Разнолигандные комплексы меди(II) с 1H-тетразол-5-уксусной кислотой и производными олигопиридина, проявляющие цитотоксичную активность Российский патент 2024 года по МПК C07F1/08 A61K31/555 A61P35/00 

Изобретение относится к области координационной и медицинской химии, в частности к новым химическим соединениям, проявляющим противоопухолевую активность.

В последние годы большой интерес вызывает использование металлосодержащих препаратов для лечения рака. Несмотря на то, что соединения на основе платины широко используются для химиотерапии, клиническое применение препаратов на основе металлов по-прежнему невелико. Координационные соединения меди(II) привлекают все большее внимание как противоопухолевые средства, поскольку обладают высоким сродством к ДНК, в связи с чем в течение двух последних десятилетий становятся многообещающей альтернативой существующим препаратам для лечения рака. Медь присутствует во многих биомолекулах и играет значительную роль в разнообразных биохимических процессах благодаря окислительно-восстановительной паре Cu(II)/Cu(I), способности образовывать активные формы кислорода (АФК) внутри клеток, а координационные соединения меди не только могут повреждать ДНК, но и, возможно, проявлять избирательность действия по отношению к раковыми клеткам. Отсутствие селективности действия химиопрепаратов до сих пор является существенным недостатком при терапии рака, так как приводит к серьезным побочным эффектам. Следовательно, существует высокий потенциал для разработки комплексов меди в качестве противоопухолевых средств. Актуальным является изучение их цитотоксичности и селективности Q., Giuseppe Sciortino G., Jean-Didier J-D. et al. Copper(II) N, N, O-Chelating Complexes as Potential Anticancer Agents//Inorg Chem. 2021. Vol.60. N. 5. P.2939-2952. doi: 10.1021/acs.inorgchem.0c02932].

Комплексы на основе 1,10-фенантролина с ионами различных металлов, включая медь(II), кобальт(II), цинк(II), марганец(II), известны своей способностью взаимодействовать с ДНК, часто вызывая разрыв полинуклеотидных цепей [Sigman, D.S., Bruice, T.W., Mazumder, A., Sutton, C.L.: Targeted chemical nucleases. Acc. Chem. Res., 1993, 26, 98-104. DOI: 10.1021/ar00027a004]. Как и в случае наиболее плоских гетероароматических соединений, способ взаимодействия зависит от формы ДНК, а также от структурных особенностей комплексов. Наиболее вероятно, что именно это свойство комплексов лежит в основе их цитотоксического действия.

Известны разнолигандные комплексы меди(II) с 1,10-фенантролином и нестероидными противовоспалительными препаратами, производными антраниловой кислоты, проявляющие противоопухолевую активность в отношении клеточных линий НТ-29, HeLa и T-47D [Simunkova М., Lauro P., Jomova K. et al. Redox-cycling and intercalating properties of novel mixed copper(II) complexes with non-steroidal antiinflammatory drugs tolfenamic, mefenamic and flufenamic acids and phenanthroline functionality: Structure, SOD-mimetic activity, interaction with albumin, DNA damage study and anticancer activity//J Inorg Biochem. 2019. N. 194. P. 97-113. doi: 10.1016/j.jinorgbio.2019.02.010]. Кроме интеркаляции ДНК, воздействие данных комплексных соединений приводят к образованию активных форм кислорода, тем самым вызывая повреждение ДНК. Описаны также комплексы меди(II) с 2,9-диметил-1,10-фенантролин-5,6-дионом и 2,9-диметил-1,10-фенантролином, которые проявляют свою цитотоксическую активность в отношении клеток нейробластомы посредством индукции окислительного стресса, тем самым вызывая апоптоз [Naletova I., Satriano С, Curci A., et al. Cytotoxic phenanthroline derivatives alter metallostasis and redox homeostasis in neuroblastoma cells//Oncotarget. 2018. Vol. 9. N. 91. P. 36289-36316. doi: 10.18632/oncotarget.26346]. Кроме того, разнолигандные комплексы меди(II) с общей формулой Cu-DPA-N,N' (где N,N'=1,10-фенантролин, дипиридохиноксалин или дипиридофеназин, DPA=ди-(2-пиколил)амин) обладают цитотоксической активностью в отношении четырех различных линий клеток поджелудочной железы (PIN127, MiaPaCa-2, Panc-1 и НРАС) за счет связывания и интеркаляции ДНК, а также окислительного повреждения ДНК [Fantoni N.Z., Molphy Z., O'Carroll S. et al. Polypyridyl-Based Copper Phenanthrene Complexes: Combining Stability with Enhanced DNA Recognition//Chemistry. 2021. Vol. 27. N. 3. P. 971-983. doi: 10.1002/chem.202001996]. Недостатком вышеуказанных соединений является их низкая селективность действия (индекс селективности не превышает 6) или отсутствие исследования данного параметра. [Banashree Deka В.. Sarkar Т., Banerjee S. Novel mitochondria targeted copper(ii) complexes of ferrocenyl terpyridine and anticancer active 8-hydroxyquinolines showing remarkable cytotoxicity, DNA and protein binding affinity//Dalton Trans. 2017 Jan 3;46(2):396-409. doi: 10.1039/c6dt03660k].

