Штамм бактерии Pasteurella multocida "РМ - В" для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/102 A61P31/04 C12R1/01 

Изобретение относится к области ветеринарной бактериологии и биотехнологии, может быть использовано для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В.

Животноводство - стратегическая отрасль сельского хозяйства, обеспечивающая продовольственную независимость страны молочной и мясной продукцией [1]. Для стабильного развития животноводства необходимым является выполнение двух условий: во-первых, обеспечение сохранности и роста поголовья, во-вторых, обеспечение постоянного увеличения производимой продукции, ввиду увеличения потребителей и их потребностей. Сложность выполнения обоих условий заключается в необходимости предотвращения снижения продуктивности, массового падежа животных или вынужденного убоя в случаях развития эпизоотий. Среди всех инфекционных болезней в нашей стране на особом месте находится пастереллез как наиболее часто встречаемая инфекция разных видов сельскохозяйственных животных и птиц с обширной зоной распространения [2, 3, 4, 5].

Пастереллез - контагиозная болезнь большинства животных и птиц, вызываемая бактериями рода Pasteurella. Инфекция широко распространена во всем мире. При остром течении патологии наблюдаются септические процессы, крупозное воспаление легких, плевриты и отеки различной локализации. Подострое и хроническое течения болезни характеризуютсягнойно-некротизирующими пневмониями, поражением суставов, молочных желез, органов зрения и геморрагическим энтеритом [6].

Согласно «Руководству по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных» Международного эпизоотического бюро (МЭБ), существует три отдельных нозологических единицы, вызываемых Pasteurella multocida (P. multocida): геморрагическая септицемия крупного рогатого скота, атрофический ринит свиней и холера птиц [6]. По классификации МЭБ геморрагическая септицемия крупного рогатого скота включена в список В как менее опасное, но достаточно широко распространенное среди крупного рогатого скота, после лейкоза, туберкулеза, бруцеллеза инфекционное заболевание. Болезни списка В - контагиозные болезни, которые считаются опасными с социально-экономической и санитарной точек зрения. Занос возбудителей этих инфекций при международной торговле животными и продуктами животноводства может иметь крайне неблагоприятные последствия.

Возбудителем пастереллеза крупного рогатого скота (геморрагической септицемии) является бактерия вида P. multocida типов В и Е, при этом тип Е на территории России не встречается, но его циркуляция подтверждена в ряде зарубежных стран [7].

P. multocida представляет собой сферические, овальные или палочковидные клетки длиной 0,3-1,5 и шириной 0,15-0,25 мкм. При микроскопии мазков-отпечатков тканей животных, а также первичных культур, выделенных из патологического материала, пастереллы обычно имеют биполярное окрашивание, расположены одиночно, парно или в виде коротких цепочек [8].

На агаризированных питательных средах P. multocida формирует колонии трех типов: S, М, R. S форма имеет вид средних (1,0-2,0 мм), круглых, выпуклых полупрозрачных с гладкой поверхностью и ровными краями колоний, флюоресцирующих в косо проходящем свете. Колонии М формыболее крупные, слизистой консистенцией, с непрозрачным центром. R форма имеет вид шероховатых, не прозрачных колоний. На жидких питательных средах рост P. multocida характеризуется равномерным помутнением среды и выпадением слизистого осадка на дно емкости, который при встряхивании поднимается в виде косички [9].

В Российской Федерации наиболее распространены три типа пастерелл: А, В и D. Тип А чаше всего вызывает пастереллезную инфекцию птиц, кроликов и пушных зверей, а также способствует развитию подострого или хронического течения энзоотической пневмонии у телят и поросят; тип В вызывает геморрагическую септицемию крупного рогатого скота и диких жвачных животных; тип D - пастереллез свиней. Типы P. multocida Е и F на территории РФ не распространены, при этом являются возбудителями геморрагической септицемии крупного рогатого скота и диких жвачных животных в ряде зарубежных стран.

Источником возбудителя являются больные и переболевшие животные-носители, не проявляющие каких-либо клинических признаков. Длительность бактерионосительства достигает нескольких лет, в связи с чем такие животные доживают до репродуктивного возраста и в случае использования их в качестве родительского поголовья могут распространять заболевание. Для пастереллеза свойственно формирование стационарного эпизоотического очага [5].

Пастереллез может развиваться как самостоятельное заболевание, но при этом наличие вирусных и/или иных бактериальных инфекций, проходящих в сочетанном виде, отягощают течение инфекции [10, 11].

Развитие патогенеза инфекции подразумевает проникновение возбудителя в организм восприимчивого животного респираторным или алиментарным путем. В первую очередь слабовирулентные изоляты колонизируют миндалины, которые являются основной локализацией Р. multocida, маскируясь от воспалительных клеток, а также действуют какдополнительный барьер для внешних факторов. В таком виде микроорганизм может длительное время сохраняться в организме животных, не приводя к развитию видимых признаков патологий, но при этом само животное длительное время будет бактерионосителем. Вирулентные культуры после колонизации верхних дыхательных путей могут сразу проникать в кровь и лимфу вызывая септицемию и приводя к гибели животных в течение 12-36 часов после заражения. Скорость развития септицемии зависит от вирулентности возбудителя и комплекса факторов вирулентности, которыми он обладает [4].

