Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области искусственного питания для младенцев и детей раннего возраста и к улучшению здоровья кишечника.
Предпосылки к созданию изобретения
Грудное молоко является предпочтительной пищей для младенцев. Грудное молоко содержит несколько биологически активных факторов, которые приносят пользу относительно незрелой иммунной системе и здоровью кишечника новорожденных в раннем возрасте. Младенцы, вскармливаемые грудным молоком, имеют меньшую подверженность инфекциям, чем младенцы, вскармливаемые смесями. Многие компоненты грудного молока, включая иммуноглобулины (такие как sIgA), интерлейкин (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-10, интерферон-γ (IFN-γ), иммунокомпетентные клетки, трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), лактоферрин, нуклеотиды и олигосахариды грудного молока (HMO), как полагают, играют роль в защите от инфекции патогенами. Кроме того, созревание кишечника и развитие микробиоты у младенцев, вскармливаемых грудным молоком, считается оптимальным.
Однако грудное кормление младенца не всегда возможно или желательно. В таких случаях хорошей альтернативой являются молочные смеси первого уровня или молочные смеси второго уровня. Эти смеси должны иметь оптимальную композицию, чтобы как можно точнее имитировать благотворное воздействие грудного молока.
В WO 2005/122790 раскрыт способ стимуляции целостности барьера путем введения композиции, содержащей эйкозапентаеновую кислоту (EPA), докозагексаеновую кислоту (DHA) и арахидоновую кислоту (ARA) и по меньшей мере два различных олигосахарида. Олигосахариды действуют опосредованно, будучи ферментированными до короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) кишечной микробиотой.
В WO 2016/013935 раскрыто применение неперевариваемого олигосахарида в получении композиции для обеспечения питания младенца, страдающего повышенным риском пищевой аллергии. Младенец предпочтительно подвергается повышенному риску воздействия трихотеценовых микотоксинов, например, при употреблении большого количества злаков. В примерах VivinalGOS является источником галактоолигосахаридов.
В WO 2010/023422 раскрыто применение галактоолигосахаридов для профилактики или лечения воспаления. Была протестирована смесь галактоолигосахаридов.
В WO 2004/112509 раскрыта композиция для индукции модели созревания кишечного барьера, подобной наблюдаемой при грудном вскармливании. Композиция помогает улучшить созревание кишечного барьера, например во время неонатального стресса. Раскрыто, что разлучение с матерью у крыс увеличивает проницаемость кишечника и что смесь, содержащая LC-PUFA, Lactobacillus paracasei и неперевариваемые олигосахариды, может восстановить проницаемость кишечника до нормального уровня.
Все еще существует потребность в улучшении детских смесей и композиций для детей младшего возраста, чтобы они приблизились к грудному молоку по структуре и функциям.
Сущность изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что комбинация питательных ингредиентов 2’-FL и 3’-GL имеет благоприятный эффект на барьерную функцию кишечника. Также было обнаружено, что ответ иммунной системы и микробиота отличаются, когда присутствуют оба 2’-FL и 3’-GL, по сравнению с тем, когда присутствует только один из этих ингредиентов. Было показано, что смесь 2’-FL и 3’-GL имеет благоприятный эффект на экспрессию щелочной фосфатазы, что является показателем улучшенного созревания барьерной функции кишечника и улучшенной защиты против кишечных патогенных бактерий. Эти эффекты еще более улучшаются в присутствии диетической масляной кислоты. Следовательно, питательная композиция, включающая оба 3’-GL и 2’-FL и предпочтительно дополнительно включающая масляную кислоту, будет иметь благоприятные эффекты на здоровье детей грудного возраста и детей раннего возраста.
Перечень вариантов осуществления
1. Питательная композиция для детей грудного возраста или детей раннего возраста, включающая:
a. 2’фукозиллактозу (2’-FL) и
b. 3’галактозиллактозу (3’-GL).
2. Питательная композиция в соответствии с вариантом осуществления 1, дополнительно включающая диетический бутират.
3. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где композиция по меньшей мере частично ферментирована продуцирующими молочную кислоту бактериями и включает от 0,1 до 1,5% масс. суммарного количества молочной кислоты и лактата в расчете на сухую массу питательной композиции, и где по меньшей мере 90% масс. от суммарного количества молочной кислоты и лактата составляет L-молочная кислота и L-лактат.
4. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где композиция дополнительно включает LC-PUFA, выбранные из группы DHA, ARA и EPA, предпочтительно DHA и EPA, предпочтительно DHA, EPA и ARA, более предпочтительно, включает по меньшей мере 1% масс. суммарного количества DHA, ARA и EPA в расчете на общее содержание жирных кислот.
5. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где композиция дополнительно включает галакто-олигосахариды и/или фрукто-олигосахариды.
6. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где питательная композиция выбрана из группы, состоящей из детской смеси первого уровня, детской смеси второго уровня или смеси для детей раннего возраста, предпочтительно детской смеси первого уровня.
7. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где композиция включает (i) 0,01-1 г 2’-FL на 100 мл питательной композиции; (ii) 0,075-7,5% масс. в расчете на сухую массу; и/или (iii) 0,015-1,5 г на 100 ккал.
8. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где питательная композиция включает (i) 0,010-0,500 г 3’-GL на 100 мл; (ii) 0,075-3,75% масс. в расчете на сухую массу и/или (iii) 0,015-0,75 г на 100 ккал.
9. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, включающая (i) 0,3-5% масс. диетической масляной кислоты в расчете на общее содержание жирных кислот; (ii) 10 мг - 175 мг на 100 мл; (iii) 15-250 мг на 100 ккал; и/или (iv) 0,075-1,3% масс. в расчете на сухую массу.
10. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, включающая (i) 0,2-5 г суммарного количества галакто-олигосахаридов и фрукто-олигосахаридов на 100 мл; (ii) 0,3-7,5 г на 100 ккал; и/или (iii) 1,5-35% масс. в расчете на сухую массу.
11. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения для улучшения барьерной функции кишечника, и/или для применения для улучшения иммунной системы, и/или для применения для улучшения кишечной микробиоты, и/или для применения в лечении или профилактике инфекций, в частности кишечных инфекций.
12. Питательная композиция в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в лечении или профилактике аллергии, для применения для индукции устойчивости к аллергенам, и/или для применения в профилактике и/или лечении атопического дерматита.
13. Питательная композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 11 или 12, где питательную композицию вводят детям грудного возраста или детям раннего возраста, предпочтительно детям грудного возраста.
14. Питательная композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10, или питательная композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 11-13, для применения для обеспечения питания детям грудного возраста.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к питательной композиции для детей грудного возраста или детей раннего возраста, включающей:
a. 2’фукозиллактозу и
b. 3’галактозиллактозу.
В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция дополнительно включает диетический бутират.
Еще в одном или дополнительном предпочтительном варианте осуществления питательная композиция по меньшей мере частично ферментирована продуцирующими молочную кислоту бактериями и включает от 0,1 до 1,5% масс. суммарного количества молочной кислоты и лактата в расчете на сухую массу питательной композиции, и где по меньшей мере 90% масс. от суммарного количества молочной кислоты и лактата составляет L-молочная кислота и L-лактат.
Изобретение также относится к указанной питательной композиции для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно для лечения, профилактики и/или облегчения заболевания и/или расстройства. Питательная композиция предпочтительно предназначена для применения для улучшения барьерной функции кишечника, для применения для улучшения иммунной системы, для применения для улучшения кишечной микробиоты, для применения в лечении или профилактике инфекций, в частности кишечных инфекций, и/или для применения в лечении или профилактике аллергии, предпочтительно для применения для индукции пероральной толерантности к аллергенам.
Этот аспект изобретения также можно сформулировать как применение указанной питательной композиции для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения заболевания и/или расстройства, предпочтительно для лечения заболевания. Применение питательной композиции предпочтительно для улучшения барьерной функции кишечника, для улучшения кишечной микробиоты и/или для лечения или профилактики инфекций, в частности кишечных инфекций.
Этот аспект изобретения также можно сформулировать как применение указанной питательной композиции для лечения, профилактики и/или облегчения заболевания и/или расстройства. Применение питательной композиции предпочтительно для улучшения барьерной функции кишечника, для улучшения кишечной микробиоты, для лечения или профилактики инфекций, в частности, кишечных инфекций, и/или для применения в лечении или профилактике аллергии, предпочтительно для применения для индукции пероральной толерантности к аллергенам.
Этот аспект изобретения также можно сформулировать как способ для лечения, профилактики и/или облегчения заболевания и/или расстройства, включающий введение указанной композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Способ предпочтителен для улучшения барьерной функции кишечника, для улучшения кишечной микробиоты, для лечения или профилактики инфекций, в частности кишечных инфекций, и/или для применения в лечении или профилактике аллергии, предпочтительно для применения для индукции пероральной толерантности к аллергенам.
Определения
В контексте настоящего изобретения термин “профилактика” означает "снижение риска (возникновения)" или "уменьшение тяжести". Термин "профилактика определенного состояния" также включает "лечение субъекта с (повышенным) риском указанного состояния".
В настоящем описании и в формуле изобретения глагол "включать" и формы его спряжения используются в неограничивающем смысле для обозначения того, что элементы, следующие за словом, включены, но элементы, не указанные специально, не исключаются. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности наличия более одного элемента, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает "по меньшей мере один".
2’-Фукозиллактоза
Питательная композиция по настоящему изобретению включает 2’-фукозиллактозу (2-‘FL). 2’-FL, как было обнаружено, улучшает барьерную функцию кишечника. Также 2’-FL, как было обнаружено, улучшает иммунную систему. Фукозиллактоза (FL) представляет собой неперевариваемый олигосахарид, присутствующий в грудном молоке. Он не присутствует в коровьем молоке. Он состоит из трех монозных звеньев, фукозы, галактозы и глюкозы, связанных вместе. Лактоза представляет собой галактозное звено, связанное с глюкозным звеном через бета 1,4 связь. Фукозное звено связано с галактозным звеном молекулы лактозы через альфа 1,2 связь (2’-фукозиллактоза, 2’-FL) или через альфа-1,3 связь с глюкозным звеном лактозы (3-Фукозиллактоза, 3-FL).
2’-FL, предпочтительно α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc, коммерчески доступна, например, от Sigma-Aldrich. Альтернативно, она может быть выделена из грудного молока, например, как описано в Andersson & Donald, 1981, J Chromatogr. 211:170-1744, или получена с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, например, как описано в Albermann et al, 2001, Carbohydrate Res. 334:97-103.
Предпочтительно питательная композиция в соответствии с изобретением включает от 10 мг до 1 г 2’-FL на 100 мл, более предпочтительно от 20 мг до 0,5 г, еще более предпочтительно от 40 мг до 0,2 г 2’-FL на 100 мл. В расчете на сухую массу питательная композиция по изобретению предпочтительно включает от 0,075% масс. до 7,5% масс. 2’-FL, более предпочтительно от 0,15% масс. до 3,75% масс. 2’-FL, еще более предпочтительно от 0,3% масс. до 1,5% масс. 2’-FL. В расчете на энергию питательная композиция по изобретению предпочтительно включает 0,015-1,5 г 2’-FL на 100 ккал, более предпочтительно 0,03-0,075 г 2’-FL на 100 ккал, еще более предпочтительно 0,06-0,3 г 2’-FL на 100 ккал. Меньшее количество фукозиллактозы будет менее эффективным для стимуляции иммунной системы или улучшения барьерной функции кишечника, тогда как слишком высокое количество будет приводить к неприемлемо высокой стоимости продукта.
3’галактозиллактоза
Питательная композиция по настоящему изобретению включает 3’-галактозиллактозу. Предпочтительно 3’-галактозиллактоза представляет собой трисахарид Gal-(бета 1,3)-Gal-(бета 1,4)-Glc. В контексте изобретения все указания 3-‘GL относятся к бета1,3’-галактозиллактозы, или бета3’-GL, если конкретно не уазано иное. Этот трисахарид можно вводить в подходящей матрице или в питательной композиции. Трисахарид может, например, быть частью смеси галакто-олигосахаридов (GOS), предпочтительно бета-галакто-олигосахаридов (бетаGOS). Бета3’-GL, как было обнаружено, улучшает барьерную функцию кишечника.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает 0,07-3,75% масс. Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc в расчете на сухую массу питательной композиции. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,07-0,375% масс. Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc в расчете на сухую массу питательной композиции. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 1,125-1,725% масс. Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc в расчете на сухую массу питательной композиции.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает 15-750 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 ккал питательной композиции. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 15-75 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 ккал питательной композиции. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 225-375 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 ккал питательной композиции.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает 10-500 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 мл питательной композиции. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 10-50 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 мл питательной композиции. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 150-250 мг Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc на 100 мл питательной композиции. Известно, что грудное молоко содержит низкие уровни 3’-GL, в частности не превышающие 5 мг/100 мл.
В предпочтительном варианте осуществления массовое отношение 2’-FL к 3’-GL находится в пределах от 10:1 до 1:10, предпочтительно от 5:1 до 1:5, более предпочтительно от 3:1 до 1:3.
Другие олигосахариды
Бета1,3’-галактозиллактоза может быть частью смеси галакто-олигосахаридов (GOS), предпочтительно бета-галакто-олигосахаридов (BGOS). Предпочтительно добавление GOS к питательной композиции по изобретению, в дополнение к бета1,3’-галактозиллактозе (бета3’-GL), например. Смесь GOS с различными размерами и связями будет иметь повышенный благоприятный эффект на микробиоту и улучшенную продукцию короткоцепочечных жирных кислот, что, в свою очередь, имеет еще больший улучшающий эффект на иммунную систему и/или на лечение или профилактику инфекций, в частности кишечных инфекций. Присутствие GOS, отличных от бета3’-GL, будет, в частности, иметь дополнительный эффект на барьерную функцию кишечника в толстом кишечнике и конце тонкого кишечника, тогда как бета3’-GL будет также, и наиболее, эффективной в тонком кишечнике. Комбинация 2’-FL и 3’-GL и GOS поэтому будет иметь еще больший улучшающий эффект на здоровье, в частности, на улучшение барьерной функции кишечника, на улучшение иммунной системы, на улучшение кишечной микробиоты и/или на лечение или профилактику инфекций, в частности кишечных инфекций.
