БИОРАЗЛАГАЕМАЯ ПОЛИМЕРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C08L67/04 C08J11/00 C12P1/00 C12P7/40 C12P7/62 

Область техники настоящего изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к биоразлагаемым полимерам, в частности, к биоразлагаемым полимерным композициям и к способам их изготовления с использованием отходов каннабиса в качестве источника углерода.

Уровень техники настоящего изобретения

[0002] Пластмасса представляет собой долговечный и универсальный материал низкой плотности, который является неотъемлемым компонентом, применяемым во многих отраслях промышленности от строительства до здравоохранения для производства от потребительских изделий до упаковочных материалов. Изготовление многих пластических материалов зависит от невозобновляемых ресурсов, что в долгосрочной перспективе делает востребованность этих материалов неустойчивой с экономической и экологической точек зрения. Эти проблемы также обостряет время, требуемое для разложения в окружающей среде пластмасс многих типов. Как правило, время разложения в окружающей среде пластмасс, используемых в потребительских изделиях, таких как пластмассовые соломинки для напитков, составляет приблизительно 200 лет. Для разложения более устойчивых пластмасс, таких как пластмасса, используемая в рыболовной леске, может потребоваться более продолжительное время, составляющее вплоть до 600 лет.

[0003] В результате этого в окружающей среде накапливаются пластмассовые отходы, которые вызывают общественное беспокойство, увеличивающееся в возрастающей степени, что приводит к попыткам сокращения пластмассовых отходов, таким как запрещение пластмассовых изделий одноразового применения, включая соломинки для напитков. Другие меры, такие как развитие программ переработки пластмассы, оказываются ограниченными по экономическим соображениям, а также поскольку большинство пластмасс можно перерабатывать лишь ограниченное число раз, прежде чем их физические свойства становятся непригодными для последующего использования. Еще одна возможность решения проблемы накопления пластмассовых отходов в окружающей среде заключается в том, чтобы производить пластмассы, которые быстрее разлагаются в окружающей среде.

[0004] Биоразлагаемые пластмассы представляют собой пластмассы, которые могут разлагаться под действием микроорганизмов, образуя низкомолекулярные вещества, такие как вода, диоксид углерода или метан, и биомассу в течение значительно меньшего времени, чем время, которое требуется для разложения типичных пластмасс. Многие биоразлагаемые пластмассы также могут быть изготовлены из возобновляемых источников, а не из невозобновляемых нефтехимических источников. Однако, как известно, биоразлагаемые пластмассы страдают от ряда нежелательных характеристик, таких как хрупкость или низкая термическая устойчивость. Другие известные биоразлагаемые пластмассы имеют запретительно высокую стоимость изготовления, которая препятствует их широкому применению.

[0005] Соответственно, существует потребность в новых биоразлагаемых пластмассах, имеющих улучшенные механические характеристики. Кроме того, существует потребность в новых способах изготовления биоразлагаемых пластмасс из возобновляемых исходных материалов для снижения стоимости изготовления.

[0006] Согласно прогнозам отходы каннабиса и способы их утилизации превращаются в значительную проблему для промышленности, поскольку в различных юрисдикциях начинается легализация использования каннабиса. В результате изготовления одного килограмма каннабиса для потребителей образуется восемь килограммов отходов. Существующие в настоящее время способы утилизации отходов каннабиса представляют собой строго регулируемые практические процедуры, включающие смешивание отходов каннабиса с химическими реагентами и другими материалами, предназначенными для утилизации.

[0007] Соответственно, существует потребность в разработке полезных приложений для растущих объемов отходов каннабиса, производимых в этой новой отрасли промышленности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[0008] Биоразлагаемая полимерная композиция согласно настоящему изобретению содержит полигидроксибутират и сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, с которыми смешаны термопластический крахмал, один или несколько компатибилизаторов, выбранных из группы, которую составляют дигексилсульфосукцинат натрия и малеиновый ангидрид, а также одна или несколько добавок, выбранных из группы, которую составляют целлюлоза и микрокристаллическая целлюлоза.

[0009] Согласно другому варианту осуществления биоразлагаемая полимерная композиция содержит от 5 мас. % до 70 мас. % полигидроксибутирата, от 5 мас. % до 70 мас. % сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, от 5 мас. % до 45 мас. % термопластического крахмала, от 0,5 мас. % до 35 мас. % одного или нескольких компатибилизаторов и от 0,5 мас. % до 15 мас. % одной или нескольких добавок.

[0010] Согласно другому варианту осуществления биоразлагаемая полимерная композиция содержит от 10 мас. % до 30 мас. % полигидроксибутирата, от 20 мас. % до 60 мас. % сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, от 10 мас. % до 30 мас. % термопластического крахмала, от 10 мас. % до 20 мас. % одного или нескольких компатибилизаторов и от 1 мас. % до 10 мас. % одной или нескольких добавок.

[0011] Согласно другому варианту осуществления биоразлагаемая полимерная композиция содержит 20 мас. % полигидроксибутирата, 40 мас. % сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, 20 мас. % термопластического крахмала, 15 мас. % одного или нескольких компатибилизаторов и 5 мас. % одной или нескольких добавок.

