СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ КОНТРОЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ШТАММА БАКТЕРИЙ PASTEURELLA MULTOCIDA Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для стандартизации любого контрольно-производственного штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц (Pasteurella multocida).

В работе с каждым контрольно-производственным штаммом бактерий возбудителя пастереллеза птиц (Pasteurella multocida) не обеспечивается единство и достоверность измерения показателей качества биопрепаратов как основной задачи стандартизации. Проблема заключается в выраженной вариабельности возбудителя пастереллеза, издавна обозначенной - «парадокс вирулентности». Микроорганизм обычно не удается пассировать через восприимчивый организм способом, близким к естественному заражению, и поэтому с целью восстановления (стандартизации) его вынуждены вводить во внутреннюю среду организма способом инъекции (например, внутримышечно) - прототип (Вет. препараты. М., 1981, с.238, 248). Однако такое решение нарушает (изменяет) естественный механизм взаимодействия микро- и макроорганизмов и исключает в нем особую роль условий внешней среды. Микроб изначально лишают проявления важных атрибутов вирулентности - инфективности и инвазивности, а организм птицы - важной роли первичных естественных барьеров и защитных приспособлений. Поскольку естественный путь заражения и влияние условий окружающей среды в пассаже исключены, свойства изолируемого микроорганизма каждый раз выражены недостаточно и по-разному. К тому же выделенный микроорганизм довольно быстро ослабляет вирулентность и одновременно изменяет другие свои свойства, тогда как природные условия быстрого восстановления его в исходное состояние не известны. В результате контрольно-производственные штаммы пастерелл практически получают нестандартные, применение которых не обеспечивает качество и контроль качества биопрепаратов. В частности, по причине несовершенства стандартизации применяемого в работе микроорганизма невозможно достоверно контролировать особо важный показатель качества вакцины - иммуногенность. Очевидно, что существующие научно-технические решения по подготовке контрольно-производственных и других вирулентных штаммов пастерелл к работе не отвечают требованиям стандартизации.

Известно, что утрата или же восстановление вирулентности и, как правило, капсулы, капсульного антигена (К-антигена), а также иммуногенности пастерелл сопровождается диссоциацией их микробной клетки, выявляемой по изменению колоний: S-, М-, R- формы и S^R- или R^S- переходные формы (G.R. Carter, E. Annau, 1953; G.R. Carter, C.H. Rigland, 1953; G.R. Carter, 1957; A.H.Борисенкова, 1979). У клонированных и пассированных через восприимчивый организм капсулообразующих штаммов пастерелл в S-форме вирулентность, агглютинабельность К-антигена и иммуногенность прямо зависимы (В.В.Каширин, 1995). Однако условия диссоциации пастерелл, особенно по части восстановления биологических свойств пастерелл, почти не изучены.

В предыдущих наших работах показана функциональная термолабильность пастерелл с объяснением изменчивости по морфологии (Патент РФ №2051970 от 10.01.1996. Бюл. №1. Ж. «Доклады Россельхозакадемии». 1996. №5. С.32-35) и вирулентности (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998. Бюл. №35), показаны условия восстановления и биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования (Патент РФ №2286391 от 27.10.2006. Бюл. №30) и условия заражения птиц возбудителем пастереллеза в эксперименте для постановки биологической пробы близко к природному заражению (Патент РФ №2286390 от 27.10.2006. Бюл. №30).

