Настоящее изобретение относится к новым эстеразам, более конкретно к эстеразам, имеющим улучшенную активность и/или улучшенную термостабильность по сравнению с исходной эстеразой. Настоящее изобретение также относится к применению указанных новых эстераз для разрушения материалов, содержащих сложные полиэфиры, таких как пластмассовые изделия. Эстеразы по изобретению особенно подходят для разрушения полиэтилентерефталата и материалов, содержащих полиэтилентерефталат.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Эстеразы способны катализировать гидролиз различных полимеров, включая сложные полиэфиры. В этом контексте, эстеразы продемонстрировали многообещающие эффекты в ряде промышленных применений, в том числе, в качестве моющих средств для мытья посуды и стирки, в качестве разрушающих ферментов для переработки биомассы и пищевых продуктов, в качестве биокатализаторов при детоксикации загрязнителей окружающей среды или для обработки полиэфирных тканей в текстильной промышленности. Особый интерес представляет использование эстераз в качестве разрушающих ферментов для гидролиза полиэтилентерефталата (PET). Действительно, РЕТ используется в большом количестве технических областей, таких как производство одежды, ковров или в виде термореактивной смолы для производства упаковки или автомобильного пластика и т. д., так что накопление РЕТ на свалках становится нарастающей экологической проблемой.
Ферментативное разрушение сложных полиэфиров, и особенно РЕТ, считается интересным решением для уменьшения накопления пластиковых отходов. Действительно, ферменты могут ускорять гидролиз материала, содержащего сложный полиэфир, и, в частности, пластиковых изделий, даже до мономерного уровня. Кроме того, гидролизат (т.е. мономеры и олигомеры) можно рециркулировать в качестве материала для синтеза новых полимеров.
В этом контексте, несколько эстераз были идентифицированы как кандидатные ферменты, разрушающие сложные полиэфиры, и были разработаны некоторые варианты таких эстераз. Среди эстераз особый интерес представляют кутиназы, также известные как кутингидролазы (EC 3.1.1.74). Кутиназы были идентифицированы в различных грибах (P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- strόm and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504), бактериях и пыльце растений. Недавно, подходы метагеномики привели к идентификации дополнительных эстераз.
Однако по-прежнему существует потребность в эстеразах с улучшенной активностью и/или улучшенной термостабильностью по сравнению с уже известными эстеразами, чтобы предоставить более эффективные и, следовательно, более конкурентоспособные процессы разрушения сложных полиэфиров.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым эстеразам, проявляющим повышенную активность и/или повышенную термостабильность по сравнению с родительской эстеразой или эстеразой дикого типа, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID N 1. Эта эстераза дикого типа соответствует аминокислотам с 28 по 290 аминокислотной последовательности эстеразы, описанной в Yoshida S. et al., 2016 (A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate) Science 351 (6278), 1196-1199 (2016)), где метионин был добавлен в положении 1. Эстеразы по настоящему изобретению особенно полезны в процессах разрушения пластиковых изделий, в частности пластиковых изделий, содержащих РЕТ.
В этом отношении, целью изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID N 1, и (ii) имеет, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 и C263, где положения пронумерованы со ссылкой на аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой с SEQ ID N 1.
Другой целью изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ. ID N 1, и (ii) имеет, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255, C263, G60, S161, S162, P184, G208 или G209, где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой с SEQ ID N 1.
Также целью изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из S256C, S212I/W, N207C, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, N220P/D, S187E, A14H, T172Q или K226E, где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1, предпочтительно выбранной из S256C, S212I/W, N207C, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
Предпочтительно, эстераза по изобретению содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S256, предпочтительно S256C, и, необязательно, замену в положении N207, предпочтительно N207C. Более предпочтительно, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S212, предпочтительно S212I/W.
Предпочтительно, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180, H211, предпочтительно из комбинации S134+D180+H211.
Другой целью изобретения является предоставление нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу по изобретению. Настоящее изобретение также относится к кассете экспрессии или вектору экспрессии, содержащим указанную нуклеиновую кислоту, и к клетке-хозяину, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, кассету экспрессии или вектор.
Настоящее изобретение также представляет композицию, содержащую эстеразу по настоящему изобретению, клетку-хозяина по настоящему изобретению или их экстракт.
Еще одной целью изобретения является предоставление способа получения эстеразы по изобретению, включающего:
(а) культивирование клетки-хозяина по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу; и необязательно
(b) выделение указанной эстеразы из клеточной культуры.
Еще одной целью изобретения является предоставление способа разрушения полиэфира, включающего
(а) контакт сложного полиэфира с эстеразой по изобретению, или клеткой-хозяином по изобретению, или композицией по изобретению; и, необязательно
(b) восстановление мономеров и/или олигомеров.
В частности, изобретение предоставляет способ разрушения РЕТ, включающий контакт РЕТ с, по меньшей мере, одной эстеразой по изобретению и необязательное восстановление мономеров и/или олигомеров РЕТ.
Настоящее изобретение также относится к способу разрушения, по меньшей мере, одного сложного полиэфира материала, содержащего сложный полиэфир, включающему следующие стадии:
(а) контакта материала, содержащего сложный полиэфир, с эстеразой или клеткой-хозяином по изобретению, тем самым разрушая, по меньшей мере, один сложный полиэфир или материал, содержащий сложный полиэфир; и необязательно
(b) восстановления мономеров и/или олигомеров указанного, по меньшей мере, одного сложного полиэфира.
Изобретение также относится к применению эстеразы по изобретению для разрушения РЕТ или пластикового изделия, содержащего РЕТ.
Настоящее изобретение также относится к материалу, содержащему сложный полиэфир, в который включены эстераза, или клетка-хозяин, или композиция по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к моющей композиции, содержащей эстеразу или клетку-хозяина по изобретению, или к композиции, содержащей эстеразу по настоящему изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Настоящее раскрытие будет лучше всего понято со ссылкой на следующие определения.
В настоящем документе термины «пептид», «полипептид», «белок», «фермент» относятся к цепи аминокислот, связанных пептидными связями, независимо от количества аминокислот, образующих указанную цепь. Аминокислоты в настоящем документе представлены их однобуквенным или трехбуквенным кодом в соответствии со следующей номенклатурой: A: аланин (Ala); C: цистеин (Cys); D: аспарагиновая кислота (Asp); E: глутаминовая кислота (Glu); F: фенилаланин (Phe); G: глицин (Gly); H: гистидин (His); I: изолейцин (Ile); K: лизин (Lys); L: лейцин (Leu); М: метионин (Мет); N: аспарагин (Asn); Р: пролин (Pro); Q: глутамин (Gln); R: аргинин (Arg); S: серин (Ser); T: треонин (Thr); V: валин (Val); W: триптофан (Trp) и Y: тирозин (Tyr).
Термин «эстераза» относится к ферменту, принадлежащему к классу гидролаз, классифицированному как EC 3.1.1 согласно Enzyme Nomenclature, который катализирует гидролиз сложных эфиров в кислоту и спирт. Термин «кутиназа» или «кутингидролаза» относится к эстеразам, классифицированным как EC 3.1.1.74 согласно Enzyme Nomenclature, которые способны катализировать химическую реакцию образования мономеров кутина из кутина и воды.
Термины «белок дикого типа» или «исходный белок» относятся к не мутантной версии полипептида в том виде, в каком он находится в природе. В данном случае, исходная эстераза относится к эстеразе, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID N 1.
Термины «мутант» и «вариант» относятся к полипептидам, полученным из SEQ ID N 1, и содержащим, по меньшей мере, одну модификацию или изменение, т. е. замену, вставку и/или делецию, в одном или более (например, нескольких) положениях, и обладающим активностью разрушения сложного полиэфира. Варианты могут быть получены различными методами, хорошо известными в данной области техники. В частности, примеры методов изменения последовательности ДНК, кодирующей белок дикого типа, включают, но не ограничены ими, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез и конструирование синтетических олигонуклеотидов. Таким образом, термины «модификация» и «изменение», используемые в настоящем документе в отношении конкретного положения, означают, что аминокислота в этом конкретном положении была модифицирована по сравнению с аминокислотой в этом конкретном положении в белке дикого типа.
«Замена» означает, что аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком. Предпочтительно, термин «замена» относится к замене аминокислотного остатка на другой, выбранный из встречающихся в природе стандартных 20 аминокислотных остатков, редко встречающихся в природе аминокислотных остатков (например, гидроксипролина, гидроксилизина, аллогидроксилизина, 6-N-метиллизина, N-этилглицина, N-метилглицина, N-этиласпарагина, алло-изолейцина, N-метилизолейцина, N-метилвалина, пироглутамина, аминомасляной кислоты, орнитина, норлейцина, норвалина) и не встречающихся в природе аминокислотных остатков, часто полученных синтетическим путем (например, циклогексилаланина). Предпочтительно, термин «замена» относится к замене аминокислотного остатка на другой, выбранный из встречающихся в природе стандартных 20 аминокислотных остатков (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S и T). Знак «+» указывает на комбинацию замен. В настоящем документе, для обозначения замены используется следующая терминология: L82A означает, что аминокислотный остаток (лейцин, L) в положении 82 исходной последовательности заменен аланином (А). A121V/I/M означает, что аминокислотный остаток (аланин, A) в положении 121 исходной последовательности заменен одной из следующих аминокислот: валином (V), изолейцином (I) или метионином (M). Замена может быть консервативной или не консервативной заменой. Примерами консервативных замен являются группы основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин, аспарагин и треонин), гидрофобных аминокислот (метионин, лейцин, изолейцин, цистеин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин и серин).
Если не указано иное, положения, описанные в настоящей заявке, пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N 1.
Используемый в настоящем документе термин «идентичность последовательности» или «идентичность» относится к количеству (или доле, выраженной в процентах %) совпадений (идентичных аминокислотных остатков) между двумя полипептидными последовательностями. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения последовательностей, выровненных таким образом, чтобы максимизировать перекрытие и идентичность при минимальных гэпах в последовательностях. В частности, идентичность последовательности может быть определена с использованием любого из ряда математических алгоритмов глобального или локального выравнивания в зависимости от длины двух последовательностей. Последовательности одинаковой длины предпочтительно выравнивают с использованием алгоритма глобального выравнивания (например, алгоритма Нидлмана и Вунша; Needleman and Wunsch, 1970), который оптимально выравнивает последовательности по всей длине, в то время как последовательности существенно разной длины предпочтительно выравнивают с использованием алгоритма локального выравнивания (см. например, алгоритма Смита и Уотермана (Smith and Waterman, 1981) или алгоритма Альтшула (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)). Выравнивание с целью определения доли идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, известными специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, доступного на веб-сайтах в Интернете, таких как http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ или http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего документа, значения % идентичности аминокислотной последовательности относятся к значениям, полученным с использованием программы парного выравнивания последовательностей EMBOSS Needle, которая создает оптимальное глобальное выравнивание двух последовательностей с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша, в котором все параметры поиска установлены на значения по умолчанию, т.е. Матрица подсчета очков=BLOSUM62, Штраф за открытие гэпа=10, Штраф за продолжение гэпа=0,5, Штраф за внесение концевого гэпа=ложь, Штраф за внесение концевого гэпа=10 и Штраф за продолжение концевого гэпа=0,5.
«Полимер» относится к химическому соединению или смеси соединений, структура которых состоит из множества мономеров (повторяющихся звеньев), связанных ковалентными химическими связями. В контексте изобретения, термин полимер содержит природные или синтетические полимеры, состоящие из повторяющихся звеньев одного типа (т.е. гомополимеры) или из смеси различных повторяющихся звеньев (т.е. сополимеры или гетерополимеры). Согласно изобретению «олигомеры» относятся к молекулам, содержащим от 2 до примерно 20 мономеров.