Пастереллез КРС имеет четыре типа течения: сверхострое, острое, подострое, хроническое. Сверхострое течение характерно для септической формы заболевания, вызванного P.multocida серогруппы В. При проявлении данного течения наблюдается резкое повышение температуры тела до 42°С, нарушения сердечной деятельности, отек легких и острый гастроэнтерит. Гибель при сверхостром течении наступает в течение нескольких часов. Зачастую патологоанатомические изменения при данном течении пастереллеза отсутствуют, ввиду скорости наступления гибели животного.

Геморрагическая септицемия животных и птиц регистрируется во всех регионах Российской Федерации, в том числе на территории Восточной Сибири [3]. Болезнь поражает животных всех возрастных групп, при этом наиболее восприимчивым к заболеванию является молодняк до шести месячного возраста. Болезнь протекает, как правило, в виде энзоотий, летальность может достигать 75% [3, 8, 12, 13].

В настоящее время проведение традиционной профилактики и терапии осуществляется на основе использования химиотерапевтических средств. Однако повсеместное применение антибиотиков способствует появлению побочных явлений у людей и животных. Также установлено, что антимикробные препараты оказывают негативное влияние на иммунологическую реактивность организма, что может снижатьэффективность лечения. Кроме того, многие лекарства чрезвычайно дороги, и не нашли широкого применения в ветеринарной практике. Повсеместное и бессистемное использование большого количества препаратов, содержащих антибиотики, привело к тому, что образовались лекарственно устойчивые резистентные штаммы микроорганизмов [14, 15, 16].

На протяжении нескольких десятков лет в нашей стране ведутся работы по созданию новых, высокоэффективных лекарственных средств антимикробного и противовоспалительного действия, допустимых к использованию в условиях современных животноводческих ферм. Однако их эффективность не всегда достаточно высокая и большинство препаратов имеют длительный период выведения [15, 16, 17].

Возбудитель P. multocida серогруппы В обладает целым комплексом факторов вирулентности, к которым относят: полисахариды капсулы, эндотоксины, липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии, адгезины, липаза и гиалуронидаза. Поэтому эффективность специфической профилактики определяется наличием комбинации данных факторов в антигенном составе входящих в вакцину компонентов.

Известен способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida [18]. Способ включает в себя заражение животных с последующим выделением возбудителя. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, №55, №115, №712, №915, №1931 - контрольно-производственные штаммы из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».

Известен способ получения аттенуированных иммуногенных штаммов Pasteurella multocida [19]. Способ включает посев культур пастерелл на питательные среды содержащие стрептомицин с последующим культивированием, тем самым получая стрептомицин устойчивые культуры.

Известен способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования [20]. Способ включает в себя заражениеживотных с последующим выделением возбудителя из сердца павшего животного. Данный способ позволяет получать культуру S-формы. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, США, №55, №115, №712, №915, №1931 -контрольно-производственные штаммы из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».

Известен способ стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий Pasteurella multocida [21]. Способ описывает условия и алгоритм восстановления возбудителя пастереллеза птиц Pasteurella multocida А:1 серовара. Способ отличающийся тем, что штамм пастерелл в S- или М- форме клонируют и при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды последовательно пассируют путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм. В исследовании использовались контрольно-производственные штаммы пастерелл из коллекции ФГБУ «ВГНКИ»: №712, №55, №115, №712, №915, №1931.

Известен способ выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida [22]. Описано вскрытие зараженной и павшей от пастереллеза птицы или кроликов массой, взятие пробы крови из сердца, внесение в стерильную воду при (20,0±1,0)°С в соотношении 1:9 по объему. Затем осадок встряхивают, переводят во взвесь, центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10^-1 разводят до 10^-2, 10^-3, высевают при (20,0±1,0)°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при (37,0±0,5)°С и 1 ч при (20,0±1,0)°С. Способ обеспечивает выделение чистой культуры P. multocida с высокой вирулентностью. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, США; контрольно-производственные штаммы №55, №115, №712, №915, №1931- из коллекции ФГБУ «ВГНКИ» и пять полевых изолятов, относящихся к серовару А:1, также контрольно-производственные штаммы №116, №656, №79- из коллекции ФГБУ «ВГНКИ», относящихся к серовару В.

Известна живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida, вакцина на ее основе, способ получения вакцины и применения этой бактерии для получения вакцины для защиты животных или человека [23]. Описано получение живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida модифицированной внесением мутации в ген Orf-15. Мутация представляет собой инсерцию и/или делецию в гене Orf-15, без нарушения иммунной реактивности штамма. В результате модификации бактерия не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15, что приводит к ее аттенуации. В данном патенте не указан, какой именно штамм P. multocida подвергли мутации, однако для создания вакцины использовали свежие культуры штамма Р15.

Известен штамм Pasteurella multocida КМИЭВ-13-Х - штамм-антиген [24], выделенный в 1990 году в колхозе «Рассвет» Несвижского района Минской области из легочной ткани телят возрастом 1-1,5 месяцев. Штамм бактерий P. multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) депонирован в коллекции РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси». Данный штамм относится к виду Pasteurella multocida серотипа Д.

