Способ выделения чистой культуры возбудителя пастереллёза Pasteurella multocida Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida.

Пастереллез («куриная холера», геморрагическая септицемия млекопитающих) вызывает бактерия Pasteurella multocida, способная многих и много (multi) убить (cid), представленная С.Т. Rosenbusch и I.A. Merchant (1939) типовым видом рода Pasteurella [5, 6, 9, 34]. Ее первая в бактериологии культура на искусственной среде (в бульоне) выделена из трупов кур при изучении «куриной холеры» Л. Пастером (1880) [32]. С тех пор культурой бактериальной называют популяцию жизнеспособных бактерий, выращенных на питательной среде, а прямое выделение ее из трупов (из патологического материала) применяют как основной способ бактериологического исследования [4, 6]. Наиболее чаще его используют в целях диагностики и таксономии. Идентификация и дифференциация бактерий могут быть проведены только при наличии их чистых культур [6]. Поэтому в случаях получения смешанной культуры микроорганизмов, ей инфицируют восприимчивый организм и затем прямым выделением из трупа получают чистую культуру возбудителя болезни [2]. В пассаже через восприимчивый организм с последующим тем же способом прямого выделения из трупа чистой культуры восстанавливают штаммы бактерий при поддержании в коллекции, при изготовлении и контроле биопрепаратов. Ему дополнением служит дробный посев исследуемого патологического материала на плотной питательной среде с последующим пересевом характерно растущей колонии бактерий (в частности, P. multocida) в питательный бульон и получением их чистой культуры [2]. Однако в этом случае чистая культура бактерий уже второй генерации на питательной среде после их размножения in vivo, несколько отличающаяся от исходной (первой) морфологией роста, то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации. По определению микробиологии, диссоциация (разъединение) - появление в популяции бактерий особей, отличающихся от исходного типа внешним видом и структурой колоний, а также наследственно закрепленными изменениями некоторых морфологических и биологических свойств [6]. Данные многих исследователей, в т.ч. и наши, показывают, что важным фактором вирулентности P. multocida служит капсула [2, 9, 15, 31]. Утрата или же восстановление капсулы и, как правило, вирулентности P. multocida сопровождаются изменением морфологии ее колоний, которые могут иметь гладкую радужную или не радужную (S-), слизистую или мукоидную (М-), шероховатую (R-) формы и S^R- и R^S-переходные формы [2, 9, 10, 11, 29, 30]. Однако это характеризует изменчивость P. multocida, но не раскрывает условия ее диссоциации. По этой причине не представляется возможным обеспечить единство методологии выделения чистой культуры P. multocida и достоверность оценки морфологических и биологических свойств бактерии. В этом заключается основной недостаток традиционного способа.

Согласно принятому в микробиологии определению, чистая культура бактерий, выделенная из какого-либо источника в определенное время, называется штаммом [4, 6]. Также известно, что стабильность патогенных свойств микроорганизмов - важнейший показатель при их использовании [7, 21, 27]. Однако в научных и практических целях выделяемые и применяемые штаммы P. multocida часто не отвечают этим критериям, а существующая методология не обеспечивает их восстановление в пассаже через восприимчивый организм. Исходя из этого, исторически сложившийся традиционный способ выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida из какого-либо источника в определенное время взят за прототип [4, 6]. За показатель «источник» принимают, как правило, зараженный организм или труп погибшего в заражении организма определенного вида и возраста. Показатель «определенное время» подробно не раскрыт и вероятнее всего указывает на дату выделения чистой культуры P. multocida. Ее же по-прежнему эмпирически выделяют от павших и вынужденно убитых больных, произвольно доставленных из эпизоотических очагов или воспроизведенных в экспериментальном заражении. Выделенные из одного и того же источника (трупа) культуры P. multocida нередко отличаются по морфологии роста, в частности - по форме колоний (то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации), по формообразованию и форме микробной клетки, а также по вирулентности. Адаптация и изменчивость пастерелл в изменяющихся условиях трупа с момента смерти не учитываются. Ввиду этого срок (своевременность) выделения чистой культуры (штамма) P. multocida и ряд других принципиально важных условий методически не предусмотрены. Однако от этого зависит типичность ее свойств и, как следствие, достоверность результата исследования. Очевидно, что традиционный способ (прототип) не обеспечивает условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза P. multocida строгой типичности морфологических и биологических свойств.