Комплексы меди нередко сравнивают с известным платиносодержащим противоопухолевым препаратом цисплатин, представляющим собой цис-диамминдихлороплатину, противораковая активность которого описана в многочисленных источниках [Jamieson E.R., Lippard S.J. Structure, recognition, and processing of cisplatin-DNA adducts//Chem. Rev., 1999, 99, 2467-2498; Dasari S., Tchounwou P.B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action//Eur. J. Pharmacol, 2014, 740, 364-378; Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд. - М: Новая Волна, 2005. - 989 с.]. Он используется для лечения многих видов злокачественных опухолей человека, включая рак мочевого пузыря, головы и шеи, легких, яичников, яичек и ряда других опухолей. Его способ действия связан со способностью образовывать внутри- и межнитевые сшивки ДНК, тем самым вмешиваясь в механизмы репарации ДНК, вызывая повреждение ДНК и впоследствии индуцируя апоптоз раковых клеток. Однако из-за лекарственной устойчивости и многочисленных нежелательных побочных эффектов, таких как серьезные проблемы с почками, аллергические реакции, снижение иммунитета, желудочно-кишечные расстройства, кровотечения и потеря слуха, особенно у молодых пациентов, его применение ограничено и замещается другими платиносодержащими препаратами, например, карбоплатином, но эффективность последнего существенно ниже [Dasari S., Tchounwou Р.В. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action // Eur. J. Pharmacol, 2014, 740, 364-378]. Недостатком цисплатина является отсутствие селективности в отношении опухолевых клеток, что приводит к множеству побочных эффектов.

Ранее авторами получены разнолигандные комплексы цинка(II) с тетразол-5-уксусной кислотой (H2L) и олигопиридинами. Установлено, что комплексы {[Zn(dmphen)(H₂O)₂L]⋅2H₂O}_n и {[Zn(dmbipy)L]⋅H₂O}_n представляют собой полимерные цепочки благодаря мостиковой функции тетразолатного цикла. Показана высокая цитотоксическая активность комплекса [Zn(phendione)(H₂O)L]⋅2H₂O в отношении опухолевых клеток HepG-2 и MCF-7 (IC50=6,4±0,9 мкМ (клетки HepG-2), IC50=2,6±1,1 мкМ (клетки MCF-7)) [Е.A. Ermakova, J.A. Golubeva, К.S. Smirnova, L.S. Klyushova, I.V. Eltsov, A.A. Zubenko, L.N. Fetisov, A.E. Svyatogorova and E.V. Lider Bioactive mixed-ligand zinc(II) complexes with lH-tetrazole-5-acetic acid and oligopyridine derivatives//Polyhedron, 2023, 230, 116213]. Недостатком данного цитотоксичного комплекса является низкая растворимость и селективность действия в отношении опухолевых клеток.

