СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЕПАТОЦИТОВ Российский патент 2024 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 G01N33/48 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к определению основных клеток печени - гепатоцитов - в состоянии митоза, т.е. к оценке пролиферативной способности печени. Может быть использовано в клинической и научно-исследовательской практике. Изобретение относится к способам наблюдения митоза в клетках млекопитающих, таких как гепатоциты, обработанных митостатическим агентом.

Уровень техники

Одной из проблем современной научной и клинической медицины является определения митотической активности в печени. Печень является одним из основных модельных органов при многочисленных фундаментальных и прикладных исследованиях и в практической деятельности медицинских работников возникает необходимость определения уровня митоза в печени - например, при процессах репаративной регенерации, направленных на компенсацию дефицита массы ее паренхимы [1, 2].

Пролиферация является одной из основных функций клеток, с помощью которой не только осуществляется регенерация - по степени пролиферативной активности можно судить о нормальном или злокачественном росте числа клеток. В связи с этим количественный показатель пролиферативной активности клеток является важнейшей характеристикой клеточной популяции, отражает интенсивность регенераторных процессов, а также используется для ранней диагностики опухолевого процесса и прогнозирования скорости опухолевого роста при различных онкологических заболеваниях [3,4].

В настоящее время для оценки интенсивности пролиферативных процессов применяются несколько основных способов.

Одним из наиболее часто применяемых способов определения клеток в состоянии митоза являются иммуногистохимические реакции с целью визуализации ядрышковых белков, изменяющихся или появляющихся в процессе пролиферативной активности клеток. В частности, в клинико-лабораторной практике широко используются иммуногистохимические реакции для определения белков Ki-67, PCNA, В23 [5].

К недостаткам этих способов можно отнести высокую стоимость проведения реакций, а также возникающие сложности в интерпретации результатов.

Самым простым способом выявления клеток в процессе митоза является визуальное определение и подсчет на окрашенном препарате тех из них, которые содержат фигуры митоза. Этот способ весьма неточен, т.к. зависит от субъективного определения оператором фигур митоза, а также от качества окраски микропрепарата [6].

Еще одним способом, применяемым для определения клеток в состоянии митоза, является цитофотометрия препаратов, окрашенных по Фельгену, с анализом распределения клеток по стадиям митотического цикла. Этот способ сложен и занимает длительное время [7].

Те же недостатки можно отметить и у ДНК-цитофлуориметрии с анализом клеточных популяций при помощи проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и других способов.

Задачей данного изобретения является создание способа определения митотических клеток в печени.

Заявляемый способ является более точным и менее затратным по сравнению с вышеописанными.

Сущность изобретения

Сущностью настоящего изобретения является создание способа определения гепатоцитов в состоянии митоза.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к упрощению визуального подсчета клеток печени в состоянии митоза.

Технический результат достигается с помощью фиксации образца печени в 0,1% растворе колхицина в физиологическом растворе в течение 1 часа при температуре +37°С, с последующей фиксацией в формалине, проводкой и заливкой в парафин, приготовлением срезов толщиной 5-7 мкм и их окраской гематоксилином и эозином. С последующим визуальным исследованием срезов с помощью микроскопа.

Раствор колхицина проникает в ткань печени и вызывает блокаду митоза в гепатоцитах. Колхицин действует на механизм веретена в процессе митоза, что исключает расхождение дочерних хромосом в анафазе и цитокинезе, а сами хромосомы располагаются по экватору клетки и легко доступны для визуального подсчета.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлена таблица результатов получения митотического индекса, определяемого иммуногистохимическим и предлагаемым способом.

Вариант 1

Из печени вырезали 5 образцов ткани печени, затем из каждого вырезали по 2 фрагмента размером 1,5×1×0,5 см. Половину из них помещали на 1 час в 0,01% раствор колхицина в физрастворе, при температуре +37°С, с последующей фиксацией в формалине, проводкой и заливкой в парафин, приготовлением срезов толщиной 5-7 мкм и их окраской гематоксилином и эозином. С последующим визуальным исследованием срезов с помощью микроскопа. Затем другую половину образцов фиксировали сразу же после взятия и осуществляли постановку иммуногистохимической реакции на Ki-67 - маркер пролиферации.

Затем на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали количество клеток в состоянии митоза, а на препаратах с результатами иммуногистохимической реакции, служивших контролем, подсчитывали клетки, окрашенные с помощью антител. Вычисляли соответствующий индекс как отношение митотических/окрашенных клеток к общему числу клеток в процентах (%). Результаты представлены в первой строке таблицы 1.

Вариант 2.