В контексте изобретения подходящим путем образования GOS является обработка лактозы бета-галактозидазами. В зависимости от специфичности используемого фермента галактозное звено гидролизуют из лактозы и связывают с другим лактозным звеном через бета-связь с образованием трисахарида. Галактозное звено также можно связать с другим отдельным галактозным звеном с образованием дисахарида. Последующие галактозные звенья связывают с образованием олигосахаридов. Большинство таких образованных олигосахаридов имеют степень полимеризации (DP) 7 или ниже. В зависимости от фермента эти связи между галактозными остатками могут быть преимущественно бета1,4’, бета1,6’ или бета1,3’.
Подходящим путем для получения бета1,6’ и/или бета1,4’ GOS является использование бета-галактозидазы из Bacillus circulans. Коммерчески доступным источником BGOS является Vivinal-GOS от FrieslandCampina Domo (Amersfoort, The Netherlands). Vivinal-GOS включает BGOS преимущественно с DP2-8 (пик при DP3) и преимущественно с бета1,4’ и бета1,6’ связями, при этом бета1,4’ связи являются преобладающими. Бета1,4’- и бета1,6’-галактозил-лактоза может быть обогащена или очищена из этих GOS смесей, как известно в данной области техники, например с использованием эксклюзионной хроматографии. Другими коммерчески доступными источниками BGOS с преимущественно бета1,4’ и/или бета 1,6’ связями являются Oligomate 55 и 50 от Yakult и Cup Oligo от Nissin Sugar. Альтернативно бета1,4’- и бета1,6’-галактозиллактозы коммерчески доступны как отдельные компоненты (Carbosynth).
Подходящим путем для получения бета1,3’ GOS является использование бета-галактозидазы из S. thermophilus. Особенно подходящим является применение бета-галактозидазы из штамма CNCM I-1470 и/или CNCM I-1620 в способе, раскрытом в примере 4 FR2723960 или примере 6 EP0778885. S. thermophilus CNCM I-1620 был депонирован в соответствии с Будапештским договором от 23 августа 1995 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов института Пастера, Париж, Франция, компанией Compagnie Gervais Danone. Штамм S. thermophilus CNCM I-1620 также указывают как штамм S. thermophilus ST065. S. thermophilus CNCM I-1470 был депонирован в соответствии с Будапештским договором от 25 августа 1994 в Национальной коллекции культур микроорганизмов института Пастера, Париж, Франция, компанией Compagnie Gervais Danone. Композиция этого GOS также описана более подробно в LeForestier et. al., 2009 Eur J Nutr, 48:457-464. Оба штамма также были опубликованы в WO 96/06924. Другим коммерчески доступным GOS с высоким содержанием бета1,3 и бета1,6 галакто-олигосахаридов является Bimuno от Clasado или Purimune от GTC Nutrition. Бета1,6’- и бета1,3’-галактозил-лактоза может быть обогащена или очищена из этих смесей GOS, как известно в данной области техники, например с использованием эксклюзионной хроматографии. Альтернативно, чистая бета1,3’-галактозил-лактоза коммерчески доступна (Carbosynth).
GOS, включая BGOS, являются неперевариваемыми. Человеческие пищеварительные ферменты (включая человеческую лактазу) не способны к гидролизации GOS. Поэтому GOS после употребления достигает толстого кишечника интактным и доступен для ферментации кишечной микробиотой.
Предпочтительно питательная композиция включает по меньшей мере 250 мг GOS на 100 мл, более предпочтительно по меньшей мере 400, еще более предпочтительно по меньшей мере 600 мг на 100 мл. Предпочтительно питательная композиция включает не более чем 2500 мг GOS на 100 мл, предпочтительно не более чем 1500 мг, более предпочтительно не более чем 1000 мг. Более предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает GOS в количестве 250-2500 мг/100 мл, еще более предпочтительно в количестве 400-1500 мг/100мл, еще более предпочтительно в количестве 600-1000 мг/100 мл.
Предпочтительно питательная композиция включает по меньшей мере 1,75% масс. GOS в расчете на сухую массу всей композиции, более предпочтительно по меньшей мере 2,8% масс., еще более предпочтительно по меньшей мере 4,2% масс., все значения в расчете на сухую массу всей композиции. Предпочтительно питательная композиция включает не более чем 17,5% масс. GOS в расчете на сухую массу всей композиции, более предпочтительно не более чем 10,5% масс., еще более предпочтительно не более чем 7% масс. Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает GOS в количестве 1,75-17,5% масс., более предпочтительно в количестве 2,8-10,5% масс., наиболее предпочтительно в количестве 4,2-7% масс., все значения указаны в расчете на сухую массу всей композиции.
Предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере 0,35 г GOS на 100 ккал, более предпочтительно по меньшей мере 0,6 г, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8 г на 100 ккал. Предпочтительно питательная композиция включает не более чем 3,7 г GOS на 100 ккал, предпочтительно не более чем 2,5 г на 100 ккал, более предпочтительно не более чем 1,5 г на 100 ккал. Более предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает GOS в количестве 0,35-3,7 г на 100 ккал, еще более предпочтительно в количестве 0,6-2,5 г на 100мл, еще более предпочтительно в количестве 0,8-1,5 г на 100 мл.
Более низкие количества приводят к менее эффективной композиции, тогда как присутствие более высоких количеств GOS может привести к побочным эффектам, таким как осмотические нарушения, абдоминальная боль, вздутие, газообразование и/или метеоризм.
Общее количество GOS, определенное для питательной композиции по изобретению, включает количество бета1,3’-галактозиллактозы.
В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,25-2,5 г галакто-олигосахаридов на 100 мл, где от 10 мг до 500 мг на 100 мл галакто-олигосахаридов приходится на Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,25-2,5 г галакто-олигосахаридов на 100 мл, где количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc составляет больше чем 20% масс. в расчете на общее количество галакто-олигосахаридов. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,25-2,5 г галакто-олигосахаридов на 100 мл, где количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc находится между 10-500 мг на 100 мл. В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,25-2,5 г галакто-олигосахаридов на 100 мл, где количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glcс составляет больше чем 20% масс. в расчете на общее количество галакто-олигосахаридов, и где количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc находится между 150 мг и 250 мг на 100 мл.
В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция включает 0,25-2,5 г галакто-олигосахаридов на 100 мл, где количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc находится между 10 мг и 50 мг на 100 мл.
Количество бета1,3’-галактозил-лактозы в этом препарате GOS предпочтительно находится в пределах 60-65% масс. в расчете на общее количество галакто-олигосахаридов (за исключением лактозы, галактозы и глюкозы). Другие предпочтительные источники бета1,3’-галактозил-лактозы включают Bimuno (Clasado) или Purimune (GTC Nutrition).
Предпочтительно - как подробнее объясняется ниже - питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением также включает фрукто-олигосахариды (FOS).
Диетический бутират
Питательная композиция по изобретению предпочтительно содержит диетический бутират. Бутират, как было обнаружено, улучшает барьерную функцию кишечника. Питательная композиция предпочтительно включает между 0,3 и 5% масс. масляной кислоты в расчете на массу всех жирных ацильных цепей, предпочтительно между 0,6 и 5% масс., еще более предпочтительно между 1 и 5% масс. Питательная композиция по изобретению предпочтительно содержит трибутирин (т.е. триглицерид с 3 цепями масляной кислоты, присоединенными к глицериновому скелету через сложноэфирные связи).
Предпочтительно питательная композиция содержит 0,075-1,3% масс. бутирата в расчете на сухую массу композиции, предпочтительно между 0,15 и 1,3% масс., и более предпочтительно между 0,25 и 1,3% масс. Альтернативно, питательная композиция включает 0,015-0,25 г бутирата на 100 ккал, предпочтительно 0,03-0,25 г бутирата на 100 ккал, и более предпочтительно 0,05-0,25 г бутирата на 100 ккал. Когда питательная композиция представляет собой жидкость, композиция предпочтительно содержит 0,01-0,175 г бутирата на 100 мл, более предпочтительно 0,02-0,175 г бутирата на 100 мл, и более предпочтительно 0,035-0,175 г бутирата на 100 мл. Известно, что грудное молоко содержит очень низкие уровни бутирата, в частности < 0,1% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот.
Диетический бутират может поставляться из любого подходящего источника, известного в данной области техники. Неограничивающие источники диетического бутирата включают жиры животного происхождения и производные продукты, такие как, но не ограничиваясь этим, молоко, молочный жир, масляный жир, топленое масло, масло, пахта, масляная сыворотка, сливки; продукты, полученные микробной ферментацией, такие как, но не ограничиваясь этим, йогурт и ферментированная пахта; и продукты растительного происхождения, полученные из масел семян, такие как ананас и/или ананасовое масло, абрикос и/или абрикосовое масло, ячмень, овес, коричневый рис, отруби, зеленая фасоль, бобовые, листовая зелень, яблоки, киви, апельсины. В некоторых вариантах осуществления диетический бутират получают синтетически. Предпочтительным источником диетического бутирата является молочный жир жвачных животных, предпочтительно жир коровьего молока.
В вариантах осуществления, где диетический бутират получают синтетически, химическая структура диетического бутирата может быть модифицирована при необходимости. Кроме того, диетический бутират, полученный синтетически, может быть очищен любыми способами, известными в данной области, для получения очищенной диетической бутиратной добавки, которая может быть включена в пищевые композиции, раскрытые в настоящей заявке. Диетический бутират может обеспечиваться липидами молочных продуктов и/или формами бутирата, связанными с триглицеридами.
В некоторых вариантах осуществления диетический бутират может включать бутиратные соли, например бутират натрия, бутират калия, бутират кальция, бутират магния и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления диетический бутират включает подходящую бутиратную соль, покрытую одним или несколькими жирами или липидами. В некоторых вариантах осуществления, в которых диетический бутират включает бутиратную соль, покрытую жиром, пищевая композиция может быть сухой порошкообразной композицией, в которую включен диетический бутират. Предпочтительно диетический бутират поставляется как часть триглицерида. Это выгодно, потому что бутират является летучим (и имеет неприятный запах), если его используют в свободной или солевой форме. В триглицеридной форме бутират будет высвобождаться в желудке и после выхода из него из-за действия липаз.
Комбинация 2’-FL, бутирата и 3’-GL будет иметь еще больший улучшающий эффект на здоровье, в частности, на улучшение барьерной функции кишечника, на улучшение иммунной системы, на улучшение кишечной микробиоты и/или на лечение или профилактику инфекций, в частности кишечных инфекций.
В предпочтительном варианте осуществления массовое отношение 2’-FL к диетическому бутирату находится в пределах 10:1-1:10, предпочтительно 5:1-1:5, более предпочтительно 3:1-1:3.
Ферментированная композиция
Питательная композиция по изобретению предпочтительно является, по меньшей мере частично, ферментированной. Частично ферментированная питательная композиция включает по меньшей мере часть композиции, которая была ферментирована продуцирующими молочную кислоту бактериями. Было показано, что частично ферментированная композиция имеет защитный эффект на поддержание кишечной проницаемости в условиях физического или психологического стресса.
Ферментация предпочтительно происходит в процессе производства пищевой композиции. Предпочтительно, чтобы пищевая композиция не содержала в конечном продукте значительных количеств жизнеспособных бактерий, и этого можно достичь путем тепловой инактивации после ферментации или инактивации другими способами. Предпочтительно ферментированная композиция представляет собой продукт, полученный из молока, который представляет собой молочный субстрат, ферментируемый бактериями, продуцирующими молочную кислоту, при этом молочный субстрат содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина или их смеси. Соответственно, пищевые композиции, содержащие ферментированные композиции и неперевариваемый олигосахарид, и способ их получения описаны в WO 2009/151330, WO 2009/151331 и WO 2013/187764.
Ферментированная композиция предпочтительно содержит фрагменты бактериальных клеток, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (LTA), липопротеины, нуклеотиды и/или капсульные полисахариды. Предпочтительно использовать ферментированную композицию, содержащую инактивированные бактерии и/или фрагменты клеток, непосредственно как часть конечного пищевого продукта, поскольку это приведет к более высокой концентрации фрагментов бактериальных клеток. Когда используются коммерческие препараты бактерий, продуцирующих молочную кислоту, их обычно промывают и отделяют материал от водной ростовой среды, содержащей фрагменты бактериальных клеток, тем самым уменьшая или устраняя присутствие фрагментов бактериальных клеток. Кроме того, при ферментации и/или других взаимодействиях бактерий, продуцирующих молочную кислоту, с молочным субстратом могут образовываться дополнительные биоактивные соединения, такие как короткоцепочечные жирные кислоты, биоактивные пептиды и/или олигосахариды и другие метаболиты, что также может приводить к функции кишечной микробиоты больше похожей на функцию кишечной микробиоты у младенцев, вскармливаемых грудью. Такие биоактивные соединения, которые продуцируются во время ферментации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, также можно назвать постбиотиками. Считается, что композиция, содержащая такие постбиотики, преимущественно ближе к грудному молоку, поскольку грудное молоко не является чистой синтетической смесью, а содержит метаболиты, бактериальные клетки, фрагменты клеток и т.п. Следовательно, ферментированная композиция, в частности продукт, полученный из ферментированного молока, как полагают, имеет улучшенный эффект по сравнению с продуктом, полученным из неферментированного молока, без или просто с добавлением бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на предотвращение преждевременного созревания кишечника у младенца, и индуцируя у младенца паттерн созревания кишечника, который больше похож на паттерн созревания кишечника, наблюдаемый у младенцев, вскармливаемых грудным молоком.
Предпочтительно конечная питательная композиция включает 5-97,5% масс. ферментированной композиции в расчете на сухую массу, более предпочтительно 10-90% масс., более предпочтительно 20-80% масс., еще более предпочтительно 25-60% масс. Для определения, что конечная питательная композиция включает по меньшей мере частично ферментированную композицию, и для определения степени ферментации может быть взят уровень суммарного количества молочной кислоты и лактата в конечной питательной композиции, поскольку это является метаболическим конечным продуктом, полученным в результате ферментации продуцирующими молочную кислоту бактериями. Представленная конечная питательная композиция предпочтительно включает от 0,1 до 1,5% масс. суммарного количества молочной кислоты и лактата в расчете на сухую массу композиции, более предпочтительно 0,15-1,0% масс., еще более предпочтительно 0,2-0,5% масс. Альтернативно питательная композиция включает 0,02-0,3 г суммарного количества молочной кислоты и лактата на 100 ккал, предпочтительно 0,03-0,2 суммарного количества молочной кислоты и лактата на 100 ккал, предпочтительно 0,04-0,1 суммарного количества молочной кислоты и лактата на 100 ккал. Альтернативно, когда композиция представляет собой жидкость, суммарное количество молочной кислоты и лактата составляет 0,0125-0,2 г на 100 мл, предпочтительно 0,02-0,125 г на 100 мл, предпочтительно 0,03-0,07 г на 100 мл.