Известно противоопухолевое лекарственное средство для лечения рака молочной железы, представляющее собой раствор для инъекционного введения, включающий в качестве активного вещества комплекс хлорида меди(II) с (5Z,5'Z)-2,2'-(этан-l,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она), а также растворитель, включающий диметилсульфоксид, полисорбат 20 и полоксамер 407 [патент на изобретение РФ №2676279 «Стабильное противоопухолевое лекарственное средство, способ его получения и применения», опубл. 27.12.2018 Бюл. №36]. На модели in vivo (иммунодефицитные мыши линии SCID, которым в область абдоминальной молочной железы (ортотопно) привиты клетки рака молочной железы линии MDA-MB-231) показано существенное снижение размеров опухоли молочной железы. На культурах недифференцированных клеток эпителия кишечника Сасо2, недифференцированных клеток гепатомы человека HepaRG и клеток рака молочной железы MDA-MB-231 показана разная степень чувствительности данных линий к указанному средству, наивысшая - к HepaRG. Основываясь на том, что средство интеркалирует ДНК, приводя к разрывам полинуклеотидных цепей, авторы предполагают, что после введения в организм оно накапливается во всех активно пролиферирующих и обладающих повышенной метаболической активностью клетках тканей, т.е. не обладает существенной селективностью в отношении опухоли. По результатам изучения токсичности, средство отнесено к III классу умеренно токсичных лекарственных веществ. В качестве побочного эффекта установлена опасность развития фебрильной нейтропении, Известны моно- и биядерные комплексы диацетата меди(II) с 1-[(диметиламино)метил]-2-нафтолом, проявляющие противоопухолевую активность [патент на изобретение РФ №2739317 «Моно- и биядерные N,O-комплексы диацетата меди(II) с 1-[(диметиламино)метил]-2-нафтолом, обладающие противоопухолевой активностью», опубл. 22.12.2020 Бюл. №36 Бюл. №36]. Оценка противоопухолевой активности соединений осуществлена методом проточной цитофлуориметрии, по отношению к трем клеточным линиям: Jurkat, K562 и U937. В качестве препарата сравнения использовали цисплатин. В целом, значение ингибирующей концентрации IC₅₀ для соединений варьируется в зависимости от клеточной культуры. Активность соединений кратно превышает препарат сравнения цисплатин. Недостатком известного средства является отсутствие исследований его селективности в отношении опухолевых клеток.

Известны пиридинилметиленамино-бензо-18-крауны-6 и медные комплексы на их основе, обладающие противоопухолевым действием [патент на изобретение РФ №2655166 «Пиридинилметиленамино-бензо-18-крауны-6 и их медные комплексы», опубл. 24.05.2018 Бюл. №15]. Предложено 6 вариантов медных комплексов. Исследование проводилось на 5 клеточных линиях опухолей человека: карцинома толстой кишки НСТ-116; карцинома простаты РС-3; карцинома легкого А549; аденокарцинома молочной железы MCF-7; Т-клеточный лимфобластный лейкоз Jurkat, полученных из Банка клеточных линий ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Для оценки противоопухолевой активности полученных соединений использовался МТТ-тест. Соединение считали цитостатически активным, если оно вызывало подавление роста клеток более 50%. Все медные комплексы проявили цитотоксическую активность, однако только один из них показал свою эффективность для всех клеточных линий, эффекты остальных проявлялись на двух-четырех линиях клеток, при этом процент ингибирования клеток, когда он превышал 50%, варьировал в широких пределах от 53 до 85%. Недостатком указанных медных комплексов является отсутствие исследования их селективности.

Наиболее близким по химической природе аналогом является серия комплексов под общим названием Casiopeinas®, представляющих собой разнолигандные комплексы меди(II) с олигопиридинами и анионами аминокислот/ацетилацетоната, обладающие выраженной цитотоксической активностью и предназначенные для использования в качестве противоопухолевых препаратов [Serment-Guerrero J., Bravo-Gomez М.Е., Lara-Rivera E., Ruiz-Azuara L. Genotoxic assessment of the copper chelated compounds Casiopeinas: Clues about their mechanisms of action//J Inorg Biochem. 2017. N. 166 R 68-75. doi: 10.1016/j.jinorgbio.2016.11.007]. Некоторые из этих соединений показали многообещающие результаты, и фактически одно из них под названием Casiopeina III-ia завершило доклинические испытания и готово к началу клинической фазы I в Мексике. На моделях in vivo и in vitro показано, что Casiopeina III-ia - нитрат ацетилацетанато-аква-(4,4'-диметил-2,2'-бипиридин)-меди(II) - обладает противоопухолевым действием, однако в качестве побочного эффекта соединения выявлена кардиотоксичность, вероятнее всего обусловленная ингибированием энергетического метаболизма [L. Hernandez-Esquivel, А. Marin-Hernandez, N. Pavon, К. Carvajal, R. Moreno-Sanchez. Cardiotoxicity of copper-based antineoplastic drugs casiopeinas is related to inhibition of energy metabolism. Toxicol Appl Pharmacol, 2006, 212, 79-88.], что побуждает исследователей создавать инкапсулированные нанопрепараты Casiopeina III-ia для снижения токсического эффекта.

Технической проблемой настоящего изобретения является расширение арсенала противоопухолевых средств на основе комплексов меди(II).

