Способ диагностики колоректального рака Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/74 G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для верификации колоректального рака (КРР), в том числе у пациентов с дивертикулярной болезнью толстой кишки (ДБТК).

КРР - это злокачественное новообразование, которое развивается из эпителия толстой кишки, включая ободочную кишку, ректосигмоидное соединение, прямую кишку и анус. Статистические данные свидетельствуют о том, что в развитых странах мира отмечается неуклонный рост впервые выявленных случаев КРР по сравнению со злокачественными опухолями любой другой локализации. При этом одним из основных факторов развития КРР является ДБТК (Viscido A. et al. Association of Colonic Diverticula with Colorectal Adenomas and Cancer. Medicina. Kaunas, Lithuania, 2021, v. 57, №2, p. 4-6). Почти в 90% случаев КРР представляет собой аденокарциному - злокачественную опухоль, которая развивается из железистых эпителиальных клеток ободочной и прямой кишки. При этом КРР в 20% от общего количества колоректальных опухолей развивается в сигмовидном отделе толстого кишечника, в том числе ее наиболее подвижной части - средней трети (Федянин М.Ю. и др. Практические рекомендации по лекарственному лечению рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения. «Злокачественные опухоли: Практические рекомендации RUSSCO». 2020, #3s2, т. 10, с. 350-391). Дивертикулы в 90% случаев развиваются там же (Ивашкин В.Т. и др. Рекомендации Российской гастроэнтерологической ассоциации и Ассоциации колопроктологов России по диагностике и лечению взрослых больных дивертикулярной болезнью ободочной кишки. «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии». 2016, №1, с. 66).

Известен целый ряд инвазивных способов диагностики КРР. Традиционно диагностика КРР осуществляется на основе рентгенологического и эндоскопического исследований. Наиболее часто применяемым скрининговым методом выявления КРР является колоноскопия, все пациенты с положительным результатом других скрининговых исследований в последующем направляются на колоноскопию (Пузанов Д.П. и др. Скрининг колоректального рака. Обзор существующих методов и рекомендаций. «Инновационная медицина Кубани». 2018, т. 9, №1, с. 58-64). Тотальная колоноскопия с биопсией - наиболее информативный метод исследования при КРР, позволяющий непосредственно визуализировать опухоль, определить ее размеры, локализацию и макроскопический тип, оценить угрозу осложнений (кровотечение, перфорация), а также получить материал для морфологического исследования (Федянин М.Ю. и др. Практические рекомендации по лекарственному лечению рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения. «Злокачественные опухоли: Практические рекомендации RUSSCO». 2021, #3s2, т. 11, с. 330-372).

Исследовать всю толстую кишку позволяет ирригоскопия с двойным контрастированием (ИДК), но ее чувствительность и специфичность ниже диагностических показателей, получаемых при проведении колоноскопии. Кроме того, ИДК дает больше ложно-положительных результатов (Winawer S.J. et al. A comparison of colonoscopy and double - contrast barium enema for surveillance after polypectomy. National Polyp Study Work Group. «The New England Journal of Medicine». 2000, v. 342, p. 1766-1772). При ИДК возникают диагностические проблемы, если у пациента имеется недиагностированный или субклинически протекающий дивертикулит, который опасен при использовании контрастной нагрузки, при болях, сопровождающих исследование, так как повышается риск ятрогенной перфорации, кровотечения и развития свободной перфорации при наличии прикрытой дивертикулы. Отмечается также большой процент побочных реакций при применении рентгенконтрастных препаратов (Поляев Ю.А., Шимановский Н.Л. Безопасность современных йодированных контрастных средств. «Вестник рентгенологии и радиологии». 2010, №4, с. 48-56.).

Создать объемную реконструкцию просвета толстой кишки позволяет послойное спиральное компьютерно-томографическое сканирование брюшной полости и таза с последующей цифровой обработкой и анализом изображений («виртуальная колоноскопия»). Серьезным препятствием использования этого метода для раннего определения КРР является то, что полипы с размерами 6-9 мм и плоские образования в кишке могут быть пропущены (Kim D.H. et al. СТ colonography versus colonoscopy for the detection of advanced neoplasia. «The New England Journal of Medicine». 2007, v. 357, p. 1403-1412). Существенным недостатком является и то, что для его повторного проведения пациента необходимо подвергнуть повторному воздействию ионизирующего излучения.