Известен аттенуированный иммуногенный штамм Pasteurella multocida SMI, используемый для приготовления препарата живой вакцины против пастереллеза кур и индеек [25]. В данной заявке не описано какие именно штаммы P. multocida используются в данном изобретении.

Известна «Вакцина ассоциированная инактивированная гидроокисьалюминиевая против инфекционной пневмонии и сальмонеллеза свиней и способ ее изготовления» [26]. При изготовлении данной вакцины используют бактериальные массы из штаммов Haemophilus pleuropneumoniae серогрупп 1 и 2, стрептококков серогрупп С и R, и Pasteurella multocida серовариантов А №1231, В №681 и Д №Т-80.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие штамм микроорганизма Pasteurella multocida «РМ-В» аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Выделение штамма микроорганизма при пастереллезе в форме геморрагической септицемии, и использование его в качестве производственного штамма, способствующего формированию иммунитета к циркулирующим патогенам, вызывающих пастереллез, который оказывал бы положительный экономический эффект, является актуальным направлением и будет способствовать обеспечению страны безопасной продукцией, снижению применения антибактериальных препаратов в животноводстве и за счет этого выходом продукции на экспорт.

Техническая проблема заключается в расширении арсенала актуальных производственных штаммов вида Pasteurella multocida обладающих новыми биологическими характеристиками и пригодных для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота.

Указанная проблема решена путем получения штамма Pasteurella multocida «РМ-В», который может использоваться для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза в форме геморрагической септицемии.

Технический результат достигается использованием штамма Pasteurella multocida «РМ-В» серогруппы В для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота, путем получения высоко иммуногенных вакцинных препаратов.

Изолят P. multocida серогруппы В, послуживший источником для получения штамма Pasteurella multocida «РМ-В», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. при проведении бактериологических исследований проб патологического материала от крупного рогатого скота.

Штамм P. multocida «РМ-В» депонирован во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №492 - деп/23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма P. multocida «РМ-В» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики, экспериментально показана выработка антител на введение моновакцины, изготовленной из антигена данного штамма, лабораторным животным.

Штамм P. multocida «РМ-В» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологическая характеристика

Штамм P. multocida «РМ-В» относится к семейству Pasteurellaceae, роду Pasteurella, виду P. multocida, серогруппы В, обладает морфологическими признаками, характерными для бактерий рода Pasteurella.

При микроскопии P. multocida представляет собой полиморфные, короткие грамотрицательные, неподвижные эллипсовидные палочки, располагающиеся изолированно, парами или реже цепочками, спор не образуют; являются аэробами или факультативными анаэробы. При окраске мазка по методу Гинса обнаруживают отчетливую, хорошо выраженную капсулу.

На агаризированных питательных средах P. multocida формирует колонии трех типов: S, М, R. S форма имеет вид средних (1,0-2,0 мм), круглых, выпуклых полупрозрачных с гладкой поверхностью и ровными краями колоний, флюоресцирующих в косо проходящем свете. Колонии М формы более крупные, слизистой консистенцией, с непрозрачным центром. R форма имеет вид шероховатых, не прозрачных колоний.

На жидких питательных средах рост P. multocida характеризуется равномерным помутнением среды и выпадением слизистого осадка на дно емкости, который при встряхивании поднимается в виде косички.

Кулътуралъные свойства - неподвижный факультативный анаэроб, оптимальная температура роста (37,0±0,5)°С;

На агаризированных питательных средах P. multocida «РМ-В» формирует:

- на сердечно-мозговом агаре (СМА) с добавлением 5% сыворотки крови лошади имеют вид полупрозрачных колоний с ровными, округлыми краями достигающих до 3 мм в диаметре;

- на кровяном агаре образует круглые полупрозрачные с сероватым оттенком колонии, без зоны гемолиза;

На жидкой среде:

- на сывороточном сердечно-мозговом бульоне (СМБ) - характеризуется равномерным помутнением среды с выпадением слизистого осадка, который при встряхивании поднимается в виде косички.

Бактерии рода Pasteurella обладают зависимостью от наличия сыворотки крови лошади в питательной среде. Без сыворотки отмечен слабый рост на поверхности агаровой среды в виде напыления, видимый только при рассмотрении под лупой. Общепринятыми средами для выращивания пастерелл являются сывороточный СМА, СМБ, мясо-пептоный бульон (МПБ), мясо-пептоный агар (МПА), агар или бульон по Хоттингеру (рН 7,2-7,8).

Хорошо сохраняется при условии лиофильного высушивания с сахарозо-желатиновой средой, а также при быстром замораживании и хранении при минус 40°С.

Ферментативные свойства

При посеве на среды Гисса P. multocida «РМ-В» проявляет следующие биохимические свойства, представленные в таблице 1, в которой показано: не обладает каталазной и оксидазной активностями; разжижает желатин; ферментирует глюкозу, сорбит, сахарозу, маннит, D-сорбитол, инозит, ксилозу; не ферментирует лактозу, рафинозу и дульцид; отмечено наличие орнитиндекарбоксилазы.

Антигенные свойства

Стимулирует образование в сыворотке крови типоспецифичных антител, обладающих защитным действием против пастереллеза, выявляемых в реакции агглютинации (РА) и иммуноферментным анализом (ИФА) (табл. 2).