[0012] Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ изготовления биоразлагаемого полимера с использованием отходов каннабиса в качестве источника углерода включает следующие стадии: а) переработка отходов каннабиса посредством механического измельчения; b) нагревание отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты в течение по меньшей мере 25 минут при температуре, составляющей по меньшей мере 121°С, с получением раствора каннабиса в кислоте; с) охлаждение, нейтрализация и фильтрование раствора каннабиса в кислоте с получением фильтрата; d) смешивание фильтрата с минеральной солевой средой в соотношении, составляющем от 1:1 до 1:2, с получением производственной питательной среды; е) засевание производственной питательной среды заквасочной культурой микроорганизмов, выбранных из группы, которую составляют встречающиеся в природе и модифицированные штаммы Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium, и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение от 48 до 72 часов с получением культуры; и f) экстракция биоразлагаемого полимера из культуры.

[0013] Согласно другому варианту осуществления стадия экстракции биоразлагаемого полимера из культуры включает следующие стадии: а) фильтрование культуры через мембрану с размером пор, составляющим приблизительно 1 мм; b) отделение клеток микроорганизма от подвергнутой фильтрованию культуры; с) суспендирование клеток в растворе NaOH и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение по меньшей мере 1,5 часов с высвобождением биоразлагаемого полимера из клеток; d) отделение биоразлагаемого полимера от раствора NaOH и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в воде; е) отделение биоразлагаемого полимера от воды и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в этанольном растворе; и f) отделение биоразлагаемого полимера от этанольного раствора.

[0014] Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ изготовления производственной питательной среды из отходов каннабиса для использования в изготовлении биоразлагаемого полимера, включает следующие стадии: а) переработка отходов каннабиса посредством механического измельчения с увеличением доступной площади поверхности отходов каннабиса; b) нагревание отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты в течение по меньшей мере 25 минут при температуре, составляющей по меньшей мере 121°С, с получением раствора каннабиса в кислоте; с) охлаждение, нейтрализация и фильтрование раствора каннабиса в кислоте с получением фильтрата; и d) смешивание фильтрата с минеральной солевой средой в соотношении, составляющем от 1:1 до 1:2.

[0015] Согласно другому варианту осуществления способ дополнительно включает следующие стадии: перемешивание переработанных отходов каннабиса в воде с разложением отходов каннабиса; фильтрование получаемой в результате смесь, а затем нагревание и перемешивание фильтрата с гидроксидом натрия и пероксидом водорода; фильтрование получаемой в результате суспензии, доведение до нейтрального значения рН и высушивание с получением высушенной биомассы перед стадией нагревания отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты.

[0016] Согласно другому варианту осуществления стадия охлаждения, нейтрализации и фильтрования раствора каннабиса в кислоте включает прекращение реакции посредством добавления холодной деионизированной воды; центрифугирование получаемой в результате смеси и промывание осадка деионизированной водой до достижения нейтрального значения рН; гидролиз целлюлозы, представляющий собой кислотный гидролиз при 0,5 М и 70°С в 67% растворе хлорида цинка, и разбавление конечного продукта стерильный фосфатно-солевым буферным раствором.

[0017] Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ изготовления биоразлагаемого полимера включает следующие стадии: а) засевание производственной питательной среды, имеющей ограниченное содержание азота и содержащей переработанные растительные отходы в качестве источника углерода и заквасочную культуру микроорганизма, выбранного из группы, которую составляют встречающиеся в природе и модифицированные штаммы Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium, и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение от 48 до 72 часов с получением культуры; b) фильтрование культуры через мембрану с размером пор, составляющим приблизительно 1 мм; с) отделение клеток микроорганизма от подвергнутой фильтрованию культуры; d) суспендирование клеток в растворе NaOH и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение по меньшей мере 1,5 часов с высвобождением биоразлагаемого полимера из клеток; е) отделение биоразлагаемого полимера от раствора NaOH и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в воде; f) отделение биоразлагаемого полимера от воды и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в этанольном растворе; и g) отделение биоразлагаемого полимера от этанольного раствора.

[0018] Способом согласно другому варианту осуществления получают полигидроксибутират (РНВ) с использованием производственной питательной среды, полученной из отходов каннабиса, и при этом способ включает следующие стадии: культивирование одного или нескольких микроорганизмов, способных производить РНВ в питательном бульоне из концентрата; засевание производственной питательной среды одним или несколькими микроорганизмами; дополнение производственной питательной среды ограниченным источником азота и обеспечение культивации одного или нескольких микроорганизмов в производственной питательной среде; центрифугирование производственной питательной среды для отделения клеток одного или нескольких микроорганизмов от производственной питательной среды и высушивание клеток; повторное суспендирование высушенных клеток в дистиллированной воде и добавление гидроксида натрия для экстракции РНВ из клеток; прекращение реакции посредством установления рН на уровне 7,0 и центрифугирование получаемой в результате смеси с выделением гранул РНВ из суспензии; промывание гранул дистиллированной водой и повторное центрифугирование получаемой в результате смеси в случае необходимости; отделение гранул посредством добавления минеральной кислоты и центрифугирования смеси; отбрасывание жидкой фазы и промывание продукта в щелочной ванне для очистки РНВ; промывание РНВ водой и центрифугирование в случае необходимости.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[0019] Настоящее изобретение относится к биоразлагаемым полимерным композициям и к способам их изготовления. Биоразлагаемые полимерные композиции содержат полигидроксибутират (РНВ) и сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата (РНВННх), с которыми смешаны термопластический крахмал (TPS), один или несколько компатибилизаторов и одна или несколько добавок.