Предпочтительно по меньшей мере 50% масс., еще более предпочтительно по меньшей мере 90% масс. суммарного количества молочной кислоты и лактата находится в форме L(+)-изомера. Таким образом, в одном варианте осуществления суммарное количество L(+)-молочной кислоты и L(+)-лактата составляет больше чем 50% масс., более предпочтительно больше чем 90% масс., в расчете на суммарное количество всей молочной кислоты и лактата. При этом, L(+)-лактат и L(+)-молочная кислота также указаны как L-лактат и L-молочная кислота.
Комбинация 2’-FL, 3’-GL и необязательного бутирата и частично ферментированной композиции будет иметь еще больший улучшающий эффект на здоровье, в частности, на улучшение барьерной функции кишечника, на улучшение иммунной системы, на улучшение кишечной микробиоты и/или на лечение или профилактику инфекций, в частности кишечных инфекций.
LCPUFA
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA). LC-PUFA представляют собой жирные кислоты или жирные ацильные цепи с длиной 20-24 атомов углерода, предпочтительно 20 или 22 атомов углерода, включающие две или более ненасыщенные связи. Предпочтительно питательная композиция включает по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно три LC-PUFA, выбранных из докозагексаеновой кислоты (DHA), ейкозапентаеновой кислоты (EPA) и арахидоновой кислоты (ARA). Было обнаружено, что эти LC-PUFA улучшают барьерную функцию кишечника, и поэтому особенно полезным может быть объединение с 2-‘FL и 3’-GL и необязательным бутиратом для еще большего улучшения кишечного барьера. Эта комбинация имеет неожиданные полезные эффекты и предпочтительно работает синергетически. Предпочтительно питательная композиция включает повышенное количество таких LC-PUFA. Существующие детские смеси первого уровня, в случае, если они включают эти LC-PUFA, типично имеют суммарное количество DHA, ARA и EPA 0,4-0,9% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. В питательной композиции в соответствии с настоящим изобретением количество этих LC-PUFA предпочтительно выше 1% масс., предпочтительно выше 1,1% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот. Предпочтительно количество этих LC-PUFA не более чем 15% масс., предпочтительно не более чем 5% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот, предпочтительно не более чем 2,5% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. Более предпочтительно, когда количество этих LC-PUFA находится в пределах 1-15% масс., предпочтительно 1,1-5% масс., более предпочтительно 1,5-2,5% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот. Это считается наиболее оптимальным диапазоном для использования в детской смеси для улучшения барьерной функции кишечника.
Предпочтительно количество DHA составляет по меньшей мере 0,4, предпочтительно по меньшей мере 0,5% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот. Предпочтительно количество DHA составляет не более чем 1% масс., предпочтительно не более чем 0,7% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот. Предпочтительно питательная композиция включает количество DHA по меньшей мере 0,5% масс., предпочтительно по меньшей мере 0,7% масс., более предпочтительно по меньшей мере 1% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот. Предпочтительно питательная композиция включает количество DHA 0,4-1% масс., более предпочтительно 0,5-0,7% масс.
Предпочтительно питательная композиция включает количество EPA по меньшей мере 0,09% масс., предпочтительно по меньшей мере 0,1% масс., в расчете на общее содержание жирных кислот, и предпочтительно не более чем 0,4% масс., более предпочтительно не более чем 0,1% масс. Предпочтительно питательная композиция включает количество EPA 0,09-0,4% масс., более предпочтительно 0,1-0,2% масс.
Предпочтительно питательная композиция включает количество ARA по меньшей мере 0,25% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, более предпочтительно по меньшей мере 0,5% масс. и предпочтительно не более чем 1% масс. Предпочтительно питательная композиция включает количество ARA 0,4-1% масс., более предпочтительно 0,5-0,7% масс.
Предпочтительно питательная композиция включает DHA в количестве 0,4-1,0% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, и EPA в количестве 0,09-0,4% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. Более предпочтительно питательная композиция включает DHA в количестве 0,5-0,7% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, и EPA в количестве от 0,1 до 0,2% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. Особенно предпочтительно, когда питательная композиция включает DHA в количестве больше чем 0,5% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, и EPA в количестве больше чем 0,1% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. Предпочтительно питательная композиция включает DHA, EPA и ARA в количестве 0,4-1,0% масс., 0,09-0,4% масс. и 0,25-1,0% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, соответственно. Более предпочтительно питательная композиция включает DHA, EPA и ARA в количестве 0,5-0,7% масс., 0,1-0,2% масс. и 0,5-0,7% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, соответственно.
Предпочтительно питательная композиция включает DHA в количестве 20-50 мг/100 ккал и EPA в количестве 4,3-10,8 мг/100 ккал. Более предпочтительно питательная композиция включает DHA в количестве 25-33,5 мг/100 ккал и EPA в количестве 5,4-7,2 мг/100 ккал. Наиболее предпочтительно питательная композиция включает DHA в количестве около 25 мг/100 ккал и EPA в количестве около 5,4 мг/100 ккал. В этих вариантах осуществления присутствие ARA необязательно. В случае присутствия, количество ARA предпочтительно составляет 12,5-50 мг, более предпочтительно 25-33,5 мг и наиболее предпочтительно около 25 мг на 100 ккал. Предпочтительно массовое отношение DHA/ARA составляет 0,9-2.
Предпочтительно массовое отношение DHA/EPA/ARA составляет 1: (0,19 -0,7) : (0,9-2,0). Такие количества и/или соотношения DHA, EPA и ARA являются оптимальными для дальнейшего улучшения барьерной функции кишечника, для дальнейшего улучшения кишечной микробиоты и/или для лечения или профилактики инфекций, в частности кишечных инфекций. LC-PUFA могут обеспечиваться в виде свободных жирных кислот, в триглицеридной форме, в диглицеридной форме, в моноглицеридной форме, в форме фосфолипидов или в виде смеси одного или нескольких из вышеперечисленных. Подходящими источниками этих LC-PUFA являются, например, рыбий жир и масло из Mortierella alpina.
Предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает липид, где липид включает LC-PUFA, выбранные из группы, состоящей из DHA, EPA и ARA, и где суммарное количество DHA, ARA и EPA составляет по меньшей мере 1% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, и при этом липид включает DHA в количестве 0,4-1,0% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, EPA в количестве 0,09-0,4% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот и ARA в количестве 0,25-1% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. В этом варианте осуществления более предпочтительно, когда липид включает DHA в количестве 0,5-0,7% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот, EPA в количестве от 0,1-0,2% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот и ARA в количестве 0,5-0,7% масс. в расчете на общее содержание жирных кислот. Более предпочтительно липид включает DHA в количестве по меньшей мере 0,5% масс., EPA в количестве по меньшей мере 0,1% масс. и ARA в количестве по меньшей мере 0,5% масс., все значения указаны в расчете на общее содержание жирных кислот.
Комбинация 2’-FL, 3’-GL и необязательного бутиратп и LC-PUFA, в частности EPA, DHA и/или ARA, будет иметь еще больший улучшающий эффект на здоровье, в частности, на улучшение барьерной функции кишечника, на улучшение иммунной системы, на улучшение кишечной микробиоты и/или на лечение или профилактику инфекций, в частности кишечных инфекций.
Питательная композиция
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением не является грудным молоком.
Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для детей грудного возраста или детей раннего возраста.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает липиды, белки и углеводы, и ее предпочтительно вводят в жидкой форме. Питательная композиция по изобретению также может быть в форме сухой пищи, предпочтительно в форме порошка, к которому прилагаются инструкции по смешиванию указанного сухого корма, предпочтительно порошка, с подходящей жидкостью, предпочтительно водой. Питательная композиция по изобретению, таким образом, может быть в форме порошка, подходящего для восстановления водой с получением питательной композиции, готовой к употреблению, предпочтительно готовой к употреблению детской смеси первого уровня, детской смеси второго уровня или смеси для детей раннего возраста, более предпочтительно готовой к употреблению детской смеси первого уровня или детской смеси второго уровня. Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает другие фракции, такие как витамины, минералы, микроэлементы и другие питательные микроэлементы, чтобы сделать ее полной питательной композицией. Предпочтительно детские смеси первого уровня и детские смеси второго уровня включают витамины, минералы, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с международными директивами.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает липиды, белки и перевариваемые углеводы, при этом липиды обеспечивают 25-65% от общего количества калорий, белки обеспечивают 6,5-16% от общего количества калорий, а перевариваемые углеводы обеспечивают 20-80% от общего количества калорий. Предпочтительно в питательной композиции по изобретению липиды обеспечивают 30-55% от общего количества калорий, белки обеспечивают 7-9% от общего количества калорий, а перевариваемые углеводы обеспечивают 35-60% от общего количества калорий. Для расчета % от общего количества калорий для белка необходимо учитывать общее количество энергии, обеспечиваемой белками, пептидами и аминокислотами.
Предпочтительно липиды обеспечивают 3-7 г липидов на 100 ккал, предпочтительно 3,5-6 г на 100 ккал, белки обеспечивают 1,6-4 г на 100 ккал, предпочтительно 1,7-2,3 г на 100 ккал, а перевариваемые углеводы обеспечивают 5-20 г на 100 ккал, предпочтительно 8-15 г на 100 ккал питательной композиции. Предпочтительно питательная композиция по изобретению включает липиды, обеспечивающие 3,5-6 г на 100 ккал, белки, обеспечивающие 1,7-2,3 г на 100 ккал, и перевариваемые углеводы, обеспечивающие 8-15 г на 100 ккал питательной композиции.
Предпочтительно липиды обеспечивают 2,5-6,5 г липидов на 100 мл, предпочтительно 2,5-4 г на 100 мл, белки обеспечивают 1-3 г на 100 мл, предпочтительно 1-1,5 г на 100 мл, а перевариваемые углеводы обеспечивают 3-13 г на 100 мл, предпочтительно 5-10 г на 100 мл питательной композиции. Предпочтительно питательная композиция по изобретению включает липиды, обеспечивающие 2,0-6,5 г на 100 мл, белки, обеспечивающие 1-3 г на 100 мл, и перевариваемые углеводы, обеспечивающие 5-10 г на 100 мл питательной композиции.
Предпочтительно липиды составляют 15-45% масс., предпочтительно 20-30% масс. в расчете на сухую массу композиции, белки обеспечивают 8-20% масс., предпочтительно 8,5-11,5% масс. в расчете на сухую массу композиции, а перевариваемые углеводы составляют 25-90% масс., предпочтительно 40-75% масс. в расчете на сухую массу композиции. Предпочтительно питательная композиция по изобретению включает липиды, обеспечивающие 20-30% масс., белки, обеспечивающие 8,5-11,5% масс., и перевариваемые углеводы, обеспечивающие 40-75% масс., все значения указаны в расчете на сухую массу композиции.
Композиция по изобретению предпочтительно включает липиды. Предпочтительно композиция по изобретению включает по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из растительных липидов. Предпочтительно композиция по изобретению включает комбинацию растительных липидов и по меньшей мере одного масла, выбранного из группы, состоящей из рыбьего жира, масла водорослей, масла грибов и бактериального масла. Липиды в питательной композиции по изобретению предпочтительно обеспечивают 3-7 г на 100 ккал питательной композиции, предпочтительно липиды обеспечивают 3,5-6 г на 100 ккал. Когда она находится в жидкой форме, например в виде готовой к употреблению жидкости, питательная композиция предпочтительно включает 2,0-6,5 г липидов на 100 мл, более предпочтительно 2,5-4,0 г на 100 мл. В расчете на сухую массу питательная композиция по изобретению предпочтительно включает 15-45% масс. липидов, более предпочтительно 20-30% масс. Предпочтительно питательная композиция по изобретению включает по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два источника липидов, выбранных из группы, состоящей из рапсового масла (такого как масло сурепки, рапсовое масло с низким содержанием эруковой кислоты и масло канолы), подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, сафлорового масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, оливкового масла, рыбьего жира, микробного жира, кокосового масла, пальмоядрового масла.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно содержит белок. Белок, используемый в питательной композиции, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из животных белков не относящегося к человеку происхождения, предпочтительно молочных белков, растительных белков, таких как предпочтительно соевый белок и/или рисовый белок, и их смесей. Питательная композиция по изобретению предпочтительно содержит казеин и/или сывороточный белок, более предпочтительно сывороточные белки и/или казеин из коровьего молока. Таким образом, в одном варианте осуществления белок в питательной композиции по изобретению включает белок, выбранный из группы, состоящей из белка молочной сыворотки и казеина, предпочтительно белка молочной сыворотки и казеина, предпочтительно белка молочной сыворотки и/или казеина из коровьего молока. Предпочтительно белок содержит менее 5% масс., в расчете на общее количество белка, свободных аминокислот, дипептидов, трипептидов или гидролизованного белка. Питательная композиция по изобретению предпочтительно содержит казеин и белки сыворотки при массовом соотношении казеин:белок молочной сыворотки от 10:90 до 90:10, более предпочтительно от 20:80 до 80:20, еще более предпочтительно от 35:65 до 55:45.
В одном варианте осуществления белок, используемый в питательной композиции, включает гидролизованный белок, предпочтительно белок, используемый в питательной композиции, представляет собой гидролизованный белок или, другими словами, состоит из гидролизованного белка. Гидролизованный белок также может содержать свободные аминокислоты. Предпочтительно гидролизованный белок включает гидролизованный сывороточный белок. В одном варианте осуществления белок, используемый в питательной композиции, представляет собой свободные аминокислоты или, другими словами, состоит из свободных аминокислот. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления питательная композиция по настоящему изобретению, включающая 2’-FL и диетический бутират и, необязательно, также 3’GL, дополнительно включает гидролизованный белок и/или свободные аминокислоты. Такие композиции предпочтительно используются для профилактики или лечения аллергии, более предпочтительно для профилактики или лечения аллергии на белок коровьего молока.
