Способ нейропротекции головного мозга при моделировании фотоиндуцированного ишемического инсульта Российский патент 2024 года по МПК A61M16/12 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении клинической эффективности и безопасности применения инертного газа аргона в качестве нейропротектора при фокальной ишемии головного мозга (ГМ).

Уровень техники

Известно значительное количество работ, в которых особое внимание уделяется изучению нейропротекторных свойств аргона. Большое количество исследований было проведено на различных моделях ишемического повреждения ГМ, таких как, окклюзия средней мозговой артерии, черепно-мозговая травма (ЧМТ), остановка кровообращения и другие. В частности, известна работа Moro F., Fossi F., и др., посвященная определению эффективности острого введения вдыхаемого аргона при ЧМТ у мышей [Moro F., Fossi F., Magliocca A., Pascente R., Sammali E., Baldini F., Tolomeo D., Micotti E., Citerio G., Stocchetti N., Fumagalli F., Magnoni S., Latini R., Ristagno G., Zanier E.R. Efficacy of acute administration of inhaled argon on traumatic brain injury in mice. Br J Anaesth. 2021; 126 (1): 256-264. doi: 10.1016/j.bja.2020.08.027. Epub 2020 Sep 22.]. Данные исследования включали ингаляцию газовой смеси: аргон 70%, кислород 30% в течение 24 часов после моделирования ЧМТ у мышей. По данным исследования аргон ускорял восстановление сенсомоторной функции и улучшал когнитивные и структурные показатели после тяжелой ЧМТ у взрослых мышей. Однако данный способ воздействия не позволяет сделать выводы о степени влияния ингаляционного воздействия аргона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

Известна также работа GrtiBer L., Blaumeiser-Debarry R. и др., в которой рассмотрено влияние аргона на последствия вторичного повреждения после ЧМТ [GrtiBer L., Blaumeiser-Debarry R., Krings M., Kremer В., Hollig A., Rossaint R., Coburn M. Argon attenuates the emergence of secondary injury after traumatic brain injury within a 2-hour incubation period compared to desflurane: an in vitro study. Med Gas Res. 2017; 7 (2): 93-100. doi: 10.4103/2045-9912.208512. Erratum in: Med Gas Res. 2017; 7 (3): 155] Данные исследования включали ингаляцию газовой смеси: аргон 50%, кислород 50% в течение 2-х часов в модели ЧМТ in vitro. По данным исследования аргон уменьшал гибель нейронов в зоне вторичного повреждения. Данный способ воздействия также не позволяет сделать выводы о степени влияния ингаляционного воздействия аргона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

Кроме того, известен ряд работ, имеющих непосредственное отношение к исследованию зависимости вдыхания аргона на неврологический исход после закрытой травмы головы у мышей. К ним относятся, в частности, исследования Creed J., Cantillana-Riquelme V. и др. Данные исследования включали ингаляцию газовой смеси: аргон 70%, кислород 30% в течение 24 часов после моделирования ЧМТ у мышей. [Creed J., Cantillana-Riquelme V., Yan B.H., Ma S., Chu D., Wang FL, Turner D.A., Laskowitz D.T., Hoffmann U. Argon Inhalation for 24 h After Closed-Head Injury Does not Improve Recovery, Neuroinflammation, or Neurologic Outcome in Mice. Neurocrit Care. 2021; 34 (3): 833-843. doi: 10.1007/s12028-020-01104-0. Epub 2020.]. По данным исследования аргон не влиял на неврологический исход и не ускорял восстановление сенсомоторной функции после тяжелой ЧМТ у взрослых мышей. Результаты выполненного исследования противоречат данным, полученным Moro F., и соавт. в 2021 г. Данный способ воздействия не позволяет сделать выводы о степени влияния ингаляционного воздействия аргона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