Решение технической проблемы достигается созданием комплексов меди(II) с 1Н-тетразол-5-уксусной кислотой (H₂L) и олигопиридинами, обладающих противоопухолевой активностью.

Техническим результатом является получение указанных комплексов, которые проявили более высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеточных линий по сравнению со стандартными противоопухолевыми препаратами, такими как цисплатин.

Раскрытие изобретения

С целью расширения арсенала противоопухолевых средств предлагаются комплексы меди(II) с 1 Н-тетразол-5-уксусной кислотой и олигопиридинами (далее -комплексы) с общей структурной формулой:

6

где N_tza - анион 1Н-тетразол-5-уксусной кислоты, phen - 1,10-фенантролин, dmbipy - 4,4'-диметил-2,2'-бипиридин, bipy - 2,2'-бипиридин.

Общая химическая формула данной группы комплексов

[Cu(олигопиридин)L]_n⋅xH₂O,

где (n=∞, х=0, если олигопиридин - 2,2'-бипиридин, 4,4'-диметил-2,2'-бипиридин, 1,10-фенантролин,

n=1, х=0,5, если олигопиридин - 4,7-диметил-1,10-фенантролин, 5-хлоро-1,10-фенантролин,

n=1, х=0,8, если олигопиридин - 1,10-фенантролин-5,6-дион).

(n - число мономерных звеньев, х - число молекул воды).

В соответствии с указанной формулой предлагаются следующие 6 комплексов:

0,5-гидрат тетразол-5-ацетато-4,7-диметил-1,10-фенантролин-медь(II) [Cu(dmphen)L]⋅0.5H₂O(1);

0,8-гидрат тетразол-5-ацетато-аква-1,10-фенантролин-5,6-дион-медь(II) [Cu(phendione)(H₂O)L]⋅0.8H₂O (2);

0,5-гидрат тетразол-5-ацетато-5-хлоро-1,10-фенантролин-медь(И) Cu(5-Cl-phen)L]⋅0.5H₂O (3);

поли(тетразол-5-ацетато-1,10-фенантролин-медь(II)) [Cu(phen)L]_n (4)

поли(тетразол-5-ацетато-4,4'-диметил-2,2'-бипиридин -медь(II)) [Cu(dmbipy)L]_n (5)

поли(тетразол-5-ацетато-2,2'-бипиридин-медь(II)) [Cu(bipy)L]_n (6)

Полученные комплексы охарактеризованы методами элементного, рентгенофазового и термогравиметрического анализов, рентгеноструктурного анализа монокристаллов, ЭПР и ИК-спектроскопии. Цитотоксическую активность комплексов определяли в отношении опухолевых (гепатоцеллюлярная карцинома (HepG2) и аденокарцинома молочной железы (MCF-7)) и неопухолевых клеточных линий (клетки почки эмбриона человека (Нек-293) и нормальные фибробласты легкого (MRC-5)). Полученные новые кристаллические структуры были расшифрованы с помощью SHELXT и уточнены с помощью программ SHELXL в графическом интерфейсе OLEX2 GUI.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Рассчитанные (черная линия) и теоретические (серая линия) диффрактограммы комплексов 4 (а), 5 (б), 6 (в).

Фиг. 2. Термогравиметрический анализ для комплексов 1 (а) и 2 (б).

Фиг. 3. Спектры поглощения в видимой области комплексов (1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г), 5 (д), 6 (е)) в растворе ДМСО (1, 2, 5, 6) или EtOH (3, 4).

Фиг. 4. Спектры диффузного отражения комплексов (1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г), 5 (д), 6

(е)).

Фиг. 5. Экспериментальные (сплошная линия) и моделированные (пунктирная линия) спектры ЭПР в Х-диапазоне частот для комплексов (1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г), 5 (д), 6 (е)) при 77К и 300К.

Фиг. 6. Влияние комплексов меди(II) на жизнеспособность клеток HepG-2, определяемое двойным окрашиванием Hoechst 33342/иодидом пропидия.

Фиг. 7. Влияние комплексов меди(II) на жизнеспособность клеток MCF-7, определяемое двойным окрашиванием Hoechst 33342/иодидом пропидия.

Фиг. 8. Влияние комплексов меди(II) на жизнеспособность клеток Нек-293, определяемое двойным окрашиванием Hoechst 33342/иодидом пропидия.

Фиг. 9. Влияние комплексов меди(II) на жизнеспособность клеток MRC-5, определяемое двойным окрашиванием Hoechst 33342/иодидом пропидия.