Биотехнологические свойства

Оптимальными условиями культивирования штамма P. multocida «РМ-В» являются следующие:

- чашки Петри с питательными средами: сывороточный СМА, кровяной СМА; посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (37,0±0,5)°С;

- флаконы с жидкой питательной средой (сывороточный СМБ); посев инкубируют при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Чистоту культуры проверяют методом световой микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

По завершении культивирования агаровую культуру штамма P. multocida «РМ-В» смывают стерильным физиологическим раствором в объеме 5,0 см³ на одну чашку, определяют концентрацию бактериальной суспензии по оптическому стандарту мутности. По результатам визуальной стандартизации доводят концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм P. multocida «РМ-В» чувствителен к амоксициллину, амоксициллину с клавулановой кислотой, цефалоспоринам, аминогликозидам, тетрациклинам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - штамм в составе инактивированной вакцины индуцирует в организме животного образование специфических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами в составе инактивированной вакцины не обладает.Иммунизация кроликов в удвоенной терапевтической дозе вакцины, в соответствии с ГОСТ 31926, не вызывает местной-раздражительной и воспалительной реакций после инъекции.

Патогенные свойства - штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для белых мышей.

Вирулентность - высоковирулентен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами - штамм бактерий P. multocida «РМ-В» не контаминирован другими бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

При хранении штамма в нативном состоянии при температуре минус (70±5)°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес, а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 5 лет.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма бактерий P. multocida «РМ-В», с целью получение инактивированного антигена данного штамма

Для культивирования P. multocida «РМ-В» использовали питательную среду СМБ с добавлением 5% сыворотки крови лошади.

Для получения бактериальной массы был использован ферментер «Biotron LiFlus GX», оснащенный системами регистрации и регулирования основных параметров культивирования: температуры, концентрации водородных ионов, скорости вращения мешалки и расхода кислорода дляаэрации. Объем питательной среды в аппарате составлял 7,0 л с добавлением сыворотки крови лошади в количестве 0,35 л. Культивирование проводили в течение 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С с постоянной подачей кислорода в количестве 1 л/ч.

Через 24 ч культивирования в бактериальную суспензию добавляли 0,2% формалина по объему. Инактивацию проводили 24 часа при непрерывном перемешивании 100 об/мин и поддержании температуры в диапазоне (37,0±0,5)°С.

Для определения полноты инактивации через 24 часа после внесения формалина бактериальную суспензию высевали «газоном» в количестве 1,0 см³ на чашку Петри с сывороточным СМА. Инкубацию чашек Петри проводили в течение 48 часов при температуре (37,0±0,5)°С в условиях обычной атмосферы. При просмотре чашек Петри рост культур бактерий Р. multocida отсутствовал, что характеризовало положительное проведение инактивации.

Таким образом, получен инактивированный антиген штамма бактерий P. multocida «РМ-В», пригодный для изготовления биопрепарата для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота.

Пример 2. Определение патогенных свойств штамма P. multocida «РМ-В» проводили на белых мышах и естественно-восприимчивых животных (КРС)

Для заражения были использованы 18-20 часовые бульонные культуры штамма P. multocida «РМ-В», выращенной на сывороточном СМБ.

Для заражения использовали 20 белых мышей массой 14-18 гр., которых разделили на 2 группы (10 голов на заражение+10 голов контрольная группа). Суточную бульонную культуру штамма P. multocida «РМ-В» вводили животным опытной группы подкожно в объеме 0,2 см³. Наблюдение за подопытными животными вели в течение 5 сут. Культуру признают патогенной при гибели через 24-72 ч половины животных в опытной группе.

Для подтверждения специфической гибели белых мышей делали посевы на сывороточный СМА образцов спинного мозга, крови, сердце, печени и селезенки от павших мышей.

В опыте с целевыми животными использовали 4 головы КРС массой 250-300 кг, опытная группа - 2 головы на заражение и 2 головы контрольной группы. Из суточной культуры P. multocida «РМ-В» методом центрифугирования получали осадок, который разбавляли в изотоническом фосфатно-буферном растворе до концентрации 500 млн микробных клеток в 1,0 см³. Животным опытной группы заражающую дозу вводили внутривенно в объеме 0,2 см³. Наблюдение за подопытными животными вели в течение 5 сут. Культуру признают патогенной при гибели через 24-72 ч всех животных в опытной группе. Для подтверждения специфической гибели животных делали посевы на сывороточный СМА образцов крови.

В ходе установления специфичности гибели при проведении бактериологического исследования проб от всех павших животных была выделена чистая культура штамма P. multocida «РМ-В».

Штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для белых мышей. Вирулентность штамма P. multocida «РМ-В» - высокая. Летальность составила в группе 100% в течение 24 ч.

Штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для КРС. Вирулентность штамма P. multocida «РМ-В» - высокая, летальность составила в группе 100% в течение 36 ч.

Пример 3. Определение стабильности штамма P. multocida «РМ-В» при хранении

Для получения бактериальной массы, штамм P. multocida «РМ-В» высевали на чашки Петри с сывороточным СМА. Посевы инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 ч. По завершению инкубирования агаровую культуру смывали стерильной сахарозо-желатозной средой (стабилизирующая среда) в объеме 5,0 см³ на одну чашку. Определяликонцентрацию бактериальной суспензии по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ». По результатам визуальной стандартизации доводили концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Бактериальную суспензию фасовали по 0,5 см³ в ампулы соответствующей вместимости.