[0020] Один или оба полимера из РНВ и РНВННх, которые используются в биоразлагаемых полимерных композициях, описанных в настоящем документе, предпочтительно производят, используя микроорганизмы, которые представляют собой встречающиеся в природе или модифицированные микроорганизмы, производящие РНВ и/или РНВННх. РНВННх может представлять собой статистический или нестатистический сополимер мономеров 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата. Предпочтительно 3-гидроксигексаноатные звенья биологически синтезированного сополимера РНВННх остаются в аморфной фазе полукристаллического РНВННх.

[0021] Подходящие микроорганизмы для изготовления биоразлагаемых полимеров, включая РНВ и/или РНВННх, представляют собой встречающиеся в природе или модифицированные штаммы следующих микроорганизмов: Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium. Предпочтительно используется модифицированный штамм Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Lactobacillus rhamnosus или Fermicutes bacterium, чтобы производить РНВ и РНВННх для биоразлагаемых полимерных композиций, которые описаны в настоящем документе. Предпочтительные микроорганизмы представляют собой Bacillus subtilis, потому что они являются грамположительными бактериями, и, таким образом, в них отсутствует токсичный липид А, который присутствует в грамотрицательных бактериях. Загрязнение биоразлагаемого полимера липидом А является нежелательным в определенных приложениях, таких как упаковки для пищевых продуктов, медицинские устройства или упаковки, гигиенические упаковки и продукты для маленьких детей.

[0022] Модифицированные микроорганизмы, используемые в способах, которые описаны в настоящем документе, представляют собой микроорганизмы, генетически модифицированные, чтобы экспрессировать гены, включая трансгены, необходимые для изготовления одного или нескольких биоразлагаемых полимеров. Получаемый биоразлагаемый полимер предпочтительно представляет собой РНВ. Подходящие гены представляют собой один или несколько генов из phaA, phaB, phaC, phaJ и phaP, которыми кодируются ацетил-СоА-ацетилтрансфераза, ацетил-СоА-редуктаза и РНВ-полимераза. Многие микроорганизмы в естественных условиях экспрессируют один или несколько из указанных генов. Некоторые микроорганизмы также могут экспрессировать гены, кодирующие одну или несколько деполимераз, которые разлагают один или несколько биоразлагаемых полимеров, в том числе РНВ. Предпочтительно модифицированные микроорганизмы, используемые в способах, которые описаны в настоящем документе, будут экспрессировать гены, необходимые для изготовления РНВ, и не будут экспрессировать какие-либо гены, которые кодируют деполимеразу, способную разлагать РНВ или какие-либо другие желательные биоразлагаемые полимеры, производимые выбранным микроорганизмом.

[0023] Когда синтезируют и экстрагируют РНВ, например, согласно одному из способов, описанных в настоящем документе, с ним смешаны РНВННх, термопластический крахмал, один или несколько компатибилизаторов и одна или несколько добавок. Термопластический крахмал, используемый в биоразлагаемых пластических композициях согласно настоящему изобретению, представляет собой пластифицированный природный полимер, предпочтительно содержащий аскорбиновую кислоту и лимонную кислоту в низких концентрациях, 30% глицерина в качестве пластификатора и воду, составляющую приблизительно 20 мас. % по отношению к крахмалу. Термопластический крахмал может присутствовать в количествах, составляющих вплоть до 45 мас. % биоразлагаемой полимерной композиции.

[0024] Термопластический крахмал может быть получен любым подходящим способом получения пластифицированных природных полимеров, например, посредством смешивания природного крахмала с пластификатором в двухшнековом экструдере при повышенных температурах, составляющих от приблизительно 30°С до приблизительно 200°С. В качестве пластификатора предпочтительно используется смесь воды и глицерина. Пластификация термопластического крахмала может быть осуществлена перед смешиванием термопластического крахмала с биоразлагаемой полимерной композицией или посредством одновременного добавления всех компонентов, представляющих собой крахмал, глицерин, воду, с другими компонентами биоразлагаемой полимерной композиции для получения конечной смеси.

[0025] Компатибилизаторы могут представлять собой одно или несколько из следующих соединений: дигексилсукцинат, дигексилсульфосукцинат натрия, малеиновый ангидрид, метилендифенилдиизоцианат, диоктилфумарат или другие полиолефины, привитые полярными мономерами. Предпочтительно каждое соединение из дигексилсукцината и малеинового ангидрида присутствует в количестве, составляющем от 0,5 до 35 мас. %.

[0026] Добавки могут представлять собой одно или несколько веществ из целлюлозы и микрокристаллической целлюлозы. Предпочтительно каждое соединение из целлюлозы и микрокристаллической целлюлозы присутствует в количестве, составляющем от 0,5 до 35 мас. %.