Несмотря на диссеминацию (генерализацию) клеток P. multocida током крови по всему организму, ее чистую культуру выделяют произвольно в большом объеме посева проб патологического материала (разных органов, тканей) [1-3]. Такой подход влечет необоснованные затраты материальных средств и рабочего время, тогда как выделение чистой культуры P. multocida и наличие типичности ее свойств не во всех случаях исследования возможны. Нередко при культивировании посевов на плотной питательной среде нет роста культуры бактерий, а в питательном бульоне получают нетипичной морфологии «интенсивный» рост культуры. И в первом случае создается мнение о стерильности патологического материала, а во втором - подозрение на получение смешанной культуры, что соответственно влечет дополнительные манипуляции в исследованиях. Вызывают вопрос и случаи, когда культура P. multocida, выделенная при явно остром течении пастереллеза, в биологической пробе не проявляет патогенность. По этим причинам на бактериологическое исследование затрачивают до 10 суток или даже экспертизу повторяют на вновь доставленном материале. Чтобы оптимизировать условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза применяют разные обогащенные питательные среды, обычно тоже эмпирически подобранные. Однако P. multocida легко дает рост даже на обычной простой плотной и жидкой питательной среде для культивирования микроорганизмов, в частности, имеющей Технические условия (ТУ-9398-020-78095326-2006, ТУ9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4). Тем не менее, изменчивость бактерии обусловлена влиянием условий окружающей среды. Первые попытки сохранить возбудителя «куриной холеры» (P. multocida) in vitro предпринял Л. Пастер [32]. Лишенная контакта с атмосферным кислородом культура не потеряла вирулентности, а оставленная в обычных условиях ее утратила. Аналогично, выращенные и хранящиеся в 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом культуры P. multocida продолжительно сохраняют биологические свойства, на что не влияет содержание в среде сыворотки крови разных видов животных [25]. Однако, P. multocida - не только аэроб, но и факультативный анаэроб. Ее обмен веществ и энергии, ослабление вирулентных и других свойств в отсутствии свободного кислорода и при использовании атомарного лишь замедляются.

Имеются сведения о том, что «носители» P. multocida - потенциальный источник инфекции [3, 17, 19, 20, 28]. Бактерия локализуется, переживает, колонизирует и проявляет инвазивность на слизистых оболочках полости носа, рта, глотки [6, 17, 18, 33]. Однако ее избирательность паразитирования в этой области не раскрыта. Кроме того, заболевание пастереллезом регистрируется в регионах с теплым и умеренным климатом, возникает неожиданно (в виде «молниеносного» течения или внезапной «взрывной вспышки») при ослаблении естественных защитных сил организма под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды, особенно резких колебаний температуры и дождей [3, 6, 8, 9, 26]. Однако традиционные представления о природе активизации и о происхождении инфекции носят гипотетический характер, так как механизм повышения вирулентности Р. multocida и заражения восприимчивых организмов естественным путем экспериментально не воспроизведен и, поэтому, не установлен.

По нашим наблюдениям заболевание действительно часто и внезапно возникает при резких колебаниях температуры и дождливой погоде, характеризуясь, как правило, сверхострым течением в начале эпизоотии [15]. Смерть наступает так быстро, что классические патологоанатомические изменения, кроме геморрагий, не успевают развиться. Первые погибшие наиболее упитанные и крепкие на вид особи, поэтому всякие предположения об ослаблении естественных защитных сил организма как условия возникновения пастереллеза исключаются. Не находят объяснения случаи быстрого угасания эпизоотии, когда без видимых причин число погибших за сутки значительно уменьшается, а динамика снижения падежа выглядит волнообразной. Гибель в очаге резко прекращается и на слизистых оболочках верхних дыхательных путей и глотки остаются потенциально патогенные пастереллы («здоровое носительство»). Однако эпизоотическая ситуация становится чрезвычайно опасной, а течение болезни сверхострым, если распространение инфекции и заражение происходят через воду. При проведении опытов нами отмечена зависимость морфологических и биологических свойств P. multocida от пути заражения организма, инфицирующего материала, температуры и жидкой фазы окружающей среды [23, 24, 13]. В динамике размножения P. multocida в крови зараженных и погибших, а также в пробах крови, на жидкой и плотной питательной среде изучен морфогенез (формообразование), в т.ч. формирование капсулы и биполярности [12, 14, 16, 22]. Это позволило впервые установить функциональную морфо- и термолабильность P. multocida, объяснить условия вирулентности и диссоциации бактерии, раскрыть природный механизм пастереллеза [11, 14, 15]. P. multocida выделяет экзометаболит. Из него при снижении температуры формируется капсула и, соответственно, повышается вирулентность бактерии. Изолированная в стерильной (чистой) воде бактерия сохраняет, а при контакте с питательной средой быстро утрачивает капсулу и вирулентность. Температура, как фактор воздействия на формирующуюся и сформированную капсулу P. multocida, предопределяет возможность проявления бактерией патогенных свойств и обусловливает закономерность возникновения пастереллеза в периоды резких колебаний температуры и выпадения дождей. Внезапное появление и неожиданное угасание эпизоотий пастереллеза - результат прямо противоположного резкого влияния низкой, умеренной и повышенной температуры окружающей среды на капсулу и патогенные свойства Р. multocida. Слизистые оболочки носовой, ротовой и глоточной полостей -природная область естественного носительства P. multocida (локализации, длительного переживания, колонизации и инвазивности), где бактерии свойственна функциональная морфо- и термолабильность в зависимости от температуры окружающей среды (в основном воздуха и питьевой воды). Именно здесь взаимодействие P. multocida и восприимчивого организма при ключевой роли температурного фактора определяет возможность начала воспалительного процесса (первичный аффект) и представляет собой естественный путь (механизм) заражения пастереллезом [15]. С раскрытием природных условий развития пастереллеза окончательно определены недостатки традиционного способа и основополагающие отличительные признаки нового решения на способ выделения чистой культуры (штамма) Р. multocida и ее оценки. Ввиду функциональной морфо- и термолабильности Р. multocida, принципиальное значение в выделении и оценке ее чистой культуры (штамма) представляют: путь заражения, масса тела восприимчивого организма, инфицирующий материал, температура окружающей среды (при заражении организма и при остывании трупа соответственно), время вскрытия трупа после смерти организма, глубина точки отбора инфекционного материала из трупа для бактериологического исследования.