Процесс лиофилизации после внесения стабилизаторов сушки включает стадии замораживания, высушивания, досушивания и запаивания ампул.

Замораживание: бактериальную суспензию перед лиофилизацией промораживали. Для этого устанавливали три датчика контроля температуры материала в процессе сушки. При достижении температуры в материале минус (60,0±1,0)°С его выдерживали при внешней температуре не выше минус (70,0±1,0)°С в течение 24 ч, после чего процесс замораживания бактериальной суспензии считали законченным. Холодильную камеру сублиматора перед постановкой кассет с замороженным материалом дезинфицировали 70%-ным этиловым спиртом и охлаждали до температуры не выше минус (50,0±1,0)°С.

Высушивание: замороженный материал незамедлительно перегружали в камеру сублиматора. Сублимационная установка перед загрузкой должна находиться в режиме:

- температура полок - минус (50,0±1,0)°С;

- температура конденсора - минус (60,0±1,0)°С;

- вакуум-насос - в рабочем состоянии, отключен.

После загрузки камеры подключали вмороженные в материал датчики контроля температуры, камеру герметизировали и вакуумировали до остаточного давления 80-90 мм рт. ст., проводили процесс высушивания согласно установленному режиму: температура конденсора - минус 50-80°С, вакуум в камере - 80-90 мм рт. ст., время сушки - до 48 ч.

Досушивание проводили при температуре материала 24-27°С в течение 12-16 ч. Давление в камере не должно быть выше 90 мм рт. ст. Общее время сушки с досушиванием составляет 60-64 ч.

Запаивание ампул: после завершения процесса сублимационного высушивания камеру сублиматора через стерилизующий фильтр заполняли стерильным воздухом, открывали и ампулы с материалом быстро перекладывали в эксикатор с осушенным силикагелем. Ампулы с материалом запаивали незамедлительно в день разгрузки в условиях стерильного бокса.

Датой изготовления лиофилизированной бактериальной культуры штамма P. multocida «РМ-В», считали дату проведения пассажа на питательной среде перед смывом культуры.

Штамм P. multocida «РМ-В» хранят в лиофилизированном виде в запаянных ампулах, упакованных в коробки из картона и металлические контейнеры, при температуре минус (40,0-70,0)°С.Срок хранения штамма P. multocida «РМ-В» с даты лиофилизации - 5 лет.

При хранении (по истечении 6 мес.) проводили вскрытие 5 ампул с лиофилизированной культурой штамма P. multocida «РМ-В» и определяли физико-химические и биологические показатели штамма. Все показатели соответствовали требуемым нормам, т.е. штамм при хранении в течение 6 мес.не изменил свои свойства.

Пример 4. Определение биохимических свойств штамма P. multocida «РМ-В»

Биохимические свойства штамма P. multocida «РМ-В» (предлагаемое изобретение) определяли с помощью набора API 20Е (BioMerieux) для идентификации Enterobacteriaceae и других неприхотливых грамотрицательных палочек по ферментации Сахаров: глюкозы, сахарозы, маннита, сорбита; газообразованию индола; продукции каталазы, орнитиндекарбоксилазы, отсутствию продукции: уреазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы, β-галактозидазы.

В контейнер для инкубации (поднос и крышку) вносят 5 см³ очищенной воды для создания влажной атмосферы. Помещали в контейнер для инкубации стрип.В пробирку, содержащую 5 см³ стерильного физиологическогораствора с помощью бактериологической петли вносили 2-3 изолированных колонии предлагаемого штамма P. multocida «РМ-В» и тщательно растирали в пробирке. Пипеткой распределяли суспензию по лункам стрипа, избегая образования пузырьков. Поднос накрывали крышкой и инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Продукцию каталазы определяли в тесте с 3%-ным раствором перекиси водорода.

Биохимические свойства штамма представлены в таблице 1, соответствуют свойствам описанным в определителе Берджи - штамм бактерий P. multocida «РМ-В» относится к виду P. multocida, роду Pasteurella.

Пример 5. Проведение генетической идентификации и определение серогрупповой принадлежности штамма P. multocida «РМ-В»

Генетическую идентификацию штамма P. multocida «РМ-В» проводят с использованием «Методики выявления P. multocida и определения типа капсульного антигена бактерии с использованием полимеразной цепной реакции» [27]. Размер ампликона для P. multocida серогруппы В должен составлять 540 пар нуклеотидов (п. н.).

Отбирали отдельные колонии штамма P. multocida «РМ-В» с питательной среды из которых проводили выделение ДНК с использованием 6М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F. Выделение ДНК проводили в стерильных условиях в отдельном помещении с использованием индивидуального комплекта пипеток.

Выделенную ДНК использовали для постановки ПЦР. Для проведения ПЦР в отдельной пробирке готовили общую реакционную смесь. Для ее изготовления реактивы вносили в количестве, приведенном ниже.

Деионизованная вода - 15,3 мкл.

Смесь праймеров - 1,0 мкл.

дНТФ - 1,0 мкл.

10×буфер для ПЦР - 2,5 мкл.