[0027] Продолжительность времени, требуемого для разложения биоразлагаемых полимерных композиций, может быть селективно увеличена или уменьшена посредством регулирования количества термопластического крахмала, целлюлозы и/или микрокристаллической целлюлозы в композициях. Когда увеличивается относительное количество термопластического крахмала, целлюлозы и/или микрокристаллической целлюлозы, уменьшается продолжительность времени, требуемого для разложения композиций. Предпочтительно регулируют относительное количество термопластического крахмала, а не относительное количество целлюлозы или микрокристаллической целлюлозы, таким образом, чтобы селективно увеличивать или уменьшать продолжительность времени, требуемого для разложения композиций. Кроме того, продолжительность времени, требуемого для разложения биоразлагаемых полимерных композиций, может быть селективно увеличена или уменьшена посредством регулирования количества РНВННх в композициях. Когда увеличивается относительное количество РНВННх, увеличивается продолжительность времени, требуемого для разложения композиций.

[0028] Источники углерода, используемые для изготовления биоразлагаемого полимера, могут представлять собой отходы каннабиса, листья, твердые рыбные отходы, кленовый сок, тыквенные семена, виноградные выжимки или виноградная мезга, или отходы от производства вина/пива/дистиллированных спиртных напитков. Предпочтительно отходы каннабиса представляют собой материал, используемый в качестве источника углерода для изготовления РНВ. Отходы каннабиса представляют собой корни, обрезки, листья и стебли растений, то есть практически все части, за исключением цветковых почек растения Cannabis sativa L (конопля посевная по классификации Ламарка).

[0029] Отходы каннабиса являются особенно подходящими для использования в качестве источника углерода в изготовлении РНВ с применением микроорганизмов, потому что растение каннабиса имеет высокое содержание биомассы и быстро растет в большинстве климатических условий, требуя лишь умеренные количества воды и удобрений. По сравнению с другими потенциальными источниками углерода, такими как сельскохозяйственные и лесохозяйственные биомассы, уголь, нефтяные остатки и кости, отходы каннабиса имеют уникальные иерархические пористые структуры и соединенные макропоры. В результате этого отходы каннабиса имеют желательные характеристики для использования в качестве источника углерода, такие как пористость, адсорбционная способность и степень поверхностной реакционной способности. По сравнению с другими потенциальными источниками углерода, отходы каннабиса также имеют более высокую концентрацию углерода и менее высокое содержание азота, калия и фосфора, что является благоприятным для изготовления РНВ с применением микроорганизмов.

[0030] Для использования в изготовлении РНВ отходы каннабиса подвергают первоначальной переработке посредством механического измельчения посредством следующего способа. Отходы каннабиса могут быть подвергнуты переработке посредством резания, помола, прессования или других подходящих способов механического измельчения в целях увеличения доступной площади поверхности для удаления целлюлозы и жирных кислот. После этого осуществляют отделение жирных кислот от переработанных отходов каннабиса, чтобы обеспечить источник углерода для синтеза РНВ, например, следующим образом.

Пример: производственная питательная среда 1

[0031] Переработанные отходы каннабиса смешивают с раствором 1% серной кислоты в соотношении 10 г растительных отходов на 100 мл раствора кислоты. Раствор нагревают, предпочтительно в автоклаве, в течение 25 минут при температуре 121°С, затем охлаждают до комнатной температуры. После этого раствор нейтрализуют раствором 2 М NaOH и фильтруют через сито для удаления крупных частиц растительных отходов. Раствор затем центрифугируют в течение 20 минут при ускорении 1500 g, и надосадочный раствор фильтруют через мембрану, имеющую размер пор, составляющий приблизительно 1 мм. Полученный в результате фильтрат, содержащий собой продукты гидролиза отходов каннабиса, можно немедленно использовать или хранить при температуре 4°С до востребования.

[0032] Производственную питательную среду 1 получают посредством смешивания фильтрата с минеральной солевой средой 2Х (0,9 г (NH₄)₂SO₄, 0,3 г KH₂PO₄, 1,32 г Na₂HPO₄, 0,06 г MgSO₄⋅7H₂O, 300 мкл раствора микроэлементов (0,97 г FeCl₃, 0,78 г CaCl₂, 0,0156 г CuSO₄⋅5H₂O, 0,326 г NiCl₂⋅6H₂O) в 100 мл 0,1 М HCl) в соотношении 1:1. Среду немедленно помещают в автоклав и обрабатывают в течение 10 минут при температуре 121°С.

Пример: экстракция 1

[0033] Синтез и экстракция биоразлагаемого полимера могут быть осуществлены с применением следующего способа. Подходящий микроорганизм культивируют в питательном бульоне из концентрата при температуре 30°С в процессе встряхивания со скоростью 150 об/мин в течение 72 часов и получают заквасочную культуру. Через 72 часа заквасочную культуру засевают в производственную питательную среду 1 в соотношении 1/10 (об./об.) инкубируют при температуре 30°С в процессе встряхивания со скоростью 150 об/мин в течение 72 часов с получением культуры.

