Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12R1/385 

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии и может быть использовано для обнаружения бактерий рода Pseudomonas при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды с целью выделения бактерий рода Pseudomonas - возбудителей инфекционных заболеваний человека.

Синегнойная палочка способна вызывать различные заболевания, картина заболевания и симптоматика зависят от локализации инфекции. Характерной особенностью всех заболеваний, вызванных Pseudomonas aeruginosa, является длительное течение при хронической форме и острая форма, которая лечится так же трудно, как и хроническая, поскольку бактерия обладает высокой резистентностью к антимикробным препаратам. Так, она может стать возбудителем энцефалита, цистита, пневмонии или остеомиелита. Она способна размножаться в кишечнике, среднем ухе, абсцессах и ранах.

Лабораторная диагностика синегнойной палочки не представляет трудностей, поскольку синегнойная палочка хорошо растет на различных питательных средах.

Выделение на питательной среде чистых культур микроорганизмов с характерными для псевдомонад культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами требует постановки целого ряда подтверждающих тестов, а, следовательно, значительного времени и материальных затрат.

Быстрота получения результатов при микробиологических исследованиях в значительной степени влияет на диагностику, проведение терапевтических и противоэпидемических мероприятий.

Алгоритм бактериологического исследования инфекций синегнойной палочки соответствует той же схеме, что и при заболеваниях, вызванных энтеробактериями. При нецеленаправленном исследовании выявления псевдомонад посев производят на любую из общепринятых питательных сред: 1,5% питательный агар, 5% кровяной агар, агар Эндо, и инкубируют посевы при температуре 37°С в течение 18-24 часов.

Известны питательные среды для дифференциации псевдомонад, принцип действия которых основан на способности P. aeruginosa синтезировать феназиновый пигменты - пиоцианин, флуоресцеин или пиовердин, а также другие пигменты (пиорубин, пиомеланин, аоксифеназин), но, не обладающие выраженным ингибирующим эффектом в отношении микробов ассоциантов, и, следовательно, не могут быть использованы для одноэтапного выделения псевдомонад.

В частности, среда Кинг А используется для дифференциации синегнойной палочки и усиления способности продуцировать сине-зеленый пигмент пиоцианин и образования некоторыми штаммами синегнойной палочки другого пигмента - пиорубина, дающий красное окрашивание [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала», Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].

Среда Хью-Лейфсена с глюкозой применяется для определения способности псевдомонад окислять глюкозу до глюконовой кислоты только в аэробных условиях. При положительной реакции происходит порозовение среды в столбике среды в аэробных условиях, при отсутствии роста и изменения цвета среды в анаэробных условиях [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала»,Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonasaeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].

Среда с ацетамидом так же является дифференциальной средой для синегнойной палочки, основанный на ее способности использовать ацетамид в качестве единственного источника азота и углерода [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала», Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является питательная среда для выделения синегнойной палочки (ЦДХ агар) производства «Микроген» на основе пептона, с сульфатами калия и магния, углекислым натрием, фенозан-кислотой, цетилпиридинием хлористым и агаром, обеспечивающая рост псевдомонад и продуцирование пиоцианина (феназиновый пигмент, окрашивающий питательную среду в сине-зеленый цвет), а также ингибицию ряда сопутствующих грамположительных и грамотри цательных микроорганизмов. [ПРИКАЗ от 22 апреля 1985 года N 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», ГФ XIV т. 1 (ОФС. 1.2.4.0002.18].

Биохимические характеристики коммерческой сухой питательной среды (производства «Микроген») для выделения синегнойной палочки представлены в таблице 2.

Недостатками ЦПХ агара (производства «Микроген»)являются:

- отсутствие отечественного производства фенозана и его производных, и высокая стоимость импортного препарата;

- слабые селективные свойства в отношении сопутствующей микрофлоры (сальмонелл, протея и клебсиелл)

- сниженная чувствительность среды в отношении псевдомонад, ввиду высокой концентрации N-цетилпиридиния хлористого.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выделения псевдомонад, обладающей высокой чувствительностью, стабильностью результатов по ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам с целью обеспечения доступности и получения объективных результатов бактериологического контроля, сокращающих время и материальные затраты при лабораторных исследованиях.