В исследовании Ma S. и соавт. был показан нейропротекторный эффект аргона при нереперфузированной ишемии ГМ, вызванной перекрытием средней мозговой артерии у крыс.Исследование включало ингаляцию газовой смеси: аргон 70%, кислород 30% в течение 24-х часов после моделирования ишемии ГМ у крыс. Неврологический исход (neuroscore), общее восстановление (масса тела) и объем инфаркта были значительно улучшены после 24-часовой ингаляции 70% аргона, введенной сразу после индукции тяжелого перманентного инсульта. Данный способ воздействия наиболее близок к предлагаемому способу воздействия и указывает на положительное влияние ингаляционного воздействия аргона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом. Однако данный способ не может быть реализован в клинической практике у пациентов из-за длительности воздействия (24 часа без перерыва) вследствие того, что предполагает нахождение в условиях герметичного бокса с искусственной газовой средой [Ma S., Chu D., Li L., Creed J.A., Ryang Y.M., Sheng H., Yang W., Warner D.S., Turner D.A., Hoffmann U. Argon Inhalation for 24 Hours After Onset of Permanent Focal Cerebral Ischemia in Rats Provides Neuroprotection and Improves Neurologic Outcome // Crit Care Med. 2019. Vol. 47, N 8. e693-e699].

В исследовании Боевой Е.А. и соавт. было оценено влияние 24-часовой ингаляции аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30% после фотоиндуцированного ишемического инсульта (ФИИ) на выраженность неврологического дефицита и степень повреждения ГМ у крыс [Боева Е.А., Силачев Д.Н., Якупова Э.И., Милованова М.А., Варнакова Л.А., Калабушев С.Н., Денисов С.О., Антонова В.В., Рыжков И.А., Лапин К.Н., Гребенчикова А.А. Изучение нейропротективного эффекта ингаляции аргон-кислородной смеси после фотоиндуцированного ишемического инсульта. Общая реаниматология. 2023; 19 (3): 46-53. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2023-3-46-53]. Результаты выполненного исследования противоречат данным, полученным Ma S., и соавт. в 2019 г. В проведенном Боевой Е.А. и соавт. исследовании было показано, что 24-часовая ингаляция аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30% после инсульта не уменьшает объем повреждения ГМ и не снижает выраженность неврологического дефицита. Данный способ воздействия наиболее близок к предлагаемому способу воздействия, но не показал положительного влияния аргона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

Раскрытие сущности изобретения

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи оценки влияния на выраженность неврологического дефицита и объем повреждения ГМ у крыс в результате двухчасовой ингаляции аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30%, осуществленной в интервальном режиме: непосредственно после ФИИ, а также на 2-е и 3-и сутки.

Анализ результатов исследований показал, что аргон обладает биологической активностью. В наибольшей степени эффекты проявляются при патологических условиях. Аргон при нормальном атмосферном давлении не обладает наркотическим и анестезирующим действием, кроме того, он обеспечивает нейропротекцию при моделировании гипоксически-ишемических инсультов. Важную роль при оценке нейропротекторных свойств играет модель ишемии и режим ингаляции [Ulbrich F., Kaufmann К., Roesslein М., Wellner F., Auwarter V., Kempf J., Loop Т., Buerkle H., Goebel U. Argon Mediates Anti-Apoptotic Signaling and Neuroprotection via Inhibition of Toll-Like Receptor 2 and 4 // PLoS One. 2015. Vol.10, N 12. e0143887; Ulbrich F., Schallner N., Coburn M., Loop Т., Lagreze W.A., Biermann J. Argon inhalation attenuates retinal apoptosis after ischemia/reperfusion injury in a time- and dose-dependent manner in rats // PLoS One 2014. N 9. el 15984].

В основе ишемического инсульта лежит гипоперфузия, которая активирует гипоксию и ишемический каскад. Областью наибольшего интереса является изучение полутени: переходная зона между ишемическим повреждением и здоровыми тканями, где нейроны находятся в состоянии гибернации, которое при оптимальном лечении может быть полностью восстановлено (ad integrum).