[0034] Культуру затем фильтруют через мембрану, имеющую размер пор, составляющий приблизительно 1 мм, для удаления нерастворимого растительного материала. Клетки микроорганизмов затем отделяют от подвергнутой фильтрованию культуры посредством центрифугирования при ускорении 1500 g в течение 20 минут. Надосадочный раствор отбрасывают, и клетки затем промывают посредством повторного суспендирования клеток в минеральной солевой среде и повторения центрифугирования и последующего отбрасывания надосадочного раствора.

[0035] После этого клетки повторно суспендируют в 150 мл раствора 0,2 М NaOH, интенсивно перемешивают вихревым способом для гомогенизации раствора и инкубируют при температуре 30°С в течение 1,5 часов. Это вызывает лизис клеток и высвобождение биоразлагаемой пластмассы в раствор NaOH. Биоразлагаемый полимер затем отделяют от раствора NaOH посредством центрифугирования при ускорении 1500 g в течение 20 минут и отбрасывания надосадочного раствора.

[0036] Биоразлагаемый полимер повторно суспендируют в 150 мл воды milliQ, а затем отделяют от воды посредством центрифугирования при ускорении 1500 g в течение 20 минут. Надосадочный раствор отбрасывают для удаления примесей. Биоразлагаемый полимер затем повторно суспендируют в 150 мл 1% этанольного раствора и отделяют от этанольного раствора посредством центрифугирования при ускорении 1500 g в течение 20 минут. Надосадочный раствор снова отбрасывают для дополнительного удаления примесей.

Пример: производственная питательная среда 2

[0037] Осуществляют ультразвуковую обработку 5 г растительных отходов с 300 мл деионизированной воды при комнатной температуре. Фильтруют, используя фильтровальную бумагу Whatman №1, нагревают и интенсивно перемешивают фильтрат при температуре 55°С с добавлением 100 мл раствора гидроксида натрия (5%, мас./об.) и пероксида водорода (11%, об./об.) в течение 90 минут. Суспензию фильтруют, доводят до нейтрального значения рН и высушивают при температуре 50°С. Добавляют 5 г высушенной биомассы в 100 мл 6 М серной кислоты в процессе интенсивного перемешивания в течение 30 минут и останавливают реакцию посредством добавления 500 мл холодной деионизированной воды. Центрифугируют при скорости 10000 об/мин в течение 10 минут и промывают деионизированной водой до достижения нейтрального значения рН. Получение простых мономеров из целлюлозы осуществляют посредством применения 67% хлорида цинка и кислотного гидролиза при концентрации 0,5 М и температуре 70°С, в результате этого идеальным образом получают растворимые сахара с выходом, превышающим 80%. Конечный продукт, представляющий собой глюкозу, затем разбавляют в 1 л стерильного фосфатно-солевого буферного раствора при рН 7,0, и в результате этого получается производственная питательная среда 2 (конечные концентрации составляют 8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л Na₂HPO₄, 0,24 г/л K₂HPO₄).

Пример: экстракция 2

[0038] Синтез и экстракция РНВ для использования в биоразлагаемых полимерных композициях согласно настоящему изобретению могут быть осуществлены с применением следующего способа. Подходящие виды бактерий Bacillus культивируют в питательном бульоне из концентрата в течение ночи при температуре 37°С в процессе встряхивания со скоростью 120 об/мин. Раствор, содержащий 1,5×10⁸ клеток/мл, можно добавлять в соотношении 1/10 об./об. в производственную питательную среду 2, которую дополняет ограниченный источник азота, такой как жидкий кукурузный экстракт (CSL) или соль аммония, в концентрации, эквивалентной 0,05% NH₄Cl, и культивировать при температуре 37°С в процессе встряхивания со скоростью 120 об/мин в течение 72 часов. После этого клетки центрифугируют при ускорении 6500 g в течение 10 минут и высушивают при температуре 50°С.

[0039] Массу сухих клеток можно измерить, а затем РНВ можно экстрагировать с применением экстракции гидроксидом натрия и селективного растворения. Экстракцию гидроксидом натрия осуществляют посредством повторного суспендирования клеток в дистиллированной воде и добавления раствора NaOH (0,2 N NaOH) при температуре 30°С в течение от 1 до 5 часов. Значение рН доводят до 7,0, добавляя HCl, чтобы остановить реакцию. Центрифугируют при ускорении 2500 g в течение 20 минут. Гранулы РНВ извлекают посредством мягкого промывания в дистиллированной воде, повторно центрифугируют и высушивают на воздухе.

[0040] Селективное растворение осуществляют посредством воздействия минеральной кислоты, такой как серная кислота, на смесь, что приводит к выделению гранул в твердой фазе, в то время как нежелательный материал отделяется в жидкой фазе. Указанные фазы можно подвергать дополнительному разделению посредством центрифугирования при ускорении 5000 g. Нежелательный надосадочный раствор (жидкая фаза) подлежит утилизации, в то время как твердая фаза подвергается последующей обработке. Минеральная кислота позволяет успешно выделять РНВ из смеси, но его чистоту предпочтительно повышают перед применением. Это осуществляют посредством промывания продукта в щелочной ванне, такой как NaOH (рН 10). В результате промывания достигается высокий уровень выхода и чистоты (более 97%). Для обесцвечивания продукта может быть использовано имеющееся в продаже отбеливающее средство. После заключительного центрифугирования и промывания водой продукт РНВ готов к применению.

