Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано в качестве способа прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке ободочной кишки.

На сегодняшний день колоректальный рак (КРР) занимает одно из лидирующих мест в структуре общей онкологической заболеваемости и смертности в нашей стране (см. Кит О.И., Дженкова Е.А., Мирзоян Э.А., Геворкян Ю.А., Сагакянц А.Б., Тимошкина Н.Н., Каймакчи О.Ю., Каймакчи Д.О., Толмах Р.Е., Дашков А.В., Колесников В.Е., Милакин А.Г., Полуэктов С.И. Молекулярно-генетическая классификация подтипов колоректального рака: современное состояние проблемы. Южно-Российский онкологический журнал. 2021;2(2): 50-56. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2021-2-2-6).

Около 60% КРР приходится на рак ободочной кишки (РОК), занимающий 5 место в структуре онкологической заболеваемости у мужского населения и 4 место у женского (см. Каприн А.Д., Старинский В.В., Шахзадова А.О. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность). М.: МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. –252 с).

Наличие метастатически пораженных лимфатических узлов, их локализация и количество являются факторами прогноза заболевания, а также играют важную роль в принятии решения о вариантах дальнейшей терапии (см. Matsuda K., Hotta Т., Takifuji K., et al. Lymph nodes ratio is associated with the survival of colorectal cancer patients with peritoneal carcinomatosis. Am Surg. 2011;77(5):602-607. Ong M., Schofield J. Assessment of lymph node involvement in colorectal cancer. World J Gastrointest Surg. 2016;8(3):179-192. doi:10.4240/wjgs.v8.i3.179). Существует мнение, что имеющиеся данные о состоянии лимфатического коллектора до операции, позволят хирургу определить оптимальный объем хирургического вмешательства. Однако до сих пор вопрос об оптимальном уровне лимфодиссекции остается открытым (см. Дженкова Е.А., Мирзоян Э.А., Маслов А.А., Геворкян Ю.А., Харагезов Д.А., Милакин А.Г., Статешный О.Н., Каймакчи О.Ю., Дашков А.В., Каминский Г.В., Колесников В.Е., Малинин С.А., Толмах Р.Е., Чалхахян Л.Х., Савченко Д.А., Волошин М.В., Снежко А.В., Солдаткина Н.В. Роль D2, D3 лимфодиссекций в хирургии рака ободочной кишки. Южно-Российский онкологический журнал/ South Russian Journal of Cancer. 2022;3(3):48-54. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2022-3-3-6).

Все больше исследований в современной онкологии посвящено изучению роли различных звеньев иммунной системы в возникновении, течении, а также прогрессировании онкопроцесса. Доказана ее двойственная роль: с одной стороны, наличие противоопухолевых эффектов, с другой - опухоль-активирующих (см. Сагакянц А.Б. Объединенный иммунологический форум: современные направления развития фундаментальной и прикладной онкоиммунологии (Новосибирск, 2019). Южно-российский онкологический журнал. 2020;1(2):36-45). Этот факт определяет актуальность изучения роли отдельных компонентов как адаптивного, так и врожденного иммунитета в колоканцерогенезе.

Доказано, что колоректальные опухоли инфильтрированы различными иммунными и воспалительными клетками, наиболее значимыми из которых являются Т-лимфоциты (см. Schreiber R.D. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 2011; 331:1565–1570. PMID: 21436444. https://doi.org/10.1126/science.1203486).

Существуют ряд работ, посвященных изучению опухоль-инфильтрирующих иммунокомпетентных клеток и оценке их прогностической значимости при КРР, которые весьма противоречивы (см. Никипелова Е.А., Кит О.И., Шапошников А.В. и др. Иммунологические критерии развития отдаленных метастазов рака толстой кишки. Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Серия: Естественные науки. 2017;3(2):96-101. https://doi.org/ 10.23683/0321-3005-2017-3-2-96-10; м. Pages F., Galon J., Fridman W.H. The essential role of the in situ immune reaction in human colorectal cancer. Jornal of Leukocyte Biology. 2008;84(4):981–987. PMID: 18559950. https://doi.org/10.1189/jlb.1107773; Grizzi F., Bianchi P., Malesci A., et al. Prognostic value of innate and adaptive immunity in colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 2013;19(2):174–184. PMID: 23345940. PMCID: PMC3547568. https://doi.org/10.3748/wjg.v19.i2.174).