На основе экспериментального метода исследований установлено, пастереллы - функционально термолабильные бактерии, взаимосвязанная инфекционная природа которых в капсульном и бескапсульном вариантах микробной клетки зависит от температуры окружающей среды. С момента смерти естественно зараженной птицы, при постепенном остывании ее трупа обнаружено синхронное формирование капсулы, биполярности и усиление вирулентности пастерелл, что может быть положено в основу стандартизации любого штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц в пассаже через восприимчивый организм способом, близким к естественному заражению. Поскольку микроб в биологическом цикле своего развития от ярко выраженного аэроба без капсулы при септицемии адаптируется до факультативного анаэроба в выраженной капсуле в трупе птицы, обособление микробных клеток попарно («биполярно») в выраженную капсулу к определенному моменту снижения температуры тела можно учитывать как показатель своевременной изоляции восстановленного штамма бактерий в пассаже. С учетом этого показателя воспроизводить микроорганизм восстановленным можно при определенном стандарте условий пассажа его через восприимчивый организм. Это зависит от пути и способа заражения восприимчивого организма, температуры окружающей среды, массы тела зараженного, время вскрытия трупа после смерти, а также от органа или же, точнее, от глубины точки изоляции функционально термолабильного микроба из почти остывшего трупа. Микроорганизм, изолированный раньше положенного срока, недостаточно восстановлен, а позже (через 30 минут после восстановления) - постепенно утрачивает капсулу и одновременно ослабляет вирулентность с последующим развитием полиморфизма и сапрофитизации. Между тем восстановленный микроорганизм можно сохранять несколько суток в собственной капсуле к моменту использования без изменений, если же сразу его изолировать от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха в условия анабиоза при постоянной оптимальной температуре окружающей среды, например в физиологический раствор 20°С, запаяв в приготовленную из пастеровской пипетки ампулу. Поскольку такое решение способствует исключать из изолята пастерелл авирулентные доклеточные формы, численно доминирующие над вирулентной капсулированной микробной клеткой и конкурентные в отношении к питательному субстрату, но не резистентные в условиях анабиоза, бактерии из ампулы можно использовать через двое или трое суток изоляции. Вскрыв ампулу, можно выполнить посев биологически полноценных пастерелл в жидкую питательную среду методом 10-кратных разведений с последующим культивированием и инкапсуляцией бактерий. Это даст возможность получать бульонную культуру капсулированных бактерий первой генерации после организма птицы с определенным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной к моменту использования.

Исходя из выше изложенного реально решить исторически важную задачу, издавна рассматриваемую как особо сложную и ключевую по проблеме пастереллеза птиц и в целом - пастереллезов.

Задачей изобретения является совершенствование стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий Pasteurella multocida путем выявления условий и последовательности восстановления микроорганизма к работе с позиции повторения естественного механизма взаимодействия микро- и макроорганизмов и особой роли в нем условий внешней среды.

Поставленная задача достигается тем, что контрольно-производственный штамм пастерелл в S- или М-форме клонируют и при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды последовательно пассируют путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм массой тела около 350 г. Из крови сердца через 3 ч после смерти каждого зараженного микроорганизм соответственно изолируют в физиологический раствор и по 0,5-1,0 мл запаивают в приготовленные из пастеровских пипеток ампулы. Изолированный при внутримышечном пассаже штамм пастерелл используют на протяжении 15-20 суток как вспомогательный для проведения (повторения) пассажа интраназально. В свою очередь изолированный при интраназальном пассаже штамм пастерелл применяют через 2-3 суток изоляции в течение последующих 3 суток как восстановленный для получения 10-часовой (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) бульонной культуры капсулированных пастерелл первой генерации после организма с определенным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной к моменту использования.

Существенным отличием является то, что контрольно-производственный штамм бактерий Pasteurella multocida стандартизируют на основе функциональной термолабильности микробной клетки путем последовательного восстановления с позиции повторения естественного механизма взаимодействия микро- и макроорганизмов и особой роли в нем условий внешней среды. Микроорганизм клонируют и при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды последовательно пассируют путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм массой тела около 350 г. Из крови сердца через 3 ч после смерти каждого зараженного микроорганизм соответственно изолируют от питального субстрата и атмосферного воздуха в физиологический раствор, запаивая по 0,5-1,0 мл в приготовленные из пастеровских пипеток ампулы. Изолированный при внутримышечном пассаже штамм пастерелл используют на протяжении 15-20 суток как вспомогательный для проведения (повторения) пассажа интраназально. В свою очередь изолированный при интраназальном пассаже штамм пастерелл применяют через 2-3 суток изоляции в течение последующих 3 суток как восстановленный для получения 10-часовой (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) бульонной культуры капсулированных пастерелл первой генерации после организма с определенным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной к моменту использования.

В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта условий подготовки и применения микроорганизма.