Задачей изобретения является выделение и оценка чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida путем обеспечения единства условий методологии на природной основе.

Поставленная задача достигается тем, что в заражении естественным путем или близким к нему способом (интраназально или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей) павший от пастереллеза восприимчивый организм массой тела около 350 г (оптимум) с момента смерти остывает при температуре 20±1°С (оптимум). Через 3 ч его труп вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду (20±1°С) 1:9 по объему, осадок встряхивают и переводя во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10^-1, разводят до 10^-2, 10^-3 и соответственно высевают на питательный бульон и питательный агар при температуре 20±1°С (оптимум). Посевы культивируют и получают 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) культуру пастерелл первой генерации после организма. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.

Существенным отличием является то, что в заражении естественным путем или близким к нему способом (интраназально или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей) павший от пастереллеза восприимчивый организм массой тела около 350 г (оптимум) с момента смерти остывает при температуре 20±1°С (оптимум). Через 3 ч его труп вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду (20±1°) 1 : 9 по объему. Осадок встряхивают и переводят во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считают изолятом пастерелл из крови в разведении 10^-1, готовят его разведения 10^-2, 10^-3 и соответственно высевают на питательный бульон и питательный агар при температуре 20±1°С (оптимум). Посевы культивируют и получают 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) культуру пастерелл первой генерации после организма. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.

В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта условий заражения восприимчивого организма пастереллезом, выделения и оценки чистой культуры (штамма) P. multocida.

Примеры и сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1

Бактериологическому исследованию на предмет выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза P. multocida подлежал произвольно доставленный из очагов пастереллеза инфекционный материал: клинически больные, трупы, а также внутренние органы и ткани (в т.ч. кровь сердца на чистой воде) от павших и вынужденно убитых. Кроме этого исследованию подлежал инфекционный материал, воспроизведенный при восстановлении в пассаже через восприимчивый организм штаммов Р. multocida, длительно хранящихся на питательном бульоне под столбиком вазелинового масла высотой 1 см при 18-22°С и в сахарозо-желатиновой среде под вакуумом при 4-6°С. В частности, это выделенные в разное время и из разных регионов штаммы: эталонный Х-73 (коллекция Хеддлестоуна, США), контрольно-производственные №55, №115, №712, №915, №1931 (ВГНКИ ветпрепаратов) и пять вирулентных полевых, относящиеся к типичному серовару A:1 P. multocida, наиболее распространенному и вызывающему заболевание птиц (по нашим данным, в 89% случаев эпизоотий), а также производственные штаммы №116, №656, №796 (ВГНКИ ветпрепаратов), относящиеся к типичному серовару В Р. multocida, вызывающему заболевание млекопитающих.

Во всех случаях бактериологического исследования инфекционного материала, содержащийся в нем спонтанно изменившийся (в разном состоянии морфологических и биологических свойств) возбудитель пастереллеза P. multocida восстанавливали в пассаже через восприимчивый организм, что показано в последующем примере 3. Микроорганизмы по источнику происхождения от птиц пассировали через голубя, крайне изредка - через цыпленка или утенка, а от млекопитающих - через кролика. Восприимчивые организмы подбирали по массе тела около 350 г (оптимум).

Исходные культуры микроорганизмов в посевах подлежащего исследованию инфекционного материала, в т.ч. непосредственно из условий хранения в коллекции (т.е. не пассированные через восприимчивый организм), в каждом случае бактериологического исследования соответственно служили в качестве контроля.

Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.

Пример 2

Изучали морфогенез (формообразование) P. multocida в крови зараженных и погибших в естественном и экспериментальном заражении.

В искусственном заражении (на слизистую носовой, ротовой и глоточной полостей) инфицирующим материалом служила кровь, содержащая пастереллы при наиболее выраженной их биполярности и капсулы. Восприимчивый организм заражали при 20±1°С и затем сразу содержали при 10±1°С, а с момента его гибели и по взятие крови из сердца труп остывал 3 ч при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. Исследуемым материалом от зараженных особей были пробы слизи со слизистой в области небной щели и пробы крови из вены крыла, а от павших - пробы крови из сердца. Индикацию и идентификацию клеток P. multocida вели посредством световой и электронной микроскопии препаратов, последовательно приготавливаемых при инфекционном процессе и в посмертном периоде по общепринятым методам.