В развитии механизмов активации и реализации функций врожденного иммунитета особая роль принадлежит паттерн-распознающим рецепторам (ПРР, Pattern Recognition Receptors, PRRs). Наиболее важными представителями PRRs являются Толл-подобные рецепторы (Toll like receptors, TLRs) (см. Jiménez-Dalmaroni M.J., Gerswhin M.E., Adamopoulos I.E. The critical role of toll-like receptors — from microbial recognition to autoimmunity: a comprehensive review. Autoimmunity reviews. 2016;15(1):1-8). TLRs могут экспрессироваться не только на клетках врожденного и адаптивного иммунитета (моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, естественных клетках-киллерах и дендритных клетках, а также на T- и B- лимфоцитах), но и на различных соматических, опухолевых клетках, включая клетки колоректальной опухоли (см. Gay N.J., Symmons M.F., Gangloff M., Bryant C.E. Assembly and localization ofToll-like receptor signalling complexes. Nature reviews. Immunology.2014; 1(8):546–558.; см. Li T.T., Ogino S., Qian Z.R. Toll-like receptor signaling in colorectal cancer: carcinogenesis to cancer therapy. World journal of gastroenterology. 2014;20(47):17699–17708. PMID: 25548469. PMCID: PMC4273121. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i47.17699.; см. Свитич О.А., Филина А.Б., Давыдова Н.В., Ганковская Л.В., Зверев В.В. Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования. Медицинская иммунология. 2018;20(2):151–162. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-2-151-162).

Таким образом, не вызывает сомнения высокая важность изучения роли опухолевой инфильтрации лимфоцитов, а также оценка экспрессии TLRs в опухолях ободочной кишки, определяющих биологические свойства опухоли и особенности клинического течения заболевания, с последующим проецированием полученных результатов на риски лимфогенного метастазирования.

На сегодняшний день известны различные способы прогнозирования распространения или метастазирования рака толстой кишки, большинство из которых связано с прогнозированием отдаленных (гематогенных) метастазов и лишь единицы с лимфогенным метастазированием.

Один из самых известных способов прогнозирования метастатического поражения основан на степени дифференцировки опухоли: low-grade и high-grade новообразования (World Health Organization Classification of Tumours; 2000).

Как известно, аденокарциномы толстой кишки low-grade имеют более хороший клинический прогноз и характеризуются наименьшим риском возникновения метастазов. В то время как для high-grade аденокарцином характерно более агрессивное течение: высокий риск развития метастазирования и плохой прогноз клинического течения заболевания (см. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / World Health Organization Classification of Tumours. - Lyon, France. - 2000. (P. 110)).

Основным недостатком данного способа является отсутствие конкретных числовых значений для расчета риска метастазирования.

Из патентных источников известен «Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника». Суть данного метода заключается в макроскопическом исследовании первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов, а также морфологическом исследовании препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне: проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E1 8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), (см. заявка на изобретение RU 2 688 678 C1, МПК G01N 33/48). Авторами разработана формула расчета вероятности развития лимфогенных метастазов: при вероятности Р≥50% определяют высокий, а при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов. Однако данный способ требует особых дорогостоящих расходных материалов.

Задачей изобретения является разработка прогностической дискриминантной модели, которая по совокупности иммунологических показателей ткани опухоли позволяет прогнозировать риск развития лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки.

Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке способа, позволяющего прогнозировать риск лимфогенного метастазирования при раке ободочной кишки за счёт использования результатов оценки некоторых иммунологических характеристик первичной опухоли.

Технический результат достигается тем, что в ткани определяют лимф_ОП - общее число лимфоцитов в опухолевой ткани, CD3+_ОП –T-лимфоциты в опухолевой ткани, на CD45+ и CD45- клеточных популяциях с расчетом процентного содержания клеток соответственного фенотипа относительно общего числа клеток, определяют экспрессию СD45-TLR2+оп - клетки СD45, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45-TLR4+оп - клетки СD45-, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани, СD45+TLR2+оп- клетки СD45+, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45+TLR4+оп - клетки СD45+, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани, затем определяют показатель риска лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки по формуле:

Z= , где

Р = 0,315*лимф_Оп + 0,048*CD3_Оп + 0,014*СD45-TLR2+оп + 0,016*СD45-TLR4+оп + 0,2*СD45+TLR2+оп - 0,13*СD45+TLR4+оп -5,24,

при этом 0,315, 0,048, 0,014, 0,016, 0,2, 0,13, 5,24 – коэффициенты и при значении Z равно и выше 0,25, прогнозируют высокий риск лимфогенного метастазирования опухоли.

