СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ИЗ ГРУНТА УГОЛЬНЫХ ОТВАЛОВ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕКУЛЬТИВАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекультивации земель, имеющих техногенные нарушения, вызванные сельскохозяйственной деятельностью, добычей полезных ископаемых (уголь, руда цветных металлов, железная руда, строительные материалы и др.).

Из-за развития промышленности, связанной с добычей угля, в Кемеровской области, Кузбассе, особенно остро стоит проблема восстановления земель и сохранения биологического разнообразия. Антропогенная нагрузка на окружающую среду в регионе вышла далеко за пределы экологической емкости территории Кузбасса и в ряде районов привела к деградации природы и резкому ухудшению состояния здоровья населения. В условиях интенсивной эксплуатации угольных месторождений особое значение приобретают исследования, направленные на разработку способов восстановления биологической продуктивности грунта нарушенных территорий, в том числе угольных отвалов.

Добыча угля открытым и закрытым способами сопровождается нарушением земель, изменением рельефа, формированием техногенного ландшафта [1, 5]. Большая часть угля в Кузбассе добывается открытым способом, при котором природный ландшафт частично и/или полностью нарушается. Также стоит отметить ухудшение экологической ситуации на прилегающих территориях. При добыче 1 млн т угля нарушается в среднем от 6 до 36 га почвенного покрова, при этом в настоящее время рекультивировано не более 1/5 части объема нарушенных территорий [2].

Как в России, так и за рубежом, особое развитие получило направление биологической рекультивации с использованием микроорганизмов, функция которых заключается в переводе труднодоступных форм элементов питания в легкоусвояемые для высших растений. Данный способ позволяет в короткие сроки улучшить агрохимический состав нарушенного субстрата [3].

К настоящему времени активно изучаются процессы эволюции биогеоценозов на угольных отвалах. Показано, что на инициальной стадии освоения вскрышных пород, большое значение имеют слизистые одноклеточные и нитчатые формы фото- и гетеротрофных микроорганизмов, которые выживают благодаря метаболитам (органическим кислотам, внеклеточным ферментам, пигментам, полисахаридам и др. соединениям), притягиваемым на поверхность клеток из окружающей среды.

Вовлечение нарушенных земель в биологическую рекультивацию с целью формирования ценных свойств и режимов в техногенных почвах не снизило остроты проблемы - почвообразование происходит чрезвычайно медленно. По этой причине в последние несколько десятилетий резко возрос интерес к инновационным технологиям ускоренного восстановления нарушенных почв [4].

Главной целью биологического этапа является ускорение восстановления почвенно-экологических функций почвы и экосистемы в целом.

Одним из способов биологической рекультивации угольных отвалов является применение биопрепарата на основе микроорганизмов, выделенных из техногенно нарушенной почвы.

Область поиска направлена на известные способы выделения микроорганизмов из почвы для рекультивации техногенно нарушенных ландшафтов, устойчивых к действию тяжелых металлов и способных стимулировать рост и развитие растений.

Известен способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремеднации (патент RU №2735870, опубл. 09.11.2019). Для выделения микроорганизмов проводят следующие этапы: навеску нефтезагрязненной почвы в количестве 1 г ресуспензируют в 10 мл стерильного раствора хлорида натрия (0,9% NaCl) и высевают на поверхность минеральной агаризованной среды Basal Medium следующего состава: фосфат калия двузамещенного 5,8 г/л; фосфат калия однозамещенного 3 г/л; сульфат аммония 1 г/л; сульфат магния 0,2 г/л; агар 18 г/л. На крышку чашки Петри насыпают 0,5 г нафталина. Затем нижнюю часть чашки с посевом переворачивают на крышку. При этом пары нафталина используются микроорганизмами в качестве углерода и источника энергии. Инкубируют посеянные микроорганизмы при температуре 20°С в течение 7 сут.

Несмотря на то, что выделенные данным способом микроорганизмы способны защищать почву от негативного влияния нефти, техногенно нарушенные почвы содержат большое количество тяжелых металлов, в то время как содержание нефти незначительно. В связи с этим возникает вопрос о возможности выделенных данным способом микроорганизмов эффективно восстанавливать техногенные нарушения. Кроме того не известна способность выделенных микроорганизмов стимулировать рост и развитие растений.

Известен способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти (патент RU №2624667, опубл. 05.07.2017). Данный способ включает отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение ассоциации активных аборигенных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, активацию полученной ассоциации и дальнейшую наработку биомассы ассоциации в ферментерах при оптимальных параметрах культивирования. Для выделения микроорганизмов деструкторов нефти и нефтепродуктов используют жидкую питательную среду Маккланга следующего состава: NaNO₃ - 2,0 г/л; KH₂PO₄ - 1,0 г/л; MgSO₄×H₂O - 0,5 г/л; MnSO₄ - 0,013 г/л; ZnSO₄ - 0,002 г/л; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001 г/л. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют стерильный гексадекан (1 мас. %).