Для настоящего исследования влияния аргона в условиях ишемии использовалась модель фотохимического тромбоза. В основе патогенеза модели ФИИ лежит тромбообразование вследствие нарушения целостности эндотелия с быстро прогрессирующим ишемическим инфарктом и гибелью клеток в относительно небольшом объеме коры. В данной модели повреждение происходит одновременно в коре и подкорковых областях, а область ишемической полутени (пенумбры) небольшого объема, но хорошо выражена [Carmichael S.T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose // NeuroRx. 2005. Vol.2, N 3. P. 396-409; Hu Sh., Wu G., Wu В., Du Zh., Zhang Yi. Rehabilitative training paired with peripheral stimulation promotes motor recovery after ischemic cerebral stroke // Exp Neurol 2022. N. 349. P. 113960; Ершов A.B., Крюков И.A., Антонова В.В., Баева А.А. Влияние ксенона на активность гликоген-синтазы киназы-3β в перифокальной зоне ишемического инсульта (экспериментальное исследование) // Общая реаниматология. 2023. Т 19. №2. С. 60-67; Макарьева Л.М., Акулинин В.А., Коржук М.С., Степанов С.С., Шоронова А.Ю., Авдеев Д.Б., Цускман И.Г. Структурно-функциональная реорганизация сенсомоторной коры при перевязке общих сонных артерий (экспериментальное исследование) // Общая реаниматология. 2022. Т 18. №5. С. 32-43. Горбунова А.В., Авдеев Д.Б., Степанов С.С., Акулинин В.А., Степанов А.С., Шоронова А.Ю., Самсонов А.А. Глиоцитоархитектоника зубчатой фасции и поля СА4 гиппокампа головного мозга белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий // Общая реаниматология. 2019. Т 15. №6. С. 26-37].

В результате исследований, проведенных авторами заявляемого способа, установлено, что 2-х часовая ингаляция аргоном, осуществляемая в интервальном режиме непосредственно после моделирования ФИИ, а также через 24 и 72 часа у крыс оказывает значимое влияние на нейропротективный эффект, а именно на уровень неврологического дефицита на протяжении двух недель постишемического периода, а также на объем повреждения ГМ по данным МРТ.

Проведенное гистологическое исследование коррелирует с данными неврологического статуса и данными МРТ. При гистологическом исследовании в группе Ишемия на 14-е сутки отмечались типичные изменения при ишемическом повреждении. Ярко выражен вал глиальных клеток, уничтожающих погибшие и поврежденные клетки. Кроме того, в структуре тканей отмечается большое количество пенистых клеток, которые поглощают измененные клетки, запускают апоптотические механизмы и затем, на более поздних сроках, погибают, формируя фиброзную ткань, которая лежит в основе формирования рубца. Также в данной группе видны новообразованные сосуды, которые располагаются на периферии. Признаков формирования капсулы на данном этапе еще нет.

В группе Ишемия + iAr уже отмечаются признаки инкапсуляции, новообразованные сосуды располагаются в толще ткани, а не на периферии.

Это свидетельствует об ускорении процессов репарации тканей после ишемического повреждения. Таким образом, результаты проведенных авторами исследований позволяют сделать вывод о том, что двухчасовая ингаляция аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30% непосредственно после ФИИ, а также на 2-е и 3-й сутки в 2 раза уменьшает объем повреждения ГМ и снижает выраженность неврологического дефицита.

Таким образом, учитывая возможное посткондиционирование аргоном, а также трудности непрерывной 24-часовой ингаляции аргон-кислородной смеси в клинических условиях, было принято решение о применении двухчасовой экспозиции в течение 3-х дней.

Результаты исследования

На протяжении 14 дней из эксперимента животные не выводились, не было достижения гуманной конечной точки. Летальных исходов не было. Неврологическая оценка. Тест постановки конечностей на опору (ПКО).

Получены статистически значимые различия между группой Ишемия и группой Ишемия + iAr на 3-й сутки (7,5 (5; 10) баллов против 10 (10; 12) баллов, р=0,049), 7-е сутки (8 (7; 9) баллов против 10 (9; 11,5) баллов, р=0,029) и 14-е сутки исследования (4,5 (3; 7) баллов против 8 (6,5; 9) баллов, р=0,046).