В контексте изобретения «материал, содержащий сложный полиэфир» или «продукт, содержащий сложный полиэфир» относится к продукту, такому как пластиковый продукт, содержащий, по меньшей мере, один сложный полиэфир в кристаллической, полукристаллической или полностью аморфной форме. В конкретном варианте осуществления, материал, содержащий сложный полиэфир, относится к любому изделию, изготовленному из, по меньшей мере, одного пластикового материала, такого как пластиковый лист, труба, стержень, профиль, форма, пленка, массивный блок и т. д., который содержит, по меньшей мере, один сложный полиэфир, и возможно другие вещества или добавки, такие как пластификаторы, минеральные или органические наполнители. В другом конкретном варианте осуществления, материал, содержащий сложный полиэфир, относится к пластиковому соединению или пластиковому составу в расплавленном или твердом состоянии, подходящему для изготовления пластикового продукта. В другом конкретном варианте осуществления, материал, содержащий сложный полиэфир, относится к текстилю, тканям или волокнам, содержащим, по меньшей мере, один сложный полиэфир. В другом конкретном варианте осуществления, материал, содержащий сложный полиэфир, относится к пластиковым отходам или волокнистым отходам, содержащим, по меньшей мере, один сложный полиэфир.
В настоящем описании, термин «полиэфир(ы)» содержит, но не ограничен ими, полиэтилентерефталат (РЕТ), политриметилентерефталат (РТТ), полибутилентерефталат (РВТ), полиэтиленизосорбидтерефталат (PEIT), полимолочную кислоту (PLA), полигидроксиалканоат (PHA), полибутиленсукцинат (PBS), полибутиленсукцинатадипат (PBSA), полибутиленадипаттерефталат (PBAT), полиэтиленфураноат (PEF), поликапролактон (PCL), поли(этиленадипат) (PEA), полиэтиленнафталат (PEN) и смеси/смеси этих полимеров.
Новые эстеразы
Настоящее изобретение представляет новые эстеразы с улучшенной активностью и/или улучшенной термостабильностью по сравнению с исходной эстеразой. Более конкретно, изобретатели разработали новые ферменты, особенно подходящие для использования в промышленных процессах. Эстеразы по изобретению особенно подходят для разрушения сложных полиэфиров, более конкретно РЕТ, включая РЕТ-содержащие материалы и, в частности, пластмассовые изделия, содержащие РЕТ. В конкретном варианте осуществления, эстеразы проявляют как повышенную активность, так и повышенную термостабильность.
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление эстераз, которые демонстрируют повышенную активность по сравнению с эстеразами, имеющими аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID N 1.
В частности, авторы изобретения идентифицировали определенные аминокислотные остатки в SEQ ID N 1, которые предназначены для контакта с полимерным субстратом в рентгеновской кристаллической структуре (т.е. складчатой 3D структуре) эстераз, которые могут быть успешно модифицированы, чтобы способствовать контакту субстрата с эстеразами и приводить к повышенной адсорбции полимера и/или тем самым к повышенной активности эстераз на этом полимере.
В контексте изобретения, термин «повышенная активность» или «повышенная разрушающая активность» указывает на повышенную способность эстеразы разрушать сложный полиэфир и/или на повышенную способность адсорбироваться на сложном полиэфире при данной температуре по сравнению с способностью эстеразы с SEQ ID N 1 разрушать и/или адсорбироваться на одном полиэфире при одинаковой температуре. В частности, эстераза по изобретению обладает повышенной активностью разрушения РЕТ. Такое увеличение может быть, по меньшей мере, на 10% больше, чем активность эстеразы с SEQ ID N 1, разрушающей РЕТ, предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130% или больше. В частности, разрушающей активностью является деполимеризационная активность, приводящая к мономерам и/или олигомерам сложного полиэфира, которые могут быть дополнительно извлечены и необязательно повторно использованы.
Специалист в данной области техники может оценить «разрушающую активность» эстеразы в соответствии со способами, известными сами по себе в данной области техники. Например, разрушающую активность можно оценить путем измерения скорости активности деполимеризации конкретного полимера, измерения скорости разрушения твердого полимерного соединения, диспергированного в чашке с агаром, или измерения скорости активности деполимеризации полимера в реакторе. В частности, разрушающая активность может быть оценена путем измерения «удельной разрушающей активности» эстеразы. «Удельная разрушающая активность» эстеразы для РЕТ соответствует мкмоль гидролизованного РЕТ/мин или мг эквивалентного полученного ТА/час, и на мг эстеразы в начальный период реакции (т.е. первые 24 часа), и определяется из линейной части кривой гидролиза реакции, где такая кривая построена из нескольких проб, взятых в разное время в течение первых 24 часов. В качестве другого примера, «разрушающую активность» можно оценить путем измерения, через определенный период времени, скорости и/или выхода олигомеров и/или мономеров, высвободившихся при подходящих условиях температуры, рН и буфера, при контакте с полимером или полимерсодержащим пластиковым продуктом с разрушающим ферментом.
Способность фермента адсорбироваться на субстрате может быть оценена специалистом в данной области техники в соответствии со способами, известными сами по себе в данной области техники. Например, способность фермента адсорбироваться на субстрате может быть измерена в растворе, содержащем фермент, и где фермент предварительно инкубировали с субстратом в подходящих условиях.
Изобретатели также идентифицировали аминокислотные остатки-мишени в SEQ ID N 1, которые можно с успехом модифицировать для улучшения стабильности соответствующих эстераз при высоких температурах (т.е. улучшенной термостабильности) и преимущественно при температуре выше 40°С, предпочтительно выше 50°С.
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление новых эстераз, которые проявляют повышенную термостабильность по сравнению с термостабильностью эстеразы, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID N 1.
В контексте изобретения, термин «повышенная термостабильность» указывает на повышенную способность эстеразы сопротивляться изменениям своей химической и/или физической структуры при высоких температурах и, в частности, при температуре от 40°С до 80°С, по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1. В частности, термостабильность можно оценить посредством оценки температуры плавления (Tm) эстеразы. В контексте настоящего изобретения, «температура плавления» относится к температуре, при которой половина рассматриваемой популяции ферментов развернута или неправильно свернута. Как правило, эстеразы по изобретению демонстрируют повышенную Tm приблизительно на 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 10°C или более по сравнению с Tm эстеразы с SEQ ID N 1. В частности, эстеразы по настоящему изобретению могут иметь увеличенный период полужизни при температуре от 40°C до 80°C по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
Температуру плавления (Tm) эстеразы может измерить специалист в данной области техники в соответствии со способами, известными сами по себе в данной области техники. Например, DSF можно использовать для количественного определения изменения температуры термической денатурации эстеразы и, таким образом, для определения ее Tm. Альтернативно, Tm можно оценить путем анализа сворачивания белка с использованием кругового дихроизма. Предпочтительно, Tm измеряют с использованием DSF или кругового дихроизма, как показано в экспериментальной части. В контексте изобретения, проводят сравнение Tm с Tm, измеренной в тех же условиях (например, pH, природа и количество сложных полиэфиров и т.д.).
Альтернативно, термостабильность может быть оценена путем измерения активности эстеразы и/или активности деполимеризации сложного полиэфира эстеразы после инкубации при различных температурах и по сравнению с активностью эстеразы и/или активностью деполимеризации сложного полиэфира исходной эстеразы. Также можно оценить возможность проведения нескольких циклов анализа деполимеризации полиэфира при различных температурах. Быстрый и ценный тест может состоять из оценки, путем измерения диаметра ореола, способности эстеразы разрушать твердое полиэфирное соединение, диспергированное в чашке с агаром, после инкубации при различных температурах.
Целью настоящего изобретения является получение эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность полной длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255, C263, G60, S162, P184 или G209 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID N 1 и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, с одной аминокислотной заменой в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 C263, G60, S162, P184 или G209.
Если не указано иное, положения, описанные в настоящей заявке, пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N 1.
В частности, целью настоящего изобретения также является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность с полноразмерной аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 и C263, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
Если не указано иное, положения, описанные в настоящей заявке, пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N 1.
Согласно изобретению аминокислота-мишень может быть заменена любой из 19 других аминокислот.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, с одной аминокислотной заменой в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 и C263.
В одном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, и содержат, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, C247 и C263. В предпочтительном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S256. Предпочтительной заменой является S256C.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S66. Предпочтительной, заменой является S66T. В другом варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении K226, предпочтительно выбранную из K226E.
В одном варианте осуществления эстераза может дополнительно содержать, по меньшей мере, одну замену или комбинацию замен в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A14, Y61, T62, A63, R64, S67, K69, L91, Q93, S95, W133, M135, W159, S161, F175, C177, S181, I182, A183, S187, I192, G208, S212, C213, A214, N215, I224, T244, E248, T253, R254, T87, T90, P94, I142, I206, N207, S210, S216, G217, N218, S219, N220, Q221, G60, S162, P184 или G209. Например, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A14, Y61, T62, A63, R64, S67, K69, L91, Q93, S95, W133, M135, W159, S161, F175, C177, S181, I182, A183, S187, I192, G208, S212, C213, A214, N215, I224, T244, E248, T253 или R254. В частности, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из A14T/S/R/H, Y61A/F, T62A/M, A63R, R64A/E, S67M, K69A/E/N, L91F, Q93A/G/Y/P, S95D/E, W133A/H/F, M135A, W159H/A, S161A/W/Q, F175I, C177A/S, S181T/N, I182A/V/F, A183I, S187Q/E, I192F, G208N, S212F/A/I/V/W, C213A/S, A214P, N215A/F/D/M, I224L, T244S, E248P/S, T253P/Y или R254A/N.
В одном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T87, T90, P94, I142, I206, N207, S210, S216, G217, N218, S219, N220 или Q221. В частности, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из N220P/D, предпочтительно N220P.
В одном варианте осуществления, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T62, Q93, F175, S181, S187, N207, S212, N215 или N220, предпочтительно выбранных из T62, Q93, F175, S181, N207, S212 или N215. Предпочтительно, замену выбирают из T62M, Q93G/P, F175I, S181N, S187E, N207C, S212I/W, N215D/M или N220P/D, более предпочтительно, из T62M, Q93G/P, F175I, S181N, N207C, S212I/W или N215D/М. Предпочтительно, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, замену N207C.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID. N 1 и, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях N207+S256. Предпочтительно, комбинацией является N207C+S256C. В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, с комбинацией замен N207C+S256C. В одном варианте осуществления, эстераза содержит аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, с комбинацией замен N207C+S256C. Преимущественно, эстераза содержит комбинацию N207C+S256C и демонстрирует как повышенную термостабильность, так и повышенную разрушающую активность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях N207+S256 и, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, выбранном из T62, S66, Q93, F175, S181, S187, S212, N215 или N220, предпочтительно, выбранных из Q93, S187, S212 или N220. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положении, предпочтительно N207C+S256C, и по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из T62M, S66T, Q93G/P, F175I, S181N, S187E, S212I/W, N215D/M или N220P/D, предпочтительно, выбранную из Q93G/P, S187E, S212I/W или N220P/D.
Более предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256, предпочтительно, выбранную из S212I/W+N207C+S256C.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, четыре замены в положениях, выбранных из S212, N207, S256, F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220. Предпочтительно, по меньшей мере, четыре замены выбирают из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E и N220P/D. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, четыре замены в положениях, выбранных из S212, N207, S256, F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. Предпочтительно, по меньшей мере, четыре замены выбирают из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256 и одну или две замены в положениях, выбранных из F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно, выбранных из F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212I/W+N207C+S256C и одну или две замены, выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256 и, по меньшей мере, одну замену в положении, выбранном из F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно в положении, выбранном из F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212I/W+N207C+S256C и по меньшей мере, одну замену, выбранную из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно выбранную из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256+Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен, выбранных из S212I/W+N207C+S256C+Q93G/P. Преимущественно, эстераза содержит комбинацию S212I/W+N207C+S256C+Q93G и демонстрирует как повышенную термостабильность, так и повышенную разрушающую активность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит комбинацию замен, выбранных из S212+N207+S256+Q93+N220+S187, предпочтительно выбранных из S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E.