Сведения и примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Изучали типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida А:1 серовара, наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотии). В исследованиях применяли контрольно-производственные штаммы бактерий Pasteurella multocida коллекции ВГНКИ (в частности, №712 или же №55, №115, №915, №1931, а также какой-либо другой по источнику происхождения от птиц), голубей массой тела около 350 г, взрослых уток и кур массой тела около 2 кг. Препараты для световой микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму. В отдельных случаях результаты световой микроскопии подтверждали на уровне электронной микроскопии, выполняя исследования по общепринятой методике. Штаммы пастерелл культивировали на плотной питательной среде (питательный агар, ТУ 9398-020-78095326-2006) и в жидкой питательной среде (питательный бульон, ТУ 9398-021-78095326-2006). Вирулентность оценивали по абсолютной летальной дозе (ЛД₁₀₀), а при возможности и по 50%-летальной дозе (ЛД₅₀ по Риду и Менчу или по Керберу).

Стандартизация контрольно-производственного штамма пастерелл последовательно включала клонирование микроорганизма после хранения, восстановление и биологическую изоляцию микроорганизма при внутримышечном заражении голубя с оценкой по показателям морфологии и вирулентности, а затем восстановление и биологическую изоляцию микроорганизма при интраназальном заражении голубя с оценкой по показателям морфологии и вирулентности. Микроорганизм восстанавливали по установленному стандарту условий, каждый раз сохраняя в собственной капсуле в анабиозе, без доступа атмосферного воздуха и питательного субстрата, при постоянной оптимальной температуре окружающей среды к моменту использования.

В разные годы с целью контроля качества изготовленных серий живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» Краснодарской НИВС (сухой) на иммуногенность для кур и уток обычно стандартизировали и применяли контрольный штамм пастерелл ВГНКИ №712.

Пример 1.

Клонирование микроорганизма после хранения.

Контрольно-производственный штамм пастерелл дробно высевали на плотную питательную среду и культивировали при 37°С 18-20 ч. Не менее 10 характерно растущих колоний пастерелл в S-форме, а при отсутствии таких - в М-форме, отвивали бактериологической петлей и соответственно засевали в жидкую питательную среду. Посевы культивировали при 37°С 10-12 ч. Выросшие культуры бактерий визуально оценивали на типичность роста для пастерелл и с 37°С переносили в 20°С на 1 ч для инкапсуляции микробной клетки. Одну из приготовленных культур бактерий с типичным ростом для пастерелл применяли для пассажа через восприимчивый организм.

Пример 2.

Восстановление и биологическая изоляция микроорганизма при внутримышечном заражении голубя.

Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды с целью возможного восстановления, биологической изоляции и оценки контрольно-производственного штамма пастерелл. Микроорганизм восстанавливали в пассаже на голубе массой тела около 350 г. Учитывая, что у голубя инфекционный процесс при пастереллезе непродолжительный, птицу заражали за 9-10 ч до начала рабочего дня. Культуру клонированного микроорганизма, по примеру 1, в произвольно взятой дозе (0,1-0,3 мл) вводили голубю внутримышечно. При септицемии, лучше в период терминальных состояний зараженного, перед тем как быть с момента смерти снижению температуры тела, готовили из крови вены крыла препараты для световой микроскопии в качестве контрольных. Препараты готовили с окраской по методам Гинса, Романовского-Гимза, Грама. Затем отмечали точное время гибели птицы и через 3 часа после смерти вскрывали остывший труп, брали пробу крови из сердца и также готовили препараты для световой микроскопии. Одновременно бактерии изолировали от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха в условия анабиоза. Для этого 0,2 мл (4 капли) той же пробы крови вносили в 1,8 мл физиологического раствора, встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считали изолятом пастерелл из крови в разведении 10^-1. Чтобы более полно изолировать микроорганизм от питательного субстрата брали 0,5 мл этой надосадочной жидкости и на физиологическом растворе в рабочем объеме 5 см^-3 готовили последующие разведения 10^-2 и 10^-3. Пастереллы в разведениях 10^-2 и 10^-3 высевали по 0,5 мл в жидкую и на плотную питательные среду для оценки культуральных свойств по общепринятым методам. Одновременно пастереллы в разведениях 10^-2 и 10^-3 изолировали по 0,5-1,0 мл в приготовленные из пастеровских пипеток ампулы. С этой целью пастеровские пипетки, предварительно оплавленные по форме ампул с истонченными промежутками или концами в виде капилляров, заполняли по объему, насасывая резиновой грушей, герметично запаивали концы над пламенем огня, дополнительно парафинируя конец последней пайки, и сохраняли в горизонтальном положении не более 20 суток для последующего применения.

Оценка микроорганизма по морфологии микробной клетки.