Массовая доля белка в расчете на сухую массу питательной композиции по изобретению рассчитывается согласно методу Кьельдаля путем измерения общего азота и использования коэффициента преобразования 6,38 в случае казеина или коэффициента преобразования 6,25 для других белков, кроме казеина. Термин «белок» или «белковый компонент», используемый в настоящем изобретении, относится к сумме белков, пептидов и свободных аминокислот.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает белок, обеспечивающий от 1,6 до 4,0 г белка на 100 ккал питательной композиции, предпочтительно от 11,7 до 2,3 г на 100 ккал питательной композиции. Слишком низкое содержание белка на общее количество калорий приведет к менее адекватному росту и развитию детей грудного и раннего возраста. Слишком большое количество вызовет метаболическую нагрузку, например, на почки младенцев и детей раннего возраста. В жидкой форме, в виде готовой к употреблению жидкости, питательная композиция предпочтительно содержит от 1,0 до 3,0 г, более предпочтительно от 1,0 до 1,5 г белка на 100 мл. В расчете на сухую массу настоящая питательная композиция предпочтительно включает от 8 до 20% масс. белка, более предпочтительно от 8,5 до 11,5% масс., в расчете на общую сухую массу питательной композиции.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает перевариваемые углеводы, обеспечивающие 5-20 г на 100 ккал, предпочтительно 8-15 г на 100 ккал. Предпочтительно количество перевариваемых углеводов в питательной композиции по изобретению составляет 25-90% масс., более предпочтительно 8,5-11,5% масс., в расчете на общую сухую массу композиции. Предпочтительными перевариваемыми углеводами являются лактоза, глюкоза, сахароза, фруктоза, галактоза, мальтоза, крахмал и мальтодекстрин. Лактоза является основным перевариваемым углеводом, присутствующим в грудном молоке. Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает лактозу. Предпочтительно питательная композиция по изобретению не включает высокие количества углеводов, отличных от лактозы. По сравнению с перевариваемыми углеводами, такими как мальтодекстрин, сахароза, глюкоза, мальтоза и другие перевариваемые углеводы с высоким гликемическим индексом, лактоза имеет более низкий гликемический индекс и поэтому является предпочтительной. Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает перевариваемые углеводы, при этом по меньшей мере 35% масс., более предпочтительно по меньшей мере 50% масс., более предпочтительно по меньшей мере 60% масс., более предпочтительно по меньшей мере 75% масс., еще более предпочтительно по меньшей мере 90% масс., наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% масс. перевариваемых углеводов приходится на лактозу. В расчете на сухую массу питательная композиция по изобретению предпочтительно включает по меньшей мере 25% масс. лактозы, предпочтительно по меньшей мере 40% масс., более предпочтительно по меньшей мере 50% масс. лактозы.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает неперевариваемые олигосахариды (NDO). Термин “олигосахариды” в контексте настоящей заявки относится к сахаридам со степенью полимеризации (DP) 2-250, предпочтительно с DP 2-100, более предпочтительно 2-60, еще более предпочтительно 2-10. Если олигосахарид с DP 2-100 включают в питательную композицию по изобретению, это приводит к композициям, которые могут содержать олигосахариды с DP 2-5, с DP 50-70 и/или с DP 7-60. Термин “неперевариваемые олигосахариды” (NDO) в контексте настоящего изобретения относится к олигосахаридам, которые не перевариваются в кишечнике под действием кислот или пищеварительных ферментов, присутствующих в верхнем пищеварительном тракте человека, например тонком кишечнике и желудке, но которые предпочтительно ферментируются кишечной микробиотой человека. Например, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины считаются перевариваемыми.
Предпочтительно неперевариваемые олигосахариды по изобретению являются растворимыми. Термин "растворимый" в контексте настоящей заявки, когда имеет отношение к полисахаридам, волокнам или олигосахаридам, означает, что вещество является по меньшей мере растворимым в соответствии со способом, описанным L. Prosky et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).
Бета1,3’-галактозиллактоза может присутствовать в питательной композиции в соответствии с изобретением как таковая, или как часть смеси галакто-олигосахаридов (GOS), предпочтительно бета-галакто-олигосахаридов (BGOS). В предпочтительном варианте осуществления бета1,3’-галактозиллактоза присутствует как часть смеси галакто-олигосахаридов. В одном варианте осуществления количество Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc составляет больше чем 20% масс. в расчете на общее количество галакто-олигосахаридов.
Предпочтительно питательная композиция по изобретению также включает фрукто-олигосахариды (FOS). Термин “фрукто-олигосахариды” в контексте настоящего изобретения относится к углеводам, состоящим на более чем 50%, предпочтительно на более чем 65% из фруктозных звеньев, в расчете на мономерные субъединицы, где по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, фруктозных звеньев связаны вместе через бета-гликозидную связь, предпочтительно бета-2,1 гликозидную связь. Глюкозное звено может присутствовать на восстанавливающем конце цепи фруктозных звеньев. Предпочтительно фрукто-олигосахариды имеют DP или среднюю DP в пределах 2-250, более предпочтительно 2-100, еще более предпочтительно 10-60. Термин “фрукто-олигосахариды” включает леван, гидролизованный леван, инулин, гидролизованный инулин и синтезированные фрукто-олигосахариды. Предпочтительно препарат включает короткоцепочечные фрукто-олигосахариды со средней степенью полимеризации (DP) 3-6, более предпочтительно гидролизованный инулин или синтетический фрукто-олигосахарид. Предпочтительно препарат включает длинноцепочечные фрукто-олигосахариды со средней DP выше 20. Предпочтительно препарат включает как короткоцепочечные, так и длинноцепочечные фрукто-олигосахариды. Фрукто-олигосахарид, подходящий для применения в композиции по изобретению, также является легко доступным коммерческим продуктом, например RaftilineHP (Orafti). Предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере 25 мг FOS на 100 мл, более предпочтительно по меньшей мере 40, еще более предпочтительно по меньшей мере 60 мг. Предпочтительно композиция включает не более чем 250 мг FOS на 100 мл, более предпочтительно не более чем 150 мг на 100 мл, и наиболее предпочтительно не более чем 100 мг на 100 мл. Количество FOS предпочтительно составляет 25-250 г фрукто-олигосахаридов на 100 мл, предпочтительно 40-150 г на 100 мл, более предпочтительно 60-100 г на 100 мл. Предпочтительно питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере 0,15% масс. FOS в расчете на сухую массу, более предпочтительно по меньшей мере 0,25% масс., еще более предпочтительно по меньшей мере 0,4% масс. Предпочтительно композиция включает не более чем 1,5% масс. FOS в расчете на общую сухую массу композиции, более предпочтительно не более чем 2% масс. Присутствие FOS демонстрирует еще больший улучшающий эффект на микробиоту и ее продукцию SCFA.
Предпочтительно питательная композиция по изобретению включает смесь галакто-олигосахаридов (включая бета1,3’-галактозиллактозу) и фрукто-олигосахаридов. Предпочтительно смесь галакто-олигосахаридов и фрукто-олигосахаридов присутствует в массовом отношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, более предпочтительно от 1/1 до 19/1, более предпочтительно от 2/1 до 15/1, более предпочтительно от 5/1 до 12/1, еще более предпочтительно от 8/1 до 10/1, еще более предпочтительно в отношении около 9/1. Это массовое отношение особенно предпочтительно, когда галакто-олигосахариды имеют низкую среднюю DP, а фрукто-олигосахариды имеют относительно высокую DP. Наиболее предпочтительной является смесь галакто-олигосахаридов со средней DP ниже 10, предпочтительно ниже 6, и фрукто-олигосахаридов со средней DP выше 7, предпочтительно выше 11, еще более предпочтительно выше 20.
В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция по изобретению включает смесь короткоцепочечных (sc) фрукто-олигосахаридов и длинноцепочечных (lc) фрукто-олигосахаридов. Предпочтительно смесь короткоцепочечных фрукто-олигосахаридов и длинноцепочечных фрукто-олигосахаридов присутствует в массовом отношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, еще более предпочтительно от 1/10 до 19/1, более предпочтительно от 1/5 до 15/1, более предпочтительно от 1/1 до 10/1. Предпочтительной является смесь короткоцепочечных фрукто-олигосахаридов со средней DP ниже 10, предпочтительно ниже 6, и фрукто-олигосахаридов со средней DP выше 7, предпочтительно выше 11, еще более предпочтительно выше 20.
В другом предпочтительном варианте осуществления питательная композиция по изобретению включает смесь короткоцепочечных (sc) фрукто-олигосахаридов и короткоцепочечных (sc) галакто-олигосахаридов. Предпочтительно смесь короткоцепочечных фрукто-олигосахаридов и короткоцепочечных галакто-олигосахаридов присутствует в массовом отношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, еще более предпочтительно от 1/10 до 19/1, более предпочтительно от 1/5 до 15/1, более предпочтительно от 1/1 до 10/1. Предпочтительной является смесь короткоцепочечных фрукто-олигосахаридов и короткоцепочечных галакто-олигосахаридов со средней DP ниже 10, предпочтительно ниже 6.
Питательная композиция по изобретению предпочтительно включает 1,75-17,5% масс. общего количества неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно 2,8-10,5% масс., наиболее предпочтительно 4,2-7% масс., в расчете на сухую массу питательной композиции. В расчете на 100 мл питательная композиция по изобретению предпочтительно включает 0,25-2,5 г общего количества неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно 0,4-1,5 г, наиболее предпочтительно 0,6-1 г, на 100 мл питательной композиции. Меньшее количество неперевариваемых олигосахаридов будет менее эффективным для улучшения барьерной функции кишечника, тогда как слишком высокое количество будет приводить к побочным эффектам, таким как вздутие и дискомфорт в животе. Общее количество неперевариваемых олигосахаридов включает галакто-олигосахариды, включая бета3’-GL, фрукто-олигосахариды и любые дополнительные неперевариваемые олигосахариды, которые также могут присутствовать в композиции.
Также важно, чтобы питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением не имела чрезмерной калорийности, однако при этом обеспечивала достаточно калорий для кормления субъекта. Следовательно, жидкая пища предпочтительно имеет калорийность между 0,1 и 2,5 ккал/мл, более предпочтительно калорийность между 0,5 и 1,5 ккал/мл, еще более предпочтительно между 0,6 и 0,8 ккал/мл, и наиболее предпочтительно между 0,65 и 0,7 ккал/мл.
Применение
Питательная композиция по изобретению предпочтительно представляет собой детскую молочную смесь первого уровня, детскую смесь второго уровня или смесь для детей раннего возраста. Примеры смеси для детей раннего возраста включают молочную смесь третьего уровня, детскую смесь третьего уровня и молочную смесь для детей 1-3 лет. Более предпочтительно питательная композиция представляет собой детскую молочную смесь первого уровня, детскую смесь второго уровня. Питательная композиция по изобретению может выгодно применяться в качестве полноценного питания для детей грудного возраста. Детская смесь первого уровня определяется как смесь для применения для детей грудного возраста и может, например, представлять собой молочную смесь первого уровня, предназначенную для детей грудного возраста 0-6 или 0-4 месяцев. Детская смесь второго уровня предназначена для детей грудного возраста от 4 или 6 месяцев до 12 месяцев. В этом возрасте детей грудного возраста начинают приучать к другой пище. Смесь для детей раннего возраста, или детская смесь третьего уровня или смесь или композиция для детей 1-3 лет предназначена для детей возраста 12-36 месяцев. Предпочтительно питательная композиция по изобретению представляет собой детскую смесь первого уровня.
Детская смесь первого уровня, детская смесь второго уровня или смесь для детей раннего возраста может быть в форме жидкости, предпочтительно жидкости, готовой к употреблению, или в форме порошка. В одном варианте осуществления детская смесь первого уровня, смесь второго уровня или смесь для детей раннего возраста находится в форме порошка, подходящего для восстановления водой для получения готовой к употреблению детской смеси первого уровня, детской смеси второго уровня или смеси для детей раннего возраста. Должно быть понятно, что, когда детская смесь первого уровня, детская смесь второго уровня или смесь для детей раннего возраста по настоящему изобретению находится в форме порошка, количества всех ингредиентов, включая неперевариваемые олигосахариды, 2'-FL и 3'- GL в указанной композиции определяются как количества, которые будут присутствовать после восстановления порошка водой, т.е. количества определяются в мг на 100 мл смеси, готовой к употреблению.
Питательная композиция в соответствии с изобретением предназначена для использования в питании младенца или ребенка раннего возраста, предпочтительно младенца, предпочтительно в возрасте до 12 месяцев.
Детская смесь первого уровня, детская смесь второго уровня или смесь для детей раннего возраста по настоящему изобретению предназначена для использования в питании младенца или ребенка младшего возраста, предпочтительно младенца, предпочтительно в возрасте до 12 месяцев.
Предпочтительные варианты осуществления, описанные выше для детской смеси первого уровня, детской смеси второго уровня или смеси для детей раннего возраста в соответствии с изобретением, также применимы для детской смеси первого уровня для использования, детской смеси второго уровня для использования и смеси для детей раннего возраста для использования в соответствии с настоящим изобретением.
Изобретение также относится к композиции, включающей 2-‘FL, бутират и, необязательно, 3-‘GL, или к композиции в соответствии с изобретением для применения в качестве лекарственного средства. Предпочтительно указанная композиция предназначена для применения для улучшения здоровья кишечника у детей грудного возраста, в частности барьерной функции кишечника и созревания кишечника, для применения для улучшения физиологии кишечника, для применения для улучшения барьерной функции кишечника, для применения для улучшения кишечной микробиоты, в частности для уменьшения кишечных патогенных бактерий, для применения в лечении или профилактике инфекций, в частности кишечных инфекций, и/или для применения в лечении и/или профилактике аллергии, и/или для применения для индукции пероральной толерантности к аллергенам.
Предпочтительно указанная композиция предназначена для применения для улучшения иммунной системы, предпочтительно для уменьшения Th2 ответа.