Все вышеописанные инвазивные способы не подходят для ранней диагностики КРР, так как ни одно из них не может охватить полной картины развития и распространения КРР. При использовании этих способов возникают указанные выше диагностические проблемы и имеет место значительное количество побочных эффектов. Поэтому при диагностике КРР использование эндоскопии и контрастирования ограничено, особенно у пациентов с ДБТК.

Известны неинвазивные способы диагностики КРР, например, способ неинвазивной диагностики КРР, основанный на анализе целостности ДНК из стула пациента методом ПЦР-анализа (RU 2586775 С1, 2016). При этом анализируют два фрагмента ДНК в дуплексном режиме и при обнаружении хотя бы одного из них в продуктах ПЦР делают вывод о наличии КРР у пациента. Однако из-за неполноты конверсии способ может давать ошибочные результаты. Он сложен, имеет высокую себестоимость, анализ занимает продолжительное время, при положительном ответе рекомендуется пройти колоноскопию. Поэтому такой способ малоэффективен.

Для диагностики КРР используют также способ, основанный на анализе молекулярных онкомаркеров белковой природы, хотя клиническая ценность такого метода неочевидна (Rodriguez-Casanova A. et al. Epigenetic Landscape of Liquid Biopsy in Colorectal Cancer. ((Frontiers in Cell and Developmental Biology». 2021, 9:622459). При этом для оценки концентрации в плазме молекулярных онкомаркеров (РЭА, СА19.9, СА 242, СК17, СК18 и др.) используются технологии иммуноферментного или иммунохимического анализа. Недостатком этого способа в рамках диагностики КРР является низкая диагностическая специфичность.

Из известных способов наиболее близким к предложенному является способ диагностики КРР, включающий забор биоптата из слизистой оболочки толстой кишки пациента и проведение его иммуноморфологического анализа, по результатам которого судят о развитии у пациента КРР (Чиж А.А. и др. Показатели нейрогормонов в прогнозировании течения колоректального рака. «Фундаментальные исследования». 2007, №7, с. 60-62). В этом способе определяют количество D₁-клеток в слизистой оболочке толстой кишки. При анализе морфометрических данных различных апудоцитов по типам секретируемых гормонов авторами установлено, что распространение КРР происходит на фоне снижения содержания в слизистой оболочке толстого кишечника D₁-клеток, продуцирующих ВИП. Местное распространение КРР происходит на фоне гипоплазии всех эндокринных клеток, независимо от их функциональной специализации. В популяции энтерохромаффинных клеток уменьшается количество мелатонин- и серотонинпродуцирующих апудоцитов, снижается количество D₁-клеток, продуцируемых ВИП. Поэтому при снижении количества D₁-клеток в слизистой оболочке толстой кишки у пациента диагностируют КРР. Однако этот способ малоинформативен. Получаемое количество клеток не позволяет сделать вывод о количестве вещества, т.е. этот способ позволяет сделать вывод о наличия КРР лишь на основании качественного критерия. Ограничением способа является прогнозирование развития КРР у пациентов с ДБТК только с воспалительными заболеваниями толстой кишки, поэтому прогнозирование развития КРР у пациентов с ДБТК, которая не относится к воспалительным процессам, с помощью этого способа невозможно. Отсутствие количественных показателей, характеризующих наличие у пациента и развитие у него КРР, не позволяет построить в целом картину возникновения и течения КРР, в том числе при ДБТК.

Техническая проблема, решаемая изобретением, состоит в создании способа диагностики КРР, лишенного недостатков прототипа. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении информативности способа.

Это достигается тем, что в способе диагностики КРР, включающем забор биоптата из слизистой оболочки толстой кишки пациента и проведение его иммуноморфологического анализа, по результатам которого судят о развитии у пациента КРР, определяют относительную площадь экспрессии вазоактивного кишечного пептида (ВИП) в средней трети слизистой оболочки сигмовидной кишки, при этом диагностируют у пациента КРР, если относительная площадь экспрессии находится в пределах от 11,9 до 13,1.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков, приведенных в формуле изобретения.