В препаратах, приготовленных из крови сердца трупа птицы, выявляли по методу Гинса - разные по величине капсулированные бактерии, по методу Романовского-Гимза - разные по величине парно расположенные бактерии или же так называемые «биполярные палочки» («биполяры»), по методу Грама - отрицательно окрашенные бактерии. В контрольных препаратах, приготовленных из крови вены при септицемии в период терминальных состояний, при тех же методах окраски обнаруживали разные по величине бескапсульные и изредка слабо капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.

Изолированные в физиологическом растворе пастереллы из крови сердца трупа птицы при необходимости выявляли микроскопией препаратов, приготовленных с окраской по тем же методам. Пастереллы, вследствие нарушения в жидкой фазе парного («биполярного») расположения, опознавали в виде разных по величине бескапсульных и слабо капсулированных, грамотрицательных коккобактерий.

Микроскопией препаратов, приготовленных из 9- и 20-часовых бульонных культур пастерелл перед снятием с культивирования при 37°С, обнаруживали изредка слабо капсулированные и в основном без капсулы кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии. В препаратах, приготовленных из этих же культур пастерелл через 1 час после изменения температуры культивирования с 37 на 20°С, выявляли в основном слабо капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.

Оценка микроорганизма по морфологии роста культуры.

В жидкой питательной среде, в посевах пастерелл, изолированных из крови сердца на физиологическом растворе в разведениях 10^-2 и выше в рабочем объеме 5 см³, отмечали весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий при 37°С. По росту 9-часовой культуры пастерелл отмечали предельный титр изолированных пастерелл на физиологическом растворе обычно по разведение 10^-4, 10^-5 или 10^-6 и соответственно в результате перерасчета условно полагали как минимум о 20 тыс., 200 тыс. и 2 млн. микробных клеток в 1 мл крови сердца трупа на момент изоляции пастерелл.

На плотной питательной среде в посевах тех же изолированных из крови сердца пастерелл отмечали весьма нежный, чуть с голубизной в косо проходящем свете сплошной рост культуры бактерий и нежные, прозрачные, круглые, с ровными краями, размером 0,5-1,5 мм отдельно растущие колонии бактерий S-формы.

Оценка микроорганизма по вирулентности.

Вирулентность микроорганизма оценивали на курах или утках в зависимости от пути (способа) заражения с определением ЛД₁₀₀. По существующей методике этот показатель определяли путем подтитровки 20-часовой бульонной культуры микроорганизма при внутримышечном заражении птиц. Чаще устанавливали, что ЛД₁₀₀ микроорганизма для птиц не соответствует данным по паспорту. В частности, ЛД₁₀₀ контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №712 определяли 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10^-4, 10^-5, 10^-6 или 10^-7. Последнее значение ЛД₁₀₀ микроорганизма соответствует данным по паспорту. Препятствием в оценке вирулентности микроорганизма были и принципиально противоположные результаты в биологической пробе, так как нередко были случаи выживаемости птиц, зараженных в дозе 0,5 мл бульонной культуры в низком разведении и при этом гибель таких же птиц, зараженных в дозе 0,5 мл бульонной культуры в более высоком разведении. В биологической пробе, приближенной к естественному заражению - интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей, ЛД₁₀₀ этого микроорганизма для таких же птиц определяли 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10^-1, 10^-2 или 10^-3.

Пример 3.

Восстановление и биологическая изоляция микроорганизма при интраназальном заражении голубя.

Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды с целью полного восстановления, биологической изоляции и оценки контрольно-производственного штамма пастерелл. Микроорганизм, изолированный согласно примеру 2, не ранее чем через 72 часа изоляции повторно восстанавливали в пассаже на голубе массой тела около 350 г. Учитывая, что у голубя инфекционный процесс при пастереллезе непродолжительный, птицу заражали за 9-10 ч до начала рабочего дня. Для этого микробную клетку, осевшую по внутренней поверхности запаянной пастеровской пипетки (ампулы), переводили во взвесь путем вращения ампулы между ладонями рук. Затем удостоверялись в герметичности укупорки ампулы, обломив конец ее первой пайки, опустив, при этом, другой (парафинированный) в стерильную пробирку Флоринского. Если содержимое ампулы не истекало, то изолированные пастереллы считали хранившимися без доступа атмосферного воздуха (в условиях анаэробиоза). Перевернув ампулу, направив ее вскрытый конец в эту же пробирку, содержимое извлекали, оно истекало, если нарушали целостность запаянного противоположного (парафинированного), обломив его. Затем изолированные пастереллы в объеме 0,5 см³ разведения 10^-2 высевали в 4,5 мл жидкой питательной среды, культивировали при 37°С 9 ч. Выращенную 9-часовую культуру бактерий первой генерации после организма птицы, отличающуюся особо нежным бирюзовым оттенком, переносили с 37 в 20°С на 1 ч для инкапсуляции микробной клетки. Культуру капсулированных бактерий в произвольно взятой дозе (0,1-0,3 мл) вводили голубю интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Всю последующую работу выполняли согласно описанию примера 2. Восстановленный микроорганизм, изолированный от питательного субстрата и атмосферного воздуха на физиологическом растворе в собственной капсуле, запаянный в приготовленную из пастеровской пипетки ампулу, через 2-3 суток хранения при постоянной оптимальной температуре окружающей среды (20°С) считали стандартизированным и в течение 3 суток применяли в целях работы, контролируя титр микробной клетки. Для этого готовили ряд 10-кратных разведении изолированных пастерелл на физиологическом растворе в рабочем объеме 5 см³ и параллельно высевали в жидкую питательную среду. Из полученного ряда 10-часовых (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) бульонных культур капсулированных бактерий первой генерации после организма птицы брали для работы конкретную культуру с известным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной.

Оценка микроорганизма по морфологии микробной клетки.

В препаратах, приготовленных из крови сердца трупа птицы, выявляли по методу Гинса - одинаковые выражено капсулированные бактерии, по методу Романовского-Гимза - одинаковые, парно расположенные бактерии или же равномерно сформированные так называемые «биполярные палочки» («биполяры»), по методу Грама - отрицательно окрашенные бактерии. В контрольных препаратах, приготовленных из крови вены при септицемии в период терминальных состояний, то есть перед тем как быть снижению температуры тела с момента смерти зараженного, обнаруживали бескапсульные, очень маленькие по величине, коккоподобные, грамотрицательные бактерии.

Изолированные в физиологическом растворе пастереллы из крови сердца трупа птицы при необходимости выявляли микроскопией препаратов, приготовленных с окраской по тем же методам. Пастереллы, вследствие нарушения в жидкой фазе парного («биполярного») расположения, опознавали только в виде одинаковых по величине, капсулированных, грамотрицательных коккобактерий.

Микроскопией препаратов, приготовленных из 9- и 20-часовых бульонных культур пастерелл перед снятием с культивирования при 37°С, обнаруживали изредка слабо капсулированные и в основном без капсулы кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии. В препаратах, приготовленных из этих же культур пастерелл через 1 час после изменения температуры культивирования с 37 на 20°С, выявляли одинаковые, в основном выражено капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.

Оценка микроорганизма по морфологии роста культуры.

В жидкой питательной среде, в посевах пастерелл, изолированных из крови сердца на физиологическом растворе в разведениях 10^-2 и выше в рабочем объеме 5 см³, отмечали весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий при 37°С. По росту 9-часовой культуры пастерелл отмечали предельный титр изолированных пастерелл на физиологическом растворе обычно по разведение 10^-7 (изредка - 10^-8) и соответственно в результате перерасчета условно полагали как минимум о 20 (изредка о 200) млн. микробных клеток в 1 мл крови сердца трупа на момент изоляции пастерелл. В результате посева изолированных пастерелл в объеме 0,5 см³ разведения 10^-2 в 4,5 мл жидкой питательной среды и культивирования (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) в 1 мл устанавливали около 1 млрд. жизнеспособных микробных клеток, что обычно являлось предельным накоплением микроорганизма в данной среде в рабочем объеме 5 см³. Следует отметить, что в бульонной культуре пастерелл, представляющей собой первую генерацию микробных клеток после организма птицы, под вазелиновым маслом столбиком примерно в 1 см при температуре 15-25°С никогда при длительном хранении не формировался хорошо известный слизистый осадок. После постепенного просветления среды с выпадением пастерелл в осадок в виде пуговки до 3 мм на дне пробирки, любое встряхивание с переводом бактерий во взвесь или же резкий перепад температуры на 5 и более°С окружающей среды влекло их последующую генерацию в среде как факультативных анаэробов и ослабление исходных свойств. С последующим пересевом, культивированием при 37°С и затем хранением полученной бульонной культуры пастерелл при 20°С окружающей среды отмечали изменение исходных культуральных свойств - оседание микробных клеток с формированием слизистого осадка, хорошо известного тем, что при встряхивании поднимается в виде «косички» как важный признак при идентификации этих бактерий.

