часа в 5% обезжиренном сухом молоке в TBS-T.

Сыворотку из пула из пяти рыб разводили в 2000, 4000 или 6000 раз в TBS-T и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Сыворотка была получена либо от рыб, положительных по деформации позвоночника, либо от рыб, отрицательных по деформации позвоночника. Дважды промывали в течение 5 минут в TBS-Tween/Triton (TBS-T+0,2% (об./об.) Triton X-100; (Sigma)).

Промывали один раз в течение 5 минут в TBS-T и инкубировали в течение 1 часа с IgG2a мыши против IgM лосося (2 мкг/мл, Immunoprecise). Промывали дважды в течение 5 минут в TBS-TT, один раз промывали в течение 5 минут в TBS-T и инкубировали в течение 1 часа с козьим конъюгированным с Alexa-680 антителом против мышиного IgG, (1: 10000, Abcam), а затем промывали четыре раза по 5 минут в TBS-TT. Вестерн-блоты получали с помощью системы изображений Odyssey, LI-COR.

На Фигуре 5 показано, что сыворотки рыб, положительные на SDS, сильно реактивны к среде для культивирования клеток, но не реактивны или почти не реактивны к бычьему сывороточному альбумину высокой степени чистоты. Сыворотка рыб, отрицательная на SDS, не реактивна или почти не реактивна к среде для культивирования клеток и к бычьему сывороточному альбумину высокой степени чистоты.

Изобретение относится к ветеринарии. Описана вакцинная композиция, содержащая антиген внутриклеточного патогена рыб, для применения в способе лечения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном у рыб, где внутриклеточный патоген представляет собой вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) или внутриклеточную бактерию, выбранную из Aeromonas, Vibrio и Moritella, и уменьшения, предотвращения или избежания деформации позвоночника у указанной рыбы, где деформация позвоночника характеризуется полным коллапсом межпозвонкового пространства, где композиция не содержит сыворотки, где антиген представляет собой антиген патогена лосося, причем антиген представляет собой убитый внутриклеточный патоген. Изобретение позволяет уменьшать деформацию позвоночника у рыб, снизить частоту и/или тяжесть состояния позвонков в форме «вышивки крестом». 5 ил., 2 табл., 4 пр.

Вакцинная композиция, содержащая антиген внутриклеточного патогена рыб, для применения в способе лечения заболевания, вызванного внутриклеточным патогеном у рыб, где внутриклеточный патоген представляет собой вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) или внутриклеточную бактерию, выбранную из Aeromonas, Vibrio и Moritella, и уменьшения, предотвращения или избежания деформации позвоночника у указанной рыбы, где деформация позвоночника характеризуется полным коллапсом межпозвонкового пространства, где композиция не содержит сыворотки, где антиген представляет собой антиген патогена лосося, причем антиген представляет собой убитый внутриклеточный патоген.