В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен, выбранных из N207C+S256C, S212I/W+N207C+S256C+Q93G или S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E. В одном варианте осуществления, эстераза содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, с комбинацией замен, выбранных из N207C+S256C или S212I/W+N207C+S256C+Q93G, и демонстрирует как повышенную разрушающую активность, так и повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В конкретном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A7, R8, N11, T25, V26, R27, G38, P45, T51, W71, R97, S98, S99, R106, S110, N112, G113, T114, S115, G121, A126, M128, M131, G132, A145, N146, L150, A154, P155, Q156, A157, D160, T163, F165, V168, L173, S188 L190, P191, A200, K201, Q202, T240, S243, T260, N262, V108, G113, T114, S115, G121, K122, T125, A126, G129, G139, S140, A154, P155, D160, T172, N186, S188, A200, E205, S264. Предпочтительно замену выбирают из A7Q/E, R8E, N11A, T25P/S, V26Y, R27E/Q, G38R, T51E/P, W71L, R97A, S98C, S99R, R106G/S, S110T, N112S, G113N/R, G121N/T, A126S, M128L, A145R, L150I, P155A/G/S, Q156L, D160H/F/I/L/V/S, T163K, V168L, S188H, L190D, P191T, A200P, K201R, Q202E, T240R, S243T, T260V, N262A, V108L, G113N, T114D, S115P, G121T, K122W, T125P, A126S, G129A, G139A, S140T, A154I, P155A, D160H, T172Q/V, N186R, S188H, A200P, E205M или S264P.
В одном варианте осуществления, эстераза по изобретению содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180, H211, как и в исходной эстеразе, т.е. эстераза по изобретению не модифицирована в одном, двух или во всех этих положениях. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию S134+D180+H211, как в исходной эстеразе.
Альтернативно или дополнительно, эстераза содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из C177, C213, C247 или C263, как в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию C247+C263, как в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, одну комбинацию С247+С263 или С177+С213, как в исходной эстеразе, еще более предпочтительно, эстераза содержит С247+С263+С177+С213. В частности, эстераза содержит S134+D180+H211+C247+C263+C177+C213, как в исходной протеазе.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255, C263, G60, S161, S162, P184, G208 и G209 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255 и C263.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, с одной аминокислотной заменой в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255, C263, G60, S161, S162, P184, G208 или G209. В частности, эстераза имеет единственную аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255 и C263. В одном варианте осуществления, эстераза содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, с одной аминокислотной заменой в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255 и C263.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255, C263, G60, S162, P184 или G209 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID N 1, и (iii) демонстрирует повышенную активность разрушения сложного полиэфира и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой из SEQ ID N 1. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 или C263.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N 1, с одной аминокислотной заменой в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255, C263, G60, S162, P184 или G209. В частности, эстераза имеет единственную аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255 или C263.
В варианте осуществления изобретения, эстераза имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, и содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, F175, S187, I192, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, V255 и С263. В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из C247 и C263.
В одном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, и содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из G60, S161, S162, P184, G208 или G209.
В одном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, и содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S256. Предпочтительно, заменой является S256C.
В другом предпочтительном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, и содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, выбранном из S66 и F175. Предпочтительно, замену выбирают из S66T и F175I. В другом конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении S187, предпочтительно, выбранную из S187E. В другом варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении K226, предпочтительно выбранную из K226E.
В конкретном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A14, Y61, T62, A63, R64, S67, K69, L91, Q93, S95, W133, M135, W159, C177, S181, I182, A183, S212, C213, A214, N215, R254, T87, T90, P94, I142, I206, N207, S210, S216, G217, N218, S219, N220 или Q221.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A14, Y61, T62, A63, R64, S67, K69, L91, Q93, S95, W133, M135, W159, C177, S181, I182, A183, S212, C213, A214, N215 или R254. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из A14H/T/S/R, Y61A/F, T62A/M, A63R, R64A/E, S67M, K69A/E/N, L91F, Q93A/G/Y/P, S95D/E, W133A/H/F, M135A, W159H/A, C177A/S, S181T/N, I182A/V/F, A183I, S212F/A/V/I/W, C213A/S, A214P, N215A/F/D/M или R254A.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T87, T90, P94, I142, I206, N207, S210, S216, G217, N218, S219, N220 или Q221. В частности, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из N220P/D, предпочтительно, N220P.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T62, Q93, S181, N207, S212, N215 или N220, предпочтительно, из T62, Q93, S181, N207, S212 или N215. Предпочтительно, замену выбирают из T62M, Q93G/P, S181N, N207C, S212I/W, N215D/M или N220P/D, более предпочтительно, из T62M, Q93G/P, S181N, N207C, S212I/W или N215D/M. Предпочтительно, эстераза содержит замену N207C.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях N207+S256. Предпочтительно, комбинацией является N207C+S256C. В предпочтительном варианте осуществления, эстераза содержит комбинацию N207C+S256C и демонстрирует повышенную термостабильность и повышенную активность разрушения по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1. В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях N207+S256 и, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, выбранном из S212, F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно, выбранных от Q93, S187, S212 или N220. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положении предпочтительно N207C+S256C и, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из S212I/W, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно выбранную из Q93G/P, S187E, S212I/W или N220P/D.
Более предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256, предпочтительно, выбранную из S212I/W+N207C+S256C.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, четыре замены в положениях, выбранных из S212, N207, S256, F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно, выбранных из S212, N207, S256, F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, четыре замены, выбранные из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P, предпочтительно, выбранных из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256 и, по меньшей мере, одну замену в положении, выбранном из F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно, в положении, выбранном из F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212I/W+N207C+S256C и, по меньшей мере, одну замену, выбранную из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно, выбранную из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P. В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256 и одну или две замены в положениях, выбранных из F175, S181, S66, T62, N215, Q93, S187 или N220, предпочтительно, в положениях, выбранных из F175, S181, S66, T62, N215 или Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212I/W+N207C+S256C и одну или две замены, выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно, выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212+N207+S256+Q93. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен, выбранных из S212I/W+N207C+S256C+Q93G/P. Преимущественно, эстераза содержит комбинацию S212I/W+N207C+S256C+Q93G и демонстрирует как повышенную термостабильность, так и повышенную активность разрушения по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит комбинацию замен в положениях S212+N207+S256+Q93+N220+S187, предпочтительно, выбранную из S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E. В конкретном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать, по меньшей мере, одну замену в положениях, соответствующих остаткам, выбранным из R8, P45, W71, R97, S98, T114, S115, M131, G132, N146, A154, P155, Q156, A157, F165. или L173. Предпочтительно, замену выбирают из R8E, W71L, R97A, S98C, P155A/G/S, Q156L или T260V. В другом конкретном варианте осуществления, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из A7Q, R27E, R106G или D160H/F/I/L/V.
Альтернативно или дополнительно, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из V108, G113, T114, S115, G121, K122, T125, A126, G129, G139, S140, A154, P155, D160, T172, N186, S188, A200, E205, S264, предпочтительно, выбранным из V108L, G113N, T114D, S115P, G121T, K122W, T125P, A126S, G129A, G139A, S140T, A154I, P155A, D160H, T172Q, T172V, N186R, S188H, A200P, E205M или S264P.
В одном варианте осуществления, эстераза по изобретению содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180, H211, как и в исходной эстеразе, т.е. эстераза по изобретению не модифицирована в одном, двух или во всех этих положениях. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию S134+D180+H211, как в исходной эстеразе.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из C177, C213, C247 или C263, как и в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию C247+C263, как в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, одну комбинацию С247+С263 или С177+С213, как в исходной эстеразе, еще более предпочтительно, эстераза содержит С247+С263+С177+С213. В частности, эстераза содержит S134+D180+H211+C247+C263+C177+C213, как в исходной протеазе.
Также целью изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из S256C, S212I/W, N207C, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, N220P/D, S187E, A14H, T172Q или K226E, и (iii) имеет повышенную активность разрушения и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из S256C, S212I/W, N207C, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену или комбинацию замен, выбранных из группы, состоящей из N207C+S256C, S212I/W, S181N, S66T, T62M, N215D/M, N220P, S187E, Q93G/P, A14H, T172Q или K226E. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену или комбинацию замен, выбранных из группы, состоящей из N207C+S256C, S212I/W, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В конкретном варианте осуществления, указанная эстераза дополнительно содержит замену F175I.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID. N 1 и, по меньшей мере, сочетание замен N207C+S256C. В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен N207C+S256C и, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из T62M, S66T, Q93G/P, F175I, S181N, S187E, S212I/W, N215D/M N220P/D, A14H, T172Q или K226E, предпочтительно, выбранную из T62M, S66T, Q93G/P, F175I, S181N, S212I/W или N215D/M, более предпочтительно, выбранную из Q93G/P, S187E, S212I/W или N220P/D, еще более предпочтительно, S212I/W. Более предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен, выбранных из S212I/W+N207C+S256C.
В одном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, четыре замены в положениях, выбранных из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E и N220P/D, предпочтительно, выбранных из S212I/W, N207C, S256C, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен S212I/W+N207C+S256C и, по меньшей мере, одну замену в положениях, выбранных из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E, N220P/D, A14H, T172Q или K226E, предпочтительно, выбранных из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P. В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен S212I/W+N207C+S256C и одну или две замены, выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E или N220P/D, предпочтительно, выбранные из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M или Q93G/P. Преимущественно, эстераза содержит комбинацию S212I/W+N207C+S256C+Q93G и демонстрирует как повышенную термостабильность, так и повышенную активность разрушения по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1. В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит комбинацию замен, выбранных из S212+N207+S256+Q93+N220+S187, предпочтительно, выбранных из S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E.
Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену или комбинацию замен, выбранную из группы, состоящей из S212I/W, N207C, S256C, S181N, S66T, T62M, N215D/M, N220P, S187E, Q93G/P, N207C+S256C, S212I/W+N207C+S256C, S212I/W+N207C+S256C+Q93G/P или S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E.
В частности, эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен, выбранную из N207C+S256C, S212I/W+N207C+S256C+Q93G или S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E. В одном варианте осуществления, эстераза содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N 1, с комбинацией замен, выбранной из N207C+S256C или S212I/W+N207C+S256C+Q93G, и демонстрирует как повышенную активность разрушения, так и повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1.
В одном варианте осуществления, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180, H211, как в исходной эстеразе, т.е. эстераза по изобретению не модифицирована в одном, двух или во всех этих положениях. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию S134+D180+H211, как в исходной эстеразе.
В другом варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из C177, C213, C247 или C263, как в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию C247+C263, как в исходной эстеразе. Предпочтительно, эстераза содержит, по меньшей мере, одну комбинацию С247+С263 или С177+С213, как в исходной эстеразе, еще более предпочтительно, эстераза содержит С247+С263+С177+С213. В частности, эстераза содержит S134+D180+H211+C247+C263+C177+C213, как в исходной протеазе.
В одном варианте осуществления, эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену или комбинацию замен в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T13, A14, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, G60, Y61, A63, R64, S67, I68, K69, W70, P73, R74, D86, T87, T90, L91, D92, P94, S95, W133, M135, G136, I142, W159, S161, S162, C177, I182, A183, P184, S187, I192, I206, G208, G209, S210, C213, A214, S216, G217, N218, S219, N220, Q221, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, R254, V255 или C263, предпочтительно, выбранным из T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, G60, Y61, A63, R64, S67, I68, K69, W70, P73, R74, D86, T87, T90, L91, D92, P94, S95, W133, M135, G136, I142, W159, S161, S162, C177, I182, A183, P184, S187, I192, I206, G208, G209, S210, C213, A214, S216, G217, N218, S219, N220, Q221, A222, L223, I224, G225, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, R254, V255 или C263.