На плотной питательной среде в посевах тех же изолированных из крови сердца пастерелл отмечали весьма нежный, чуть с голубизной в косо проходящем свете сплошной рост культуры бактерий и нежные, прозрачные, круглые, с ровными краями, размером 0,5-1,5 мм отдельно растущие колонии бактерий S-формы.

Оценка микроорганизма по вирулентности. Количество пастерелл в крови сердца трупа птицы считали косвенным показателем вирулентности изолированного контрольно-производственного штамма пастерелл. Если при культивировании в жидкой питательной среде 10-кратных разведении изолированных пастерелл устанавливали характерный рост по разведение 10^-7, что в перерасчете на исходную концентрацию в 1 мл крови есть как минимум около 20 млн. микробных клеток, штамм бактерий условно считали восстановленным. В биологической пробе вирулентность микроорганизма, в частности контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №712, оценивали на курах или утках в зависимости от пути (способа) заражения с определением ЛД₁₀₀ и, при возможности, ЛД₅₀. С целью точного определения вирулентности микроорганизма применяли из ряда полученных 10-часовых бульонных культур капсулированных пастерелл (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) конкретно обозначенную культуру бактерий. Эту культуру бактерий определяли по титру в посеве изолированной микробной клетки из организма птицы, например 0,5 мл разведения 10^-2 (100 тыс. м.к.) посеянных в 4,5 мл жидкой питательной среды, и применяли в качестве стандартной. В данном случае ЛД₁₀₀ контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №712 для кур или уток при внутримышечном заражении обычно устанавливали 0,5 мл этой бульонной культуры в разведении 10^-7 (около 50 м.к.), что соответствовало данным по паспорту. В биологической пробе, приближенной к естественному заражению птиц - интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды, ЛД₁₀₀ этого штамма пастерелл для кур или уток устанавливали 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10^-2, что соответствовало около 5 млн. микробных клеток. При этом ЛД₅₀ микроорганизма устанавливали 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10^-3 или изредка - 10^-4, что в перерасчете около 500 и 50 тыс. микробных клеток.

Пример 4

Применение стандартизированного микроорганизма.

Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды. В разные годы с целью контроля качества изготовленных серий живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» Краснодарской НИВС (сухой) на иммуногенность для кур и уток применяли стандартизированный контрольный штамм пастерелл ВГНКИ №712. Микроорганизм восстанавливали согласно описанию примеров 1, 2, 3 и апробировали в качестве 10-часовой бульонной культуры капсулированных бактерий первой генерации после организма птицы с известным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной. Способом, близким к природному заражению птиц - на слизистую носовой и ротоглоточной полостей, подтитровывали ЛД₅₀ стандартизированной культуры бактерий. В этой дозе и тем же способом заражения птиц одновременно подтверждали качество подготовки микроорганизма и иммуногенность вакцины. Оценку вели по специфической устойчивости вакцинированных и восприимчивости не вакцинированных птиц к пастереллезу в остром опыте. С этой целью 10 двукратно вакцинированных птиц (с интервалом 7 суток, через 10 суток после последней прививки вакцины) и 10 не вакцинированных (контрольные) одновременно заражали ЛД₁₀₀ стандартизированной культуры бактерий в объеме 0,5 см³ интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - по 0,25 см³ в оба носовых отверстия. Зараженную птицу содержали по группам изолировано и вели наблюдение. При этом учитывали клинические признаки заболевания птиц, ежесуточно регистрировали количество павших птиц в группе вакцинированных и в группе невакцинированных (контрольных) соответственно. Гибель птиц от пастереллеза подтверждали по результатам патологоанатомических и бактериологических исследований. Контрольный штамм пастерелл оценивали методически правильно стандартизированным, а живую вакцину изготовленной серии - иммуногенной, если в течение 7 суток с момента введения смертельной дозы культуры стандартизированного контрольного штамма пастерелл в капсульном варианте микробной клетки выживало не менее 8 (80%) специфически устойчивых вакцинированных и при этом гибло не менее 8 (80%) восприимчивых невакцинированных (контрольных) птиц. В разное время изготовленные пять серий живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» соответственно все при применении контрольного штамма пастерелл, стандартизированного по предлагаемому способу, прошли биологический контроль качества на иммуногенность: две - на курах и три - на утках.