МРТ-исследование головного мозга

Средний объем повреждения в группе Ишемия + iAr и группе Ишемия составил 11,3 (8,8; 16,6) mm³ и 20,7 (16,7; 23,79) mm³, соответственно. Получены статистически значимые различия между группами (р=0.01).

Морфологическая оценка ишемического повреждения мозга крыс из группы Ишемия и Ишемия + Ar.

Мягкие оболочки присутствовали на большинстве препаратов. На препаратах мягкие оболочки частично отслоены, утолщены на всех препаратах. Сосуды полнокровны, встречаются гиалинизированные.

В участке повреждения в коре, центральная часть которого, в группе Ишемия представлена гомогенно окрашенным участком некроза, окруженным валом из глиальных клеток, присутствовали макрофаги с зернистой цитоплазмой, пенистые клетки на разных стадиях апоптоза. Кроме того, наблюдались полнокровные капилляры в зоне клеточного вала. В центральной части зоны повреждения на препаратах группы Ишемия + iAr располагался детрит, внутри которого фибробласты создавали подобие ячеистой структуры, так же в детрите диффузно, равномерно присутствовали клетки глии. Обнаруживались полнокровные капилляры с вытянутыми эндотелиоцитами с гиперхромными ядрами.

В группе Ишемия + iAr на всех препаратах по периферии участок повреждения окружен скоплением фибробластов и глиальных клеток. Наблюдались крупные полнокровные сосуды. Так же в этой области заметно разрежена ткань вследствие отека. Обнаруживались кисты, имеющие неполную эпителиальную выстилку, внутри встречались единичные макрофаги с зернистой цитоплазмой.

На части препаратов из группы Ишемия на периферии были выявлены пенистые клетки, глиальные клетки и новообразованные сосуды. В зоне пенумбры обнаруживались нейроны с признаками альтерации (темные нейроны, нейроны с гиперхромным ядром, гипохромные нейроны, смещение ядра, смещение ядрышка) наблюдался периваскулярный отек средней выраженности.

На основании наличия фибробластов, образующих ячеистую структуру, новообразованных сосудов в центре очага повреждения, а также диффузно расположенных микроглиоцитов, можно сделать вывод о том, что процесс регенерации более выражен на препаратах группы Ишемия + iAr, чем на препаратах группы Ишемия, где не наблюдалось фибробластов, новообразованные сосуды присутствовали только по периферии. Микроглиоциты, макрофаги и пенистые клетки находились по периферии очага.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлены сравнительные результаты теста ПКО между группой Ишемия и группой Ишемия + iAr на 3-й сутки, 7-е сутки и 14-е сутки исследования.

На Фиг. 2 представлены сравнительные результаты измерений среднего объема повреждения ГМ в группе Ишемия + iAr и группе Ишемия.

Осуществление изобретения

Эксперименты были проведены на крысах-самцах линии Wistar весом 250-300 г (n=18). Животные были случайным образом разделены на 2 группы в зависимости от объема проводимых вмешательств:

- контрольная группа с ишемией+ингаляция газовой смесью: N₂ 70%/О₂ 30% (группа Ишемия), n=10;

- опытная группа с ишемией+ингаляция газовой смесью: Ar 70%/О₂ 30% (группа Ишемия + iAr), n=8.

Неврологический статус оценивали в течение 14 дней с помощью теста ПКО. Магнитно-резонансная томография (МРТ) и гистологическое исследование ГМ с оценкой размера очага повреждения были выполнены через 14 суток после ФИИ. Получены статистически значимые различия при оценке в тесте ПКО между группой Ишемия и группой Ишемия + iAr на 3-й, 7-е и 14-е сутки. Объем ишемии по данным МРТ статистически значимо различался между группами.

За 8 часов до эксперимента животные не получали корм, но имели свободный доступ к воде. Протокол исследования был утвержденным Локальным этическим комитетом ФНКЦ РР №3/22/3 от 14 декабря 2022 г. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях.