Поскольку питательная композиция по изобретению имеет улучшенный эффект на барьерную функцию кишечника, она снижает транслокацию аллергенов, токсинов и/или патогенов и, таким образом, предотвращает и/или лечит аллергию и/или предотвращает или лечит инфекции. Поскольку также было обнаружено улучшенное действие на активность кишечной щелочной фосфатазы, питательная композиция будет уменьшать количество кишечных патогенов, тем самым предотвращая и/или осуществляя лечение инфекций, в частности кишечных инфекций. Улучшение созревания лактазы и пролиферации кишечных клеток также свидетельствует об улучшении созревания кишечного барьера. Наблюдалось улучшение микробиоты, увеличение количества бифидобактерий, усиленное закисление в результате ферментации и уменьшение количества патогенов. Улучшение кишечной микробиоты и/или иммунной системы, кроме того, будет способствовать предотвращению и/или лечению аллергии и инфекций, в частности кишечных инфекций. Эффекты на иммунную систему будет иметь эффект на стимулирование пероральной толерантности к аллергенам.
Эффекты как для IL-10, так и для уровней CCL20 указывают на неожиданно улучшенную модуляцию респонсивности PBMC человека в присутствии комбинации 2’-FL и бутирата, которая еще больше улучшается, когда присутствует 3’-GL.
Поскольку питательная композиция по изобретению оказывает улучшенное действие на снижение Th2 ответа, она, таким образом, предотвращает и/или лечит аллергию.
Питательная композиция в соответствии с изобретением предпочтительно предназначена для обеспечения питания младенца или ребенка раннего возраста, предпочтительно младенца, страдающего аллергией или имеющего повышенный риск заболевания аллергией.
Изобретение также относится к применению питательной композиции в соответствии с изобретением для обеспечения питания младенцев или детей младшего возраста, предпочтительно для обеспечения питания младенцев.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1:
Эффекты различных галактозиллактоз (GLs) на DON-индуцированное нарушение целостности клеточного монослоя Caco-2. Фиг. 1A и 1B показывают трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) для различных GL. Фиг. 1C и 1D показывают транслокацию люцифера желтого (LYF) к базолатеральному компартменту. TEER выражали как процент от исходного значения, и LYF выражали в нг/см2 x ч, т.е. в нг/мл. Альфа3’-GL представляет собой Gal(альфа 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета3’-GL представляет собой Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета4’-GL представляет собой Gal(бета 1-4)-Gal(бета 1-4)-Glc’; бета6’-GL представляет собой Gal(бета 1-6)-Gal(бета 1-4)-Glc. Данные представляют собой среднее значение ± s.e. *: p < 0,05 по сравнению с контролем, **: p < 0,01 по сравнению с контролем, ***: p < 0,001 по сравнению с контролем, ^: p < 0,05 по сравнению с DON контролем, ^^ p< 0,01 по сравнению с DON контролем, ^^^ p< 0,001 по сравнению с DON контролем.
Фиг. 2:
Различные эффекты GLs на DON-индуцированное повышение высвобождения IL8 клетками Caco-2. Секреция IL-8 выражена в пг/мл как среднее значение ± s.e. Альфа3’-GL представляет собой Gal(альфа 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета3’-GL представляет собой Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc, бета4’-GL представляет собой Gal(бета 1-4)-Gal(бета 1-4)-Glc, бета6’-GL представляет собой Gal(бета 1-6)-Gal(бета 1-4)-Glc. Данные представляют собой среднее значение ± s.e. *: p < 0,05 по сравнению с контролем, **: p < 0,01 по сравнению с контролем, ***: p < 0,001 по сравнению с контролем, ^: p < 0,05 по сравнению с DON контролем, ^^ p< 0,01 по сравнению с DON контролем, ^^^ p< 0,001 по сравнению с DON контролем.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Детская смесь с 2’-FL и диетическим бутиратом улучшает кишечную экспрессию щелочной фосфатазы
Две детские смеси первого уровня подвергали стадии переваривания in vitro и после стадии переваривания in vitro исследовали эффект на созревание кишечного барьера, в частности, созревание щелочного фосфата (AP). AP представляет собой кишечный фермент, который экспрессируется и секретируется энтероцитами и используется в качестве маркера дифференциации. AP играет ключевую роль в кишечном гомеостазе и врожденной иммунной защите путем дефосфорилирования вредных веществ, таких как микробный лиганд липополисахарид (эндотоксин).
Контрольной детской смесью первого уровня была неферментированная детская смесь, дополненная неперевариваемыми олигосахаридами (scGos/lcFOS) в количестве 0,8 мг/100 мл, когда она находится в готовой для питья форме. scGOS получают из Vivinal GOS, а lcFOS получают из RaftilineHP. Жировой компонент преимущественно представляет собой растительные масла, рыбий жир и микробный жир (источник арахидоновой кислоты). Количество масляной кислоты было ниже 0,05% масс. в расчете на общее количество жира.
Активной детской смесью первого уровня была частично ферментированная детская смесь, подобная примеру 8, т.е. дополнительно содержащая 0,1 г 2’-FL, липидный компонент, включающий около 50% масс. молочного жира коровьего молока, и содержащая около 1,5% масс. масляной кислоты в расчете на общее содержание жирных кислот, около 3,4 г жира на 100 мл, около 0,28% масс. молочной кислоты в расчете на сухую массу и около 25 мг 3’-GL на 100 мл, когда она находится в готовой для питья форме.
Переваривание in vitro:
Детские смеси первого уровня получали при 13,7% (масс./об.) в MiliQ воде и 35 мл переносили в биореакторы в управляемой компьютером полудинамической модели желудочно-кишечного тракта, имитирующей состояние младенца. Каждый реактор был оборудован pH-электродом и четырьмя дозирующими линиями. Каждая дозирующая линия была подключена к насосу, добавляющему либо а) хлористоводородную кислоту 0,25 М и b) бикарбонат натрия 0,5 М для контроля pH, либо c) имитацию желудочного сока (SGF), d) имитацию кишечного сока (SIF). pH контролировали путем стандартизации до 6,8 в начале переваривания, затем постепенно снижая pH в течение 2-часовой желудочной фазы до 4,3. В кишечной фазе переваривания pH постепенно повышается с 6,5 до 7,2 в течение 2 часов. При t=0 (начало переваривания) добавляли 5,8 мл имитированной слюнной жидкости (100 мМ NaCl, 30 мМ KCl, 1,4 мМ CaCl2, 14 мМ NaHCO2, 0,6 мг/мл α-амилазы из Aspergillus oryzae (SIGMA, A9857)) в виде болюса. Начиная с t=0 и далее 12,25 мл SGF (100 мМ NaCl, 30 мМ KCl, 1,4 мМ CaCl2, 50 мМ ацетата натрия, 0,125 мг/мл пепсина из слизистой оболочки желудка свиньи (SIGMA, P7012) и 0,05 мг/мл липазы из Rhizopus oryzae, Amano) постепенно добавляли до t=120 (конец желудочной фазы). Последовательная кишечная фаза начиналась с повышения pH до 6,5 и постепенного добавления 31,5 мл SIF (100 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1,7 мМ CaCl2, 0,17 мг/мл трипсина из поджелудочной железы коровы (SIGMA, T9201), 0,18 мг/мл химотрипсина из поджелудочной железы коровы (SIGMA, C4129), 0,09 мг/мл липазы поджелудочной железы из поджелудочной железы свиньи (SIGMA, L0382), 1,42 мг/мл таурохолата (SIGMA, 86339) и 0,6 мг/мл тауроурсодезоксихолата (SIGMA), T0266). В конце имитированного желудочно-кишечного пищеварения брали образец объемом 5 мл, смешивали с 5 мл буфера для ингибитора ферментов (0,1 М фосфата натрия, pH 5,5, 0,58 мг/мл ингибитора трипсин-химотрипсина от Glycine max (SIGMA, T9777), 34,5 мкг/мл Orlistat (SIGMA, O4139)), быстро замораживали и хранили при -20°C до дальнейшего использования.
Клеточная дифференциация
Клетки из энтероцит-подобной и экспрессирующей щеточную каемку кишечной клеточной линии человека C2BBe1 (ATCC® CRL-2102™) высевали при 5000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты Nunc™ Edge и выращивали до конфлюентности в модифицированной Дульбекко среде Игла, (Catalog No. 30-2002) с 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и 0,01 мг/мл человеческого трансферрина. После достижения конфлюентности культуральную среду заменяли предварительно переваренной детской смесью, разбавленной в культуральной среде без фетальной телячьей сыворотки при конечных концентрациях 0,34%, 0,17% и 0,08 5% (масс./об.), в четырех параллельных анализах, и инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 96 часов, обновляя среду разбавленной предварительно переваренной детской смесью через 48 часов. По окончании периода инкубации собирали 50 мкл культуральной среды на лунку, смеси четырех параллельных анализов объединяли и хранили при -20°C до определения AP активности. Затем все лунки промывали охлажденным льдом фосфатно-солевым буферным раствором и в каждую лунку добавляли 100 мкл 50 мМ Tris-HCL, 150 мМ NaCl, 0,5% triton-100 при pH 7,0. После 30 мин инкубации на льду клеточные лизаты собирали и определяли содержание белка с использованием набора Thermo Fischer, Pierce BCA Protein Assay Kit в соответствии с инструкциями изготовителя. AP активность определяли с использованием набора для колориметрического анализа активности щелочной фосфатазы Biovision в соответствии с инструкциями изготовителя. AP активность выражали как Единицы/мг белка
Результаты
AP активность статистически значимо увеличивалась (p<0,05, t-критерий) в энтероцитах, которые обрабатывали предварительно переваренной детской смесью по изобретению, по сравнению с энтероцитами, обработанными предварительно переваренной контрольной смесью. Этот эффект был дозозависимым и существенно различался при всех испытываемых концентрациях. Повышение внеклеточной AP активности по сравнению с контрольной смесью составило 43%, 36% и 32% при концентрации детской смеси 0,34, 0,17 и 0,085% (масс./об.), соответственно, см. Таблицу 1. Это повышение внеклеточной AP активности указывает на улучшенное созревание барьерной функции кишечника и улучшенную защиту против кишечных патогенных бактерий.
AP активность кишечных энтероцитов при воздействии предварительно переваренной контрольной или экспериментальной смеси в мЕд./мг белка
Пример 2 Детская смесь с 2’-FL и 3’-GL улучшает кишечную экспрессию лактазы и клеточную пролиферацию
Питательные композиции примера 1 испытывали в таком же эксперименте, как в примере 1. Вместо 13,7 использовали смесь при 13,6% (масс./об.). Вместо липазы из Rhizopus oryzae использовали кроличью липазу при 16,6 мг/мл (Germ, REG,340) в желудочной фазе. В кишечной фазе использовали 0,06 мг/мл панкреатической Липазы из поджелудочной железы свиньи (SIGMA, L0382) и 3,5 мг/мл панкреатической липазы свиньи (SIGMA L0126) вместо 0,09 мг/мл панкреатической Липазы из поджелудочной железы свиньи (SIGMA, L0382).
Активность лактазы измеряли путем смешивания 30 мкл клеточного лизата с 30 мкл аналитического буфера (малеиновая кислота 0,625 M, лактоза 0,12 M, pH 6,0) и инкубировали при 37°C в течение 4 часов, определяли количество полученной глюкозы. Активность лактазы выражали как мкмоль глюкозы/мин/мг.
Было обнаружено, что активность лактазы существенно повышалась, когда клетки обрабатывали предварительно переваренной экспериментальной испытываемой детской смесью по сравнению с предварительно переваренной контрольной смесью, см. Таблицу 2.
Активность лактазы кишечных энтероцитов при воздействии предварительно переваренной контрольной или экспериментальной смеси в мЕд./мг белка
Активность лактазы повышается в дифференцирующих энтероцитах с последующим увеличением активности сахаразы, после чего активность лактазы щеточной каемки начинает снижаться. Поскольку клетки не демонстрировали активности сахаразы во время измерения (данные не показаны), повышенная активность лактазы, таким образом, свидетельствует о более дифференцированном состоянии клеток.
Испытание клеточной пролиферации
Крипто-подобные клетки карциномы толстой кишки человека HT-29 высевали при 5.104 в 96-луночные планшеты Nunc™ Edge в DMEM с 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1 г/л галактозы. Клеткам давали возможность прикрепиться в течение 30 часов, после чего среду заменяли переваренной IF, разведенной в культуральной среде без фетальной телячьей сыворотки при конечных концентрациях 0,23%, 0,17% и 0,085% (масс./об.) в трех параллельных экспериментах. Разная скорость пролиферации клеток приводила к разному содержанию клеточного белка после 72 часов инкубации, это было измерено путем лизирования клеток с последующим определением содержания белка с использованием набора Thermo Fischer, Pierce BCA Protein Assay Kit в соответствии с инструкциями изготовителя.
Клеточная пролиферация значительно увеличивалась, о чем свидетельствует повышенное содержание клеточного белка в клетках, обработанных предварительно переваренной экспериментальной испытываемой детской смесью по сравнению с предварительно переваренной контрольной смесью (Таблица 3).
Пролиферация (клеточный белок мкг/лунка) кишечных энтероцитов при воздействии предварительно переваренной контрольной или экспериментальной смеси в мЕд./мг белка
Для достижения его функции как барьера для внешней среды кишечный эпителий должен непрерывно обновляться. Рост и обновление кишечных эпителиальных клеток зависит от пролиферации клеток в кишечных криптах. Как ожидается, стимуляция скорости клеточной пролиферации, таким образом, будет поддерживать барьерную функцию кишечника.
Пример 3: бета1,3’-галактозиллактоза и 2’фукозиллактоза защищает против разрушения кишечного барьера и препятствует повышению проницаемости.
Бета1,3’-галактозил-лактозу (бета3’-GL), бета1,4′-галактозиллактозу (бета4’-GL) и бета1,6′-галактозил-лактозу (бета6’-GL) получали от Carbosynth (Berkshire, UK). Альфа1,3’-галактозил-лактозу (альфа3’-GL) получали от Elicityl (Crolles, France). Очищенный дезоксидиваленол (DON) (D0156; Sigma Aldrich, St Luis, MO, USA) растворяли в чистом этаноле и хранили при -20°C. Клетки эпителиальной колоректальной аденокарциномы человека (Caco-2) получали от American Type Tissue Collection (Code HTB-37) (Manasse, VA, USA, passage 90-102).