Taq ДНК-полимеразам - 0,2 мкл.

ДНК (ГПМ или РПМ) - 5,0 мкл.

Встряхивали пробирки на смесителе, все капли со стенок собирали центрифугированием в течение 5-10 с.

Сбор инкубационной смеси проводили в стерильных условиях в боксе для ПЦР с использованием индивидуального комплекта пипеток.

Переносили пробы в амплификатор и проводили ПЦР при следующих температурно-временных режимах: предварительная денатурация - 95°С в течение 2 мин., далее 35 циклов: денатурация - 95°С в течение 30 сек., отжиг праймеров - 55°С в течение 30 сек., элонгация цепи - 72°С в течение 40 сек., и один цикл заключительной элонгации - 72°С в течение 3 мин.

В каждой серии анализов ставили два контрольных образца: положительный контроль (с контрольной ДНК P. multocida), и отрицательный контроль (с деионизованной водой).

Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Электрофорез продуктов амплификации проводили следующим образом. Из пробирок с исследуемыми образцами после завершения амплификации отбирали по 5 мкл реакционной смеси, добавляли 3 мкл красителя (0,25% раствор бромфенолового синего в 50% глицерине), перемешивали наконечником для пипеточных дозаторов и вносили в лунки агарозного геля.

Электрофорез проводили при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 мин.

Результаты электрофореза учитывали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос.

Заключение о типе выявленной P. multocida делали по результатам мультиплексной ПЦР. Размер ампликона для серотипов Е, D, А, В и F составляет 243, 308, 405, 540 и 700 п. н. соответственно.

Амлифицированный фрагмент ДНК в исследуемых пробах располагался на уровне, соответствующем ампликону серотипа В (540 п. н.).

Пример 6. Определение антигенных свойств штамма P. multocida «РМ-В»

Полученный препарат антигена, как описано в примере 1, исследовали в РА микрометодом для выявления агглютинирующей активности антигена по ниже описанной методике.

Принцип реакции агглютинации на планшете микрометодом заключается в склеивании антиген-антитело и выпадении в осадок антигенов P. multocida под действием специфических антител (агглютининов) в специфической сыворотке крови кролика в присутствии солей электролитов, что визуально регистрируется образованием четко оформленного зонтика на дне лунки планшета. При отрицательной реакции агглютинации (отсутствие специфических антител в сыворотке крови) антиген оседает на дно в виде точки.

Использовали иммуноспецифические компоненты реакции:

- специфическая сыворотка крови кролика, двукратно иммунизированных антигеном P. multocida серогруппы В (положительный контроль);

- нормальная сыворотка крови кролика, не содержащая антител к P. multocida серогруппы В (отрицательный контроль);

- исследуемый антиген штамма P. multocida «РМ-В» (бактериальная суспензия, полученная методом культивирования в жидкой питательной среде, инактивированная формалином). Общую концентрацию микробных клеток в бактериальной суспензии определяли визуально по стандарту (эталону) мутности. Для постановки РА использовали инактивированныйантиген из штамма P. multocida «РМ-В» концентрацией микробных клеток 1×10⁹ в см³.

Для постановки РА готовили двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки планшета вносили фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) рН 7,2-7,4 - в объеме 0,05 см³. В первую лунку добавляли подготовленные пробы антигена штамма P. multocida «РМ-В» в объеме 0,05 см³, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см³ во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см³ испытуемого материала удаляли в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.

Готовили рабочее разведение положительной и отрицательной контрольных сывороток (1:100) и вносили их во все лунки планшета с разведениями антигена в объеме 0,05 см³. Одновременно ставили контроли реакции:

- контроль антигена - в две лунки планшета вносили по 0,05 см³ ФСБР разведения антигена. Агглютинация антигена должна полностью отсутствовать;

- контроль сывороток на спонтанную агглютинацию - к 0,05 см³ контрольной сыворотки крови добавляли 0,05 см³ ФСБР. Спонтанная агглютинация сывороток крови должна отсутствовать.

Планшеты с компонентами реакции инкубировали в течение 18 часов при температуре (37±0,5)°С в статическом состоянии в шейкере-инкубаторе, затем выдерживали в бытовом холодильнике при температуре 4°С в течение 1 часа, после чего производили визуальный учет реакции.

Реакцию учитывали после полного оседания бактериальных клеток в лунках с контролем антигена.

Титром исследуемого антигена считали его наибольшее разведение, которое дает четкую видимую агглютинацию («зонтик»).

Результат реакции считали положительным, если в лунке наблюдали четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика», с титром в РА≥1:16 (4 log₂).

Результат считали отрицательным, если антиген оседал на дно лунки в виде точки («пуговки»), с титром в РА<1:16 (4 log₂).

Для определения специфичности сыворотки ставили РА с антигенами Streptococcus agalactiae (S. agalactiae), Staphylococcus aureus (S. aureus).

Агглютинирующий титр бактериальной суспензии штамма бактерий P. multocida «РМ-В» составил 1:512 (9 log₂).

Полученные препараты антигена, как описано выше, дополнительно исследовали в ИФА для определения титра антител при помощи «Набора для определения антител к Pasteurella multocida иммуноферментным методом», производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» по ниже описанной методике.

Из комплекта набора брали планшет, сенсибилизированный антигеном бактерий вида P. multocida серогруппы В.