Моделирование ФИИ

После внутрибрюшинного введения 6% хлоралгидрата было выполнено моделирование ФИИ в соответствии с методикой [Silachev D.N., Uchevatkin А.А., Pirogov Y.A., Zorov D.B., Isaev N.K. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries // Bull Exp Biol Med. 2009. Vol. 147, N 2. P. 269-72].

ФИИ моделировали в сенсомоторной коре ГМ крыс с помощью фотохимически индуцированного тромбоза сосудов коры ГМ. Введение светочувствительного красителя rose Bengal (3%, 40 мг/кг внутривенно; Sigma-Aldrich, St. Луис, Миссури, США) осуществляли в яремную вену. После этого, голову крысы фиксировали в стереотаксической рамке (стереотаксические координаты Bregma: 0,5 мм дистально и 2,5 мм латерально), череп обнажали через разрез по средней линии, очищенный от надкостницы. Далее, полушарие мозга в области сенсомоторной коры облучали зеленым лазером при λ=550 нм в течение 15 минут. После наложения швов на кожу крыс помещали в клетку под инфракрасную нагревательную лампу до их выхода из наркоза. Температура тела во время всего эксперимента поддерживалась на уровне 37±0,5°С. Термометрию выполняли путем установки ректального датчика температуры тела, а терморегуляцию осуществляли в автоматическом режиме путем соединения модуля обогрева с термореле и установкой пограничных значений [Silachev D.N., Uchevatkin А.А., Pirogov Y.A., Zorov D.B., Isaev N.K. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries // Bull Exp Biol Med. 2009. Vol. 147, N 2. P. 269-72].

Воздействие аргоном

Через 15 минут после моделирования фокальной ишемии ГМ животных помещали в прозрачную пластиковую камеру объемом 15 литров, в которую постоянно подавали свежую газовую смесь (N₂ 70%/О₂ 30% - группа Ишемия; Ar 70%/O₂ 30% - группа Ишемия + iAr) с потоком 0,5 л/мин на одно животное. Одномоментно в камере находились не более 5 животных одной группы, что позволяло избежать гипоксии и гиперкапнии.

Длительность воздействия газовыми смесями в камере составила 2 часа. На протяжении всего эксперимента осуществляли непрерывный контроль уровня О₂ и СО₂ в камере с животными с использованием блока контроля атмосферы закрытых помещений (ЗАО «ИНСОВТ» СПБ, Россия). После окончания периода экспозиции проводили оценку общего состояния каждого животного (уровень бодрствования, подвижность) и осуществляли обезболивание (парацетамол 50 мг/кг и/к). Затем животных перемещали в клетку с предоставлением свободного доступа к воде и пище. Через 24 часа животных группы Ишемия + iAr повторно помещали в камеру для ингаляции газовой смесью, содержащей аргон в течение 2 часов. Между ингаляциями животных перемещали в клетку с предоставлением свободного доступа к воде и пище. Через 72 часа от начала эксперимента животных группы Ишемия + iAr в третий раз помещали в камеру для ингаляции газовой смесью, содержащей аргон в течение 2 часов.

Оценка неврологического статуса

Оценку неврологического статуса животных обеих групп проводили на 3-й, 7-й и 14-й день после моделирования ишемии.

Использовали протокол, основанный на методике, описанной Де Риком и соавт. (1989) [De Ryck М., Van Reempts J., Borgers M., Wauquier A., Janssen P.A. Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats // Stroke. 1989. Vol. 20, N 10. P. 1383-90] и модифицированный Ю. Ёолкконеном и соавт. (2000) [Jolkkonen J., Puurunen K., Rantakomi S., Harkonen A., Haapalinna A., Sivenius J. Behavioral effects of the alpha(2)-adrenoceptor antagonist, atipamezole, after focal cerebral ischemia in rats // Eur J Pharmacol. 2000. Vol. 400, N 2-3. P. 211-9]. Крыс приучали к рукам в течение недели до тестирования. Тест состоял из семи испытаний, оценивающих сенсомоторную интеграцию передних и задних конечностей в ответ на тактильную, проприоцептивную и зрительную стимуляцию. Каждый тест оценивали следующим образом: крыса выполняла испытание нормально - 2 балла; крыса выполняла испытание с промедлением >2 с и/или не полностью - 1 балл; крыса не выполнила испытание - 0 баллов. Баллы суммировались, результаты представлены в виде суммы баллов за тест.