Вышеизложенные результаты исследований в приведенных примерах, подтверждающих возможность осуществления изобретения, многократно воспроизведены. Выявленные условия и последовательность восстановления контрольно-производственного штамма пастерелл с оценкой по установленным показателям морфологии и вирулентности определяют возможность стандартизировать микроорганизм. В силу функциональной термолабильности пастерелл определяющим отличительным признаком технического решения одновременно являются как путь (место) введения вирулентного микроорганизма, так и допустимая оптимальная температура окружающей среды, в основном - вдыхаемого воздуха и употребляемой питьевой воды птицей. Предлагаемый для практического применения способ можно применять в разных целях, в том числе и в случае необходимости подготовить микроорганизм к лиофилизации. Поскольку составляющая лиофилизации - заморозка - значительно влияет на инвазивность пастерелл в силу их функциональной термолабильности, предлагаемый способ предназначен также и для восстановления микроорганизма из этого состояния в целях последующей работы. Изобретение содержит существенные отличия научно-практического значения и может быть использовано в микробиологии, эпизоотологии, биотехнологии и в условиях современной биологической промышленности.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИ

1. Ананьева Н.В., Ганина В.И., Ленченко Е.М., Ванина Н.Н. Оценка методов исследования взаимодействия бактерий с клетками животных // Доклады Россельхозакадемии. - 2007. - №3. С.53-55.

2. Бакулов И.А., Зеленцова Т.Я. Проблема Л-форм бактерий в ветеринарии // Ветеринария. - 1980. - №10. С.23-27.

3. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза птиц. - М.: Россельхозиздат, 1979. С.4, 5.

4. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Справочник: Вет. препараты / Под редакцией доктора биологических наук Д.Ф.Осидзе. - М.: Колос, 1981 // Пастереллезы. С.236-251.

5. Буткин Е.И. Пастереллез (холера) птиц. - М.: Колос, 1972. С.48, 58, 62, 63.

6. Вет. энциклопедический словарь. - М., 1981. С.490.

7. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин // Сельскохозяйственная биология. - 1987. - №12. С.100-104.

8. Домарадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М.: Медицина, 1971. С.46.

9. Каширин В.В. Иммуногенные свойства штаммов Pasteurella multocida // Ветеринария. - 1995. - №10. С.25-28.

10. Каширин В.В. Объяснение феномена биполярности бактерий Pasteurella multocida // Доклады Россельхозакадемии. - 1996. - №5. С.32-35.

11. Кожевников Е.М. Локализация Р. multocida в организме птиц-пастереллоносителей // Ветеринария. - 1971. - №2. С.106-107.

12. Кожевников Е.М. О формировании пастереллоносительства у птиц // Ветеринария. - 1973. - №8. С.45-46.

13. Куликовский А.В., Павлова И.Б. Изменение адгезивной способности микроорганизмов // Ветеринария. - 1993. - №7. С.22-24.

14. Масюков А.В., Глебова И.Я. Доклеточные формы некоторых видов микроорганизмов // «Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных». - Научные тр. Краснодарской НИВС. Т.4. - Краснодарское книжное издательство, 1971. С.24-32.

15. Масюков А.В., Глебова И.Я. Иммуногенность доклеточных форм птичьих пастерелл // «Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных». - Научные тр. Краснодарской НИВС. Т.4. - Краснодарское книжное издательство, 1971. С.33-40.

16. Масюков А.В. Направленная изменчивость патогенных микроорганизмов с целью получения вакцинных штаммов // Тр. Краснодарской НИВС. Т.3. - Краснодарское книжное издательство, 1965. С.179-187.

17. Наставление по применению вакцин против пастереллеза водоплавающих птиц из штаммов АВ и К Краснодарской НИВС, сухих.

- В последней редакции утверждено от 22.07.1996 г. зам. начальника Департамента ветеринарии МСХ РФ В.В.Селиверстовым.

18. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Кононенко А.Б. Влияние температурного фактора на популяционную изменчивость иерсиний // Ветеринария. - 2004. - №5. С.41-44.