Предложенный способ диагностики КРР, в том числе у пациентов с ДБТК, основан на выявлении дисбаланса в диффузной эндокринной системе. При этом выявляются морфологические особенности кишечника при ДБТК и КРР с учетом относительной площади экспрессии ВИП в слизистой оболочке средней трети сигмовидной кишки.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор биоптата, например, с помощью ректороманоскопии, в средней трети сигмовидной кишки кишечника и готовят микропрепараты для анализа. Для иммуноморфологического окрашивания, например, готовят серийные срезы толщиной 4-6 мкм, которые помещают на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (Menzel). Исследования проводят преимущественно на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидинбиотинового иммунопероксидазного метода. Для верификации экспрессии используются, например, первичные антитела к ВИП (Ab22736, 1:800, Abcam, UK). Полученные микропрепараты сканируют, например, с применением сканера Leica Aperio АТ2 с последующим анализом ВИП с использованием соответствующего программного обеспечения, например, Aperio ImageScope. При этом определяют относительную площадь экспрессии ВИП, которая рассчитывается как отношение площади экспрессии маркера к площади исследуемой ткани. И если относительная площадь экспрессии находится в пределах от 11,9 до 13,1 - диагностируют у пациента КРР. Забор биоптата для исследования из слизистой оболочки средней трети сигмовидной кишки обусловлен тем, что колоректальные опухоли в подавляющем большинстве развиваются в этом участке кишечника. Использование для оценки экспрессии относительной площади обусловлено экспрессией данного белка в большом количестве клеток, в том числе и стромы. Установлено, что клинические проявления кишечной дисфункции и эндоскопические признаки поражения кишечника у лиц с КРР, в том числе с ДБТК, во многом определяются относительной площадью экспрессии ВИП в средней трети слизистой оболочки сигмовидной кишки. Указанные минимальное и максимальное значения относительной площади экспрессии установлены эмпирическим путем и подтверждены статистическим исследованием и клиническими обследованиями пациентов.

Для статистического исследования отобрано 35 пациентов с ДБТК и КРР (средний возраст 68,6±7,4; женщин - 19, мужчин - 16) и 42 пациента с ДБТК (средний возраст 67,6±6,9; женщин - 23, мужчин - 19) - группа №1 и №2 соответственно. В контрольную группу (группа №3) включены 25 здоровых людей (средний возраст 65,6±8,1; женщин - 14, мужчин - 11). Все пациенты обследовались по единой программе, включавшей клинические, эндоскопические и иммуноморфологические методы. Для анализа результатов статистического исследования использовался критерий малых выборок Стьюдента. Результаты иммуноморфологического анализа приведены в Таблице.

Установлено, что у группы пациентов с ДБТК с КРР достоверно снижена относительная площадь экспрессии ВИП (р<0,05) по сравнению с группами пациентов с ДБТК и здоровых людей. Установлено, что развитие КРР у лиц с ДБТК связано со снижением относительной площади экспрессии ВИП. С высокой степенью вероятности можно судить о наличии КРР у пациентов с ДБТК с относительной плотностью экспрессии ВИП в пределах от 11,9 до 13,1.

Пример 1. Больная В., 67 лет. Была обследована в связи с жалобами на схваткообразные боли в нижних отделах живота, уменьшающиеся после дефекации, урчание, запоры, повышение температуры до 37,6°С. Ранее, два года назад, проводилось исследование кишечника, при котором были обнаружены дивертикулы в ободочной кишке. Объективно: кожные покровы обычной окраски. Тоны сердца ясные, ритм правильный. ЧСС 88 уд. в минуту. АД 130/80 мм рт. ст. Дыхание везикулярное. ЧДД 19 в минуту. Живот мягкий, резко болезненный по ходу толстого кишечника. Стул оформленный. Диурез без особенностей. В OAK - СОЭ 38 мм/ч, гемоглобин 88 г/л, эритроциты 2,4x10.е12/л. Рентгенологические исследования не проводились вследствие отягощенного аллергоанамнеза (ранее отмечалась генерализованная крапивница и зуд на рентгеноконтрастное вещество), фиброколоноскопия была отменена из-за риска перфорации. В результате, у данной пациентки была взята биопсия из слизистой оболочки средней трети сигмовидной кишки во время ректороманоскопии. Результаты иммуноморфологического исследования показали следующее: ВИП - 12,3. Выявлено снижение относительной площади экспрессии ВИП. На основании полученных данных морфометрического анализа компонентов диффузной эндокринной системы был поставлен диагноз КРР. Пациентке проведена антибиотико-противовоспалительная, спазмолитическая терапия. Спустя месяц, диагноз КРР подтвердился при фиброколоноскопическом исследовании.