В конкретном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать, по меньшей мере, одну замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из A7, R8, N11, T25, V26, R27, G38, P45, T51, W71, R97, S98, S99, R106, S110, N112, G113, T114, S115, G121, A126, M128, M131, G132, A145, N146, L150, A154, P155, Q156, A157, D160, T163, F165, V168, L173, S188 L190, P191, A200, K201, Q202, T240, S243, T260, N262, V108, G113, T114, S115, G121, K122, T125, A126, G129, G139, S140, A154, P155, D160, T172, N186, S188, A200, E205, S264. Предпочтительно, замена выбрана из A7Q/E, R8E, N11A, T25P/S, V26Y, R27E/Q, G38R, T51E/P, W71L, R97A, S98C, S99R, R106G/S, S110T, N112S, G113R, G121N, A126S, M128L, A145R, L150I, P155A/G/S, Q156L, D160H/F/I/L/V/S, T163K, V168L, S188H, L190D, P191T, A200P, K201R, Q202E, T240R, S243T, T260V, N262A, V108L, G113N, T114D, S115P, G121T, K122W, T125P, A126S, G129A, G139A, S140T, A154I, P155A, D160H, T172Q/V, N186R, S188H, A200P, E205M или S264P.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление эстеразы, которая (i) имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID N 1, (ii) содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из группы, состоящей из A14, Y61, T62, A63, R64, S67, K69, L91, Q93, S95, W133, M135, W159, S161, F175, C177, S181, I182, A183, S187, I192, G208, S212, C213, A214, N215, I224, T244, E248, T253 и R254, и где замены отличаются от A14T/S/R, Y61A/F, T62A, A63R, R64A/E, S67M, K69E/N, L91F, Q93A, S95D/E, W133A/H/F, M135A, W159H/A, S161A, F175I, C177A/S, S181T, I182A/V/F, A183I, S187Q, I192F, G208N, S212F/A/V, C213A/S, A214P, N215A/F, I224L, T244S, E248S, T253Y или R254A/N.
В конкретном варианте осуществления, эстераза дополнительно содержит замену в положении, выбранном из S256, T13, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, S66, I68, W70, P73, R74, D86, D92, G136, A222, L223, G225, K226, K227, F245, A246, C247, N249, P250, N251, S252, V255, C263, G60, S162, P184 или G209.
В конкретном варианте осуществления, эстераза может дополнительно содержать, по меньшей мере, одну замену в положении, выбранном из T87, T90, P94, I142, I206, N207, S210, S216, G217, N218, S219, N220 или Q221.
В конкретном варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180, H211, как в исходной эстеразе, т.е. эстераза по изобретению не модифицирована в одном, двух или во всех этих положениях. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию S134+D180+H211, как в исходной эстеразе.
В другом варианте осуществления, эстераза содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из C177, C213, C247 или C263, как в исходной эстеразе, т.е. эстераза по изобретению не модифицирована в одном, двух или во всех этих положениях. Предпочтительно, эстераза содержит комбинацию C247+C263, как в исходной эстеразе.
Активность варианта по разрушению полиэфира
Целью изобретения является предоставление новых ферментов, обладающих активность эстеразы. В конкретном варианте осуществления, фермент по изобретению демонстрирует активность кутиназы.
В конкретном варианте осуществления, эстераза по изобретению обладает активностью разрушения сложного полиэфира, предпочтительно, активностью разрушения полиэтилентерефталата (PET), и/или активностью разрушения полибутиленадипаттерефталата (PBAT), и/или активностью разрушения поликапролактона (PCL) и/или активностью разрушения поликапролактона (PCL) или активностью разрушения полибутиленсукцината (PBS), более предпочтительно, активностью разрушения полиэтилентерефталата (PET) и/или активностью разрушения полибутиленадипаттерефталата (PBAT). Еще более предпочтительно, эстераза по изобретению обладает активностью разрушения полиэтилентерефталата (РЕТ).
Преимущественно, эстераза по изобретению демонстрирует активность разрушения сложного полиэфира, по меньшей мере, в диапазоне температур от 20°С до 90°С, предпочтительно, от 40°С до 80°С, более предпочтительно, от 35°С до 55°С. В конкретном варианте осуществления, эстераза демонстрирует активность разрушения сложного полиэфира при 40°C. В конкретном варианте осуществления, эстераза демонстрирует активность разрушения сложного полиэфира при 50°C. В конкретном варианте осуществления, активность разрушения сложного полиэфира все еще поддается измерению при температуре от 55°С до 65°С. В другом варианте осуществления, активность разрушения сложного полиэфира все еще поддается измерению при температуре от 40°С до 50°С. В другом варианте осуществления, активность разрушения сложного полиэфира все еще поддается измерению при температуре от 60°С до 80°С. В другом варианте осуществления, активность разрушения сложного полиэфира все еще поддается измерению при температуре от 65°С до 75°С.
В конкретном варианте осуществления, эстераза по изобретению обладает повышенной активностью разрушения сложного полиэфира при данной температуре по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1, и, более конкретно, при температуре от 40°C до 80°C, более предпочтительно, от 40°С до 60°С, от 40°С до 50°С, от 60°С до 80°С, от 65°С до 75°С.
В конкретном варианте осуществления, эстераза имеет активность разрушения сложного полиэфира при 50°C, по меньшей мере, на 5% выше, чем активность разрушения сложного полиэфира эстеразы SEQ ID N 1, предпочтительно, по меньшей мере, на 10%, 20%, 50%, 100% или больше.
В другом конкретном варианте осуществления, эстераза имеет активность разрушения сложного полиэфира при 40°C, по меньшей мере, на 5% выше, чем активность разрушения сложного полиэфира эстеразы SEQ ID N 1, предпочтительно, по меньшей мере, на 10%, 20%, 50%, 100% или больше.
В конкретном варианте осуществления, эстераза по изобретению демонстрирует измеримую активность эстеразы, по меньшей мере, в диапазоне рН от 5 до 11, предпочтительно, в диапазоне рН от 6 до 9, более предпочтительно, в диапазоне рН от 6,5 до 9, еще более предпочтительно, в диапазоне рН от 6,5 до 8.
Нуклеиновые кислоты, кассета экспрессии, вектор, клетка-хозяин
Еще одной целью изобретения является предоставление нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу, как определено выше.
Используемые в настоящем документе, термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» относятся к последовательности дезоксирибонуклеотидов и/или рибонуклеотидов. Нуклеиновыми кислотами могут быть ДНК (кДНК или гДНК), РНК или их смесь. Она может быть в одноцепочечной форме или в форме дуплекса или их смеси. Она может быть рекомбинантного, искусственного и/или синтетического происхождения и может содержать модифицированные нуклеотиды, содержащие, например, модифицированную связь, модифицированное пуриновое или пиримидиновое основание или модифицированный сахар. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть в выделенной или очищенной форме и могут быть получены, выделены и/или обработаны методами, известными сами по себе в данной области техники, например, клонированием и экспрессией библиотек кДНК, амплификацией, ферментативным синтезом или рекомбинантной технологией. Нуклеиновые кислоты также могут быть синтезированы in vitro с помощью хорошо известных методов химического синтеза, как описано, например, в Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444.
Изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются, в жестких условиях, с нуклеиновой кислотой, кодирующей эстеразу, как определено выше. Предпочтительно, такие жесткие условия включают инкубацию фильтров для гибридизации при примерно 42°C в течение примерно 2,5 часов в 2 X SSC/0,1% SDS с последующей промывкой фильтров четыре раза по 15 минут в 1 X SSC/0,1% SDS при 65°C. Используемые протоколы описаны в таких ссылках, как Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) и Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989)).
Изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие эстеразу по изобретению, где последовательность указанных нуклеиновых кислот или, по меньшей мере, часть указанной последовательности была сконструирована с использованием оптимизированного кодона.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты по изобретению можно расшифровать из последовательности эстеразы по изобретению, и использование кодонов можно адаптировать в соответствии с клеткой-хозяином, в которой должны транскрибироваться нуклеиновые кислоты. Эти стадии могут быть осуществлены в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области, некоторые из которых описаны в справочном руководстве Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001).
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут дополнительно содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как регуляторные области, т.е. промоторы, энхансеры, сайленсеры, терминаторы, сигнальные пептиды и подобные, которые можно использовать для индукции или регуляции экспрессии полипептида в выбранной клетке-хозяине или системе.
Настоящее изобретение дополнительно относится к кассете экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению, функционально связанную с одной или несколькими контрольными последовательностями, которые управляют экспрессией указанной нуклеиновой кислоты в подходящей клетке-хозяине.
Термин «экспрессия», используемый в настоящем документе, относится к любой стадии, связанной с продуцированием полипептида, включая, но не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
Термин «кассета экспрессии» обозначает конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую область, т.е. нуклеиновую кислоту по изобретению, и регуляторную область, т.е. содержащую одну или несколько контрольных последовательностей, функционально связанных.
Как правило, кассета экспрессии содержит или состоит из нуклеиновой кислоты по изобретению, функционально связанной с контрольной последовательностью, такой как промотор транскрипции и/или терминатор транскрипции. Контрольная последовательность может включать промотор, распознаваемый клеткой-хозяином, или систему экспрессии in vitro для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу по настоящему изобретению. Промотор содержит последовательности контроля транскрипции, которые опосредуют экспрессию фермента. Промотор может быть любым полинуклеотидом, проявляющим транскрипционную активность в клетке-хозяине, включая мутантные, укороченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные клетке-хозяину. Контрольной последовательностью также может быть терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Терминатор функционально связан с 3'-концом нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу. В настоящем изобретении можно использовать любой терминатор, функционирующий в клетке-хозяине. Как правило, кассета экспрессии содержит или состоит из нуклеиновой кислоты по изобретению, функционально связанной с промотором транскрипции и терминатором транскрипции.
Изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту или кассету экспрессии, как определено выше.
Используемые в настоящем документе термины «вектор» или «вектор экспрессии» относятся к молекуле ДНК или РНК, содержащей кассету экспрессии по изобретению, используемой в качестве носителя для переноса рекомбинантного генетического материала в клетку-хозяин. Основными типами векторов являются плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды и искусственные хромосомы. Самим вектором, как правило, является последовательность ДНК, состоящая из вставки (гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, трансгена) и более крупной последовательности, которая служит «скелетом» вектора. Назначение вектора, который передает генетическую информацию хозяину, обычно состоит в выделении, размножении или экспрессии вставки в клетке-мишени. Векторы, называемые векторами экспрессии (конструкциями экспрессии), специально адаптированы для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетке-мишени и обычно имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией гетерологичных последовательностей, кодирующих полипептид. Как правило, регуляторные элементы, присутствующие в векторе экспрессии, включают промотор транскрипции, сайт связывания рибосомы, терминатор и необязательно присутствующий оператор. Предпочтительно, вектор экспрессии также содержит точку начала репликации для автономной репликации в клетке-хозяине, селектируемый маркер, ограниченное количество полезных сайтов рестрикционных ферментов и возможность большого числа копий. Примерами векторов экспрессии являются клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы, специально сконструированные плазмиды и вирусы. Векторы экспрессии, обеспечивающие подходящие уровни экспрессии полипептида у разных хозяев, хорошо известны в данной области техники. Выбор вектора обычно будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Предпочтительно, вектором экспрессии является линейная или кольцевая двухцепочечная молекула ДНК.