Формообразование бактерии P. multocida в естественном заражении и в экспериментальном (близком к естественному заражению) было одинаковым. В частности, на слизистой в воротах инфекции при резком изменении температуры окружающей среды (в основном воздуха и питьевой воды) пастереллы быстро утрачивали капсулу, биполярность, уменьшались, принимали вид относительно равных по величине маленьких коккобактерий и проникали в кровь (кровоток) густой сети капилляров соединительнотканного слоя слизистых оболочек. С развитием септицемии, при повышенной температуре тела организма, P. multocida выявляли в виде бескапсульной коккобактерии. Ей непрерывно характерно деление и диссеминация (генерализация) гематогенным путем с признаком свободного выделения экзометаболита (по данным электронной микроскопии то же вещество, что и капсульное) в смертельной для птицы дозе. С момента смерти зараженной особи, по мере остывания ее трупа, синхронно снижению температуры экзометаболит принимает вязкую консистенцию и его все больше остается на клетке P. multocida в виде формирующейся капсулы. При этом бактерия делится пополам на две дочерние, которые, вокруг и противоположно выделяя экзометаболит, пластично и в напряжении принимают выпукло-вогнутую форму. Традиционно это ошибочно характеризуют избирательным окрашиванием полюсов и не окрашенной середины бактерии, обозначая «биполярная палочка», «биполяр» или просто «феномен биполярности». Однако на признак биполярности P. multocida очень влияет жидкая фаза среды. «Биполяры» в крови из сердца трупа при внесении в обычную воду и другие жидкие среды быстро (за 3-5 с) распадаются. Выпукло-вогнутые по форме и в напряжении клетки Р. multocida сразу же утрачивают парное расположение и оформляются в кокко- и диплококкоподобные. После легкого встряхивания материала в жидкой среде диплококкоподобные формы бактерий распадаются на коккоподобные. Поэтому «биполяр» или «биполярная палочка» P. multocida - это структура из двух клеток в капсуле, легко и быстро утрачивающих взаимосвязь и принимающих шаровидную форму (особенно в жидкой среде). Однако при индикации и идентификации P. multocida капсулу и признак биполярность следует по-прежнему считать важными для диагностики и таксономии показателями. Тем не менее, из-за распада парной структуры пастерелл, выявляемый возбудитель пастереллеза птиц чаще представлен в форме кокка разной величины, что затрудняет индикацию и идентификацию как первый этап диагностики. Формообразование клетки P. multocida (в том числе формирование капсулы) происходит при изменении температуры окружающей среды и обусловлено функциональным состоянием бактерии. Выраженность капсулы и биполярности P. multocida в трупе естественно зараженной особи зависит от срока после ее смерти, массы тела и глубины отбора из него пробы инфекционного материала, от температуры окружающей среды и фазы среды (плотной или жидкой). На основе установленной закономерности формообразования P. multocida, для точности выявления этой бактерии подобран и рекомендуется для применения в лабораторной практике стандарт оптимальных условий отбора и исследования патологического материала. В заражении близком естественному при массе тела павшей особи около 350 г, остывшей при температуре окружающей среды 20±1°С (оптимум), труп вскрывают через 3 ч с момента смерти, берут пробу крови из сердца и готовят препараты с окраской по общепринятым методам (Бурри, Романовского-Гимза, Грама). При микроскопии препаратов регистрируют грамотрицательные клетки Р. multocida, их выраженную капсулу и биполярность. В сравнении с традиционным вариантом, предлагаемую методологию отличают объективность исследования, достоверность результата, минимизация материальных затрат и рабочего время.

Пример 3

Возбудитель пастереллеза P. multocida (в разном состоянии морфологических и биологических свойств по причине диссоциации), содержащийся в подлежащем исследованию инфекционном материале (пример 1), восстанавливали в пассаже через восприимчивый организм. Ввиду функциональной морфо- и термолабильности P. multocida, принципиальное значение в восстановлении ее штаммов представляли: путь заражения, масса тела восприимчивого организма, инфицирующий материал, температура окружающей среды (при заражении организма и при остывании трупа соответственно), время вскрытия трупа после смерти организма, глубина точки отбора материала из трупа для бактериологического исследования. Во всех случаях инфицирующим материалом служила кровь сердца в объеме 0,1 см³ (две капли), взятая у зараженного голубя/кролика массой тела около 350 г через 3 ч после смерти при температуре хранения трупа 20±1°С (оптимум). Для ее получения подлежащий исследованию инфекционный материал, отмеченный в примере 1, в каждом случае соответственно дробно высевали на плотную питательную среду (ТУ 9398-020-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С и культивировали при 37°С. Из выросших колоний (чаще М- и реже S- и R-форм) отбирали типичную М-формы и пересевали на питательный бульон (ТУ 9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С. Посев культивировали 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20±1°С. Клонированную таким способом 10-20 - часовую бульонную культуру внутримышечно вводили голубю/кролику в дозе 0,3-0,5 мл (вспомогательный пассаж). Кровью сердца погибшего голубя/кролика заражали следующего голубя/кролика способом близким к естественному инфицированию - на слизистую оболочку носовой и глоточной полостей (основной пассаж). Восприимчивый организм заражали при 20±1°С, а затем содержали при 10±1°С. С момента его гибели и по взятие крови из сердца труп остывал 3 ч при температуре 20±1°С окружающей среды. Наличие выражено капсулированных клеток P. multocida в крови сердца трупа принимали за косвенный показатель восстановления микроорганизма и как признак своевременной его изоляции.

