СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОЙ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ СВИНЕЙ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/42 A61K39/395 

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностической высокоактивной специфичной к вирусу классической чумы свиней сыворотки крови, и может быть применен в научно-исследовательских институтах и производственных лабораториях.

Существует много способов получения гипериммунных сывороток, имеющих общие правила, которые учитывают в интересах стандартизации и воспроизводимости. Это характеристика вируса, его доза, способ введения, кратность введения и интервалы между ними, иммунный ответ на дозу антигена.

Для приготовления диагностикумов необходимы высокоактивные специфические сыворотки крови животных, содержащие специфические антитела в высоких титрах. В практике получения специфичных к вирусу классической чумы свиней (КЧС) сывороток крови ряд исследователей использовали гетерогенных и гомогенных животных. Так, Кулеско И.И. и Соболев Н.М. (К вопросу о дифференциации эпизоотического и аттенуированного штаммов вируса чумы свиней. // Ветеринария. "Урожай", 1969, т. 24, с. 55-58), Притулин П. Я. и Конопаткин А.А (Применение метода флуоресцирующих антител для обнаружения вируса чумы свиней. // Акт. вопр. ветер. вирусол., 1965, 1, с.46-47), Гизатуллин Х.Г. и Юсупов Р. Х. (Чума свиней и современные методы ее лабораторной диагностики. // Казань, 1973, с.120) гипериммунизировали кроликов, вводя им в качестве антигена вирус-вакцину "АСВ" из шт. "К", вируссодержащую кровь больных КЧС свиней, суспензии органов. Для усиления иммуногенеза использовали метод неспецифической стимуляции витамином В₁₂.

Karasszon D. and Bodon L. (Demonstration of the swin fever virus in tissue culture by immunofluorescence. // Acta Mikrobiol. Acad. Sci. Hung. 1963, 10, v.3, р.287-291) получали сыворотки от кроликов, гипериммунизированных суспензией селезенки свиньи, больной КЧС.

Юсупов Р. Х., Ильясова Г.Х. (Белые крысы как модель для получения асцитических жидкостей при чуме свиней. // Акт. вопр. ветер. вирусол., Владимир, 1976, с. 168-170) в качестве продуцентов антител к вирусу КЧС использовали белых крыс. Антигеном служила вирус-вакцина из штамма "К" (ВГНКИ), приготовленная на культуре клеток почки плода свиньи.

Ряд исследователей предлагает способы получения специфических сывороток на свиньях с использованием в качестве антигена вируссодержащую кровь и другой гомологичный материал для снижения образования изотканевых антител.

Кузнецов А.В. (Изучение чувствительности и специфичности реакции связывания комплемента и метода флуоресцирующих антител при классической чуме свиней. // Автореф. дисс. канд. вет. наук. Покров, 1975, с.24); Avrameas S. (Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. // Immunochemistry. 1969, v. 6, p.43-52); Danner K. und Bachmann P. (Vermehrung und Ausbrei von Schweine-pest-Virus, Stamm Munchen - in PK-15-Zellkulturen. // Zbl. Vet. Med. Reihe B. 1970, v.17, 3, p.353-362); Engler E, Urbaneck D. and Olechnowitz A. (Immunohistologiche Intersuchungen bei Schweinepest. 1. Methode zum Nachweis des Schweinepestvirus in Organmaterial experimentell infizierter Schweine mit der direkted Immunofluoreszenz unter Verwendung der Kontrastfarbung mit Evans Blue. // Arch. Ex. Med. 1970, v.24, p.481-498); Ressang and Boer J. (The diagnosis of hog cholera in the Netherlands. // Bull. of. int. epiz. 1971, v.75, p.519-531); Robertson A., Greid A., Appel M. et al. (Hog cholera. 4. Demonstration of the virus in tissue culture preparation by the fluorescent antibody technique. // Canad. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1965, 29, p.234-241) гипериммунные сыворотки КЧС получали на свиньях. Авторы использовали длительные схемы иммунизации, вводя большое или небольшое количество вируссодержащей крови или вируссодержащей сыворотки свиней, зараженных вирулентным вирусом КЧС. Предложенные схемы почти не отличаются друг от друга и заключаются в применении аттенуированного (чаще вакцинного) штамма, через две недели контрольное заражение 1-2 см³ вирулентного вируса для оценки грунд-иммунитета. Затем в зависимости от принятой схемы двух-трехкратное внутривенное введение большого (200-400 см³) или малого (5 см³) объемов вируссодержащей крови (сыворотки) с 2-4 недельным интервалом. Тотальное обескровливание через 10-12 дней после последнего введения.

Однако, предложенные Кулеско И.И. и Соболевым Н.M., Притулиным П.И. и Конопаткиным А. А., Газатуллиным Х.Е. и Юсуповым Р.Х., Karasszon D. и Bodon L. , Юсуповым Р.Х. и Ильясовой Г.Х. способы получения специфичных к вирусу КЧС сывороток крови не исключают возможность "загрязнения" получаемых препаратов антителами к белкам крови, клеток органов свиней, в случае, если они являются донорами антигена. Это обстоятельство обусловливает необходимость истощения сывороток перед применением для метки маркерами (флуорохромами, ферментами), что удлиняет способ получения специфических сывороток крови.