[0041] Для измерения выхода РНВ осуществляют центрифугирование и промывание гранул спиртом. Гранулы растворяют в хлороформе, и раствор переносят в чистые и предварительно взвешенные пробирки для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают до испарения хлороформа и взвешивают для вычисления количества полученного РНВ. Этот способ позволяет получать от 2 до 5 г/л РНВ, используя от 7 до 9 г/л массы сухих клеток. Данный способ культивирования может быть видоизменен для использования с бактериями видов Bacillus, чтобы также получать большие количества РНВ из меньшего объема культуральной среды в течение менее продолжительного времени. В качестве альтернативы, аналогичным образом может быть использован вместо этого модифицированный штамм Cupriavidus necator.

Пример: экстракция 3

[0042] Согласно другому варианту осуществления РНВ можно синтезировать и экстрагировать, используя бактерии Cupriavidus necator в качестве микроорганизма и отходы каннабиса в качестве источника углерода, посредством осуществления следующего способа. Здесь используется штамм С. necator, который способен производить РНВ и называется Alcaligenes eutrophus Н16 (бактерии С. necator были ранее известны как Alcaligenes eutrophus). Штамм A. eutrophus Н16 культивируют при температуре 30°С в минеральной солевой среде с ограниченным содержанием азота, добавляя 1% (об./об.) конопляного масла и 0,05% (мас./об.) NH₄Cl в течение 72 часов. Канамицин (50 мг/л) добавляли для поддержания плазмиды с широким кругом хозяев, введенной в A. eutrophus Н16. После культивирования клетки извлекали и дважды промывали дистиллированной водой и лиофилизировали. РНВ экстрагировали с применением горячего хлороформа в аппарате Сокслета и очищали посредством переосаждения метанолом.

[0043] РНВ может быть получен способом экстракции 3 в количестве, составляющем приблизительно 0,0128 г РНВ в расчете на 1 г конопляного масла в час.

Пример: экстракция 4

[0044] Согласно другому варианту осуществления РНВ можно синтезировать и экстрагировать, используя бактерии С. necator в качестве микроорганизма и отходы каннабиса в качестве источника углерода посредством осуществления следующего способа. Поверхностно-активное вещество, представляющее собой аравийскую камедь, необязательно можно добавлять в реакционную среду, чтобы повышать способность С.к взаимодействию/использованию конопляного масла, поскольку отсутствует токсичность и ингибирование культивирования С. necator. Бактерии С. necator можно культивировать в минимальной питательной среде из концентрата, содержащей 2% фруктозы и 0,1% NH₄Cl (16 г/л), NaH₂PO₄ (4 г/л), Na₂HPO₄ (4,6 г/л), K₂SO₄ (0,45 г/л), MgSO₄ (0,39 г/л), CaCl₂ (62 мг/л) и 1 мл/л раствора микроэлементов (15 г/л FeSO₄⋅7H₂O, 2,4 г/л MnSO₄⋅H₂O, 2,4 г/л ZnSO₄⋅7H₂O, и 0,48 г/л CuSO₄⋅5H₂O в растворе 0,1 М хлористоводородной кислоты). Клетки из минимальной питательной среды используют для засевания каждого ферментатора и достижения оптической плотности OD600 0,1. Каждый реакционный резервуар содержит 400 мл среды эмульгированного конопляного масла. Для минимальной питательной среды, содержащей 0,1% NH₄Cl, используют приблизительно 2% конопляного масла. Для изготовления среды используют 10Х раствор аравийской камеди после смешивания с водой и быстрого перемешивания. Этот раствор центрифугируют при ускорении 10500 g для отделения нерастворимых частиц. Воду, осветленный раствор аравийской камеди и конопляное масло объединяют с фосфатом натрия (4,0 г/л) и K₂SO₄ (0,45 г/л). Смесь эмульгируют посредством гомогенизации или ультразвуковой обработки. Количество воды, добавляемой перед эмульгированием, зависит от конкретного устройства, используемого для изготовления эмульсии. После эмульгирования автоклав охлаждают и добавляют MgSO₄ (0,39 г/л), CaCl₂ (62 мг/л), микроэлементы (15 г/л FeSO₄⋅7H₂O, 2,4 г/л MnSO₄⋅H₂O, 2,4 г/л ZnFeSO₄⋅7H₂O, и 0,48 г/л CuSO₄⋅5H₂O в растворе 0,1 М хлористоводородной кислоты) и гентамицин (10 мкг/мл). Содержимое каждого реакционного резервуара выдерживают при температуре 30°С и рН 6,8 (регулируют с применением раствора 2 М NaOH) и перемешивают при скорости от 500 до 900 об/мин и концентрации растворенного кислорода 40% в течение 72 часов. Предпочтительно используют технологию периодической подпитки культуры клеток для поддержания избытка углерода в целях увеличения производства РНВ.

[0045] РНВ можно производить способом экстракции 4 в количестве, составляющем приблизительно 0,2415 г РНВ на 1 г конопляного масла.