Пример 4

Восстановленный микроорганизм, в виде выражено капсулированных клеток P. multocida (пример 3), биологически изолировали в условия анабиоза для сохранения исходной идентичности на момент получения, оценки и применения его в качестве чистой культуры. В частности, через 3 ч с момента смерти голубя/кролика при 20±1°С (оптимум) окружающей среды (основной пассаж, пример 3) брали пробу крови из сердца трупа и 0,2 мл (4 капли) ее сразу вносили в 1,8 мл стерильной воды (20±1°С). Содержимое пробирки встряхивали 1 мин, переводя во взвесь, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость считали изолятом выражено капсулированных пастерелл из крови в разведении 10^-1 и готовили его разведения 10^-2 и 10^-3 на стерильной воде. Изолят пастерелл из разведений 10^-2 и 10^-3 соответственно высевали на питательный агар (ТУ 9398-020-78095326-2006, рН 7,2-7,4) и питательный бульон (ТУ 9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С. Посевы культивировали и получали 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) чистую культуру пастерелл первой генерации после организма, которую оценивали по морфологическим и биологическим свойствам. Кроме того, изолят пастерелл на чистой воде в разведении 10^-2 и 10^-3 изолировали от атмосферного воздуха, запаивая в предварительно приготовленные из пастеровских пипеток ампулы, что обеспечивало возможность сохранять идентичность его морфологических и биологических свойств в течение 10 суток (срок наблюдений). В результате было доступно получить повторно чистую культуру микроорганизма в исходном (восстановленном) его качестве и провести дополнительные исследования.

Пример 5

На основе единой (стандартизированной) методологии выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза P. multocida из инфекционного материала (согласно примерам 3 и 4) результаты оценки ее морфологических и биологических свойств в каждом случае бактериологического исследования, как правило, не отличались.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии роста на плотной питательной среде. В посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза (по примеру 3 и 4) регистрировали строго типичной морфологии сплошной рост популяции и однотипные колонии пастерелл. В частности, на ровно застывшем в чашках Петри питательном агаре это весьма нежный, прозрачный, чуть с голубоватым опенком в косо проходящем свете сплошной рост культуры P. multocida и гладкие, прозрачные, круглые, 0,5-1,5 мм в диаметре, отдельно растущие колонии бактерий S-формы. На скошено застывшей среде в пробирках устанавливали такие же отдельно растущие колонии в виде «росинок» и сплошной так называемый «росинчатый» рост чистой культуры P. multocida. Все изоляты пастерелл первой генерации после организма имели идентичную морфологию роста - в виде S-формы.

Контрольные посевы инфекционного материала, отмеченного в примере 1, при традиционном методе бактериологического исследования показали отличие морфологии роста выделяемых чистых культур Р. multocida. В частности, в посеве проб органов и тканей от павших и вынужденно убитых из очагов пастереллеза в основном наблюдали сплошной рост культуры и отдельно растущие колонии пастерелл S-формы. Однако среди такого роста нередко регистрировали единичные колонии пастерелл М-формы (слизистые, непрозрачные, не чисто белого цвета на естественном свету, круглые, 1,5-3,0 мм в диаметре) и R-формы (шероховатые, непрозрачные, не чисто белого цвета на естественном свету, с неровными краями). Также и в аналогичных бактериологических посевах проб инфекционного материала, но непосредственно, а прямо из вскрытых трупов, регистрировали тоже разное соотношение этих форм колоний пастерелл, что не находило объективного объяснения. Поэтому, учитывая функциональную морфо- и термолабильность P. multocida, в последующем выполняли посев инфекционного материала только при наибольшей глубине точки его отбора из трупа, то есть - пробу крови сердца, взятую и сразу используемую при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. В случаях, если отбор и посев проб материала выполняли сразу же после (или же в момент) естественной смерти или вынужденного убоя зараженного, то на газоне питательной среды получали, как правило, слабый рост популяции или единичные колонии пастерелл только S-формы. Однако в посеве проб крови сердца, отобранных из почти остывших трупов, получали выраженный сплошной рост и много отдельно растущих колоний пастерелл S-формы, среди которых лишь изредка наблюдали единичные колонии пастерелл М-формы. В посевах проб крови сердца, отобранных после полного остывания и окоченения трупов и далее через разное посмертное время (с каждым последующим учетом результатов), среди большинства колоний пастерелл S-формы с каждым разом все больше обнаруживали колонии пастерелл М-формы. Затем, еще позже, с каждым последующим посевом инфицированной крови сердца трупа, среди доминирующих в популяции колоний пастерелл S-и М-форм все больше обнаруживали колонии пастерелл R-формы.