Прогностическая ценность комплексной модели была высокой, поскольку критерий χ² Пирсона составил 31,79 при р=0,00002.

По результатам ROC анализа при значении Z равно и выше 0,25, с диагностической чувствительностью 89,1% и диагностической специфичностью 88,2% формируется вывод о высоком риске лимфогенного метастазирования опухоли.

Индивидуальные значения больного подставляются в математическую регрессионную модель, и рассчитывается вероятность лимфогенного метастазирования опухоли.

Для лучшего понимания способа приводим фигуры.

Фигура 1. Окно программы для автоматического расчета вероятности лимфогенного метастазирования опухоли у пациента С.

Фигура 2. Окно программы для автоматического расчета вероятности лимфогенного метастазирования опухоли у пациента Х.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят исследования фрагментов ткани первичной опухоли, взятой в ходе выполнения колоноскопии на дооперационном этапе, а затем в суспензии клеток методом проточной цитометрии в соответствии с указаниями фирмы-производителя (Becton Dickinson, USA), выявляют следующие субпопуляций лимфоцитов:

лимф _ОП - общее число лимфоцитов в опухолевой ткани;

CD3+_ОП – T-лимфоциты в опухолевой ткани.

Также на CD45+, CD45-клеточных популяциях с расчетом процентного содержания клеток соответственного фенотипа относительно общего числа клеток, определяют экспрессию:

СD45-TLR2+оп-клетки СD45-, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани;

СD45-TLR4+оп-клетки СD45-, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани;

СD45+TLR2+оп-клетки СD45+, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани;

СD45+TLR4+оп-клетки СD45+, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани.

С помощью метода логистической регрессии для данных показателей было получено математическое выражение для расчета конкретной величины вероятности лимфогенного метастазирования опухоли.

Математическое выражение модели имеет следующий вид:

Z= , где Р = 0,315*лимф_Оп + 0,048*CD3_Оп + 0,014*СD45-TLR2+оп + 0,016*СD45-TLR4+оп + 0,2* СD45+TLR2+оп - 0,13*СD45+TLR4+оп - 5,24.

Прогностическая ценность комплексной модели была высокой, поскольку критерий χ² Пирсона составил 31,79 при р=0,00002.

По результатам ROC анализа при значении Z равно и выше 0,25, с диагностической чувствительностью 89,1% и диагностической специфичностью 88,2% формируется вывод о высоком риске лимфогенного метастазирования опухоли.

Индивидуальные значения больного подставляются в математическую регрессионную модель, и рассчитывается вероятность лимфогенного метастазирования опухоли.

Для удобства расчетов в табличном процессоре Ms Excel создан файл для расчета вероятности лимфогенного метастазирования, окна которого представлены на фиг. 1, 2.

В доступных источниках информации не обнаружено аналогичного предлагаемому нами способу прогнозирования лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки.

Приводим клинические примеры применения способа.

Клинический пример 1

Пациентка С., 1951 г.р., поступила в отделение абдоминальной онкологии № 2 17.07.2021 г. с диагнозом рак поперечной ободочной кишки, T3N1M0, st.III гр. 2.

26.07.2021 г. - выполнена лапароскопически-ассистированная резекция поперечной ободочной кишки. Во время операционного был произведен забор опухолевой ткани, ткани перитуморальной области и отдаленного участка кишки (условно здоровая ткань).

Результаты иммунологического обследования были следующими: лимф_Оп: 0,7%_, CD3_Оп: 85,8%, СD45-TLR2+оп: 1%, СD45-TLR4+оп: 59,6%, СD45+TLR2+оп: 4,8%, СD45+TLR4+оп: 80,8%.

Данные показатели внесены в формулу:

Р = 0,315*0,7 + 0,048*85,8 + 0,014*1 + 0,016*59,6 + 0,2* 4,8 - 0,13*80,8 - 5,24= -9,4775

Z= = 0,0001.

У пациентки C. риск метастазирования опухоли низкий, поскольку величина Z менее 0,25 (см. фиг.1).

Послеоперационный гистологический анализ подтвердил отсутствие пораженных лимфатических узлов (pT3N0M0).

Клинический пример 2

Пациент Х., 1971 г.р., поступил в отделение абдоминальной онкологии №2 07.09.2021 г. с диагнозом рак нисходящей ободочной кишки, cT3N1M0, st.III гр. 2.