Для исследования в лунки первого и второго ряда планшета, за исключением лунок А1 и А2 вносили по 0,05 см³ рабочий буферный раствор для разведения проб.

В лунку Al, А2 вносили по 0,01 см³, предварительно разведенных положительного и отрицательного контролей.

Внесенные в лунки А1 и А2 контрольные сыворотки пипетировали трижды и переносили по 0,05 см³ полученного разведения в следующий ряд лунок (В1 и В2, С1 и С2 и тд.) с двукратным шагом, получая тем самым разведения сывороток от 1:100 до 1:12800.

Планшет, накрытый крышкой, инкубировали в термостате при температуре (37,0±1,0)°С в течение 60 минут.

По окончании инкубации лунки планшета освобождали от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промывали приготовленным буфернымраствором в объеме по 0,30 см³ в каждую лунку. Затем жидкость окончательно удаляли, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Во все используемые лунки планшета вносили по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата, планшет накрывали крышкой и инкубировали 60 минут при температуре (37,0±1,0)°С. По окончании инкубации повторяли процедуру промывки планшета.

Во все используемые лунки планшета вносили по 0,05 см³ субстрата, накрывали крышкой и выдерживали 10-15 минут в темном месте при температуре (21,0±5,0)°С.

Реакцию останавливали добавлением в каждую используемую лунку по 0,05 см³ ”стоп-раствора”.

Учет результатов ИФА проводили сразу после остановки реакции, используя спектрофотометр (ридер) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм.

Результаты теста считаются достоверными, если:

- значение оптической плотности контроля К1 в рабочем разведении не превышает 0,400 оптических единиц (о.е.).

- значение оптической плотности контроля К2 в рабочем разведении не ниже 0,600 о.е.

Для определения специфичности сыворотки ставили непрямой вариант ИФА с использованием «Набора для выявления антител к возбудителям мастита крупного рогатого скота (КРС) в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (планшеты с антигенами S. agalactiae, S. aureus).

Результаты ИФА показали, что титр антител в сыворотке крови кроликов находится в диапазоне 1:800-1:1600.

Пример 7. Получение экспериментальной модели вакцины на основе антигена штамма бактерий P. multocida «РМ-В»

В качестве антигена при изготовлении вакцины против пастереллеза в форме геморрагической септицемии КРС использовали бактериальную суспензию штамма P. multocida «РМ-В», полученный по примеру 1.

Для получения клеточного антигена из бактериальной суспензии использовали высокоскоростную проточную центрифугу BR 105BRLL, скорость подачи бактериальной суспензии составляла 1 л/час при вращении ротора 14000 об/мин. Общее время центрифугирования составило 15 мин. По окончанию работы ротор извлекали и перемещали в зону чистоты класса А.

Работу по стерильному извлечению бактериальной массы проводили в локальной чистой зоне 3W. Бактериальную массу снимали с внутренних стенок ротора центрифуги стерильным металлическим шпателем и погружали в стерильный стеклянный стакан. Предварительно в стакан был внесен стерильный фосфатно-солевой буферный раствор в объеме 0,05 л. После снятия всей бактериальной массы суспензию гомогенизировали в лабораторном гомогенизаторе Silverson L4R при комнатной температуре в течение 15 мин при частоте вращения мешалки 2500-2700 об/мин.

Полученную бактериальную суспензию фильтровали через стерильный многослойный марлевый фильтр в стерильную бутыль и определяли концентрацию клеток. При постоянном перемешивании бактериальную суспензию разбавляли стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1000 ОЕ/см³ (по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ»). Готовую суспензию клеточного антигена штамма бактерий P. multocida «РМ-В» до компоновки вакцины хранили в стеклянной бутыли под резиновой пробкой в комнате-рефрижераторе при температуре (4-8)°С. Перед перемещением на хранение антигены проверяли на стерильность в соответствии с ГФ XIV, т.1, стр. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15).

Для создания экспериментальной серии препарата в количестве 1,0 тыс.доз было использовано:

- инактивированный антиген штамма бактерий P. multocida «РМ-В» - 0,01 дм³;

- стерильный физиологический раствор - 0,49 дм³;

- адъювант Montanide ISA 206 VG - 0,5 кг;

- тиомерсал - 0,002 дм³.

С целью получения эмульсионного препарата, специфический иммуностимулятор (антиген) соединяли со стерильным физиологическим раствором, заявленное выше количество антигена сопоставимо с 1×10⁹ м.к./доза. Масло предварительно было перелито в бутыль. Данный адъювант не пригоден для автоклавирования, поэтому перед эмульгированием подвергался холодной стерилизации через капсульный фильтр (0,22 мкм). Все компоненты вакцины были нагреты до 35,0°С. Адъювант соединяли с антигеном при низких оборотах мешалки (250 об/мин) в течение 15 мин. Для получения стабильной эмульсии полуфабрикат вакцины охлаждали до 12°С и проводили повторное эмульгирование в течение 15 мин.