Другой целью изобретения является предоставление клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кассету экспрессии или вектор, как описано выше. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты, кассеты экспрессии или вектора согласно изобретению для трансформации, трансфекции или трансдукции клетки-хозяина. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую он должен быть введен.
В соответствии с изобретением, клетка-хозяин может быть трансформирована, трансфицирована или трансдуцирована временным или стабильным образом. Кассету экспрессии или вектор по изобретению вводят в клетку-хозяина таким образом, чтобы кассета или вектор сохранялись как интегрированный в хромосому элемент или как самореплицирующийся внехромосомный вектор. Термин «клетка-хозяин» также охватывает любое потомство родительской клетки-хозяина, которое не идентично родительской клетке-хозяину из-за мутаций, происходящих во время репликации. Клеткой-хозяином может быть любая клетка, подходящая для получения варианта настоящего изобретения, например, прокариот или эукариот. Прокариотической клеткой-хозяином может быть любая грамположительная или грамотрицательная бактерия. Клеткой-хозяином также может быть эукариотическая клетка, такая как клетка дрожжей, грибов, млекопитающих, насекомых или растений. В конкретном варианте осуществления, клетка-хозяин выбрана из группы Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, Pichia, Vibrio или Yarrowia.
Нуклеиновая кислота, кассета экспрессии или вектор экспрессии по изобретению могут быть введены в клетку-хозяин любым способом, известным специалисту в данной области техники, таким как электропорация, конъюгация, трансдукция, трансформация компетентных клеток, трансформация протопластов, слияние протопластов, трансформация биолистической «генной пушкой», ПЭГ-опосредованная трансформация, трансформация или трансфекция с помощью жиров, химически опосредованная трансфекция, трансформация, опосредованная ацетатом лития трансформация, липосомно-опосредованная трансформация.
Необязательно, более чем одна копия нуклеиновой кислоты, кассеты или вектора по настоящему изобретению может быть встроена в клетку-хозяина для увеличения эффективности варианта.
В конкретном варианте осуществления, клеткой-хозяином является рекомбинантный микроорганизм. Изобретение действительно позволяет сконструировать микроорганизмы с улучшенной способностью разрушать материал, содержащий сложный полиэфир. Например, последовательность по изобретению может быть использована для дополнения штамма грибка или бактерии дикого типа, уже известного своей способностью разрушать сложный полиэфир, для улучшения и/или увеличения эффективности штамма.
Продуцирование эстеразы
Другой целью изобретения является предоставление способа получения эстеразы по изобретению, включающего экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей эстеразу, и, необязательно, выделение эстеразы.
В частности, настоящее изобретение относится к in vitro способам продуцирования эстеразы по настоящему изобретению, включающим (а) контакт нуклеиновой кислоты, кассеты или вектора по изобретению с системой экспрессии in vitro; и (b) выделение полученной эстеразы. Системы экспрессии in vitro хорошо известны специалистам в данной области техники и коммерчески доступны.
Предпочтительно, способ получения включает
(а) культивирование клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую эстеразу по изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты; и необязательно
(b) выделение указанной эстеразы из клеточной культуры.
Предпочтительно, клеткой-хозяином является рекомбинантная Bacillus, рекомбинантная E.coli, рекомбинантная Aspergillus, рекомбинантная Trichoderma, рекомбинантная Streptomyces, рекомбинантная Saccharomyces, рекомбинантная Pichia, рекомбинантная Vibrio или рекомбинантная Yarrowia.
Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, пригодной для продуцирования полипептидов, с использованием способов, известных в данной области техники. Например, клетки можно культивировать путем культивирования во встряхиваемых колбах или мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (включая непрерывную, периодическую, подпитываемую или твердофазную ферментацию) в лабораторных или промышленных ферментерах, проводимой в подходящей среде и в условиях, позволяющих экспрессию и/или выделение фермента. Культивирование проходит в подходящей питательной среде, полученной от коммерческих поставщиков или приготовленной в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах American Type Culture Collection).
Если эстераза выделяется в питательную среду, ее можно выделить непосредственно из супернатанта культуры. И наоборот, эстераза может быть выделена из клеточных лизатов или после пермеабилизации. Эстеразу можно выделить любым способом, известным в данной области техники. Например, эстераза может быть выделена из питательной среды обычными способами, включая, но не ограничиваясь ими, сбор, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, сушку распылением, выпаривание или осаждение. Необязательно, эстераза может быть частично или полностью очищена различными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирующую и эксклюзионную), электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракцию для получения по существу чистых полипептидов.
Эстеразу можно использовать как таковую, в очищенной форме, отдельно или в сочетании с дополнительными ферментами, для катализа ферментативных реакций, вовлеченных в разрушение и/или рециркуляцию сложных полиэфиров и/или содержащего сложный полиэфир материала, такого как пластмассовые изделия, содержащие сложный полиэфир. Эстераза может быть в растворимой форме или в твердой фазе. В частности, она может быть связана с клеточными мембранами или жировыми везикулами или с синтетическими подложками, такими как стекло, пластмасса, полимеры, фильтры, мембраны, например, в форме шариков, столбиков, пластин и подобных.
Композиция
Еще одной целью изобретения является предоставление композиции, содержащей эстеразу, или клетку-хозяина по изобретению, или их экстракта. В контексте изобретения термин «композиция» охватывает любой вид композиций, содержащих эстеразу или клетку-хозяина по изобретению.
Композиция по изобретению может содержать от 0,1% до 99,9%, предпочтительно, от 0,1% до 50%, более предпочтительно, от 0,1% до 30%, еще более предпочтительно, от 0,1% до 5% массовых эстеразы в расчете на общую массу композиции. Альтернативно, композиция может содержать от 5 до 10% массовых эстеразы по изобретению.
Композиция может быть жидкой или сухой, например, в виде порошка. В некоторых вариантах осуществления, композицией является лиофилизат.
Композиция может дополнительно содержать эксципиенты и/или реагенты и т.д. Подходящие эксципиенты включают буферы, обычно используемые в биохимии, агенты для регулирования рН, консерванты, такие как бензоат натрия, сорбат натрия или аскорбат натрия, консерванты, защитные или стабилизирующие агенты, такие как крахмал, декстрин, аравийская камедь, соли, сахара, например сорбит, трегалоза или лактоза, глицерин, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, пропиленгликоль, коплексообразователь, такой как ЭДТА, восстанавливающие агенты, аминокислоты, носитель, такой как растворитель или водный раствор, и подобные. Композиция по изобретению может быть получена путем смешивания эстеразы с одним или несколькими эксципиентами.
В конкретном варианте осуществления, композиция содержит от 0,1% до 99,9%, предпочтительно, от 50% до 99,9%, более предпочтительно, от 70% до 99,9%, еще более предпочтительно, от 95% до 99,9% массовых эксципиентов в расчете на общую массу композиции. Альтернативно, композиция может содержать от 90% до 95% массовых эксципиентов.
В конкретном варианте осуществления, композиция может дополнительно содержать дополнительные полипептиды, проявляющие ферментативную активность. Количества эстеразы по изобретению легко адаптируются специалистами в данной области техники в зависимости, например, от природы разрушаемого сложного полиэфира и/или дополнительных ферментов/полипептидов, содержащихся в композиции.
В конкретном варианте осуществления, эстеразу по изобретению солюбилизируют в водной среде вместе с одним или несколькими эксципиентами, особенно эксципиентами, которые способны стабилизировать или защищать полипептид от разрушения. Например, эстераза по изобретению может быть растворена в воде, в конечном счете, с дополнительными компонентами, такими как глицерин, сорбит, декстрин, крахмал, гликоль, такой как пропандиол, соль и т. д. Затем полученную смесь можно высушить с получением порошка. Способы сушки такой смеси хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, без ограничений, лиофилизацию, сушку вымораживанием, сушку распылением, сверхкритическую сушку, выпаривание в нисходящем потоке воздуха, тонкослойное выпаривание, центробежное выпаривание, конвейерную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, барабанную сушку или любую их комбинацию.
В конкретном варианте осуществления, композиция находится в форме порошка и содержит эстеразу и стабилизирующее/солюбилизирующее количество глицерина, сорбита или декстрина, такого как мальтодекстрин и/или циклодекстрин, крахмала, гликоля, такого как пропандиол, и/или соли.
В конкретном варианте осуществления, композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, одну рекомбинантную клетку, экспрессирующую эстеразу по изобретению, или ее экстракт. «Экстракт клетки» означает любую фракцию, полученную из клетки, такую как клеточный супернатант, клеточный дебрис, клеточные стенки, экстракт ДНК, ферменты или ферментный препарат, или любой препарат, полученный из клеток с помощью химической, физической и/или ферментативной обработки, которая практически не содержит живых клеток. Предпочтительными экстрактами являются ферментативно активные экстракты. Композиция по изобретению может содержать одну или несколько рекомбинантных клеток по изобретению или их экстракт и, необязательно, одну или несколько дополнительных клеток.
В одном варианте осуществления, композиция состоит или содержит культуральную среду рекомбинантного микроорганизма, экспрессирующего и выделяющего эстеразу по изобретению. В конкретном варианте осуществления, композиция содержит такую лиофилизированную культуральную среду.
Использование эстеразы
Еще одной целью изобретения является предоставление способов с использованием эстеразы по изобретению для разрушения и/или переработки в аэробных или анаэробных условиях сложного полиэфира или материала, содержащего сложный полиэфир. Эстеразы по изобретению особенно полезны для разрушения РЕТ и материалов, содержащих РЕТ.
Таким образом, целью изобретения является использование эстеразы по изобретению или соответствующей рекомбинантной клетки или ее экстракта, или композиции для ферментативного расщепления сложного полиэфира.
В конкретном варианте осуществления сложный полиэфир, таргетируемый эстеразой, выбран из полиэтилентерефталата (РЕТ), политриметилентерефталата (РТТ), полибутилентерефталата (РВТ), полиэтиленизосорбидтерефталата (PEIT), полимолочной кислоты (PLA), полигидроксиалканоата (PHA), полибутиленсукцината (PBS), полибутиленсукцинатадипата (PBSA), полибутиленадипаттерефталата (PBAT), полиэтиленфураноата (PEF), поликапролактона (PCL), поли(этиленадипата) (PEA), полиэтиленнафталата (PEN) и смесей/смесей этих материалов, предпочтительно, полиэтилентерефталата.
В предпочтительном варианте осуществления, сложным полиэфиром является РЕТ и, по меньшей мере, выделяют мономеры (например, моноэтиленгликоль или терефталевая кислота) и/или олигомеры (например, метил-2-гидроксиэтилтерефталат (MHET), бис(2-гидроксиэтил)терефталат (BHET), 1-(2-гидроксиэтил) 4-метилтерефталат (HEMT) и диметилтерефталат (DMT).
Также целью изобретения является использование эстеразы по изобретению, или соответствующей рекомбинантной клетки, или ее экстракта, или композиции для ферментативного разрушения, по меньшей мере, одного сложного полиэфира материала, содержащего сложный полиэфир.
Другой целью изобретения является предоставление способа разрушения, по меньшей мере, одного сложного полиэфира материала, содержащего сложный полиэфир, в котором материал, содержащий сложный полиэфир, контактирует с эстеразой, или клеткой-хозяином, или их экстрактом, или композицией по изобретению, тем самым разрушая, по меньшей мере, один сложный полиэфир материала, содержащего сложный полиэфир.
Преимущественно, сложные полиэфиры деполимеризуют до мономеров и/или олигомеров.
В частности, изобретение предоставляет способ разрушения РЕТ материала, содержащего РЕТ, где материал, содержащий РЕТ, контактирует с эстеразой, или клеткой-хозяином, или композицией по изобретению, тем самым разрушая РЕТ.