Осуществляли все те же манипуляции, что и в варианте 1, но использовали 0,1% раствор колхицина в физрастворе. Результаты представлены во второй строке таблицы 1.

Вариант 3.

Осуществляли все те же манипуляции, что и в варианте 1, но использовали 0,5% раствор колхицина в физрастворе. Результаты представлены в таблице. 1.

По проведенным серия опытов и статистической обработки результатов исследований, установлено, что наиболее точный результат достигается при инкубировании образцов печени в 0,1% растворе колхицина в физрастворе, при температуре +37°С, в течение 1 часа.

Осуществление изобретения

Предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества по сравнению с другими известными техническими решениями:

- более дешевое;

- более быстрое;

- не требует специальной подготовки и обучения исполнителя.

Данный способ осуществляется посредством широкораспространенных методик осуществления гистологических исследований [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]. Отличием от уже существующих способов, является обработка образца печени перед фиксацией формалином в 0,1% растворе колхицина в физиологическом растворе в течение 1 часа при температуре +37°С. Далее все операции по исследованию взятого образца идут по существующим методикам осуществления гистологических исследований [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15].

Источники информации:

1. Шмаров, Д.А., Погорелов, В.М., & Козинец, Г.И. (2013). Современные аспекты оценки пролиферации и апоптоза в клиниколабораторной диагностике (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика, (1), 36-39.

2. Кушлинский, Н.Е., & Немцова, М.В. (2014). Молекулярно-биологические характеристики злокачественных новообразований. Вестник Российской академии медицинских наук, 69(1-2), 5-15.

3. Урманова, Ю.М., & Миртухтаева, М.Б. (2020). Маркеры агрессивности течения неактивных аденом гипофиза с инвазивным ростом. Обзор литературы. Международный эндокринологический журнал, 16(5), 421-426.

4. Полякова, Л.В., Калашникова, С.А., Газарян, К.Э., Ваниев, А.Г., Фогель, А.В., & Косарева, П.В. (2019). Особенности распределения специфических маркеров пролиферации тироцитов при циррозе печени. Современные проблемы науки и образования, (3), 118-118.

5. Лазукин, А.В. (2014). Фактор пролиферации Ki-67 как показатель прогноза при раке молочной железы. Российский биотерапевтический журнал, 13(2), 29-34.

6. Никитаев, В.Г., Пушкарь, Д.Ю., Проничев, А.Н., Нагорнов, О.В., Прилепская, Е.А., Ковылина, М.В., & Будадин, О.Н. (2020). Способ определения степени злокачественности аденокарциномы предстательной железы. Патент RU 2717944 С1

7. Омельянчук, В.Ф., Пальчикова, И.Г., Семешин, В.Ф., Алексеева, А.Л., & Жимулев, И.Ф. (2010). Интегральный метод измерения количества ДНК в клетке с использованием цифровой микрофотографии. Цитология, 52(4), 349-353.

8. Основы гистологической техники - Практическое уководство. - М: Медицина, 2010. - 234 с

9. Мушкамбаров, цитология и эмбриология: Учебник для медицинских вузов. - М.: информационное агентство», 2005. - 600 с.

10. Гистология: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. / Под ред.,. - М.: ГЭОТАР - МЕД, 2002. - 672 с.

11. Радостина. - М.: Медицина, 1995. - 239 с.

12. Гистология / Под ред.,,. - М.: Медицина, 1983, 592 с.

13. Гистология: Пер. с англ. - М.: Мир, 1983. - Т. 5. - 296 с.

14. Елецкий гистологии с гистологической техникой. - М.: Медицина, 1982. - 298 с.

15. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Л.: Медицина, 423 с. - 1969.

Настоящее изобретение относится к способу определения митотической активности гепатоцитов в образце печени посредством подсчета и вычисления доли гепатоцитов с фигурами митоза, посредством фиксации образца печени в формалине, проводкой и заливкой в парафин, приготовлением срезов толщиной 5-7 мкм и их окраской гематоксилином и эозином, отличающемуся тем, что образец печени перед фиксацией формалином помещают в 0,1% раствор колхицина в физрастворе при температуре +37°С на 1 час. Настоящее изобретение обеспечивает упрощение визуального подсчета клеток печени в состоянии митоза. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ определения митотической активности гепатоцитов в образце печени посредством подсчета и вычисления доли гепатоцитов с фигурами митоза, посредством фиксации образца печени в формалине, проводкой и заливкой в парафин, приготовлением срезов толщиной 5-7 мкм и их окраской гематоксилином и эозином, отличающийся тем, что образец печени перед фиксацией формалином помещают в 0,1% раствор колхицина в физрастворе при температуре +37°С на 1 час.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец печени имеет размер 1,5×1×0,5 см.