В контрольных посевах экспериментально воспроизведенного в заражении инфекционного материала (без соблюдения условий восстановления и биологической изоляции штаммов P. multocida) получали примерно такие же результаты исследований, как и в посевах материала из очагов пастереллеза. Кроме того, если трупы хранили при 6-8°С в холодильнике, то с течением время (до 2-5 суток), с каждым последующим отбором и посевом проб крови сердца наблюдали среди по-прежнему доминирующих в популяции колоний пастерелл S-формы значительное увеличение численности колоний пастерелл М-формы. В целом это позволило утверждать, что после организма P. multocida быстро адаптируется к меняющимся условиям в трупе, сравнительно быстро изменяясь по морфологии роста, что на питательной среде наглядно проявляется явлением диссоциации (появления в популяции бактерий особей, отличающихся от исходного типа внешним видом и структурой колоний).

В контрольных посевах длительно хранящихся в коллекции штаммов Р. multocida (т.е. непосредственно из условий их хранения) наблюдали рост колоний только М- и R-форм. В частности, при длительном хранении культур микроорганизмов в сахарозо-желатиновой среде (под вакуумом при 4-6°С) в посевах регистрировали, как правило, колонии пастерелл М-формы, а при хранении на питательном бульоне (под столбиком 1 см вазелинового масла при 18-22°С) - колонии пастерелл М- и R-форм.

Практически важным результатом установили, что P. multocida (при S-форме колоний в контроле) в изоляции от атмосферного воздуха на стерильной воде сохраняется по морфологии микробной клетки и морфологии роста на питательной среде идентичной исходной в течение 10 суток (срок наблюдений). Это обусловлено временным прекращением ее обмена веществ и энергии, то есть явлением анабиоза, что использовано в примере 4.

Таким образом, морфология роста P. multocida в контрольных посевах на плотной питательной среде показывает выраженную (быстро происходящую) изменчивость бактерии в инфекционном материале, что подтверждает целесообразность выделения ее чистой культуры с соблюдением условий восстановления и биологической изоляции согласно примерам 3 и 4.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии роста на жидкой питательной среде. В посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза (по примеру 3 и 4) регистрировали строго типичной морфологии рост популяции пастерелл на бульоне. В частности, это весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий P. multocida при 37°С, в обычных условиях при 15-25 (оптимум 20±1)°С оседающих на дно пробирки не ранее чем через 5, а под столбиком вазелинового масла - через 10 суток. Важно, что в первом случае осадок бактерий слизистый, при легком встряхивании пробирки поднимающийся в виде «нежной косички», а во втором - в виде «пуговки» диаметром до 2-3 мм, при легком встряхивании пробирки свободно переходящий в исходную их взвесь. Оба морфологических признака чистой культуры P. multocida первой генерации после организма, формирующихся в зависимости от доступа атмосферного воздуха и температуры окружающей среды, имеют существенное диагностическое и таксономическое значение. Все изоляты пастерелл первой генерации после организма идентифицировали по морфологии роста в S-форме.

Контрольные посевы инфекционного материала, отмеченного в примере 1, в частности, проб органов и тканей от павших и вынужденно убитых из очагов пастереллеза и в экспериментальном заражении, при традиционном методе бактериологического исследования в основном показали типичной морфологии рост культуры P. multocida. Тем не менее, изредка наблюдали и интенсивное помутнение среды, что можно было бы принять за рост смешанной культуры. Однако, в таких случаях, в контрольных посевах на ровно застывшем в чашках Петри питательном агаре устанавливали, как правило, рост колоний пастерелл S-, М- и R-форм. Кроме этого подобное интенсивное помутнение среды получали в контрольных посевах длительно хранящихся в коллекции культур микроорганизмов, непосредственно из условий их хранения (обычно на питательном бульоне под столбиком вазелинового масла). Дробным методом посева этих культур на питательном агаре каждый раз получали рост колоний пастерелл М- и R-форм.