Осуществление изобретения

Синтез комплексов

В работе использовали производные 1,10-фенантролина и 2,2'-бипиридина (ABCR, Германия), 1Н-тетразол-5-уксусную кислоту (Sigma-Aldrich (Merck)), коммерчески доступный ацетат меди(II) (ч.д.а.). Растворители и реагенты использовали без дополнительной очистки.

Комплексы получены, используя соотношение реагентов Си²⁺: олигопиридин: H₂L=1:1: 1.

Синтез комплексов 1-6 осуществляли по следующей схеме:

Методика синтеза. К этанольному раствору олигопиридина (4 мл, 0,30 ммоль для комплексов 1, 3, 4, 6 и 4 мл, 0,20 ммоль для комплексов 2, 5) добавляли водный раствор ацетата меди(II) (2 мл, 0,30 ммоль, 0,060 г для комплексов 1, 3, 4, 6 и 2 мл, 0,20 ммоль, 0,040 г для комплексов 2, 5). Полученный раствор перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 минут. К смеси добавляли этанольный раствор H₂L (2 мл, 0,30 ммоль, 0,038 г для комплексов 1, 3, 4, 6 и 2 мл, 0,20 ммоль, 0,051 г для комплексов 2, 5). В случае комплексов 1, 3 сразу образовывался осадок, а в случае комплексов 2, 4, 5 и 6 осадок образовывался через 5-10 минут перемешивания. Реакционную смесь упаривали при нагревании до 100°С на магнитной мешалке в течение 30 мин для укрупнения осадка, который затем центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин, промывали небольшими порциями этанола и сушили в сушильном шкафу при 100°С в течение часа.

[Cu(dmphen)L]⋅0,5H₂O (1). Выход: 87% (0,11 г). Вычислено для C₁₇H₁₅CuN₆O_2,5 (%): С 50,2; Н 3,7; N 20,7. Найдено: С 50,2; Н 3,6; N 20,7. ИК-спектр (ν, см^-1): 3427 ν(OH), 3082, 3070, 3055, 2981 ν(CH); 1630 ν_ac(COO^-); 1598, 1578, 1521, 1460 R_кольца.

[Cu(phendione)(H₂O)L]⋅8H₂O (2). Выход: 80% (0,069 г). Вычислено для С₁₅Н_11,6CuN₆O_5,8 (%): С 41,7; Н 2,7; N 19,4. Найдено: С 41,7; Н 2,6; N 19,5. ИК-спектр (ν, см^-1): 3420, 3271 ν(OH), 3090, 3042, 2924 ν(CH); 1707 ν(CO); 1616 ν_ac(COO^-); 1575, 1461, 1421 R_кольца.

[Cu(5-Cl-phen)L]⋅0.5H₂O (3). Выход: 30% (0,037 г). Вычислено для C₁₅H₁₀CuN₆ClO_2,5 (%): С 43,6; Н 2,4; N 20,3. Найдено: С 43,8; Н 2,2; N 20,5. ИК-спектр (ν, см^-1): 3452 ν(OH), 3080, 2960, 2923, 2919 ν(CH); 1652 ν_ac(COO^-); 1606, 1583, 1516 R_кольца.

[Cu(phen)L]_n (4). Выход: 70% (0,073 г). Вычислено для C₁₅H₁₀CuN₆O₂ (%): С 48,7; Н 2,7; N 22,7. Найдено: С 48,3; Н 2,7; N 22,5. ИК-спектр (ν, см^-1): 3085, 2923, 2919 ν(CH); 1662 ν_ac (COO^-); 1625, 1588, 1517, 1461 R_{кольца.}

[Cu(dmbipy)L]n (5). Выход: 87% (0,062 г). Вычислено для C₁₅H₁₄CuN₆O₂ (%): С 48,2; Н 3,8; N 22,5, Найдено: С 47,6; Н 3,7; N 22,5, ИК-спектр (ν, см^-1): 3051, 2956, 2925 ν(CH); 1653 ν_ac (COO^-); 1616, 1590, 1556, 1462 R_кольца.

[Cu(bipy)L]_n (6). Выход: 63% (0,068 г), Вычислено для C1₃H₁₀CuN₆O₂ (%): С 45,1; Н 2,9; N 24,3, Найдено: С 45,3; Н 2,3; N 24,7, ИК-спектр (ν, см^-1): 3111, 3089, 3054, 3030, 2958 ν(CH); 1618 ν_ac(COO^-); 1571, 1504, 1480 R_кольца.