Пример: экстракция 5

[0046] Согласно другому варианту осуществления РНВ можно синтезировать и экстрагировать, используя Cupriavidus necator и модифицированный штамм Escherichia coli, а также необязательный модифицированный штамм Aeromonas hydrophila, содержащий гены phbA и phbB в качестве микроорганизмов и отходы каннабиса в качестве источника углерода посредством осуществления следующего способа. Сначала отходы каннабиса измельчают и помещают в воду в количестве, составляющем приблизительно 2% (мас./об.), при температуре, составляющей приблизительно 30°С. Смесь каннабиса и воды засевают смешанной культурой, содержащей С. necator и Е. coli и необязательно A. hydrophila, и добавляют удобрение, такое как экстракт рисовых отрубей в концентрации 0,1%. Реакционную среду затем перемешивают в течение 20 часов, чтобы обеспечить культивирование. После первоначального периода культивирования перемешивание реакционной среды продолжают в течение 15 часов без добавления какого-либо дополнительного удобрения, чтобы индуцировать состояние удаления азота и способствовать получению РНВ.

[0047] Экстракцию РНВ осуществляют посредством добавления минеральной кислоты, такой как серная кислота, в реакционную среду приблизительно через 35 часов. Гранулы РНВ отделяют посредством центрифугирования при ускорении 5000 g. Нежелательный надосадочный раствор (жидкая фаза) подлежит утилизации, в то время как твердая фаза подвергается последующей обработке. Минеральная кислота позволяет успешно выделять РНВ из смеси. Чистота соединения может быть повышена посредством промывания продукта в щелочной ванне, такой как NaOH (рН 10), с последующим центрифугированием и промыванием водой. Этот способ обеспечивает высокий уровень выхода и чистоты (более 97%). Для обесцвечивания продукта может быть использовано имеющееся в продаже отбеливающее средство.

Пример: производственная питательная среда 3

[0048] Согласно другому варианту осуществления РНВ можно синтезировать и экстрагировать, используя Pseudomonas putida GPp104 в качестве микроорганизмов и отходы каннабиса в качестве источника углерода посредством осуществления следующего способа. P. putida культивируют в течение ночи в среде лизогенного бульона (LB), содержащей 50 мг/л канамицина, при температуре 30°С в процессе встряхивания со скоростью 200 об/мин. Фосфатно-солевой буферный раствор для засевания этого штамма содержит 9,0 г/л Na₂HPO₄⋅12H₂O, 1,5 г/л KH₂PO₄, 1,0 г/л (NH₄)₂FeSO₄ и 0,4 г/л MgFeSO₄⋅7H₂O и имеет рН 7,0.

Пример: экстракция 6

[0049] После культивации в течение ночи культуру P. putida, содержащую 1,5×10⁸ клеток/мл, можно добавлять в соотношении 1/10 об./об. в 1 л производственной питательной среды 3 и культивировать при температуре 30°С в процессе встряхивания при скорости 200 об/мин в течение 72 часов. РНВ можно экстрагировать, используя гипохлорит натрия следующим образом. В 8 г биомассы добавляют 100 мл гипохлорита натрия (30%) и инкубируют в течение 90 минут при температуре 37°С. Гранулы отделяют посредством центрифугирования и промывают спиртом. Гранулы растворяют в хлороформе и необязательно переносят в чистые и предварительно взвешенные пробирки для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают до испарения хлороформа и взвешивают для вычисления количества полученного РНВ.

[0050] Настоящее изобретение было описано со ссылкой на примерный вариант осуществления, однако специалисты в данной области техники должны понимать, что могут быть произведены разнообразные изменения, и некоторые элементы могут быть замещены соответствующими эквивалентами без выхода за пределы объема настоящего изобретения, представленного в следующей формуле изобретения. Таким образом, предусмотрено, что настоящее изобретение не является ограниченным конкретными вариантами осуществления, которые описаны в настоящем документе.

Изобретение относится к способам изготовления биоразлагаемых полимерных композиций. Предложен способ изготовления биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират, с использованием отходов каннабиса в качестве источника углерода, включающий следующие стадии: a) переработка отходов каннабиса посредством механического измельчения; b) нагревание отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты в течение по меньшей мере 25 минут при температуре, составляющей по меньшей мере 121°С, с получением раствора каннабиса в кислоте; c) охлаждение, нейтрализация и фильтрование раствора каннабиса в кислоте с получением фильтрата; d) смешивание фильтрата с минеральной солевой средой в соотношении, составляющем от 1:1 до 1:2, с получением производственной питательной среды; e) засевание производственной питательной среды заквасочной культурой микроорганизмов, выбранных из группы, которую составляют встречающиеся в природе и модифицированные штаммы Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium, и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение от 48 до 72 часов с получением культуры и f) экстракция биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират, из культуры. Предложены также способ изготовления производственной питательной среды из отходов каннабиса и применение отходов каннабиса в качестве источника углерода для изготовления биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Способ изготовления биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират, с использованием отходов каннабиса в качестве источника углерода, включающий следующие стадии:

a) переработка отходов каннабиса посредством механического измельчения;

b) нагревание отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты в течение по меньшей мере 25 минут при температуре, составляющей по меньшей мере 121°С, с получением раствора каннабиса в кислоте;

c) охлаждение, нейтрализация и фильтрование раствора каннабиса в кислоте с получением фильтрата;

d) смешивание фильтрата с минеральной солевой средой в соотношении, составляющем от 1:1 до 1:2, с получением производственной питательной среды;

e) засевание производственной питательной среды заквасочной культурой микроорганизмов, выбранных из группы, которую составляют встречающиеся в природе и модифицированные штаммы Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium, и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение от 48 до 72 часов с получением культуры; и

f) экстракция биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират, из культуры.