Сделан вывод: рост культуры P. multocida в виде интенсивного помутнения среды - есть признак ее диссоциации (переход из S- формы в М- и R-формы). Выраженная изменчивость P. multocida в пробах патологического материала (в органах и тканях) и в целом трупе подтверждает необходимость выделения ее чистой культуры с соблюдением условий восстановления и биологической изоляции согласно примерам 3 и 4.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии микробной клетки. Индикацию клеток P. multocida вели посредством световой и электронной микроскопии препаратов по общепринятым методам. В частности, по примеру 4, в посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза на питательном бульоне, в 9-19 - часовой чистой бактериальной культуре (в конце культивирования при 37°С) выявляли строго типичной морфологии клетки пастерелл. Это были грамотрицательные, относительно равные по величине маленькие коккобактерии, не имеющие капсулу (при окраске по методу Бурри) и биполярность (при окраске по Романовскому-Гимза). В бактериальной культуре по истечении 1 ч снижения температуры культивирования с 37°С на 20±1°С (оптимум) у пастерелл в виде маленьких коккобактерий сформировывалась капсула. Во всех случаях исследования морфологии клетки P. multocida первой генерации после организма в посевах изолята/изолятов по примеру 4 результаты микроскопии были идентичными.

Согласно примеру 4, при культивировании изолята/изолятов возбудителя пастереллеза P. multocida на питательном бульоне (9-19 ч при 37°С и 1 ч 20±1°С) брали пробы культур и готовили препараты с окраской по общепринятым методам (Бурри, Романовского-Гимза, Грама). По каждому препарату исследовали не менее 10 полей зрения микроскопа. В каждом случае исследования бактериальной культуры (при 37°С культивирования) выявляли строго типичной морфологии клетки пастерелл. Это были грамотрицательные, относительно равные по величине маленькие коккобактерии, не имеющие капсулу (при окраске по Бурри) и биполярность (при окраске по Романовскому-Гимза). Однако в приготовленных препаратах из этих же культур через 1 ч при 20±1°С, как правило, выявляли диплококкоподобные бактерии в капсуле. Это обусловлено тем, что экзометаболит P. multocida, обретая при снижении температуры культивирования вязкую консистенцию, остается на поверхности клетки бактерии в виде капсулы. При этом бактериальная клетка успевает поделиться на две дочерние.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали на патогенность. При интраназальном заражении птиц (разных видов и возрастов) на слизистую оболочку носовой и ротоглоточной полостей в дозе 0,5 мл (по 0,25 мл в обе ноздри) чистой бульонной культуры пастерелл первой генерации наблюдали характерные клинические признаки заболевания пастереллезом. Как правило, через 10-36 ч после заражения птицы погибали. При вскрытии трупов устанавливали типичные патологоанатомические изменения острого течения пастереллеза. Гибель белых мышей, зараженных при интраназальном введении культуры в дозе 0,1 мл, отмечали через 16-24 ч.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали на микробный антагонизм. Изолят/изоляты пастереллы из крови сердца на стерильной воде в разведении 10^-3 (согласно примеру 3 и 4) высевали по 0,5 мл на 4,5 мл питательного бульона в пробирках и, не закрывая ватно-марлевыми пробками, оставляли открытыми. Часть посевов сразу помещали в термостат на культивирование при 37°С, а часть оставляли при 15-25°С окружающей среды на 20-24 ч для контаминации микрофлорой воздуха и далее также культивировали. Как правило, в обоих случаях бактериологического исследования получали чистую культуру P. multocida первой генерации после организма, типичной морфологии роста и типичной морфологии микробной клетки, характеризующуюся высокой вирулентности. В контрольном посеве на плотной питательной среде в чашках Петри культура подтверждалась чистотой.

Источники информации

1. Бакулин В.А. Кн.: Болезни птиц. - Санкт-Петербург, 2006. С. 256, 270.

2. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза птиц. - М.: Россельхозиздат, 1979. С. 4-5; 41-44.

3. Буткин Е.И. Пастереллез (холера) птиц. - М.: Колос, 1972. С. 48, 50, 61-66, 92-97.

4. Вет. энциклопедия. - М., 1972. Т. 3. С. 773.

5. Вет. энциклопедия. - М., 1973. Т. 4. С. 836-837.

6. Вет. энциклопедический словарь. - М., 1981. С. 50; 160; 257; 378-379.

7. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин // Сельскохозяйственная биология. - 1987. №12. С. 100-104.

8. Дейчман A.M. Природа происхождения и активизации инфекций // Энвайронментальная эпидемиология. 2011. №5. С. 813.

9. Домарадский И.В. Кн.: Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М.: Медицина, 1971. С. 15-18, 32-33, 41, 46, 230.

10. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по капсульному антигену и патогенности / Каширин В.В. // Сборник научных трудов ВГНКИ ветпрепаратов. - Методы и средства диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней животных. - М. - 1985. - С. 96-99.

11. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по морфологии и вирулентности / Каширин В.В. // Известия Северо-Кавказского научного центра высшей школы. Естественные науки. - Ростов-на-Дону. - 1989. - №3. - С. 109-15.

12. Каширин В.В. Объяснение феномена биполярности бактерий Pasteurella multocida// Доклады Россельхозакадемии. - 1996. - №5. С. 32-35.