Культивирование проводят в колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 об/мин в течение 3 сут.

Недостатком данного способа является то, что не доказана активность полученной микробной ассоциации в отношении устойчивости к тяжелым металлам и эффективность ростостимулирующих свойств.

В патенте (SU №1703681, опубл. 07.01.1992) рассмотрен способ выделения бактерий Bacillus macerans из почвы. Способ осуществляют следующим образом. Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии почвы в селективную среду содержащую (г/л): альфа-декстрин 3-10; кукурузный экстракт 0,19-0,21; K₂HPO₄ 0,19-0,21; (NH₄)₂HPO₄ 0,19-0,21; вода до 1 литра и инкубируют ее в атмосфере N₂ при температуре 48-49°С в течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на картофельно-глюкозном агаре и инкубируют при 48-49°С в течение 48-50 ч.

Недостатком данного способа является сложный процесс инкубирования, связанный с использованием азота, а также выделение микроорганизмов происходит при высоких температурах 48-19°С, что не позволяет выделить мезофильные бактерии, устойчивые к климатическим характеристикам региона. Несмотря на то, что данные микроорганизмы по своей природе стимулирую рост растений, техногенно нарушенные почвы содержат большое количество тяжелых металлов, из-за чего высока вероятность снижения жизнеспособности микроорганизмов в загрязненной среде.

В патенте (RU №2693892, опубл. 05.07.2019) рассмотрен способ выделения и идентификации бактерий групп Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens из почвы и воды. Исследуемый материал (водная суспензия почвы) вносят в 5 мл элективной среды с сукцинатом натрия следующего состава: нитрат калия - 5,0 г; сукцинат натрия - 4,0 г; фосфат калия двузамещенный - 0,5 г; сульфат магния - 0,2 г; фосфат калия однозамещенный - 0,1 г; хлорид кальция - 0,1 г; вода дистиллированная 1 л. Посев инкубируют при 30°С в аэробных условиях в течение 48-72 ч, после чего осуществляют посев на чашки Петри с элективной средой с фурадонином следующего состава: фурадонин - 160,0 мг; глюкоза - 10,0 г; пептон - 2,0 г; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,05 г; магний сернокислый - 0,1 г; бромтимоловый синий - 0,03 г; агар-агар - 15,0 г; вода дистиллированная - 1 л. Посев культивируют при 30°С в аэробных условиях в течение 48 ч.

Недостатком данного способа является то, что выделенные микроорганизмы используются в качестве биоремедиаторов загрязнений природной среды нефтепродуктами, что не дает гарантии их устойчивости к тяжелым металлам в почве.

Указанное изобретение принято в качестве ближайшего аналога.

Техническая задача, решаемая предлагаемым способом, состоит в повышении эффективности биологического этапа рекультивации техногенно нарушенных земель посредством использования микробных препаратов, в составе которых присутствуют бактерии, обладающие устойчивостью к тяжелым металлам, а также проявляющие ростостимулирующие свойства.

Техническим результатом, достигаемым при реализации разработанного способа, является выделение бактерий из грунта угольных отвалов, устойчивых к тяжелым металлам, продуцирующих индол-3-уксусную кислоту (ИУК), способных к фиксированию азота, а также к солюбилизации фосфора, цинка и калия.

Согласно изобретению, настоящая задача решается за счет выделения чистых культур бактерий из техногенно нарушенных грунтов, включающий выделение бактерий из грунта, посев выделенного материала на жидкую питательную среду состава: мясной экстракт - 11,0 г; пептон - 10,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; мальтоза - 5,0 г; сульфат аммония - 3,0 г; цитрат натрия - 3,0 г; сернокислый магний - 0,5 г или 0,1 г; фосфат калия однозамещенный - 0,4 г или 1,0 г; хлористый кальций - 0,2 г; сернокислый марганец - 0,1 г; сернокислое железо - 0,01 г или 0,001 г; сернокислый цинк - 0,005 г; сернокислая медь - 0,001 г; дистиллированная вода - 1 л. Культивирование и пересевание методом истощающего штриха на мясо-пептонный агар для получения чистых культур штаммов бактерий.

Изобретение иллюстрируется следующим образом.