В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один сложный полиэфир расщепляется до реполимеризуемых мономеров и/или олигомеров, которые могут быть, преимущественно, извлечены для повторного использования. Извлеченные мономеры/олигомеры могут быть использованы для рециркулирования (например, реполимеризуемых сложных полиэфиров) или метанизации. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, одним сложным полиэфиром является РЕТ, и извлекают моноэтиленгликоль, терефталевую кислоту, метил-2-гидроксиэтилтерефталат (MHET), бис(2-гидроксиэтил)терефталат (BHET), 1-(2-гидроксиэтил) 4-метилтерефталат (HEMT) и/или диметилтерефталат (DMT).
В варианте осуществления, сложные полиэфиры материала, содержащего сложный полиэфир, полностью разрушаются.
Время, необходимое для разрушения материала, содержащего сложный полиэфир, может варьироваться в зависимости от самого материала, содержащего сложный полиэфир (т. е. природы и происхождения материала, содержащего сложный полиэфир, его состава, формы и т. д.), типа и количества используемой эстеразы, а также различных параметров процесса (т.е. температуры, pH, дополнительных агентов и т.д.). Специалист в данной области техники может легко адаптировать параметры процесса к материалу, содержащему сложный полиэфир, и предполагаемому времени разрушения.
Предпочтительно, процесс разрушения осуществляют при температуре от 20°С до 90°С, предпочтительно, от 40°С до 80°С, более предпочтительно, от 40°С до 50°С. В конкретном варианте осуществления, процесс разрушения осуществляют при 40°С. В другом конкретном варианте осуществления, процесс разрушения осуществляют при 50°С. В более общем случае, температуру поддерживают ниже температуры инактивации, которая соответствует температуре, при которой эстераза инактивируется (т.е. теряет более 80% активности по сравнению с ее активностью при оптимальной температуре) и/или рекомбинантный микроорганизм больше не синтезирует эстеразу. В частности, температуру поддерживают ниже температуры стеклования (Tg) таргетного сложного полиэфира.
Преимущественно, процесс осуществляют в непрерывном потоке при температуре, при которой эстеразу можно использовать несколько раз и/или рециркулировать.
Преимущественно, процесс разрушения осуществляют при рН от 5 до 11, предпочтительно, при рН от 6 до 9, более предпочтительно, при рН от 6,5 до 9, еще более предпочтительно, при рН от 6,5 до 8.
В конкретном варианте осуществления материал, содержащий сложный полиэфир, может быть предварительно обработан перед контактом с эстеразой, чтобы физически изменить его структуру так, чтобы увеличить поверхность контакта между сложным полиэфиром и эстеразой.
Другой целью изобретения является предоставление способа получения мономеров и/или олигомеров из материала, содержащего сложный полиэфир, включающего воздействие на материал, содержащий сложный полиэфир, эстеразы по изобретению или соответствующей рекомбинантной клеткой, или их экстракта, или композиции, и, необязательно, выделение мономеров и/или олигомеров.
Мономеры и/или олигомеры, полученные в результате деполимеризации, могут быть выделены, последовательно или непрерывно. Один тип мономеров и/или олигомеров или несколько различных типов мономеров и/или олигомеров, могут быть выделены, в зависимости от исходного материала, содержащего сложный полиэфир.
Способ по настоящему изобретению особенно полезен для получения мономеров, выбранных из моноэтиленгликоля и терефталевой кислоты, и/или олигомеров, выбранных из метил-2-гидроксиэтилтерефталата (MHET), бис(2-гидроксиэтил)терефталата (BHET), 1-(2 гидроксиэтил) 4-метилтерефталата (HEMT) и диметилтерефталата (DMT), из РЕТ и/или пластмассовых изделий, содержащих РЕТ.
Восстановленные мономеры и/или олигомеры могут быть дополнительно очищены с использованием всех подходящих способов очистки, и кондиционированы в реполимеризуемой форме. Примеры способов очистки включают процесс отгонки, разделение водным раствором, селективную конденсацию паром, фильтрацию и концентрираацию среды после биопроцесса, разделение, дистилляцию, вакуумное выпаривание, экстракцию, электродиализ, адсорбцию, ионный обмен, осаждение, кристаллизацию, концентрацию и кислотно-аддитивную дегидратацию и осаждение, нанофильтрацию, обработку кислотным катализатором, перегонку в полунепрерывном режиме или перегонку в непрерывном режиме, экстракцию растворителем, испарительную концентрацию, испарительную кристаллизацию, экстракцию жидкость/жидкость, гидрирование, процесс азеотропной перегонки, адсорбцию, колоночную хроматографию, простую вакуумную перегонку и микрофильтрацию, в комбинации или нет.
Выделенные реполимеризуемые мономеры и/или олигомеры могут быть повторно использованы, например, для синтеза сложных полиэфиров. Преимущественно, сложные полиэфиры той же природы подвергают реполимеризуют. Однако, возможно смешивать выделенные мономеры и/или олигомеры с другими мономерами и/или олигомерами, например, для синтеза новых сополимеров. Альтернативно, выделенные мономеры могут быть использованы в качестве промежуточных химических соединений для получения новых представляющих интерес химических соединений.
Изобретение также относится к способу поверхностного гидролиза или поверхностной функционализации материала, содержащего сложный полиэфир, включающему воздействие на материал, содержащий сложный полиэфир, эстеразы по изобретению, или соответствующей рекомбинантной клетки, или их экстракта, или композиции. Способ по изобретению особенно полезен для повышения гидрофильности или гигроскопичности полиэфирного материала. Такая повышенная гидрофильность может представлять особый интерес в производстве текстиля, электроники и биомедицинского применения.
Еще одной целью изобретения является предоставление материала, содержащего сложный полиэфир, содержащего эстеразу по изобретению и/или рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий и выделяющий указанную эстеразу. В качестве примера, способы получения такого материала, содержащего сложный полиэфир, в том числе эстеразы по настоящему изобретению, описаны в патентных заявках WO2013/093355, WO 2016/198650, WO 2016/198652, WO 2019/043145 и WO 2019/043134.
Таким образом, целью изобретения является предоставление материала, содержащего сложный полиэфир, содержащего эстеразу по изобретению, и/или рекомбинантную клетку, и/или их композицию, или экстракт, и, по меньшей мере, РЕТ. В соответствии с вариантом осуществления, изобретение относится к пластмассовому изделию, содержащему РЕТ и эстеразу по изобретению, обладающую активностью, разрушающей РЕТ.
Таким образом, другой целью изобретения является предоставление материала, содержащего сложный полиэфир, содержащего эстеразу по изобретению, и/или рекомбинантную клетку, и/или их композицию, или экстракт, и, по меньшей мере, РВАТ. В соответствии с вариантом осуществления, изобретение относится к пластмассовому изделию, содержащему РВАТ и эстеразу по изобретению, обладающую активностью разрушения РВАТ.
Таким образом, другой целью изобретения является предоставление материала, содержащего сложный полиэфир, содержащего эстеразу по изобретению, и/или рекомбинантную клетку, и/или их композицию, или экстракт, и, по меньшей мере, PBS. В соответствии с вариантом осуществления изобретение относится к пластмассовому изделию, содержащему PBS и эстеразу по изобретению, обладающую активностью разрушения PBS.
Таким образом, другой целью изобретения является предоставление материала, содержащего сложный полиэфир, содержащего эстеразу по изобретению, и/или рекомбинантную клетку, и/или их композицию, или экстракт и, по меньшей мере, PCL. В соответствии с вариантом осуществления изобретение относится к пластмассовому изделию, содержащему PCL и эстеразу по изобретению, обладающую активностью разрушения PCL.
Классически эстераза по изобретению может использоваться в моющих средствах, пищевых продуктах, кормах для животных, при производстве бумаги, текстиля и в фармацевтике. Более конкретно, эстераза по изобретению может быть использована в качестве компонента моющей композиции. Моющие композиции включают, без ограничений, моющие композиции для ручной или машинной стирки, такие как композиция добавки для стирки, подходящая для предварительной обработки окрашенных тканей, и композиция смягчителя ткани с добавлением ополаскивателя, композиция моющего средства для использования в обычных бытовых операциях по очистке твердых поверхностей, моющие композиции для ручного или машинного мытья посуды. В конкретном варианте осуществления, эстераза по изобретению может использоваться в качестве моющей добавки. Таким образом, изобретение представляет моющие композиции, содержащие эстеразу по изобретению. В частности, эстераза по изобретению может быть использована в качестве моющей добавки для уменьшения эффекта пиллинга и посерения во время чистки текстиля.
Настоящее изобретение также относится к способам применения эстеразы по изобретению в кормах для животных, а также к кормовым композициям и кормовым добавкам, содержащим эстеразу по изобретению. Термины «корм» и «кормовая композиция» относятся к любому соединению, препарату, смеси или композиции, подходящей или предназначенной для потребления животным. В другом конкретном варианте осуществления, эстеразу по изобретению используют для гидролиза белков и получения гидролизатов, содержащих пептиды. Такие гидролизаты можно использовать в качестве кормовой композиции или кормовых добавок.
Еще одной целью изобретения является предоставление способа использования эстеразы по изобретению в бумажной промышленности. Более конкретно, эстераза по изобретению может быть использована для удаления липких включений из трубопроводов для бумажной массы и воды бумагоделательных машин.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Конструирование, экспрессия и очистка эстераз
- Конструирование
Эстеразы по изобретению создают с использованием плазмидной конструкции pET21b-IsPETase-His или pET26b-IsPETase-His. Эти плазмиды состоят из клонирования гена, кодирующего эстеразу SEQ ID N 1, оптимизированного для экспрессии Escherichia coli между сайтами рестрикции NdeI и XhoI. Лидерную последовательность PelB, для направления экспрессированного белка на бактериальную периплазму, добавляют выше SEQ ID N 1 (после метионина в положении 1) для некоторых вариантов (V2, V3 и V4). В соответствии с рекомендациями поставщика, для создания вариантов эстеразы используют два набора для сайт-направленного мутагенеза: QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit и QuikChange Lightning Multi Site-Directed от Agilent (Santa Clara, California, USA).
- Экспрессия и очистка эстераз
Штаммы Stellar™ (Clontech, California, USA) и E. coli Tuner™ (DE3) (Merck Millipore, Guyancourt, France) или E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs, Evry, France) успешно применяют для проведения клонирования и рекомбинантной экспрессии в 50 мл среды LB-Miller или аутоиндуцируемой среды ZYM (Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234). Индукцию в среде LB-Miller осуществляют при 16°C с использованием 0,5 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG, Euromedex, Souffelweyersheim, France). Культуры останавливают центрифугированием (8000 об/мин, 20 минут при 10°С) в центрифуге Avanti J-26 XP (Beckman Coulter, Brea, USA). Клетки суспендируют в 20 мл буфера Talon (Tris-HCl 20 мМ, NaCl 300 мМ, pH 8). Затем клеточную суспензию обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут с амплитудой 30% (циклы 2 с ВКЛ и 1 с ВЫКЛ) ультразвуковым устройством FB 705 (Fisherbrand, Illkirch, France). Затем проводят стадию центрифугирования: 30 минут при 11000 об/мин, 10°С в центрифуге Eppendorf. Растворимую фракцию собирают и подвергают аффинной хроматографии. Эту стадию очистки завершают с помощью смолы Talon® Metal Affinity Resin (Clontech, CA, USA). Элюирование белка проводят с использованием буфера Talon с добавлением имидазола. Очищенный белок подвергают диализу против буфера Talon, затем количественно определяют с помощью анализа белка Bio-Rad в соответствии с инструкциями производителя (Lifescience Bio-Rad, France) и хранят при +4°C.
Пример 2 - Оценка активности разрушения эстераз по изобретению
Активность разрушения эстераз определяют и сравнивают с активностью разрушения эстеразы SEQ ID N 1.