13. Каширин В.В. Биологический принцип стандартизации штаммов бактерий возбудителя пастереллеза птиц / Каширин В.В. // «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов». Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. Департамент ветеринарии МСХ РФ, ВГНКИ ветпрепаратов. 14-15 февраля 2001 г. - М. - 2001. - С. 57-58.

14. Каширин В.В. Морфогенез бактерий Pastrurella multocida, патогенных для птиц // Ветеринария. - 2012. №8. С. 26-30.

15. Каширин В.В. Влияние температуры на патогенность Pastrurella multocida - природный механизм пастереллеза // Ветеринария. - 2014. №3. С. 28-32.

16. Каширин В.В. Методология выявления Pasteurella multocida в крови зараженных и погибших птиц // Ветеринарная патология. - 2015. №3. С. 43-49.

17. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц-пастереллоносителей // Ветеринария. - 1971. №2. С. 106-107.

18. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц // Ветеринария. - 1974. №1. С. 59-61.

19. Коркишко В.П. Роль пастереллоносительства в эпизоотологии холеры птиц // Сб. работ СКЗНИВИ. - Новочеркасск, 1968. Вып. 14. С. 35-42.

20. Луницин В.Г. Пастереллоносительство у пантовых оленей, некоторых видов грызунов и птиц в горном Алтае // Научн. тр. НИИ пушного звероводства и кролиководства. - Пантовое оленеводство. - М., 1984. Т. 30. С. 160-168.

21. Панин А.Н., Татаринцев Н.Т. Основные требования к производственным и контрольным штаммам микроорганизмов // Ветеринария. - 1993. №4. С. 28-29.

22. Патент на изобретение №2051970. Способ выявления бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 10 января 1996 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №5049557/13 заявл. 24.06.1992, опубл. 10.01.1996, Бюл. №1.

23. Патент на изобретение №2123531. Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 20 декабря 1998 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №93029701/13 заявл. 15.06.1993, опубл. 20.12.1998, Бюл. №35.

24. Патент на изобретение №2286391. Способ биологический изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 27 октября 2006 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №2004122269/13 заявл. 19.07.2004, опубл. 27.10.2006, Бюл. №30.

25. Писковой Ф.Р., Кравченко З.Н. Сохранность птичьих пастерелл на жидких средах под вазелиновым маслом // Тр. Краснодарской НИВС. Т. 3. - Краснодарское книжное издательство, 1965. С. 219-220.

26. Пустовит Г.Л. Геоклиматические факторы и пастереллез птиц // Птицеводство. 1965. №12. С. 22-24.

27. Селиванов А.В., Кириллов Л.В., Борисович Ю.Ф. Требования к штаммам микроорганизмов для изготовления биопрепаратов // Ветеринария. - 1980. №4. С. 33-35.

28. Сердюк Н.Г., Цимох П.Ф. Роль свободноживущих птиц и грызунов в распространении пастереллеза // Ветеринария. 1970. №6. С. 53-54.

29. Carter G.R., Rigland С.Н. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions // Canad. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1953. Vol. 17. P. 473-479.

30. Carter. G.R. Studies on Pasteurella multocida. 2. Identification of antigenic characteristics and colonial variants // Amer. J. Vet. Res. 1957. Vol. 18. N 66. P. 210-213.

31. Namioka S., Murata M. Serological studies on P. multocida. 2. Characteristics of somatic (O) antigen of the organism // Cornell Vet. 1961. Vol. 51. №4. P. 507-521.

32. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles // C.R. Acad. Sci. 1880. 91. P. 637-680.

33. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults // Avian Diseases. 1990. - Vol. 34. - P. 381-383.

34. Rosenbusch C.T., Merchant I.A. A study of the haemorrhagic septicaemia Pasteurella // J. Bacteriology. 1939. - Vol. 37. - №1. - P. 69-89, 232-234. 16. N 4. P. 925-936.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен способ выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida. Способ включает вскрытие зараженной и павшей от пастереллеза особи птицы или кролика массой тела 350 г, взятие пробы крови из сердца, внесение в стерильную воду при 20±1°С в соотношении 1:9 по объему. Затем осадок встряхивают, переводят во взвесь, центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10^-1 разводят до 10^-2, 10^-3, высевают при 20±1°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20°С. Способ обеспечивает выделение чистой культуры Pasteurella multocida с высокой вирулентностью. 5 пр.

Способ выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida, включающий получение первой генерации микроорганизма на искусственной среде, отличающийся тем, что зараженную естественным путем или интраназально, или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей и павшую от пастереллеза особь, выбранную из птицы или кролика, массой тела 350 г через 3 ч вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду при температуре 20±1°С в соотношении 1:9 по объему, осадок встряхивают и переводят во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10^-1 разводят до 10^-2, 10^-3 и высевают при температуре 20±1°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20°С.