Пример 1. В работе использован грунт из слоя внешнего отвала. Объект исследования расположен на юго-востоке Западной Сибири в Кемеровской области (54°18'' северной широты, 87°22'' восточной долготы), Прокопьевский муниципальный район, в 6,4 км к северо-востоку от с. Большая Талда. Для выделения бактерий 1 г грунта добавляют в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды. Далее пробирки инкубируют в аэробных условиях при температуре 28±2°С и перемешивании со скоростью 110 об/мин в течение 12 ч и проводят посев полученной суспензии на среду следующего состава:

мясной экстракт 11,0 г пептон 10,0 г хлорид натрия 5,0 г мальтоза 5,0 г сульфат аммония 3,0 г цитрат натрия 3,0 г сернокислый магний 0,5 г фосфат калия однозамещенный 0,4 г хлористый кальций 0,2 г сернокислый марганец 0,1 г сернокислое железо 0,01 г сернокислый цинк 0,005 г сернокислая медь 0,001 г дистиллированная вода 1 л

Культивирование проводят при температуре 28±2°С и перемешивании со скоростью 110 об/мин в течение 18-24 ч в аэробных условиях.

Далее несколько раз пересевают методом истощающего штриха на мясо-пептонный агар для получения чистых культур штаммов бактенрий.

Из грунта в чистые культуры изолировано 30 морфолого-культуральных типов бактерий.

После изоляции бактерий их проверяют на способность к продуцированию ИУК и сидерофоров, фиксированию азота, а также солюбилизации калия, цинка, фосфора [6].

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но отличается тем, что после выделения бактерий из грунта и инкубации, проводят посев полученной суспензии бактерий в стерильной дистиллированной воде на питательную среду следующего состава:

мясной экстракт 11,0 г пептон 10,0 г хлорид натрия 5,0 г мальтоза 5,0 г сульфат аммония 3,0 г цитрат натрия 3,0 г сернокислый магний 0,1 г фосфат калия однозамещенный 1,0 г хлористый кальций 0,2 г сернокислый марганец 0,1 г сернокислое железо 0,001 г сернокислый цинк 0,005 г сернокислая медь 0,001 г дистиллированная вода 1 л

Из грунта в чистые культуры изолировано 18 морфолого-культуральных типов бактерий.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, но отличается тем, что после выделения бактерий из грунта и инкубации, проводят посев полученной суспензии бактерий в стерильной дистиллированной воде на питательную среду следующего состава:

мясной экстракт 11,0 г пептон 10,0 г хлорид натрия 5,0 г мальтоза 1,0 г сульфат аммония 5,0 г цитрат натрия 3,0 г сернокислый магний 0,5 г фосфат калия однозамещенный 0,4 г хлористый кальций 0,2 г сернокислый марганец 0,1 г сернокислое железо 0,001 г сернокислый цинк 0,005 г сернокислая медь 0,001 г дистиллированная вода 1 л

Из грунта в чистые культуры изолировано 26 морфолого-культуральных типов бактерий.

Пример 4. Аналогичен примеру 1, но отличается тем, что после выделения бактерий из грунта и инкубации, проводят посев полученной суспензии бактерий в стерильной дистиллированной воде на питательную среду следующего состава:

мясной экстракт 11,0 г пептон 10,0 г хлорид натрия 5,0 г мальтоза 5,0 г сульфат аммония 3,0 г цитрат натрия 3,0 г сернокислый магний 0,5 г фосфат калия однозамещенный 0,4 г хлористый кальций 0,2 г сернокислый марганец 0,1 г сернокислое железо 0,1 г сернокислый цинк 0,005 г сернокислая медь 0,1 г дистиллированная вода 1 л

Из грунта в чистые культуры изолировано 24 морфолого-культуральных типов бактерий.

По методике ближайшего аналога грунта в чистые культуры изолировано 25 морфолого-культуральных типов бактерий.

Результаты продуцирования ИУК и сидерофоров, а также способности к фиксированию азота и солюбилизации калия, цинка, фосфора приведены в усредненном виде в таблицах 1-2. Показано, что максимальные результаты по ростостимулирующей активности проявляют бактерии, выделенные по примерам 1 и 2.

При культивировании бактерий из грунта в питательной среде, содержащей высоки концентрации тяжелых металлов, выживают только те, которые характеризуются высокой устойчивостью к данным металлам. Например, в исследовании Yan Xie и соавторов для выделения микроорганизмов, устойчивых к кадмию, применяли среду, содержащую соли кадмия [7]. В работе Babita Sharma и соавтора для выделения микроорганизмов, устойчивых к свинцу, использовали среду, содержащую соли свинца [8]. В работе Ayansina Segun Ayangbenro и соавтора для выделения микроорганизмов, толерантных к тяжелым металлам, использовали питательные среды, содержащие соли кадмия, хрома, свинца [9].

Таким образом, предложенный способ позволяет выделять из грунтов угольных отвалов бактерии, устойчивые к тяжелым металлам, характерным именно для грунтов конкретных нарушенных территорий.