2. Способ по п. 1, в котором стадия экстракции биоразлагаемого полимера из культуры включает следующие стадии:

a) фильтрование культуры через мембрану с размером пор, составляющим приблизительно 1 мм;

b) отделение клеток микроорганизма от подвергнутой фильтрованию культуры;

c) суспендирование клеток в растворе NaOH и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение по меньшей мере 1,5 часов с высвобождением биоразлагаемого полимера из клеток;

d) отделение биоразлагаемого полимера от раствора NaOH и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в воде;

e) отделение биоразлагаемого полимера от воды и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в этанольном растворе; и

f) отделение биоразлагаемого полимера от этанольного раствора.

3. Способ по п. 2, в котором биоразлагаемый полимер представляет собой полигидроксибутират.

4. Способ по п. 3, в котором микроорганизм не экспрессирует ген, кодирующий деполимеразу, способную разлагать полигидроксибутират.

5. Способ по п. 4, в котором микроорганизм представляет собой модифицированный штамм Bacillus subtilis, который экспрессирует один или несколько генов, которыми кодируются ацетил-СоА-ацетилтрансфераза, ацетил-СоА-редуктаза, и полигидроксибутират-по лимераза.

6. Способ по п. 5, в котором один или несколько генов выбраны из группы, которую составляют phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.

7. Способ по п. 4, в котором микроорганизм представляет собой модифицированный штамм Cupriavidus necator, который экспрессирует один или несколько генов, которыми кодируются ацетил-СоА-ацетилтрансфераза, ацетил-СоА-редуктаза, и полигидроксибутират-полимераза.

8. Способ по п. 7, в котором один или несколько генов выбраны из группы, которую составляют phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.

9. Способ изготовления производственной питательной среды из отходов каннабиса для использования в изготовлении биоразлагаемого полимера, выбранного из класса полигидроксиалканоатов (PHAs), включающий следующие стадии:

a) переработка отходов каннабиса посредством механического измельчения;

b) нагревание отходов каннабиса в растворе минеральной кислоты в течение по меньшей мере 25 минут при температуре, составляющей по меньшей мере 121°С, с получением раствора каннабиса в кислоте;

c) охлаждение, нейтрализация и фильтрование раствора каннабиса в кислоте с получением фильтрата; и

d) смешивание фильтрата с минеральной солевой средой в соотношении, составляющем от 1:1 до 1:2.

10. Способ по п.9, дополнительно включающий следующие стадии:

а) засевание производственной питательной среды, имеющей ограниченное содержание азота и содержащей переработанные растительные отходы в качестве источника углерода, заквасочной культурой микроорганизмов, выбранных из группы, которую составляют встречающиеся в природе и модифицированные штаммы Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus и Fermicutes bacterium, и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение от 48 до 72 часов с получением культуры;

b) фильтрование культуры через мембрану с размером пор, составляющим приблизительно 1 мм;

c) отделение клеток микроорганизма от подвергнутой фильтрованию культуры;

d) суспендирование клеток в растворе NaOH и инкубация при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С, в течение по меньшей мере 1,5 часов с высвобождением биоразлагаемого полимера из клеток;

e) отделение биоразлагаемого полимера от раствора NaOH и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в воде;

f) отделение биоразлагаемого полимера от воды и повторное суспендирование биоразлагаемого полимера в этанольном растворе; и

g) отделение биоразлагаемого полимера от этанольного раствора.

11. Способ по п. 10, в котором биоразлагаемый полимер представляет собой полигидроксибутират.

12. Способ по п. 11, в котором микроорганизм не экспрессирует ген, кодирующий деполимеразу, способную разлагать полигидроксибутират.

13. Способ по п. 12, в котором микроорганизм представляет собой модифицированный штамм Bacillus subtilis, который экспрессирует один или несколько генов, которыми кодируются ацетил-СоА-ацетилтрансфераза, ацетил-СоА-редуктаза, и полигидроксибутират-по лимераза.

14. Способ по п. 13, в котором один или несколько генов выбраны из группы, которую составляют phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.

15. Способ по п. 12, в котором микроорганизм представляет собой модифицированный штамм Cupriavidus necator, который экспрессирует один или несколько генов, которыми кодируются ацетил-СоА-ацетилтрансфераза, ацетил-СоА-редуктаза, и полигидроксибутират-полимераза.

16. Способ по п. 15, в котором один или несколько генов выбраны из группы, которую составляют phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.

17. Применение отходов каннабиса в качестве источника углерода для изготовления биоразлагаемого полимера, содержащего полигидроксибутират.

18. Применение по п. 17, в котором отходы каннабиса состоят из одного или нескольких материалов, представляющих собой обрезки, листья, черешки и стебли растения каннабиса.

19. Применение по п. 18, в котором биоразлагаемый полимер представляет собой полигидроксибутират.