Используют несколько методологий для оценки конкретной активности:
(1) Удельная активность и конечный выход на основе гидролиза РЕТ.
(2) Активность, основанная на разрушении сложного полиэфира в твердой форме.
(3) Активность, основанная на гидролизе РЕТ в реакторах выше 100 мл
2.1. Удельная активность и конечный выход на основе гидролиза РЕТ
100 мг аморфного РЕТ в виде порошка (получен в соответствии с WO 2017/198786 для достижения кристалличности ниже 20%), взвешивают и помещают в 100 мл стеклянную бутылку. 1 мл препарата эстеразы, содержащего эстеразу с SEQ ID N 1 (в качестве эталонного контроля) или эстеразу по изобретению, приготовленные в концентрации 0,02 мг/мл в буфере Talon (Tris-HCl 20 мМ, NaCl 0,3 М, рН 8), добавляют в стеклянную бутылку. Наконец, добавляют 49 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера с рН 8.
Деполимеризацию начинают с инкубации каждой стеклянной бутылки при 30°C, 40°C, 50°C, 55°C или 60°C и 150 об/мин в инкубаторе Max Q 4450 (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA).
Начальную скорость реакции деполимеризации, выраженную в мг образованного эквивалента ТА/час, определяют путем отбора проб в разное время в течение первых 72 часов и анализа с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UHPLC). При необходимости, пробы разводят в 0,1 М калий-фосфатном буфере с рН 8. Затем к 150 мкл пробы или разведения добавляют 150 мкл метанола и 6,5 мкл HCl 6 N. После смешивания и фильтрации на 0,45 мкм шприцевом фильтре образцы загружают на UHPLC для мониторинга высвобождения терефталевой кислоты (ТА), MHET и BHET. Используемой системой хроматографии является система Ultimate 3000 UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA), включающая насосный модуль, автоматический пробоотборник, печь для колонок, термостатируемую при 25°C, и УФ датчик при 240 нм. Используемой колонкой является Discovery® HS C18 HPLC Column (150×4,6 мм, 5 мкм, оборудованная предколонкой, Supelco, Bellefonte, USA). TA, MHET и BHET разделяют с использованием градиента MeOH (от 30% до 90%) в 1 мМ H2SO4 со скоростью 1 мл/мин. Инъекция составляет 20 мкл образца. TA, MHET и BHET измеряют в соответствии со стандартными кривыми, полученными из коммерческих TA и BHET, а также из синтезированного своими силами MHET в тех же условиях, что и образцы. Удельную активность гидролиза РЕТ (мг эквивалента ТА/час/мг фермента) определяют на линейной части кривой гидролиза реакции, построенной по пробам, проведенным в разное время в течение первых 72 часов. Эквивалентная TA соответствует сумме измеренной TA и TA, содержащейся в измеренных MHET и BHET.
2.2. Активность, основанная на разрушении сложного полиэфира в твердой форме
20 мкл ферментного препарата помещают в лунку, созданную на планшете с агаром, содержащую РЕТ. Приготовление планшетов с агаром осуществляют растворением 500 мг РЕТ в гексафтор-2-пропаноле (HFIP) и заливкой этой среды в 250 мл водного раствора. После выпаривания HFIP при 52°С и давлении 140 мбар, раствор смешивают об./об. с 0,2 М калий-фосфатного буфера, рН 8, содержащего 3% агар. Около 30 мл смеси используют для приготовления каждого планшета, и хранят при 4°C.
Диаметры или площадь поверхности ореолов, образовавшихся в результате разрушения полиэфира эстеразой дикого типа и вариантами, измеряют и сравнивают через 2-24 часа при 30°C, 40°C, 50°C, 55°C или 60°C.
2.3. Активность, основанная на гидролизе РЕТ в реакторе
От 0,69 мкмоль до 2,07 мкмоль очищенной эстеразы, приготовленной в 80 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера с рН 8, смешивают с 20 г аморфного РЕТ (приготовленного в соответствии с WO 2017/198786 для достижения кристалличности ниже 20%) в 500 мл биореакторе Minibio (Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands). Регулирование температуры при 30°С, 40°С, 50°С, 55°С или 60°С осуществляют путем погружения в водяную баню, и одну судовую крыльчатку используют для поддержания постоянного перемешивания со скоростью 250 об/мин. Величину pH анализа деполимеризации РЕТ регулируют на уровне pH 8 с помощью 6N NaOH и обеспечивают биоконтроллерной системой my-Control (Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands). Потребление основания регистрируют во время анализа, и его можно использовать для характеристики анализа деполимеризации РЕТ.
Конечный выход анализа деполимеризации РЕТ определяют либо путем определения остаточной массы РЕТ, либо путем определения образованного эквивалента ТА, либо путем определения потребления основания. Массу остаточного РЕТ определяют фильтрованием, в конце реакции, реакционного объема через 12-15 мкм беззольный бумажный фильтр 11 класса (Dutscher SAS, Brumath, France) и сушкой такого ретентата перед его взвешиванием. Определение образованного эквивалента ТА осуществляют с использованием способов UHPLC, описанных в 2.1, и долю гидролиза рассчитывают на основе отношения молярной концентрации в данный момент времени (TA+MHET+BHET) к общему количеству ТА, содержавшемуся в исходном образце. Деполимеризация РЕТ дает кислотные мономеры, которые будут нейтрализованы основанием, способным поддерживать pH в реакторе. Определение произведенного эквивалента ТА рассчитывают с использованием соответствующего молярного поглощения основания, и долю гидролиза рассчитывают на основе отношения молярной концентрации эквивалента ТА в данный момент времени к общему количеству ТА, содержащемуся в исходном образце.
Выход эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 70 часов показан в Таблице 1 (при 40°С) и Таблице 2 (при 50°С) ниже. Выход эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 89 часов показан в Таблице 3 (при 40°С) и Таблице 4 (при 50°С) ниже. Все таблицы указывают на улучшение выхода варианта при деполимеризации РЕТ по сравнению с выходом эстеразы с SEQ ID N 1 при деполимеризации РЕТ, используемым в качестве эталона (приравненным к 1).
Выход деполимеризации РЕТ измеряют, как показано в примере 2.1.
Таблица 1: Повышение выхода эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 70 часов при 40°C
Таблица 2: Улучшение выхода эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 70 часов при 50°C
Таблица 3: Улучшение выхода эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 89 часов при 40°C
Таблица 4: Улучшение выхода эстеразы по изобретению при деполимеризации РЕТ через 89 часов при 50°C
Пример 3 - Оценка термостабильности эстераз по изобретению
Термостабильность эстераз по изобретению определяют и сравнивают с термостабильностью эстеразы SEQ ID N 1.
Для оценки термостабильности используют различные методологии:
(1) Круговой дихроизм белков в растворе;
(2) Остаточная активность эстеразы после инкубации белка в данных условиях температур, времени и буферов;
(3) Остаточная активность деполимеризации сложного полиэфира после инкубации белка в заданных условиях температур, времени и буферов;
(4) Способность разрушать твердое полиэфирное соединение (такое как РЕТ или РВАТ или аналоги), диспергированное в планшете с агаром, после инкубации белка в заданных условиях температур, времени и буферов;
(5) Возможность проведения нескольких циклов анализа деполимеризации сложного полиэфира в заданных условиях температур, буферов, концентраций белка и концентраций сложного полиэфира;
(6) Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF);
Подробности протокола таких способов приведены ниже.
3.1 Круговой дихроизм
Круговой дихроизм (CD) проводят на приборе Jasco 815 (Easton, USA) для сравнения температуры плавления (Tm) эстеразы SEQ ID N 1 (Tm=46,4°C) с Tm эстераз по изобретению. Технически, 400 мкл образец белка готовят в концентрации 0,5 мг/мл в буфере Talon и используют для CD. Первое сканирование от 280 до 190 нм проводят для определения двух максимальных интенсивностей CD, соответствующих правильной укладке белка. Затем проводят второе сканирование при температуре от 25°C до 110°C при длинах волн, соответствующих таким максимальным интенсивностям и дающих специфические кривые (сигмоидные 3 параметра y=a/(1+e^((x-x0)/b))), которые анализируют с помощью программного обеспечения Sigmaplot версии 11.0, Tm определяют, когда x=x0. Полученная Tm отражает термостабильность данного белка. Чем выше Tm, тем более устойчив вариант при высокой температуре.
3.2 Остаточная активность эстеразы
1 мл раствора 40 мг/л (в буфере Talon) эстеразы SEQ ID N 1 или эстеразы по изобретению инкубируют при различных температурах (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 и 90°С) в течение до 10 дней. Регулярно берут образец, разбавляют от 1 до 500 раз в 0,1 М калий-фосфатном буфере с рН 8,0 и проводят пара-нитрофенол-бутиратный (pNP-B) анализ. 20 мкл образца смешивают с 175 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 8,0, и 5 мкл раствора pNP-B в 2-метил-2-бутаноле (40 мМ). Ферментативную реакцию проводят при 30°С при перемешивании в течение 15 минут и измеряют оптическую плотность при 405 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Активность гидролиза pNP-B (начальную скорость, выраженную в мкмоль pNPB/мин) определяют с применением стандартной кривой для высвобождающегося пара-нитрофенола в линейной части кривой гидролиза.
3.3 Остаточная активность деполимеризации сложного полиэфира
10 мл раствора 40 мг/л (в буфере Talon) эстеразы SEQ ID N 1 и эстеразы по изобретению, соответственно, инкубируют при различных температурах (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 и 90°С) в течение от 1 до 30 дней. Регулярно берут 1 мл образец и переносят в бутылку, содержащую 100 мг аморфного РЕТ (приготовленного в соответствии с WO 2017/198786 для достижения степени кристалличности ниже 20%), микронизированного при 250-500 мкм, и 49 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера с рН 8,0, и инкубируют при различных температурах (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70°С). Регулярно отбирают 150 мкл буфера. При необходимости, образцы разводят в 0,1 М калий-фосфатном буфере с рН 8. Затем к 150 мкл образца или разведения добавляют 150 мкл метанола и 6,5 мкл HCl 6 N. После смешивания и фильтрации на 0,45 мкм шприцевом фильтре, образцы загружают на UHPLC для мониторинга высвобождения терефталевой кислоты (ТА), MHET и BHET. Используемой системой хроматографии является система Ultimate 3000 UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA), включающая насосный модуль, автоматический пробоотборник, печь для колонок, термостатируемую при 25°C, и УФ датчик при 240 нм. Используемой колонкой является Discovery® HS C18 HPLC Column (150×4,6 мм, 5 мкм, оборудованная предколонкой, Supelco, Bellefonte, USA). TA, MHET и BHET разделяют с использованием градиента MeOH (от 30% до 90%) в 1 мМ H2SO4 со скоростью 1 мл/мин. Инъекция составляет 20 мкл образца. TA, MHET и BHET измеряют в соответствии со стандартными кривыми, полученными из коммерческих TA и BHET, а также из синтезированного своими силами MHET в тех же условиях, что и образцы. Активность гидролиза РЕТ (мкмоль гидролизованного РЕТ/мин или мг полученного эквивалента ТА/час) определяют на линейной части кривой гидролиза, построенной по пробам, проведенным в разное время в течение первых 24 часов. Эквивалентная TA соответствует сумме измеренной TA и TA, содержащейся в измеренных MHET и BHET.
3.4 Разрушение полиэфира в твердом состоянии
1 мл раствора 40 мг/л (в буфере Talon) эстеразы SEQ ID N 1 и эстеразы изобретения, соответственно, инкубируют при различных температурах (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 и 90°С) в течение от 1 до 30 дней. Регулярно 20 мкл ферментного препарата помещают в лунку, созданную в планшете с агаром, содержащем РЕТ. Приготовление планшетов с агаром, содержащих РЕТ, осуществляют растворением 500 мг РЕТ в гексафтор-2-пропаноле (HFIP) и заливкой этой среды в 250 мл водного раствора. После выпаривания HFIP при 52°С и давлении 140 мбар, раствор смешивают об./об. с 0,2 М калий-фосфатным буфером, рН 8, содержащим 3% агар. Около 30 мл смеси используют для приготовления каждого планшета иммунологического прямоугольного OmniTray, и хранят при 4°C.