Анализ комплексов.

Элементный анализ (С, Н, N) выполняли с помощью элементного анализатора «vario MICRO cube». ИК-спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре SCIMITAR FTS 2000 в области 4000-400 см^--1 (во фторированном и вазелиновом масле, в КВr).

Рентгенофазовый анализ комплексов проводили на дифрактометре Shimadzu XRD-7000 (CuK_α-излучение, Ni-фильтр, диапазон измерений 2θ от 5° до 40°, шаг 2θ 0,03°, комнатная температура) Дифрактограммы комплексов 4-6 приведены на Фиг. 1, а, 6, в.

Термогравиметрический анализ координационных соединений проводили в атмосфере аргона на термовесах NETZSCH TG 209 F1 Iris (Erich NETZSCH GmbH & Co. Holding KG, Selb, Германия) в открытых тиглях Al₂O₃ (загрузки 5-10 мг, скорость нагрева 10 К мин^-1) Термограммы для комплексов 1, 2. приведены на Фиг. 2 а, б.

Спектры поглощения комплексов в ДМСО (комплексы 1, 2, 5, 6) или EtOH (комплексы 3, 4) регистрировали на спектрофотометре СФ-102 с использованием кювет с длиной оптического пути 1 см при комнатной температуре (С1=100 мкМ, С2=60 мкМ, С3=15 мкМ, С4=25 мкМ, С5=300 мкМ. С6=60 мкМ) (Фиг. 3).

Спектры диффузного отражения регистрировали на сканирующем спектрофотометре UV-3101 PC при комнатной температуре в диапазоне длин волн 300-1000 нм (Фиг. 4 а-е).

Электропроводность этанольных растворов комплексов 3, 4 (С=1 мМ) измеряли с помощью кондуктометра СОМ-100 при Т=23°С.

Спектры ЭПР записаны на спектрометре Varian Е-109 в Х-диапазоне частот для поликристаллических образцов (1-6) при 77 и 300 К и для замороженных при 77 К этанольных растворов комплексов 3, 4. Стандартный образец 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) использовали для калибровки магнитного поля спектрометра. Спектры моделировались в MATLAB с использованием пакета программ EasySpin для ЭПР (Фиг. 5 а-е).

Цитотоксическая активность

Цитотоксическую активность комплексов изучали на клеточных линиях человека HepG-2 (гепатоцеллюлярная карцинома), MCF-7 (карцинома молочной железы), Нек-293 (клетки почки эмбриона) и MRC-5 (нормальные фибробласты легкого) путем окрашивания флуоресцентными красителями Hoechst 33342/ пропидий йодид.

Растворы комплексов готовили следующим образом: а) комплексы растворяли в ДМСО (комплексы 1, 2, 5, 6) или этаноле (комплексы 3, 4); б) полученные растворы комплексов разводили питательной средой IMDM. Через 24 часа предварительной инкубации клеток в 96-луночных планшетах добавляли растворы тестируемых соединений в диапазоне концентраций 0,02-50 мкМ и инкубировали клетки в течение 48 часов. Конечное содержание растворителя не превышало 1%. Затем добавляли флуоресцентные красители Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) и пропидий иодид (Invitrogen) и инкубировали клетки в течение 30 минут.

Съемку проводили на приборе IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare, UK) в автоматическом режиме не менее 4 полей на лунку. Полученные изображения анализировали с помощью программы «In Cell Investigator». Результаты представлены в виде среднего процентного содержания живых и мертвых клеток, а также клеток в стадии апоптоза, ±стандартное отклонение.

Цитотоксичность не наблюдалась в выбранном диапазоне концентраций (1-50 мкМ, 48 часов) после воздействия на клетки ацетата меди(II) и H₂L. Цитотоксическая активность олигопиридинов, H₂L и ацетата меди(II) была определена ранее [J.A. Eremina, Е.А. Ermakova, K.S. Smirnova, L.S. Klyushova, A.S. Berezin, T.S. Sukhikh, A.A. Zubenko, L.N. Fetisov, K.N. Kononenko, E. V. Lider. Cu(II), Co(II), Mn(II) complexes with 5-phenyltetrazole and polypyridyl ligands: Synthesis, characterization and evaluation of the cytotoxicity and antimicrobial activity. Polyhedron, 2021, 206, 115352; E.A. Ermakova, J.A. Golubeva, K.S. Smirnova, L.S. Klyushova, I.V. Eltsov, A.A. Zubenko, L.N. Fetisov, A.E. Svyatogorova and E.V. Lider, Bioactive mixed-ligand zinc(II) complexes with lH-tetrazole-5-acetic acid and oligopyridine derivatives. Polyhedron, 2023, 230, 116213].