Caco-2 клетки использовали в соответствии с установленными методами. Вкратце: клетки культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) и высевали при плотности 0,3×105 клеток во вставки с высокой плотностью пор 0,3 см2 (0,4 мкм) с полиэтилентерефталатной мембраной (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), помещенные в 24-луночный планшет. Клетки Caco-2 поддерживали в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO2 при 37°C. После 17-19 дней культивирования получали конфлюентный монослой со средним трансэпителиальным электрическим сопротивлением (TEER), превышающим 400 Ώ см2, измеренным вольтомметром Millicell-Electrical Resistance System (Millipore, Temecula, CA, USA).
Таким образом, клеточные монослои Caco-2 выращивали в системе трансвелл, которая является моделью барьерной функции кишечника. Монослои предварительно обрабатывали в течение 24 часов различными GL, включая бета3'-GL, альфа3'-GL, бета4'-GL и бета6'-GL в концентрации 0,75% масс. GL, перед воздействием грибкового токсина дезоксиниваленола (DON), который является триггером и модельным соединением для нарушения кишечного барьера. DON разбавляли до конечной концентрации 4,2 мкМ в полной клеточной среде и добавляли к апикальной стороне, а также к базолатеральной стороне вставок трансвелл. Эта концентрация DON не влияла на жизнеспособность клеток Caco-2. Инкубацию с DON осуществляли в течение 24 ч.
Для исследования целостности барьера осуществляли измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и проницаемости люцифера желтого (LY). Для TEER измерений использовали вольтметр Millicel-ERS, подключенный к паре электродов в виде палочек для еды, для измерения значений TEER. Результаты выражены в процентах от начального значения. Для анализа парацеллюлярного потока индикаторов непроницаемый для мембраны люцифер желтый (LY) (Sigma, St Luis, MO, USA) добавляли в концентрации 16 мкг/мл в апикальный компартмент в трансвелл планшете на 4 часа, и парацеллюлярный поток определяли путем измерения интенсивности флуоресценции в базолатеральном компартменте с использованием спектрофотофлуориметра (FLUOstar Optima, BMG Labtech, Offenburg, Germany), настроенного на длины волн возбуждения и эмиссии 410 и 520 нм, соответственно. Высвобождение интерлейкина-8 (IL-8 или CXCL8), который является типичным маркером воспаления, количественно определяли в среде апикальной стороны и базолатеральной стороны Caco-2 трансвелл-вставок в ответ на обработку. Концентрации CXCL8 измеряли с использованием ELISA-анализа человеческого IL-8 (BD Biosciences, Pharmingem, San Diego, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Более подробную информацию о материалах и методах см. в Akbari et al, 2016, Eur J Nutr. 56 (5):1919-1930.
Результаты показаны на Фиг. 1 A, B, C и D и на Фиг. 2. Фиг. 1 показывает эффекты различных галактозиллактоз (GLs) на DON-индуцированное нарушение целостности Caco-2 клеточного монослоя. Фиг. 1A и 1B показывают трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) для различных GL. Фиг. 1C и 1D показывают транслокацию люцифера желтого (LYF) к базолатеральному компартменту. TEER выражали как процент от исходного значения и LYF выражали в нг/см2×ч. Альфа3’-GL представляет собой Gal(альфа 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета3’-GL представляет собой Gal(бета 1-3)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета4’-GL представляет собой Gal(бета 1-4)-Gal(бета 1-4)-Glc; бета6’-GL представляет собой Gal(бета 1-6)-Gal(бета 1-4)-Glc. Данные представляют собой среднее значение ± s.e. *: p < 0,05 по сравнению с контролем, **: p < 0,01 по сравнению с контролем, ***: p < 0,001 по сравнению с контролем, ^: p < 0,05 по сравнению с DON контролем, ^^ p< 0,01 по сравнению с DON контролем, ^^^ p< 0,001 по сравнению с DON контролем.
Как видно из Фиг. 1A-D, присутствие DON нарушало барьерную функцию, что показано уменьшением значения TEER и увеличением потока LY для DON-контрольных образцов. Кроме того, присутствие DON увеличивало высвобождение CXCL8 (IL-8), как показано на Фиг. 2. Фиг. 1A-D также показывают, что присутствие бета3'-GL предотвращает DON-индуцируемую потерю целостности эпителиального барьера, как измерено по увеличению значений TEER и уменьшению DON-влияемого потока LY через монослой кишечного эпителия. Бета4'-GL и бета6'-GL не показали значительного влияния на барьерную функцию кишечного эпителия. Интересно, что бета3'-GL, т.е. галактозил-лактоза с β1-3 гликозидной связью, была эффективной в защите кишечной барьерной функции, тогда как альфа3'-GL, т.е. галактозил-лактоза с α1-3 гликозидной связью, не предотвращала DON-индуцируемое нарушение кишечного барьера. Напротив, все галактозил-лактозы были способны снижать DON-индуцируемое высвобождение IL-8, как показано на Фиг. 2.
Эти результаты указывают на специфический эффект бета3'-GL (в настоящей заявке также называемый бета1,3'-галактозиллактозой или Gal (бета 1-3) - Gal (бета 1-4) - Glc) на защиту функции кишечного эпителиального барьера, в частности, в условиях проблем, которые выходят за рамки и/или не зависят от эффекта на предотвращение воспалительной реакции и/или эффекта на микробиоту или через нее. Таким образом, эти результаты указывают на эффект, который бета3’-GL оказывает на усиление барьерной функции кишечника и/или на предотвращение и/или лечение нарушения кишечного барьера. Кроме того, эти результаты указывают на влияние бета3'-GL на лечение, профилактику и/или облегчение состояния, связанного с воздействием токсина, у субъекта, в частности, когда токсин представляет собой трихотеценовый токсин, и, в частности, когда токсин представляет собой дезоксиниваленол.
В отдельном эксперименте эффект 2’-фукозиллактозы на TEER и LYF поток определяли в той же модели. 2'-FL испытывали в концентрации 1 мг/мл, и было обнаружено, что она статистически значимо предотвращает DON-индуцируемое снижение TEER и увеличение LYF, см. Таблицу 4. Это свидетельствует о благоприятном эффекте 2'FL на кишечную барьерную функцию. Таким образом, этот пример свидетельствует о дальнейшем улучшенном эффекте на барьерную функцию кишечника в композиции при сочетании 2’FL и бета3’-GL.
Эффект 2’-FL на DON-индуцированное нарушение целостности Caco-2 клеточного монослоя
Среднее значение (s.e.)
^^ p < 0,01 по сравнению с контролем с DON, ^p < 0,05 по сравнению с контролем с DON
Пример 4: Бутират улучшает барьерную функцию кишечника
Исследовали эффект бутирата на барьерную функцию кишечника
Методы
Эпителиальные клетки кишечника человека T84 обычно используются для изучения целостности кишечного барьера in vitro. Клетки Т84 (АТСС, США) культивировали на вставках трансвелл 12 мм (0,4 мкм, Corning Costrar, США) в DMEM-F12 glutamax с пенициллином-стрептомицином (100 МЕд./мл), дополненной 5% FBS-HI. Клетки Т84 использовали через 14 дней после достижения слияния. Монослои T84, культивируемые на фильтрах трансвелл, предварительно инкубировали в течение 48 ч с бутиратом или без него. Затем эти образцы инкубировали еще 48 ч в присутствии IL-4 (25 нг/мл). IL-4 добавляли в базолатеральный компартмент; среду и добавки заменяли каждые 24 часа.
Целостность эпителиального барьера оценивали путем измерения трансэпителиального сопротивления (TEER; Ω × см2) эпителиальным вольт-омметром (EVOM; World Precision Instruments, Germany).
Результаты показаны в таблице 5, где представлены относительные значения TEER. Колонки 48h и 96h представляют собой увеличение TEER относительно значения t=0. Обработка IL-4 нарушала барьерную функцию кишечника; однако в присутствии бутирата это нарушение устранялось.
Эффект бутирата на барьерную функцию кишечника
Поэтому этот пример указывает на еще больший улучшающий эффект на барьерную функцию кишечника в композиции при сочетании бета3’-GL, 2’-FL и необязательного диетического бутирата.
Пример 5: 2’-FL и (3’-GL и/или бутират) по разному влияют на иммунную систему
Активацию иммунных клеток и ответы определяли путем культивирования мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека в присутствии или в отсутствие 2’-FL, 3’-GL и масляной кислоты с Т-клеточной специфической стимуляцией или без нее.
Материалы и методы
Выделение PBMC от здоровых доноров: Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) от здоровых доноров выделяли из лейкоцитарной пленки (Sanquin, Amsterdam, the Netherlands). РВМС получали центрифугированием с использованием пробирок Leuosisp (Greiner Bio-One). PBMC собирали и промывали в PBS (Gibco, Thermo Fisher Technologies) + 2% термоинактивированной FCS (Invitrogen) с последующим гипотоническим лизисом эритроцитов с использованием стерильного буфера для лизиса (0,15 M NH4Cl, 0,01 M KHCO3 и 0,1 мМ EDTA, pH 7,4 при 4°C, все от Merck, Darmstadt, Germany). После лизиса PBMC ресуспендировали в замораживающей среде (70% среда RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Technologies) с добавлением 10% термоинактивированной FCS и 100 Ед./мл пенициллина-стрептомицина, 20% термоинактивированной FCS и 10% DMSO (Sigma)) и хранили замороженными.
Модель активации PBMC: PBMC (0,2×106 клеток/лунка) культивировали в 96-луночных планшетах с плоским дном (Corning). В течение 24 часов клетки предварительно инкубировали с 2’-FL (Jennewein), 3’-GL (0-0,3% масс./об.; Carbosynth) или бутиратом натрия (0,2 мМ; Sigma Aldrich) и их комбинациями. Затем клетки CD3/CD28-активировали (Pelicluster CD3 и Pelicluster CD28, Sanquin) в течение дополнительных 24 часов. После инкубации IFNγ измеряли при помощи ELISA в супернатантах (см. ниже). Для определения клеточной активности после стимуляции PBMC инкубировали с реагентом для пролиферации клеток WST-1 (10 мкл; Roche) и/или 10% Triton (5 мкл; отрицательный контроль). Через 3 часа поглощение измеряли при OD450 нм и OD650 нм и рассчитывали клеточную активность в соответствии с инструкциями изготовителя.
IFNγ продукция в PBMC: PBMC инкубировали с указанными реагентами и после инкубации супернатанты собирали и уровни медиатора измеряли с использованием наборов для ELISA IFNγ человека (R&D Systems Europe Ltd.) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Продукция цитокинов в PBMC: PBMC инкубировали с указанными реагентами. После инкубации супернатанты собирали и уровни IL2, IL6, IL10, IL13, IL21, TNFα, IFNγ, MIF, CCL1, CCL13, CCL17, CCL20, CCL22 и CXCL8-11 измеряли путем осуществления валидированного мультиплексного иммуноанализа на основе технологии Luminex (xMAP, Luminex Austin TX USA). Сбор данных осуществляли с использованием Biorad FlexMAP3D (Biorad laboratories, Hercules USA) в сочетании с программным обеспечением xPONENT версии 4.2 (Luminex). Данные анализировали путем подгонки 5-параметрической кривой с использованием программного обеспечения Bio-Plex Manager, версия 6.1.1 (Biorad).
После стимуляции РВМС клеточные культуральные супернатанты собирали, после чего измеряли цитокиновые ответы, чтобы проверить иммунную реакцию клеток. Уровни цитокинов, измеренные в стимулированных условиях, корректировали на (низкие) уровни цитокинов, измеренные в нестимулированных условиях. Кроме того, поскольку каждый донор по-своему эффективно реагирует на Т-клеточный стимул, был рассчитан индивидуальный индекс цитокинового ответа путем деления индуцированного вмешательством ответа на базальный стимулированный ответ.
Обычно считается, что IL2, IL6, TNF-альфа, CCL1, CCL17 и CCL20 связаны с воспалением и/или пролиферацией. IFN-гамма, CXCL9, CXCL10 и CXCL11 считаются связанными с Th1 ответом. Считается, что IL13, CCL13 и CCL22 связаны с Th2 ответом. Считается, что IL10 и галектин-9 связаны с Treg эффектом, а IL21 связан с B-клеточным эффектом.
Статистический анализ. Сравнение между CD3/CD28 стимулированными и контролями осуществляли с использованием парного одностороннего t-критерия (Вилкоксона), p <0,05 считалось значимым различием.
Относительное среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) от измеренных и рассчитанных значений в стимулированном состоянии было статистически проверено с использованием парного двустороннего t-критерия (Вилкоксона), p <0,05 считалось значимым различием. Расчетные значения комбинированного эффекта отдельных ингредиентов основывались на значениях, измеренных для каждого донора.
Активность иммунных клеток, измеренная при помощи WST, значительно увеличивалась через 24 часа при добавлении 2’-FL, тогда как снижение активации было обнаружено при добавлении 3’-GL. Добавление бутирата не влияло на метаболическую активность иммунных клеток ни в условиях отсутствия стимуляции, ни в условиях Т-клеточной стимуляции (CD3/CD28).
Добавление 2’-FL изменяло цитокиновый ответ, тогда как добавление 3’-GL не приводило к таким же изменениям. Интересно, что добавление 3’-GL с 2’-FL по-видимому значительно повышало эффективность 2’-FL. Более того, разница, которая была обнаружена между ответом, происходящим от 3’-GL и 2’-FL, на метаболическую активность клеток в сравнении с продукцией IFN-гамма, указывает на другие иммунные ответы.
В целом можно сделать вывод, что общий пул выделенных PBMC человека представляет собой разнообразный пул иммунных клеток, которые непосредственно и по-разному реагируют на поставляемые HMO. Хотя клетки становятся более метаболически активными, продукция цитокинов в присутствии 2’-FL не равна продукции цитокинов в присутствии 3’-GL, что свидетельствует о дифференциальных иммунных реактивных ответах.
Результаты по 2’-FL, 3’-GL и их комбинации
Был изучен эффект совместного культивирования с 2’FL и 3’GL и их комбинацией на культуры PBMC от 10 человек-доноров. Сначала был определен эффект Т-клеточной специфической стимуляции через CD3/CD28.
После стимуляции человеческих РВМС клеточные культуральные супернатанты собирали, после чего измеряли цитокиновые ответы, чтобы проверить иммунную реакцию клеток. После Т-клеточной специфической стимуляции с CD3/CD28 некоторые цитокины были обнаружены в клеточных супернатантах с использованием технологии Luminex. Уровни Th2 типа цитокинов IL-4 и IL-13, хемокинов CCL17 значительно повышались, показывая устойчивую Т-клеточную стимуляцию (Таблица 6).