Пример 2. Больной К., 70 лет. Был обследован в связи с жалобами на запоры и метеоризм. Объективно: кожные покровы обычной окраски. Тоны сердца ясные, ритм правильный. ЧСС 77 уд. в минуту. АД 135/85 мм рт. ст. Дыхание везикулярное. ЧДД 16 в минуту. Живот мягкий, безболезненный. Стул оформленный. Диурез без особенностей. В OAK - СОЭ 6 мм/ч, гемоглобин 141 г/л, эритроциты 4,8×10.е12/л. Пациенту была выполнена колоноскопия со взятием биопсии из слизистой оболочки средней трети сигмовидной кишки. Во время выполнения колоноскопии были обнаружены два дивертикула в сигмовидном кишечнике, иных новообразований и органических патологий не выявлены. Результаты иммуноморфологического исследования показали следующее: ВИП - 16,9. Выявлено снижение относительной площади экспрессии ВИП. Диагноз: дивертикулез кишечника.

Пример 3. Больная С., 61 год. Была обследована в связи с жалобами на запоры, метеоризм, мигрирующие боли по ходу толстого кишечника. Объективно: кожные покровы обычной окраски. Тоны сердца ясные, ритм правильный. ЧСС 79 уд. в минуту. АД 128/79 мм рт. ст. Дыхание везикулярное. ЧДД 17 в минуту. Живот мягкий, безболезненный. Стул оформленный. Диурез без особенностей. В OAK - СОЭ 4 мм/ч, гемоглобин 128 г/л, эритроциты 4,0 ×10.е12/л. Пациентке была выполнена колоноскопия со взятием биопсии из слизистой оболочки средней трети сигмовидной кишки. Во время выполнения колоноскопии новообразований и органических патологий не обнаружено. Результаты иммунноморфологического исследования показали следующее: ВИП - 35,1.

Способ диагностики КРР обладает более высокой информативностью по сравнению с аналогичными известными. Он обеспечивает объективную диагностику КРР, в том числе у пациентов с ДБТК, на основе иммуноморфологических показателей компонентов диффузной эндокринной системы с использованием количественного критерия. Способ практически безопасен, его использование возможно при наличии противопоказаний к проведению рентгенологического и эндоскопического исследований.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики колоректального рака. Осуществляют забор биоптата из слизистой оболочки толстой кишки пациента и проведение его иммуноморфологического анализа, по результатам которого судят о развитии у пациента колоректального рака. Определяют относительную площадь экспрессии вазоактивного кишечного пептида в средней трети слизистой оболочки сигмовидной кишки, которую рассчитывают как отношение площади экспрессии исследуемого маркера к площади исследуемой ткани. Если относительная площадь экспрессии находится в пределах от 11,9 до 13,1, диагностируют у пациента колоректальный рак. Способ обеспечивает возможность повышения информативности диагностики колоректального рака за счет определения иммуноморфологических показателей компонентов диффузной эндокринной системы с использованием количественного критерия относительной площади экспрессии вазоактивного кишечного пептида. 1 табл., 3 пр.

Способ диагностики колоректального рака, включающий забор биоптата из слизистой оболочки толстой кишки пациента и проведение его иммуноморфологического анализа, по результатам которого судят о развитии у пациента колоректального рака, отличающийся тем, что определяют относительную площадь экспрессии вазоактивного кишечного пептида в средней трети слизистой оболочки сигмовидной кишки, которую рассчитывают как отношение площади экспрессии исследуемого маркера к площади исследуемой ткани, при этом, если относительная площадь экспрессии находится в пределах от 11,9 до 13,1, диагностируют у пациента колоректальный рак.