19. Панин А.Н., Татаринцев Н.Т. Основные требования к производственным и контрольным штаммам микроорганизмов // Ветеринария. - 1993. - №4. С.28-29.

20. Патент на изобретение №2050161 «Способ вакцинации утят против пастереллеза» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1995. - Бюл. №35.

21. Патент на изобретение №2051970 «Способ выявления бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1996. - Бюл. №1.

22. Патент на изобретение №2123531 «Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1998. - Бюл. №35.

23. Патент на изобретение №2286391 «Способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2006. - Бюл. №30.

24. Патент на изобретение №2286390 «Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биологической пробы» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2006. - Бюл. №30.

25. Патент на изобретение №2310472 «Способ профилактики пастереллеза птиц живой вакциной» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2007. - Бюл. №32.

26. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий. - Л.: Медицина, 1967. С.11-40.

27. Пустовит Г.Л. Геоклиматические факторы и пастереллез птиц // Птицеводство. - 1965. - №12. С.22-24.

28. Селиванов А.В., Кириллов Л.В., Борисович Ю.Ф. Требования к штаммам микроорганизмов для изготовления биопрепаратов // Ветеринария. - 1980. - №4. С.33-35.

29. Сидоров М.А., Тарасенюк Н.И., Соколова Н.А. Вариабельность вирулентности бактерий // Ветеринария. - 1975. - №1. С.40-41.

30. Технические условия ТУ 10.19.76-89 на вакцины против пастереллеза водоплавающих птиц из штаммов Pasteurella multocida AB и К Краснодарской НИВС, сухие. - В последней редакции утверждены 19.04.1989 г.

31. Carter G.R., Annau E. Isolation of capsular polysaccharides from colonial variants of Pasteurella multocida // Amer. J. Vet. Res. 1953. Vol.14. P.475-478.

32. Carter G.R., Rigland C.H. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions // Canad. J. Соmp. Med. Vet. Sci. 1953. Vol.17. P.473-479.

33. Carter G.R. Studies on Pasteurella multocida. 2.Identification of antigenic characteristics and colonial variants // Amer. J. Vet. Res. 1957. Vol.18. N 66. P.210-213.

34. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults // Avian Diseases. 1990. Vol.34. P.381-383.

35. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles // C.R. Acad. Sci. 1880. 91. P.637-680.

36. Singer N., Malkinson M. An avirulent live Pasteurella multocida vaccine for drinking water and aerosol administration against turkey cholera // Avian Path. 1979. Vol.8. N 4. P.391-399.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц (Pasteurella multocida). Представленный способ включает клонирование штамма пастерелл в S- или М-форме, последовательное пассирование путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм массой тела около 350 г, далее из крови сердца через 3 ч после смерти каждого зараженного микроорганизм соответственно изолируют в физиологический раствор и по 0,5-1,0 мл запаивают в пастеровские пипетки, при этом изолированный при внутримышечном пассаже штамм пастерелл используют на протяжении 15-20 суток, как вспомогательный для проведения пассажа интраназально, а изолированный при интраназальном пассаже штамм пастерелл применяют через 2-3 суток изоляции в течение последующих 3 суток, как восстановленный, для получения 10-часовой (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) бульонной культуры капсулированных пастерелл. Представленное изобретение позволяет получать культуру капсулированных пастерелл первой генерации после организма с определенным титром микробной клетки с последующей возможностью использования таких клеток в производстве биопрепаратов. 15 ил., 4 пр.

Способ стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий Pasteurella multocida, включающий условия и алгоритм восстановления микроорганизма к работе, отличающийся тем, что штамм пастерелл в S- или М-форме клонируют и при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды последовательно пассируют путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм массой тела около 350 г, из крови сердца каждого через 3 ч после смерти соответственно изолируют в физиологический раствор, по 0,5-1,0 мл запаивают в пастеровские пипетки и по «внутримышечному пассажу» используют на протяжении 15-20 суток как вспомогательный для проведения (повторения) пассажа интраназально, а по «интраназальному пассажу» применяют через 2-3 суток изоляции в течение последующих 3 суток как восстановленный для получения 10-часовой (9 ч при 37 и 1 ч при 20°С) бульонной культуры капсулированных пастерелл первой генерации после организма с определенным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной к моменту использования.