Диаметр или площадь поверхности ореолов, образовавшихся в результате разрушения сложного полиэфира эстеразой дикого типа и вариантами изобретения, измеряют и сравнивают через 2-24 часа при 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C или 70°С. Период полужизни фермента при данной температуре соответствует времени, необходимому для уменьшения в 2 раза диаметра ореола.
3.5 Несколько циклов деполимеризации сложного полиэстера
Способность эстеразы осуществлять последовательные циклы анализа деполимеризации сложного полиэфира оценивают в ферментативном реакторе. Биореактор Minibio 500 (Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands) запускают с 3 г аморфного РЕТ (приготовленного в соответствии с WO 2017/198786 для достижения степени кристалличности ниже 20%) и 100 мл 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 8, содержащего 3 мг LC-эстеразы. Скорость перемешивания устанавливают на 250 об/мин с помощью судовой крыльчатки. Биореактор термостатируют при 30°С, 35°С, 40°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С или 70°С путем погружения во внешнюю водяную баню. рН регулируют на уровне 8 путем добавления КОН в концентрации 3 М. Различные параметры (рН, температура, перемешивание, добавление основания) контролируют с помощью программного обеспечения BioXpert V2.95. Каждые 20 часов добавляют 1,8 г аморфного РЕТ (полученного в соответствии с WO 2017/198786 для достижения степени кристалличности ниже 20%). Регулярно берут 500 мкл реакционной среды.
Количество TA, MHET и BHET определяют с помощью HPLC, как описано в примере 2.3. Количество EG определяют на колонке Aminex HPX-87K (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, California, United States), термостатированной при 65°С. Элюентом является K2HPO4 5 мМ при 0,6 мл.мин-1. Инъекция составляет 20 мкл. Содержание этиленгликоля контролируют с помощью рефрактометра.
Доли гидролиза рассчитывают на основе соотношения молярной концентрации в данный момент времени (TA +MHET+BHET) к общему количеству ТА, содержащейся в исходном образце, или на основе соотношения молярной концентрации в данный момент времени (EG +MHET+2 x BHET) по сравнению с общим количеством EG, содержащегося в исходном образце. Скорость разрушения рассчитывают в мг общей высвобожденной ТА в час или в мг общего EG в час.
Период полужизни фермента оценивают как время инкубации, необходимое для получения потери 50% скорости разрушения.
3.6 Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF)
DSF используют для оценки термостабильности белка дикого типа (SEQ ID N 1) и его вариантов путем определения их температуры плавления (Tm), температуры, при которой разворачивается половина белковой популяции. Образцы белка готовят в концентрации 14 мкМ и хранят в буфере А, состоящем из 20 мМ Tris HCl pH 8,0, 300 мМ NaCl. Исходный раствор красителя SYPRO Orange 5000x в ДМСО сначала разводят водой до 250x. Образцы белка загружают на белый прозрачный 96-луночный планшет для ПЦР (Bio-Rad, кат. № HSP9601), где каждая лунка содержит конечный объем 25 мкл. Конечная концентрация белка и красителя SYPRO Orange в каждой лунке составляет 5 мкМ (0,14 мг/мл) и 10Х, соответственно. Загруженные объемы на лунку следующие: 15 мкл буфера А, 9 мкл 14 мкМ раствора белка и 1 мкл 250Х разбавленного раствора Sypro Orange. Затем планшеты для ПЦР герметично закрывают герметичной лентой оптического качества и вращают при 2000 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем проводят эксперименты DSF с использованием системы ПЦР в реальном времени CFX96, настроенной на использование фильтров возбуждения 450/490 и испускания 560/580. Образцы нагревают от 25 до 100°С со скоростью 0,3°С/сек. Одно измерение флуоресценции проводят каждые 0,03 секунды. Температуры плавления определяют по пику(ам) первых производных кривой плавления с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
Затем сравнивают эстеразы SEQ ID N 1 и эстеразы по изобретению на основании их значений Tm. Из-за высокой воспроизводимости между экспериментами с одним и тем же белком из разных продуктов, ΔTm 0,8°C считается значимой для сравнения вариантов. Значения Tm соответствуют среднему значению, по меньшей мере, 3 измерений. Tm эстеразы SEQ ID N 1 оценивают при 46,4°C +/-0,2°C, как показано в примере 3.6.
Термостабильность варианта эстеразы по изобретению показана в таблице 5 ниже, выражена в значениях Tm и оценена согласно примеру 3.6. Прирост Tm по сравнению с эстеразой SEQ ID N 1 указан в скобках.
Таблица 5: Tm эстеразы по изобретению
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CARBIOS
<120> НОВЫЕ ЭСТЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> B3033PC00
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 264
<212> БЕЛОК
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 1
Met Gln Thr Asn Pro Tyr Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ser Ala Gly Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser
20 25 30
Arg Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala
35 40 45
Gly Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg
50 55 60
Gln Ser Ser Ile Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe
65 70 75 80
Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser
85 90 95
Arg Ser Ser Gln Gln Met Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn
100 105 110
Gly Thr Ser Ser Ser Pro Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met
115 120 125
Gly Val Met Gly Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala
130 135 140
Ala Asn Asn Pro Ser Leu Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp
145 150 155 160
Ser Ser Thr Asn Phe Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala
165 170 175
Cys Glu Asn Asp Ser Ile Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile
180 185 190
Tyr Asp Ser Met Ser Arg Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly
195 200 205
Gly Ser His Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile
210 215 220
Gly Lys Lys Gly Val Ala Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr
225 230 235 240
Arg Tyr Ser Thr Phe Ala Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser
245 250 255
Asp Phe Arg Thr Ala Asn Cys Ser
260
<210> 2
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность PelB
<400> 2
Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gln Pro Ala Met Ala
20
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВАРИАНТЫ ГЛИКОЛИПИДАЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ | 2004 |
|
RU2377300C2 |
| БЕЛКИ | 2004 |
|
RU2518345C2 |
| МОЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 2015 |
|
RU2737535C2 |
| ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПЕРКИСЛОТЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОДУКТАХ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА | 2011 |
|
RU2660373C2 |
| ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПЕРКИСЛОТЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОДУКТАХ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА | 2011 |
|
RU2793140C2 |
| НОВЫЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ФИТАЗЫ С ВЫСОКОЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ | 2018 |
|
RU2758271C2 |
| ФЕРМЕНТЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРКИСЛОТ | 2013 |
|
RU2645257C2 |
| ФЕРМЕНТЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРКИСЛОТ | 2013 |
|
RU2644333C2 |
| ФЕРМЕНТЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРКИСЛОТ | 2013 |
|
RU2644330C2 |
| ФЕРМЕНТЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРКИСЛОТ | 2013 |
|
RU2644336C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена эстераза, которая имеет, по меньшей мере, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NО: 1, содержит, по меньшей мере, комбинацию замен N207C и S256C и имеет повышенную активность разрушения сложных полиэфиров и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID NО: 1. Также предложены нуклеиновая кислота, кодирующая указанную эстеразу, кассета экспрессии, содержащая указанную нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, содержащая указанные нуклеиновую кислоту или кассету, композиция для разрушения материалов, содержащих сложные полиэфиры, содержащая указанные эстеразу или клетку-хозяина. Также предложен способ разрушения, по меньшей мере, одного сложного полиэфира материала, содержащего сложный полиэфир, с использованием указанных эстеразы или клетки-хозяина или композиции. Изобретение обеспечивает получение эстераз, проявляющих повышенную активность и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NО: 1. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.
1. Эстераза, которая (i) имеет, по меньшей мере, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, (ii) содержит, по меньшей мере, комбинацию замен N207C + S256C, и (iii) имеет повышенную активность разрушения сложных полиэфиров и/или повышенную термостабильность по сравнению с эстеразой SEQ ID NO: 1.
2. Эстераза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну замену, выбранную из S212I/W, F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, N220P/D, S187E, A14H, T172Q и K226E, предпочтительно выбранную из Q93G/P, S187E, S212I/W или N220P/D.
3. Эстераза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, соответствующем остаткам, выбранным из T13, A14, A15, S16, L17, E18, A19, S20, A21, G60, Y61, A63, R64, S67, I68, K69, W70, P73, R74, D86, T87, T90, L91, D92, P94, S95, W133, M135, G136, I142, W159, S161, S162, C177, I182, A183, P184, S187, I192, I206, G208, G209, S210, C213, A214, S216, G217, N218, S219, N220, Q221, A222, L223, I224, G225, K226, K227, T244, F245, A246, C247, E248, N249, P250, N251, S252, T253, R254, V255 или C263.
4. Эстераза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная эстераза содержит, по меньшей мере, комбинацию замен в положениях S212I/W+N207C+S256C.
5. Эстераза по п. 4, отличающаяся тем, что указанная эстераза содержит, по меньшей мере, одну замену в положениях, выбранных из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M, Q93G/P, S187E, N220P/D, A14H, T172Q и K226E, предпочтительно выбранных из F175I, S181N, S66T, T62M, N215D/M и Q93G/P.
6. Эстераза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная эстераза содержит, по меньшей мере, одну комбинацию замен, выбранную из группы, состоящей из S212I/W+N207C+S256C, S212I/W+N207C+S256C+Q93G/P или S212I+N207C+S256C+Q93G+N220P+S187E.
7. Эстераза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная эстераза дополнительно содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из S134, D180 и H211, предпочтительно комбинацию S134+D180+H211, и/или, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из C177, C213, C247 или C263, предпочтительно комбинацию C247+C263+C177+C213, как в исходной эстеразе.
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая эстеразу по любому из пп. 1-7.
9. Кассета экспрессии для получения эстеразы по любому из пп. 1-7, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 8.
10. Клетка-хозяин для получения эстеразы по любому из пп. 1-7, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 8 или кассету экспрессии по п. 9.
11. Композиция для разрушения материалов, содержащих сложные полиэфиры, содержащая эстеразу по любому из пп. 1-7 или клетку-хозяина по п. 10, и дополнительно содержащая эксципиенты и/или реагенты.
12. Способ разрушения, по меньшей мере, одного сложного полиэфира материала, содержащего сложный полиэфир, включающий
(a) контакт материала, содержащего сложный полиэфир, с эстеразой по любому из пп. 1-7, или клеткой-хозяином по п. 10, или композицией по п. 11; и, необязательно,
(b) выделение мономеров и/или олигомеров.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что сложный полиэфир выбран из полиэтилентерефталата (РЕТ), политриметилентерефталата (РТТ), полибутилентерефталата (РВТ), полиэтиленизосорбидтерефталата (PEIT), полимолочной кислоты (PLA), полигидроксиалканоата (PHA), полибутиленсукцината (PBS), полибутиленсукцинатадипата (PBSA), полибутиленадипаттерефталата (PBAT), полиэтиленфураноата (PEF), поликапролактона (PCL), поли(этиленадипата) (PEA), полиэтиленнафталата (PEN) и смесей/смесей этих материалов, предпочтительно полиэтилентерефталата.
14. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой моющую композицию.
| база данных UniProtKB A0A0K8P6T7 PETH_IDESA, 11.11.2015 | |||
| Poly(ethylene terephthalate) hydrolase | |||
| Найдено онлайн: https://www.uniprot.org/uniprotkb/A0A0K8P6T7/entry Дата обращения 19.11.2023 | |||
| HAN X | |||
| ET AL | |||
| Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase | |||
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Найдено онлайн: | |||