Схема гипериммунизации животных, предложенная Кузнецовым А.В., Avrameas S. , Danner К. und Bachmann P., Engler E. et al, Ressang and Boer J., Robertson А. длительна и не экономична, а выход сывороток, пригодных для получения иммуноглобулинов, по данным Liebke H. (Der fluoreszenserologische Nachweis des Schweinepestivirus uder die Gewebekulur bei experimentell infizierten Schwinen. //Zbl. Vet. Med. 1967, v.14, 1, p.57-67) составлял 50%; по данным Engler E., Urbaneck D. and Olechnowitz A. (Immunohistologiche Intersuchungen bei Schweinepest. 1. Methode zum Nachweis des Schweinepestvirus in Organmaterial experimentell infizierter Schweine mit der direkted Immunofluoreszenz unter Verwendung der Kontrastfarbung mit Evans Blue. // Arch. Ex. Med. 1970, v.24, p.481-498) невысокий - 60-80%.

Целью настоящего изобретения является разработка эффективного и безопасного способа получения высокоактивной специфичной к вирусу КЧС сыворотки крови свиней.

Данная цель достигается тем, что при получении сывороток крови свиней, вакцинированных вирус-вакциной ЛК-ВНИИВВиМ, животных гипериммунизируют препаратом, содержащим очищенный вирус КЧС штамм "Ши-Мынь" (депонирован во ВНИИВВиМ в 1969 г. за 291), внутрикожным способом введения в 40-45 точек. В отличии от прототипов это безопасно в эпизоотологическом отношении; не требует больших временных затрат; исключает возможность "загрязнения" получаемых препаратов антителами к белкам крови, клеток органов свиней; исключает этап истощения сывороток перед применением для метки маркерами (флуорохромами, ферментами) и позволяет получить высокоактивные сыворотки крови.

Пример конкретного выполнения
При гипериммунизации свиней используют инъектор "Шмель". Схема гипериммунизации включает в себя следующие этапы:
1. Введение вирус-вакцины КЧС "ЛК-ВНИИВВиМ" в дозе 10^5,0 ИмД₅₀ в объеме 2 см³ внутримышечно.

2. Через 4 недели внутрикожное введение препарата, содержащего очищенный вирус КЧС штамм "Ши-Мынь" с активностью 10^9,0 ККИД_50/мл с полным адъювантом Фрейнда (соотношение 1 : 1), в 40-45 точек по 0,2 см³.

3. Через 4-5 недель повторное внутрикожное введение препарата, содержащего очищенный вирус КЧС штамм "Ши-Мынь" с активностью 10^9,0 ККИД_50/мл, в 40-45 точек по 0,2 см³.

4. Тотальное обескровливание через 2-3 недели после последнего введения.

Активность сывороток проверяют в реакции нейтрализации флуоресцирующих бляшек (РНФБ) и реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Результаты проверки активности полученных гипериммунных сывороток представлены в таблице.

Из данных таблицы видно, что титр сывороток крови свиней, полученных предлагаемым способом, составлял в РНФБ 1:10240-25600, в РНИФ 1:640-2560. В полученных сыворотках крови не содержатся вирус КЧС, антитела к белкам крови и клеткам органов свиней.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемым способом гипериммунизации свиней можно получить высокоактивные чистые специфичные к вирусу КЧС сыворотки крови свиней.

Предлагаемый способ обеспечивает стандартизацию, позволяет получить высокоактивные сыворотки крови свиней, прост в исполнении, не требует больших временных затрат, безопасен.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения высокоактивной специфичной к вирусу КЧС сыворотки путем усовершенствования схемы гипериммунизации свиней. Способ осуществляется путем вакцинации свиней вирус-вакциной "ЛК-ВНИИВВиМ" и дополнительной гипериммунизацией животных препаратом, содержащим очищенный вирус классической чумы свиней штамм "Ши-Мынь" с полным адьювантом Фрейнда (соотношение 1:1), внутрикожно в 40-45 точек. Способ обеспечивает стандартизацию, прост в использовании, не требует больших временных затрат, позволяет улучшить высокоактивные сыворотки свиней и может быть промышленно применен в научно-исследовательских институтах и производственных лабораториях. 1 табл.

Способ получения высокоактивной специфичной к вирусу классической чумы свиней сыворотки крови путем гипериммунизации свиней, включающий грундиммунизацию свиньи вирус-вакциной классической чумы свиней с последующей гипериммунизацией и выделением сыворотки крови, отличающийся тем, что грундиммунизацию проводят вирус-вакциной "ЛК-ВНИИВВиМ", а последующую гипериммунизацию проводят путем двукратного введения препарата, содержащего очищенный вирус классической чумы свиней штамм "Ши-Мынь" с активностью 10^9,0 ККИД_50/мл (см³) с полным адъювантом Фрейнда (см³) в объемном соотношении 1: 1, в 40-45 точек, и через 2-3 недели после второго введения выделяют сыворотку крови с активностью в РНФБ 1: 10240-25600, в РИФ 1: 640-2560.