26.07.2021 г.- выполнена левосторонняя гемиколэктомия. Во время операции был произведен забор опухолевой ткани, ткани перитуморальной области и отдаленного участка кишки (условно здоровая ткань).

Результаты иммунологического обследования были следующими: лимф_Оп:14,4%_, CD3_Оп: 53,7%, СD45-TLR2+оп: 4,6%, СD45-TLR4+оп: 2,4%, СD45+TLR2+оп: 43,4%, СD45+TLR4+оп: 65,5%.

Данные показатели внесены в формулу:

Р = 0,315*14,4 + 0,048*53,7 + 0,014*4,6 + 0,016*2,4 + 0,2* 43,4 - 0,13*65,5 - 5,24= 2,1414

Z= = 0,9120.

У пациента Х. риск метастазирования опухоли высокий, поскольку величина Z более 0,25 (см. фиг. 2).

Послеоперационный гистологический анализ подтвердил наличие пораженных лимфатических узлов (pT3N2M0, st III C).

Данным способом был рассчитан прогноз для 50 больных раком ободочной кишки. Диагностическая чувствительность метода составила 89,1%, диагностическая специфичность 88,2%.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что на основе логистической регрессии разработана формула расчета прогнозирования лимфогенного метастазирования у больных раком ободочной кишки по иммунологическим параметрам первичной опухоли на предоперационном этапе, что, в свою очередь, позволяет хирургу спрогнозировать риск наличия метастатически пораженных лимфатических узлов и определить оптимальный объем лимфодиссекции.

Заявленное изобретение является промышленно применимым, так как может быть многократно повторено и использовано при прогнозировании развития лимфогенных метастазов рака ободочной кишки и воспроизведено в различных лечебно-профилактических, научных, медицинских учреждениях в онкологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки. Проводят исследование опухолевой ткани, взятой в ходе выполнения колоноскопии на дооперационном этапе методом проточной цитометрии. В ткани определяют лимф_ОП - общее число лимфоцитов в опухолевой ткани, CD3+_ОП –T-лимфоциты в опухолевой ткани, на CD45+ и CD45- клеточных популяциях с расчетом процентного содержания клеток соответственного фенотипа относительно общего числа клеток. Определяют экспрессию СD45-TLR2+оп - клетки СD45, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45-TLR4+оп - клетки СD45-, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани, СD45+TLR2+оп- клетки СD45+, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45+TLR4+оп - клетки СD45+, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани. Затем определяют показатель лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки по формуле:

Z= , где Р = 0,315*лимф_Оп + 0,048*CD3_Оп + 0,014*СD45-TLR2+оп + 0,016*СD45-TLR4+оп + 0,2*СD45+TLR2+оп - 0,13*СD45+TLR4+оп -5,24. При этом 0,315, 0,048, 0,014, 0,016, 0,2, 0,13, 5,24 – коэффициенты. При значении Z равном и выше 0,25 диагностируют лимфогенное метастазирование опухоли. Способ обеспечивает возможность диагностики лимфогенного метастазирования при раке ободочной кишки за счёт использования результатов оценки некоторых иммунологических характеристик первичной опухоли. 2 ил., 2 пр.

Способ диагностики лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки, включаюший исследование опухолевой ткани, взятой в ходе выполнения колоноскопии на дооперационном этапе методом проточной цитометрии, отличающийся тем, что в ткани определяют лимф_ОП - общее число лимфоцитов в опухолевой ткани, CD3+_ОП –T-лимфоциты в опухолевой ткани, на CD45+ и CD45- клеточных популяциях с расчетом процентного содержания клеток соответственного фенотипа относительно общего числа клеток, определяют экспрессию СD45-TLR2+оп - клетки СD45, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45-TLR4+оп - клетки СD45-, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани, СD45+TLR2+оп- клетки СD45+, экспрессирующие TLR2+ в опухолевой ткани, СD45+TLR4+оп - клетки СD45+, экспрессирующие TLR4+ в опухолевой ткани, затем определяют показатель лимфогенного метастазирования рака ободочной кишки по формуле:

Z= ,

где Р = 0,315*лимф_Оп + 0,048*CD3_Оп + 0,014*СD45-TLR2+оп + 0,016*СD45-TLR4+оп + 0,2*СD45+TLR2+оп - 0,13*СD45+TLR4+оп -5,24,

при этом 0,315, 0,048, 0,014, 0,016, 0,2, 0,13, 5,24 – коэффициенты и при значении Z равно и выше 0,25 диагностируют лимфогенное метастазирование опухоли.