Уровни цитокинов IL-4, IL-13 и хемокина CCL17 (пг/мл), измеренные в клеточных культуральных супернатантах PBMC после CD3/CD28-стимуляции по сравнению с нестимулированными условиями
Среднее значение (s.e.)
Среднее значение (s.e.)
Затем для испытания непосредственного эффекта конкретных соединений на активность РВМС, клетки активировали CD3/CD28 в течение 24 часов после предварительной инкубации в течение 24 часов с 2’-FL, 3’-GL и их комбинациями. Кроме того, поскольку каждый донор по-своему эффективно реагирует на Т-клеточный стимул, рассчитывали индивидуальный индекс цитокинового ответа путем деления индуцированного вмешательством ответа на базальный стимулированный ответ (контроль установлен на 1). Таким образом, было изучено вмешательство в 10 разных донорах.
IL-4 и IL-13 являются близкородственными цитокинами, которые, как известно, регулируют многие аспекты аллергического воспаления. Они играют важную роль в регулировании ответов лимфоцитов, миелоидных клеток и негематопоэтических клеток. Например, в Т-клетках IL-4 индуцирует дифференцировку наивных Т-лимфоцитов CD4 в Т-клетки типа Th2, в В-клетках IL-4 запускает переключение класса иммуноглобулинов (Ig) на IgG1 и IgE, а в макрофагах IL-4 и IL-13 индуцируют альтернативную активацию макрофагов.
Относительный уровень IL-4, IL-13 и CCL17 в CD3/CD28 стимулированных условиях с 2’-FL и 3’-GL или комбинацией
Наблюдаемый эффект
Рассчитанный эффект
Т-клеточная стимуляция человеческих PBMC приводила к значительному увеличению IL-4 и IL-13. Предварительная инкубация клеток с 2’-FL не имела никакого эффекта на уровни IL-4 и IL-13 по сравнению с контролями. Однако было обнаружено снижение в присутствии 3’-GL по сравнению с контролем. Более того, комбинация 2’-FL и 3’-GL индуцировала значительно более низкие уровни IL-4 и IL-13 по сравнению с контролем и 2’-FL. Интересно, что эти пониженные уровни IL-4 и IL-13 были значительно ниже, чем можно было ожидать, исходя из расчетов индивидуальных эффектов 2’-FL и 3’-GL, см. Таблицу 7.
Эти данные показывают неожиданное понижение Th2-типа респонсивности на Т-клеточную стимуляцию в общей популяции PBMC, когда клетки находятся в присутствии комбинации 2'-FL и 3'-GL, по сравнению с отдельным присутствием 3'-GL или 2'FL.
Цитокины регулируют клеточные ответы на уровне транскрипции, в то время как хемокины играют роль в рекрутинге воспалительных клеток к участкам воспаления. Хемокин CCL17 (тимус и активация-регулируемый хемокин) является сильным хемоаттрактантом для лимфоцитов Th2 и, как полагают, играет важную роль в воспалительных заболеваниях, таких как аллергия. Например, уровни CCL17 в сыворотке четко отражают активность атопического дерматита, который считается Th2-доминантным воспалительным заболеванием кожи, особенно в острой фазе.
Стимуляция человеческими Т-клетками пиводила к значительному увеличению CCL17, см. Таблицу 7. Хотя предварительная инкубация с 2'-FL или 3'-GL не имела существенного эффекта на уровни CCL17 в стимулированных Т-клетками PBMC, было обнаружено значительное снижение уровней CCL17, когда активированные PBMC предварительно инкубировали одновременно с обоими 2'-FL и 3'-GL, по сравнению с 2'-FL и 3'-GL по отдельности. Основываясь на изменениях, индуцируемых отдельными компонентами, по сравнению с контрольными уровнями, можно рассчитать ожидаемое изменение при объединении их вмешательств. Интересно, что когда стимулированные Т-клетками PBMC культивировали в присутствии комбинации 2’-FL и 3’-GL, индуцировались более низкие уровни CCL17, чем ожидалось. Изменения уровней CCL17 указывают на неожиданное дальнейшее снижение респонсивности Th2 типа при Т-клеточной стимуляции в общей популяции PBMC, когда клетки находятся в присутствии комбинации 2’-FL и 3’-GL. Эти данные для CCL17 соответствуют данным IL-4 и IL-13.
Общий пул выделенных человеческих PBMC представляет собой разнообразный пул иммунных клеток, которые могут отвечать непосредственно и по-разному на поставляемые HMO. Хотя клетки становятся более метаболически активными, воздействие только 2’-FL не оказывало значительного влияния на уровни Th2 медиаторов IL-4, IL-13 и CCL17, тогда как под воздействием только 3’-GL происходило снижение уровней этих медиаторов. Интересно, что одновременное воздействие 2’-FL и 3’-GL статистически значимо снижало уровни IL-4, IL-13 и CCL17, тем самым уменьшая ответы Th2 типа. Эти данные показывают, что добавление 3’-GL к 2’-FL имеет потенциал для снижения развития аллергии.
Результаты по 2’-FL и масляной кислоте
Интерлейкин-10 (IL10) не является цитокином, специфическим для определенного типа клеток, но широко экспрессируется многими иммунными клетками. Индукция IL10 часто происходит вместе с другими провоспалительными цитокинами, хотя пути, которые индуцируют IL10, могут отрицательно регулировать эти провоспалительные цитокины. IL10 играет центральную роль в инфекции, ограничивая/регулируя иммунный ответ на патогены и тем самым предотвращая повреждение хозяина. Поэтому IL10 обычно рассматривается как регуляторный цитокин. Уровни IL 10 измеряли в культурах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от 10 человек-доноров.
Уровни IL10 в PBMC в нестимулированных условиях, показанные как относительные (нормализованные) значения по сравнению с контролем, с поправкой, таким образом, на вариацию доноров
Наблюдаемое значение
Рассчитанное значение
В человеческих РВМС, совместно культивируемых с 0,2% 2’-FL, был обнаружен значительно (p <0,05) повышенный уровень IL10 по сравнению с пустым контролем, при этом добавление бутирата не имело эффекта на уровни IL10. Комбинация 0,2% 2’-FL и 0,2 мМ бутирата значительно повышала уровни IL10 по сравнению с пустым контролем и с 0,2 мМ бутирата. Интересно, что комбинация 2'-FL и бутирата повышала уровень IL10 до более высоких уровней, чем теоретически можно ожидать на основании отдельных компонентов, см. Таблицу 8. Это свидетельствует о неожиданном, полезном увеличении регуляторной способности человеческих PBMC в присутствии комбинации 2'-FL и бутирата по сравнению с отдельно используемыми ингредиентами.
Как правило, CCL20 и CCR6 играют роль в рекрутировании незрелых DCs и их предшественников к сайтам потенциального входа антигена. В зависимости от тканевого микроокружения (например, локального присутствия TGF-бета, IL10 или IL15) иммунные клетки могут приобретать функциональный CCR6 и, следовательно, мигрировать к участкам продукции CCL20. Показано, что CCL20 быстро индуцирует прочную адгезию субпопуляций свежевыделенных Т-лимфоцитов с молекулой-1 межклеточной адгезии. Следовательно, регуляция может достигаться через модуляцию CCL20 в нестимулированных условиях.
Уровни CCL-20 в нестимулированных условиях, показанные как относительные значения с поправкой, таким образом, на вариацию доноров
Наблюдаемое значение
Наблюдаемое значение
Рассчитанное значение
Рассчитанное значение
В человеческих PBMC при воздействии 2’-FL был обнаружен повышенный уровень CCL20 по сравнению с пустым контролем, тогда как добавление только бутирата или 3’-GL не имело статистически значимого эффекта на уровни CCL20. Инкубация человеческих PBMC с комбинацией 2’-FL и бутирата индуцировала значительно более высокие уровни CCL20 по сравнению с контролем и только бутиратом. Присутствие также 3’-GL в этой комбинации 2’-FL и бутирата еще больше повышало уровни CCL20. Неожиданно, наблюдаемые уровни для комбинации 2’-FL и бутирата были значительно выше, чем можно рассчитать на основе отдельных ингредиентов. Это также имело место, когда наблюдаемое значение комбинации 2’-FL, бутирата и 3’-GL сравнивалось с теоретически рассчитанным значением на основе отдельных ингредиентов. см. Таблицу 9.
Эти данные показывают, что добавление 2’-FL и бутирата влияет на иммунный ответ человеческих PBMC. Присутствие также 3’-GL дополнительно улучшает иммунный ответ. Общий пул выделенных человеческих PBMC представляет собой разнообразный пул иммунных клеток, которые непосредственно и по-разному отвечают на поставляемые HMO. Изменения, обнаруженные как в IL-10, так и в CCL20 уровнях, позволяют предположить неожиданное улучшение модуляции респонсивности человеческих PBMC в присутствии комбинации 2'FL и бутирата, которая еще больше улучшается, когда присутствует 3'GL.
Пример 6: 2’-FL повышает образование бутирата микробиотой, в частности, если также присутствует GOS
Образец фекалий 3-месячного здорового младенца, рожденного посредством кесарева сечения, находящегося исключительно на грудном вскармливании без истории использования антибиотиков, использовали в качестве инокулята для моделирования кишечной микробиоты младенца в отделах толстой кишки quad-SHIME® - динамическая модель желудочно-кишечного тракта человека включает 4 модуля SHIME®, работающих параллельно, и каждый модуль SHIME® состоит из 3 реакторов, имитирующих желудок и тонкий кишечник, проксимальный и дистальный отдел толстой кишки.
Профили SCFA показали, что ацетат является наиболее распространенным в дистальном отделе толстой кишки, за ним следует пропионат (Таблица 10). Концентрации ацетата и пропионата были выше в присутствии scGOS/lcFOS и scGOS/lcFOS/2’-FL, чем в контроле и в модулях с добавлением 2’-FL. Аналогичные наблюдения имели место и в проксимальном отделе толстой кишки (данные не показаны). Интересно, что бутират образовывался раньше в дистальном отделе толстой кишки и в более высокой концентрации в присутствии 2’-FL и scGOS/lcFOS/2’-FL по сравнению с контрольной и scGOS/lcFOS группами. Уровень изобутирата, разветвленных SCFA, являющихся результатом протеолитической ферментации, снижался в дистальном отделе толстой кишки в присутствии scGOS/lcFOS/2’-FL и scGOS/lcFOS.
Короткоцепочечные жирные кислоты, продуцируемые в дистальных отделах толстой кишки модулей SHIME® без добавок (контроль) и с добавками в D1-День 3 (D1-D3), День 4-День 11 (D4-D11) и День 12-D15 (D12-D15)
(Среднее значение ± SD)
± 2,32
± 9,8
± 3,35
± 0,97
± 1,04
± 9,26
± 6,8
± 9,20
(Среднее значение ± SD)
± 1
± 0,58
± 1,08
± 3,4
± 3,5
± 1,03
± 3,01
± 0,49
± 0,63
± 1,04
± 2,36
± 2,55
(Среднее значение ± SD)
± 0
± 0,12
± 0,15
± 0
± 0,1
± 0,08
± 0
± 0,49
± 0,09
± 0
± 0,32
± 0,15
(Среднее значение ± SD)
± 0
± 0,93
± 0,28
± 0
± 0,49
± 0,23
± 0
± 0,75
± 0,21
± 0
± 0,19
± 0
Данные гликопрофиля показали, что 2’-FL не метаболизируется, когда добавляется отдельно, а утилизируется только в присутствии scGOS/lcFOS, где она медленно метаболизируется в проксимальных и дистальных отделах толстой кишки. Все другие углеводы, включая scGOS, были истощены в течение первого часа в проксимальном отделе толстой кишки.
Было показано, что 2’-FL ферментируется только в присутствии других GOS, в частности GOS/lcFOS, что приводило к микробной экосистеме, которая, как предполагается, приносит пользу для здоровья.
scGOS/lcFOS/2’-FL усиливает продукцию бутирата, важной SCFA для барьерной функции кишечника. scGOS/lcFOS/2’-FL приводили к неожиданно более низкому уровню изобутирата, что свидетельствует о меньшей протеолитической активности в толстой кишке.
Пример 7: Ингибирование патогенов в микробиоте при помощи 2’-FL, 3’- GL и бутирата
Анаэробную ферментацию образцов фекальной суспензии тестировали в мини-мультиферменторе BioLector Pro microfluidics. Образцы фекалий собирали у младенцев, вскармливаемых грудью, и младенцев, вскармливаемых смесью. Эти образцы фекальной суспензии обрабатывали, добавляя 0,6 грамма фекалий в 40 мл среды Baby Reichardt V.6+слизь+сульфат аммония+лактат и ацетат. Полученные растворы помещали в мини-мультиферментор BioLector Pro microfluidics. Испытательные отсеки дополняли 3-GL, 2’-FL, 3’-GL+2’-FL и GOS/FOS. В контрольный отсек добавляли стерильную воду.
Кроме того, в испытательные отсеки добавляли Clodtridium difficile C153 (difficile агар), Salmonella enteriditis S29 (агар XLD), Cronobacter sakasakii E71 (хромогенный агар) или Klebsiella pneumonia K2 (цитрат-инозитоловый агар Саймонса). Для каждого NDO и для контроля также подготавливали свободную от патогенов культуру.
После ферментации ферментированные растворы тестировали на содержание SCFA (в частности, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и изомасляной кислоты), содержания аммиака, содержания лактата и концентрации патогенов. Также осуществляли ДНК-выделение+идентификацию и секвенирование 16s для определения состава микробиоты.
Использовали 32-луночный планшет, который может работать с низким pH. Лунки этого планшета были заполняли фекальным раствором. 2,5% (масс./об.) различных стерильных растворов углеводов (3'-GL, 2'-FL, 2'-FL/3'-GL (2,0+0,5%) и глюкозу добавляли к фекальной суспензии в соответствии с матрицей.