Данной вакциной было иммунизировано 5 кроликов внутримышечно прививной дозой 1,0 см³. У кроликов до иммунизации и через 21 день после вакцинации были отобраны пробы сыворотки крови. Данные сыворотки проверили на наличие антител к бактериям штамма P. multocida «РМ-В» в РА и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что через 21 сутки после однократной иммунизации кроликов инактивированной цельной вакциной, изготовленной из штамма P. multocida «РМ-В» в сыворотке крови кроликов обнаружены антитела к P. multocida в диапазоне титров от 9,64 до 10,64. log₂. Показано, что полученный штамм P. multocida «РМ-В» обладает антигенными свойствами, т.к. на введение вакцины, изготовленной из штамма бактерий P. multocida «РМ-В» проходит выработка специфических антител.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Pasteurella multocida «РМ-В» может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза в форме геморрагической септицемии КРС.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм бактерии Pasteurella multocida «РМ-В» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В»:

1. Hendriksen, R.S. Prevalence of antimicrobial resistance among bacterial pathogens isolated from cattle in different European countries. / R.S. Hendriksen, D.J. Mevius, A. Schroeter et.al. // Acta Vet. Scand. - 2008.

2. Аблов, A.M. Пастереллез животных и птиц в Иркутской области / A.M. Аблов, А.С.Батомункуев, А.А. Плиска, Е.В. Анганова // Достижения науки и техники АПК. - 2013. - №9. - С. 68-69.

3. Вахрушева Т.И. Геморрагическая септицемия телят: патоморфологические аспекты / Вахрушева Т.И. // Проблемы современной аграрной науки, Материалы международной научной конференции. -Красноярск, 2020, с. 121-123.

4. Джупина СИ. Особенности профилактики пастереллеза и геморагической септицемии / Джупина СИ. // Ветеринарная патология, 2016, №1 (55), с. 5-11.

5. Kapustin, A.V. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia haemolytica / A.V. Kapustin, A.I. Laishevtcev // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. - T. 52. - №4. - P. 3-12.

6. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2022.

7. Капустин A.B. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей. // Методические указания, Москва.- 2016.

8. Ермагамбетова С.Е. Изучение биологических свойств производственных штаммов пастерелл / Ермагамбетова С.Е. и др. // В сборнике: Наука и образование: опыт, проблемы, перспективы развития. Материалы международной научно-практической конференции. Красноярск, 2021. С. 43-46.

9. Гадзевич Д.В. Культурально-морфологические и биохимические особенности пастерелл / Гадзевич Д.В. и др. // Ветеринарная медицина. 2011. №95. С. 95-97.

10. Ленченко Е.М. Этиологическая структура и дифференциальная диагностика бактериальных болезней телят./ Ленченко Е.М. и др. // Аграрная наука. 2017. №5. С. 27-30.

11. Сох A.J. Functional characterization of HgbB, a new haemoglobin binding protein of Pasterella multocida. / Cox A J. et.al. // Microbiology pathology, 2003, №34, p.287-296.

12. Красникова Е.Л. Чувствительность и специфичность MULTIPLEX ПЦР Pasteurella multocida А, В, D для выявления серовариантов пастерелл / Красникова Е.Л. и др. // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. 2018. №2. С. 53-58.

13. Полковниченко А.П. Особенности биологических свойств культур P. multocida, выделенных от животных в условиях Астраханской области / Полковниченко А.П. и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2017. Т. 232. №4. С. 112-116.

14. Галка В.И. Резистентность бактерий к антибиотикам как одна из глобальных экологических проблем и некоторые пути ее решения / Галка В.И., Миськевич С.В. // Сборник: Всемирный день охраны окружающей среды. Материалы Международной научно-практической конференции. 2014. С. 20-26.

15. Гасанов A.M. Чувствительность микроорганизмов, выделенных при пастереллезной инфекции, к антибактериальным препаратам / Гасанов A.M. // Аграрная наука. 2019. №2. С. 20-21.

16. Патент RU 2 278 668 С1, от 08.12.2004.

17. Манжурина О.А. Комплексная терапия пастереллеза телят в условиях скотоводческого комплекса Белгородской области / Манжурина О.А., Калядина А.А. // Сборник: Теория и практика инновационных технологий в АПК. Материалы национальной научно-практической конференции. Воронеж, 2022. С. 144-146.

18. Патент RU 2123531 С1, от 15.06.1993.

19. Патент RU 2103355 С1, от 23.11.1995.

20. Патент RU 2286391 С2, от 19.07.2004.

21. Патент RU 2445367 С2, от 21.06.2010.

22. Патент RU 2717535 С1, от 27.03.2019.

23. Патент RU 2415 926С2, от 21.12.2005.

24. Патент BY 10966 С1, от 30.08.2008.

25. Заявка на изобретение RU №0095117747 А, от 10.10.1997.

26. Патент RU 2246316 С1, от 20.02.2005.

27. «Методика выявления P. multocida и определения типа капсульного антигена бактерии с использованием полимеразной цепной реакции» / Щербаков А.В., Тимина A.M., Яковлева А.С, Ковалишин В.Ф. // Владимир - 2005.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Предложен новый штамм бактерий Pasteurella multocida №492 –деп / 23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Предложенный штамм по серогрупповой дифференциации относится к серогруппе В, является высоковирулентным, обладает антигенными и иммуногенными свойствами. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза КРС. 2 табл., 7 пр.

Штамм бактерий Pasteurella multocida «РМ - В», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №492 - деп / 23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В.