Заявленное изобретение представляет собой эффективный способ выделения бактерий из грунта угольных отвалов, устойчивых к тяжелым металлам и обладающих ростостимулирующей активностью за счет их способности к продуцированию индол-3-уксусной кислоты и сидерофоров, а также способности к фиксированию азота и солюбилизации калия, цинка, фосфора, что делает выделенные бактерии перспективными в использовании в качестве биопрепарата на биологическом этапе рекультивации на угольных отвалах, характеризующихся высоким содержанием тяжелых металлов в почве. Существующие микробные ростостимулирующие препараты не эффективны в условиях такого загрязнения, и существует необходимость в интенсификации озеленения нарушенных территорий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Харионовский, А.А. Рекультивация нарушенных земель в угольной промышленности / А.А. Харионовский, М.Ю. Данилова // Вестник научного центра по безопасности работ в угольной промышленности. - 2017. - №3. - С.72-77.

2. Ковалевский А.В. Лесная рекультивация угольных отвалов с позиции сохранения фаунистического разнообразия Кузбасса / А.В. Ковалевский, И.В. Тарасова, Е.М. Лучникова, А.В. Филиппов и др. // Лесоведение. - 2021. - №5. - С. 509-522.

3. Макеева Н.А. Обзор методов ускоренной рекультивации нарушенных угледобычей земель // Н.А. Макеева, О.А. Неверова // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. - 2016. - №8. - С.77-86.

4. Середина В.П. Экологические аспекты биологической рекультивации почв техногенных экосистем Кузбасса // В.П. Середина, В.А. Андроханов, Т.П. Алексеева, Л.Н. Сысоева и др. // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2008. - №2 (3). - С.61-72.

5. Green technologies in land recultivation for coal mining enterprises / I.V. Kuznetsova, S.S. Timofeeva // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. - 2022. - Vol.408. DOI 10.1088/1755-1315/408/1/012075 6.

6. Kaur, J., Mudgal, G., Chand, K. et al. An exopolysaccharide-producing novel Agrobacterium pusense strain JAS1 isolated from snake plant enhances plant growth and soil water retention. Sci Rep 12, 21330 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25225-y

7. Identification of Cd-resistant microorganisms from heavy metal-contaminated soil and its potential in promoting the growth and Cd accumulation of bermudagrass /Y. Xie, H. Bu, Q. Feng, M. Wassie, et all // Environmental Research. - 2021. - Vol.200. - P. 111730. https://doi.org/10.1016/i.envres.2021.111730

8. Sharma, B. Lead bioaccumulation mediated by Bacillus cere us BPS-9 from an industrial waste contaminated site encoding heavy metal resistant genes and their transporters / B. Sharma, P. Shukla // Journal of Hazardous Materials. - 2021. -Vol.421. - P. 123285. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2020.123285

9. Genomic analysis of Bacillus cereus NWUAB01 and its heavy metal removal from polluted soil / A.S. Ayangbenro, O.O. Babalola // Scientific Reports. - 2020. - Vol.10. - P. 19660. https://doi.org/10.1038/s41598-020-75170-x

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения бактерий из грунта угольных отвалов для биологической рекультивации, включающий добавление в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды 1 г грунта, инкубацию при 28 ± 2°С и перемешивание со скоростью 110 об/мин в течение 12 ч в аэробных условиях, затем проводят посев выделенного материала на среду заданного состава, культивируют при 28 ± 2°С и перемешивании со скоростью 110 об/мин в течение 18-24 ч в аэробных условиях, пересевают методом истощающего штриха на мясо-пептонный агар. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов выделения бактерий из грунта угольных отвалов, устойчивых к тяжелым металлам и обладающих ростостимулирующей активностью за счет способности к продуцированию индол-3-уксусной кислоты и сидерофоров, способности к фиксированию азота и солюбилизации калия, цинка, фосфора. 2 табл., 4 пр.

Способ выделения бактерий из грунта угольных отвалов для биологической рекультивации, включающий добавление в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды 1 г грунта, инкубацию при температуре 28 ± 2°С и перемешивание со скоростью 110 об/мин в течение 12 ч в аэробных условиях, затем проводят посев выделенного материала на среду состава:

мясной экстракт 11,0 г пептон 10,0 г хлорид натрия 5,0 г мальтоза 5,0 г сульфат аммония 3,0 г цитрат натрия 3,0 г сернокислый магний 0,5 г или 0,1 г фосфат калия однозамещенный 0,4 г или 1,0 г хлористый кальций 0,2 г сернокислый марганец 0,1 г сернокислое железо 0,01 г или 0,001 г сернокислый цинк 0,005 г сернокислая медь 0,001 г дистиллированная вода 1 л,

культивируют при температуре 28 ± 2°С и перемешивании со скоростью 110 об/мин в течение 18–24 ч в аэробных условиях, пересевают методом истощающего штриха на мясо-пептонный агар для получения чистых культур штаммов бактерий.