Начинали эксперимент, и устанавливали pH либо на уровне 5,5 (инокулят с лица от младенца 1, рожденного естественным путем, грудного вскармливания, 5 месяцев), либо pH 6,0 (инокулят от младенца 2, рожденного естественным путем, вскармливаемого грудью, 5 месяцев) с постоянным регулированием pH и температурой 37oC, влажностью 85%, OD контролем. Через 4, 8 и 24 часа отбирают образец для определения КОЕ на TOS-пропионатном агаре MUP (общее количество бифидобактерий), агаре XLD для Salmonella enteriditis S29 и цитрат-инозитол-агаре Саймонса для анализа Klebsiella pneumonia K2 и SCFA, D- и L-лактата и аммиака. Фекальный осадок использовали для 16s ДНК-секвенирования.
Для обоих инокулятов степень ферментации, измеренная по потреблению NaOH, т.е. продукции кислоты, была самой высокой при комбинации 3’-GL/2’-FL по сравнению с только 3’-GL или 2’-FL. Скорость начального подкисления была высокой для 3’-GL и 3’-GL/2’-FL. Как правило, 2’-FL, используемая отдельно, приводила к более медленному и меньшему подкислению. Поскольку количество углеводов, которые можно ферментировать, одинаково в реакционных сосудах, более высокое общее подкисление комбинацией указывает на неожиданный синергетический эффект комбинации 2’-FL и 3’-GL. Полученные SCFA большей частью состояли из уксусной кислоты. Также продуцировалась L-молочная кислота.
Рост бифидобактерий наблюдался с 3’-GL, 2’-FL и смесью 2’-FL/3’-GL, и стимуляция роста в целом была очень похожей. Однако через 24 часа самый высокий уровень наблюдался со смесью 3'-GL/2'-FL для ребенка 1. Также наблюдался рост Enterobacteriaceae, который был очень похожим в тестируемых условиях, но был самым низким через 8 часов для комбинации 2'-FL/3'-GL для инокулята ребенка 1. Данные секвенирования 16s микробиоты в этот момент времени показали относительное уменьшение типа Proteobacteria (основным источником является род Escherichia). В конце ферментации, когда углеводы были истощены, подпитываемая 2’FL/3’GL микробиота смогла сохранить более положительный состав микробиоты по сравнению с контролями (глюкоза и пустой контроль). Для инокулята ребенка 2 эффект на бифидобактерии был самым высоким в присутствии 3’-GL, а эффект снижения роста энтеробактерий был лучшим, когда использовали комбинацию 3’GL/2’FL.
В условиях, когда в сосуды добавляли смесь патогенов, как правило, наблюдали несколько меньшее подкисление по сравнению с условиями без добавления патогенов. Однако эффекты 2'-FL, 3'-GL и 2'-FL/3'-GL на подкисление, определяемое по потреблению NaOH, не ухудшались, и снова самым высоким был эффект с 3'-GL/2'-FL для обоих инокулятов. Для инокулята ребенка 1 рост Salmonella наиболее ограничивался 2’-FL, тогда как рост Klebsiella наиболее сильно ингибировался комбинацией 3’-GL/2-’FL. Что касается инокулята ребенка 2, рост Salmonella наиболее ограничивался 2’-FL, тогда как рост Klebsiella наиболее сильно ингибировался 3’-GL или комбинацией 3’-GL/2’-FL. Для обоих инокулятов рост C. difficile ограничивался при всех условиях.
Эти результаты свидетельствуют об улучшенном эффекте на функцию кишечной микробиоты, при этом композиция, включающая комбинацию 2’-FL и 3’-GL, превосходит эффекты только одной 2’-FL или только одной 3’-GL.
Пример 8: Детская смесь первого уровня
Детская смесь первого уровня, предназначенная для детей грудного возраста 0-6 месяцев, включающая на 100 мл, после восстановления 13,7 г порошка до конечного объема 100 мл:
- 66 ккал,
- 1,3 г белка (белок молочной сыворотки/казеин, массовое соотношение 1/1),
- 7,3 г перевариваемых углеводов (преимущественно лактоза),
- 3,4 граммов жира (из которых около 50% масс. приходится на молочный жир коровьего молока, остальное составляют растительные масла, рыбий жир и микробный жир). В расчете на общее содержание жирных кислот, количество масляной кислоты составляет 1,48% масс., количество арахидоновой кислоты составляет 0,52% масс., количество ейкозапентаеновой кислоты составляет 0,11% масс., количество докозагексаеновой кислоты составляет 0,52% масс.,
- 0,9 г неперевариваемых олигосахаридов, из которых 0,1 г 2’-FL (источник Jennewein), 0,08 г длинноцепочечных фрукто-олигосахаридов (источник RaftilineHP), 0,72 г галакто-олигосахаридов (из которых около 25 мг 3’галактозиллактозы, полученной ферментацией, остальное составляют галакто-олигосахариды из Vivinal GOS),
- Минералы, витамины, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с требованиями для детской смеси,
- Часть смеси, около 26% масс. в расчете на сухую массу, происходит из продукта Lactofidus, ферментированного штаммами S. thermophilus и B. breve, что приводит к около 0,28% масс. молочной кислоты в расчете на сухую массу композиции, больше чем 95% масс. которой находится в L-форме.
Пример 9: Детская смесь второго уровня
Детская смесь второго уровня, предназначенная для детей грудного возраста от 6 месяцев, включающая на 100 мл, после восстановления 14,55 г порошка до конечного объема 100 мл:
- 68 ккал,
- 1,36 г белка (белок молочной сыворотки/казеин, массовое соотношение 4/6),
- 8,1 г перевариваемых углеводов (преимущественно лактоза),
- 3,2 граммов жира (из которых около 50% масс. приходится на молочный жир коровьего молока, остальное составляют растительные масла, рыбий жир и микробный жир). В расчете на общее содержание жирных кислот, количество масляной кислоты составляет 1,47% масс., количество арахидоновой кислоты составляет 0,29% масс., количество ейкозапентаеновой кислоты составляет 0,12% масс., количество докозагексаеновой кислоты составляет 0,56% масс.,
- 0,85 г неперевариваемых олигосахаридов, из которых 0,05 г 2’-FL (источник Jennewein, name?), 0,08 г длинноцепочечных фрукто-олигосахаридов (источник RaftilineHP), 0,72 г галакто-олигосахаридов (из которых около 25 мг 3’галактозиллактозы, полученной ферментацией, остальное составляют галакто-олигосахариды из Vivinal GOS),
- Минералы, витамины, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с требованиями для детской смеси,
- Часть смеси, около 26% масс. в расчете на сухую массу, происходит из продукта Lactofidus, ферментированного штаммами S. thermophilus и B. breve, что приводит к около 0,28% масс. молочной кислоты в расчете на сухую массу композиции, больше чем 95% масс. которой находится в L-форме.
Пример 10: Смесь для детей раннего возраста
Детская смесь для дальнейшего кормления предназначена для детей раннего возраста от 12 месяцев до 36 месяцев, включающая на 100 мл, после восстановления 15,07 г порошка до конечного объема 100 мл:
- 65 ккал,
- 1,3 г белка (белок молочной сыворотки/казеин, массовое соотношение 4/6),
- 8,7 г перевариваемых углеводов (преимущественно лактоза),
- 2,6 граммов жира (из которых около 10% масс. приходится на молочный жир коровьего молока, остальное составляют растительные масла, рыбий жир). В расчете на общее содержание жирных кислот, количество масляной кислоты составляет около 0,35% масс., количество ейкозапентаеновой кислоты составляет 0,42% масс., количество докозагексаеновой кислоты составляет 0,63% масс.,
- 1,22 г неперевариваемых олигосахаридов, из которых 0,02 г 2’-FL (источник Jennewein, name?), 0,12 г длинноцепочечных фрукто-олигосахаридов (источник RaftilineHP), 1,08 г галакто-олигосахаридов (из которых около 17 мг 3’галактозиллактозы, полученной ферментацией, остальное составляют галакто-олигосахариды из Vivinal GOS),
- Минералы, витамины, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с требованиями для детской смеси,
- Часть смеси, около 18% масс. в расчете на сухую массу, происходит из продукта Lactofidus, ферментированного штаммами S. thermophilus и B. breve, что приводит к около 0,2% масс. молочной кислоты в расчете на сухую массу композиции, больше чем 95% масс. которой находится в L-форме.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПИЩЕВАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ 2’-ФУКОЗИЛЛАКТОЗУ И ПИЩЕВОЙ БУТИРАТ | 2020 |
|
RU2820217C2 |
| БЕТА-1,3'-ГАЛАКТОЗИЛЛАКТОЗА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ БАРЬЕРНОЙ ФУНКЦИИ КИШЕЧНИКА | 2020 |
|
RU2818918C2 |
| НЕПЕРЕВАРИВАЕМЫЕ ОЛИГОСАХАРИДЫ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ БЕЛКА | 2020 |
|
RU2816647C2 |
| ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ КИШЕЧНОГО БАРЬЕРА, ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ | 2018 |
|
RU2788854C2 |
| СМЕСЬ ДЛЯ КОРМЛЕНИЯ НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ | 2007 |
|
RU2444911C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИДЕКСТРОЗЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МОЛОЧНЫХ СМЕСЕЙ ДЛЯ ДЕТЕЙ НА ИСКУССТВЕННОМ ВСКАРМЛИВАНИИ | 2006 |
|
RU2415674C2 |
| СМЕСЬ НЕУСВАИВАЕМЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ | 2010 |
|
RU2591831C2 |
| СМЕСЬ НЕУСВАИВАЕМЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ | 2010 |
|
RU2794127C2 |
| СМЕСЬ НЕУСВАИВАЕМЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ | 2010 |
|
RU2773674C2 |
| ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СОДЕЙСТВИЯ ЗДОРОВОМУ РАЗВИТИЮ И РОСТУ | 2009 |
|
RU2508121C2 |
Изобретение относится к питательной композиции для детей грудного возраста или детей раннего возраста, включающей 2'фукозиллактозу и 3'галактозиллактозу и предпочтительно диетическую масляную кислоту. При этом питательная композиция содержит 2'фукозиллактозу (2'-FL) в количестве (i) 0,01-1 г на 100 мл питательной композиции; (ii) 0,075-7,5 мас.% в расчете на сухую массу; и/или (iii) 0,015-1,5 г на 100 ккал, и бета 3'галактозиллактозу (бета3'-GL) в количестве (i) 0,010-0,500 г на 100 мл; (ii) 0,075-3,75 мас.% в расчете на сухую массу и/или (iii) 0,015-0,75 г на 100 ккал. Изобретение позволяет получить питательную композицию для обеспечения питания детям грудного возраста или детям раннего возраста, улучшающую барьерную функцию кишечника, иммунную систему, кишечную микробиоту, что позволяет применять ее при лечении или профилактике инфекций и аллергии. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 10 табл., 9 пр.
1. Питательная композиция для детей грудного возраста или детей раннего возраста, которая представляет собой искусственную питательную смесь и которая не является грудным молоком, содержащая:
a. 2'фукозиллактозу (2'-FL) в количестве (i) 0,01-1 г на 100 мл питательной композиции; (ii) 0,075-7,5 мас.% в расчете на сухую массу; и/или (iii) 0,015-1,5 г на 100 ккал, и
b. бета 3'галактозиллактозу (бета3'-GL) в количестве (i) 0,010-0,500 г на 100 мл; (ii) 0,075-3,75 мас.% в расчете на сухую массу и/или (iii) 0,015-0,75 г на 100 ккал.
2. Питательная композиция по п. 1, дополнительно содержащая диетический бутират.
3. Питательная композиция по любому из пп. 1 или 2, где композиция по меньшей мере частично ферментирована продуцирующими молочную кислоту бактериями и включает 0,1-1,5 мас.% суммарного количества молочной кислоты и лактата в расчете на сухую массу питательной композиции, и где по меньшей мере 90 мас.% от суммарного количества молочной кислоты и лактата составляет L-молочная кислота и L-лактат.
4. Питательная композиция по любому из пп. 1-3, где композиция дополнительно содержит длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA), выбранные из группы докозагексаеновой кислоты (DHA), арахидоновой кислоты (ARA) и эйкозапентаеновой кислоты (EPA), предпочтительно DHA и EPA, предпочтительно DHA, EPA и ARA, более предпочтительно включает по меньшей мере 1 мас.% суммарного количества DHA, ARA и EPA в расчете на общее содержание жирных кислот.
5. Питательная композиция по любому из пп. 1-4, где композиция дополнительно содержит галакто-олигосахариды и/или фрукто-олигосахариды.
6. Питательная композиция по любому из пп. 1-5, где питательная композиция выбрана из группы, состоящей из детской смеси первого уровня, детской смеси второго уровня или смеси для детей раннего возраста, предпочтительно детской смеси первого уровня.
7. Питательная композиция по любому из пп. 2-6, содержащая диетический бутират в количестве (i) 10 мг - 175 мг на 100 мл; (ii) 15-250 мг на 100 ккал; и/или (iii) 0,075-1,3 мас.% в расчете на сухую массу.
8. Питательная композиция по любому из пп. 5-7, содержащая (i) 0,2-5 г суммарного количества галакто-олигосахаридов и фрукто-олигосахаридов на 100 мл; (ii) 0,3-7,5 г суммарного количества галакто-олигосахаридов и фрукто-олигосахаридов на 100 ккал; и/или (iii) 1,5-35 мас.% суммарного количества галакто-олигосахаридов и фрукто-олигосахаридов в расчете на сухую массу.
9. Применение питательной композиции по любому из пп. 1-8 для улучшения барьерной функции кишечника, улучшения иммунной системы, улучшения кишечной микробиоты и для лечения или профилактики инфекций, аллергии, включая атопический дерматит, и для индукции толерантности к аллергенам.
10. Применение по п. 9, где питательную композицию вводят детям грудного возраста или детям раннего возраста, предпочтительно детям грудного возраста.
11. Применение питательной композиции по любому из пп. 1-8 для обеспечения питания детям грудного возраста или детям раннего возраста, предпочтительно для обеспечения питания детям грудного возраста.
| US 20190029306 A1, 31.01.2019 | |||
| US 20150064220 A1, 05.03.2015 | |||
| US 20190060334 A1, 28.02.2019 | |||
| EP 2845905 A1, 11.03.2015 | |||
| US 20120129935 A1, 24.05.2012 | |||
| CN 107736614 A, 27.02.2018 | |||
| КОМПОЗИЦИЯ ПРЕБИОТИКОВ ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ МИКРОФЛОРЫ ОРГАНИЗМА | 2011 |
|
RU2473347C1 |