На 14-е сутки после моделирования ишемии было проведено МРТ исследование животных обеих групп на томографе с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м (BioSpec 70/30, Bruker, Германия). Анестезию выполняли изофлураном (1,5-2%), после чего крысу помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции как описано ранее.

Использовали стандартный протокол исследования мозга крысы, который включает в себя получение Т2-взвешенных изображений. Для передачи радиочастотного (РЧ) сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Использовали следующие импульсные последовательности (ИП): RARE - ИП на основе спинового эха с параметрами: TR=6000 мс, ТЕ=63,9 мс, толщина среза 0,8 мм с шагом 0,8 мм, размер матрицы 256 х 384, разрешение 0,164 × 0,164 мм/пиксел. Общая продолжительность сканирования одного животного составляла около 25 мин. Степень повреждения ГМ оценивали с помощью графического анализа МРТ изображений с подсчетом объема поврежденного участка ГМ. Для этого на серии МРТ изображений выделяли слайд с наибольшей площадью поражения ГМ. С помощью программы ImageJ (National Institutes of Health image software, Bethesda, MD, США) рассчитывали площадь повреждения в мм². Далее аналогичным образом рассчитывали площадь повреждения ГМ еще на четырех слайдах (два краниальнее и два каудальнее). Объем повреждения ГМ рассчитывали по следующей формуле: V=∑Sn × d, где d - толщина одного среза (0,8 мм), ∑Sn - сумма площадей повреждения на пяти слайдах (мм²). Летальность в группах животных оценивали через 24 ч, на 7-е и 14-е сутки после моделирования ишемии.

На 14-е сутки была проведена эвтаназия животных с применением углекислоты. ГМ крыс был подвергнут гистологическому исследованию: проводили оценку морфологических изменений в зоне инфаркта, и пенумбры, а также площади участка повреждения.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ STATISTICA 7.0 (StatSoft. Inc., США) и GraphPad Prizm. Нормальность распределения признака в выборках оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Все данные представлены как медиана (интерквартильный интервал). Статистические различия в данных, имеющих хотя бы в одной из групп распределение, отличное от нормального, анализировали с использованием U-теста Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони для сопоставления трех и более групп, а также тест ANOVA для анализа не более 2-х групп. Критерием статистической значимости был уровень Р<0,05.

Таким образом, в результате проведенного исследования in vivo установлено, что трехкратная интервальная двухчасовая ингаляция аргон-кислородной смеси: Ак 70%/О₂ 30% непосредственно после, а также через 24 и через 72 часа после ФИИ в 2 раза уменьшает объем повреждения ГМ и снижает выраженность неврологического дефицита.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для нейропротекции головного мозга при фокальной ишемии головного мозга. У крыс моделируют фотоиндуцированный ишемический инсульт (ФИИ) in vivo. Затем проводят трехкратную двухчасовую ингаляцию аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30% со скоростью 0,5 л/мин на одно животное. Ингаляцию проводят после ФИИ, а также через 24 и через 72 часа. Способ позволяет определить клиническую эффективность и безопасность применения инертного газа аргона в качестве нейропротектора при фокальной ишемии головного мозга, что в свою очередь уменьшает в 2 раза объем повреждения головного мозга и снижает выраженность неврологического дефицита. 2 ил., 1 пр.

Способ нейропротекции головного мозга при моделировании фотоиндуцированного ишемического инсульта (ФИИ) in vivo, включающий проведение крысам с ФИИ ингаляции аргон-кислородной смеси: Ar 70%/O₂ 30%, отличающийся тем, что осуществляют трехкратную двухчасовую ингаляцию аргон-кислородной смеси со скоростью потока 0,5 л/мин на одно животное после моделирования ФИИ, затем через 24 и 72 часа.