Все комплексы меди(II) обладают выраженным дозозависимым цитотоксическим действием на линии раковых клеток (табл. 1). В комплексах токсичность усиливается по сравнению с лигандами [J.A. Eremina, Е.А. Ermakova, K.S. Smirnova, L.S. Klyushova, A.S. Berezin, T.S. Sukhikh, A.A. Zubenko, L.N. Fetisov, K.N. Kononenko, E.V. Lider. Cu(II), Co(II), Mn(II) complexes with 5-phenyltetrazole and polypyridyl ligands: Synthesis, characterization and evaluation of the cytotoxicity and antimicrobial activity. Polyhedron, 2021, 206, 115352; J.A. Eremina, E.V Lider, D.G. Samsonenko, L.A. Sheludyakova, A.S. Berezin, L.S. Klyushova, V.A. Ostrovskii, R.E. Trifonov, Mixed-ligand copper(II) complexes with tetrazole derivatives and 2,2' -bipyridine, 1,10-phenanthroline: Synthesis, structure and cytotoxic activity. Inorganica Chim. Acta, 2019, 487, 138-144]. Влияние комплексов меди(II) на жизнеспособность клеток MCF-7 и HepG-2, определяемое методом двойного окрашивания Hoechst 33342/пропидий иодидом приведено на Фиг. 6, 7. Значения IC₅₀ находятся в диапазоне 0,9-14,3 мкМ, что свидетельствует о большей токсичности полученных комплексов по сравнению с цисплатином. Комплексы 1, 2 и 4 имеют близкие значения IC₅₀ на клеточной линии HepG-2 (0,9-1,2 мкМ), их токсичность не зависит от используемого олигопиридина, при этом комплексы 1-4 имеют аналогичные значения IC₅₀ на клеточной линии MCF-7 (3,8-5,1 мкМ). Комплексы 2, 4, 5 и 6 обладают специфичностью действия в отношении клеток гепатоцеллюлярной карциномы.

Ввиду значительной токсичности комплексов меди(II) проведено исследование их активности на неопухолевых клеточных линиях Нек-293 (Фиг. 8) и MRC-5 (Фиг. 9), после чего были рассчитаны индексы селективности (табл 2). Индекс селективности (SI) представляет собой отношение значения IC₅₀ лекарственного средства на неопухолевой клеточной линии (в данной работе Нек-293 или MRC-5) к значению IC₅₀ лекарственного средства на линии опухолевых клеток. Индекс селективности выше 3 (или 10 в некоторых литературных источниках) указывает на то, что соединение может являться потенциальным противоопухолевым соединением [G. Indrayanto, G.S. Putra, F. Suhud, Chapter Six - Validation of in-vitro bioassay methods: Application in herbal drug research. Profiles Drug Subst. Excip. Relat. Methodol., 2021, 46, 273-307; N. Weerapreeyakul, A. Nonpunya, S. Barusrux, T. Thitimetharoch, B. Sripanidkulchai, Evaluation of the anticancer potential of six herbs against a hepatoma cell line. Chinese Med., 2012, 7, 15-21]. Один из наиболее токсичных комплексов 1 имеет индекс селективности менее единицы, что свидетельствует о возможной общей токсичности соединения. Комплексы 4-6 проявили селективность к клеткам гепатоцеллюлярной карциномы, индекс селективности для них больше 4 на обеих неопухолевых клеточных линиях.

Цитотоксичность комплекса 2 аналогична таковой у комплексов 1 и 4 в отношении раковых клеток, но он несколько менее цитотоксичен по отношению к неопухолевым клеткам. Таким образом, комплекс 2 проявляет селективность в отношении клеточных линий HepG-2 и MCF-7, несмотря на его высокую цитотоксичность. Комплекс с phendione из аналогичной серии цинковых комплексов [Е.A. Ermakova, J.A. Golubeva, K.S. Smirnova, L.S. Klyushova, I.V. Eltsov, A.A. Zubenko, L.N. Fetisov, A.E. Svyatogorova and E.V. Lider, Bioactive mixed-ligand zinc(II) complexes with lH-tetrazole-5-acetic acid and oligopyridine derivatives. Polyhedron, 2023, 230, 116213] также показал селективность в отношении клеток карциномы молочной железы.

Связывание с ДНК

Исследование связывания комплекса 5 с ДНК проводили методом оптической спектроскопии путем титрования раствора комплекса постоянной концентрации (20 мкМ) буферным раствором ДНК тимуса теленка (5 мМ Трис-HCl, рН 7,6), концентрация которого варьировалась в пределах 0-80 мкМ.

Константу связывания (K_b) комплекса рассчитывали по следующему уравнению:

где K_b - константа связывания, [ДНК] - концентрация ДНК, ε_а - кажущийся коэффициент экстинкции смеси связанного и свободного комплекса (A_obs/[комплекс]), ε_f и ε_b - коэффициенты экстинкции свободного комплекса и комплекса, связанного с ДНК, соответственно.

Известно, что основной мишенью цисплатина и его аналогов является ДНК [20]. Поэтому для комплекса 5 с наиболее высоким индексом селективности [Cu(dmbipy)(L)]_n исследовали возможность связывания с ДНК тимуса теленка. Способность комплекса 5 связываться с ДНК оценивали спектрофотометрически. В спектрах комплекса 5 наблюдались значительные изменения поглощения, что подтверждает наличие взаимодействия полученного соединения с ДНК. Спектры поглощения комплекса 5 в УФ-области в отсутствие ДНК и в присутствии возрастающего количества ДНК (С=0-80 мкМ). Фиг. 10 иллюстрирует изменения, происходящие в спектрах поглощения комплекса при добавлении ДНК: наблюдается гипохромный эффект при 308 нм.

Расчетное значение константы связывания ДНК для комплекса 5 составляет 1,2⋅10⁴. Таким образом, можно предположить, что ДНК может быть одной из мишеней полученных комплексов.

Итак, все комплексы показали на порядок более высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеточных линий по сравнению со стандартными препаратами, таким как цисплатин: в 4-39 раз активнее на клеточной линии HepG-2 и 2-9 раз активнее на клеточной линии MCF-7. Комплексы 2, 4-6 проявляют специфичность к клеткам HepG-2, индекс селективности для которых больше 4. Таким образом, все комплексы обладают высокой цитотоксической активностью, а комплексы 2, 4-6 имеют избирательную эффективность в отношении клеток гепатоцеллюлярной карциномы.

Изучение цитотоксической активности проводилось с использованием оборудования ЦКП ФИЦ ФТМ «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-691).

Изобретение относится к области координационной и медицинской химии, в частности к новым химическим соединениям, проявляющим противоопухолевую активность. Предложены разнолигандные комплексы меди(II) c 1Н-тетразол-5-уксусной кислотой и олигопиридином, выбранным из 1,10-фенантролина, 4,4'-диметил-2,2'-бипиридина и 2,2'-бипиридина. Указанные комплексы получают способом, в котором к этанольному раствору олигопиридина добавляют водный раствор ацетата меди(II), полученный раствор перемешивают в течение 5 минут, затем добавляют этанольный раствор 1Н-тетразол-5-уксусной кислоты (Н₂L), перемешивают 5-10 минут, реакционную смесь упаривают при нагревании до 100°С в течение 30 мин для укрупнения осадка, который затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, промывают этанолом и сушат при 100°С в течение часа, при этом комплексы получают при следующем мольном соотношении реагентов Cu²⁺ : олигопиридин : H₂L = 1 : 1 : 1. Предложенные комплексы проявляют более высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеточных линий по сравнению со стандартными противоопухолевыми препаратами, такими как цисплатин. 9 ил., 2 табл.

Разнолигандные комплексы меди(II) c 1Н-тетразол-5-уксусной кислотой и олигопиридином, выбранным из 1,10-фенантролина, 4,4'-диметил-2,2'-бипиридина и 2,2'-бипиридина, обладающие противоопухолевой активностью, полученные способом, в котором к этанольному раствору олигопиридина добавляют водный раствор ацетата меди(II), полученный раствор перемешивают в течение 5 минут, затем добавляют этанольный раствор 1Н-тетразол-5-уксусной кислоты (Н₂L), перемешивают 5-10 минут, реакционную смесь упаривают при нагревании до 100°С в течение 30 мин для укрупнения осадка, который затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, промывают этанолом и сушат при 100°С в течение часа, при этом комплексы получают при следующем мольном соотношении реагентов Cu²⁺ : олигопиридин : H₂L = 1 : 1 : 1.