Технический результат достигается тем, что предложена питательная среда, содержащая в качестве источника азотистого питания панкреатический гидролизат рыбной муки, сульфаты калия и магния, фосфаты калия и натрий углекислый в качестве стабилизатора рН, N-цетилпиридиний хлористый в качестве ингибитора, комплекс антиоксидантов - фенозан кислота и бутилгидрокситолуол, агар бактериологический при следующем содержании компонентов:

- Панкреатический гидролизат рыбной муки 20,0±3,0 г - Калий сернокислый 7,6±0,76 г - Магний сернокислый 7-водный 2,4±0,24 г - Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0±0,1 г - Калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 г - Фенозан-кислота 0,025±0,0025 г - Бутилгидрокситолуол 0,075±0,0075 г - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн (ЦПХ) 0,2±0,05 г - Агар бактериологический 9,0±2,0 г - Натрий углекислый 0,2±0,05 г - Дистиллированная вода 1000 мл

Питательная среда для выделения синегнойной палочки представляет собой смесь сухих компонентов из расчета, г/л.

Совокупность компонентов, входящих в состав среды обеспечивает питательные потребности для роста псевдомонад с образованием пигментов. N-цетилпиридиний хлористый в предложенной концентрации 0,2 г/л (в среде прототипе 0,3 г/л) подавляет рост возможных бактерий ассоциантов и при этом не влияет на чувствительность среды и способность псевдомонад к пигментообразованию. Комплекс антиоксидантов (фенозан кислота и бутилгидрокситолуол) предотвращает окисление жирорастворимых витаминов А и Е, помогает вырабатывать больше необходимой клеткам энергии, способствует накоплению биомассы. При изучении селективных свойств среды без добавления N-цетилпиридиния хлористого и мягкой стерилизации кипячением было отмечено, что на среде с комплексом антиоксидантов в отличие от одного фенозана, полностью подавляется возможный поверхностный и глубинный пророст микрофлоры, присутствующей в сырье. Среда стерилизуется кипячением до полного расплавления агара.

Проведены исследования по определению оптимума рН среды, влиянию на выделение псевдомонад фенозан-кислоты и бутилгидрокситолуола, влиянию магния сернокислого, калия сернокислого на пигментообразование, влиянию различных концентраций N-цетилпиридиния хлористого совместно с комплексом антиоксидантов на ростовые и ингибирующие свойства предлагаемой питательной среды.

По результатам работ составлена пропись питательной среды для выделения синегнойной палочки и установлено количественное содержание компонентов в г.

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование комплекса антиоксидантов и фосфатов калия, уменьшенная концентрация N-цетилпиридиния хлористого. Технический результат достигается также сбалансированностью компонентного состава среды в экспериментально установленных концентрациях. Доказана возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы. Количественное соотношение компонентов питательной среды, рН, обеспечивают сохранение хороших ростовых и ингибирующих свойств. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток.

Пример 1. Способ получения питательной среды.

Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:

- Панкреатический гидролизат рыбной муки 17,0 - Калий сернокислый......... 6,84 - Магний сернокислый 7-водный......... 2,16 - Калий фосфорнокислый однозамещенный...... 0,9 - Калий фосфорнокислый двузамещенный...... 0,9 - Фенозан-кислота...... 0,0225 - Бутилгидрокситолуол... 0,0675 - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн.... 0,15 - Агар бактериологический......... 7,0 - Натрий углекислый...... 0,15 - Вода дистиллированная 1000 мл

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют кипячением в течение 2 мин. до полного расплавления агара.

Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКГГМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых разведений: 10^-6, 10^-3 и 10^-1 и использовали для контроля среды.

Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч.

Предлагаемая среда, обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10^-6 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Pseudomonas aeruginosa 453, Pseudomonas aeruginosa 27/99, ингибицию при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов: Escherichia coli 3912/41 (055:К59), Proteus vulgaris ИХ 19 222 из разведения 10^-3, Staphylococcus aureus Wood-46 из разведения 10^-1 через 48 часов инкубации посевов при температуре (37±1)°С

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

- Панкреатический гидролизат рыбной муки... 20,0 - Калий сернокислый...... 7,6 - Магний сернокислый 7-водный...... 2,4 - Калий фосфорнокислый однозамещенный...... 1,0 - Калий фосфорнокислый двузамещенный...... 1,0 - Фенозан-кислота... 0,025 - Бутилгидрокситолуол................................. 0,075 - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн.... 0,2 - Агар бактериологический... 9,0 - Натрий углекислый............. 0,2 - Вода дистиллированная 1000 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

- Панкреатический гидролизат рыбной муки... 23,0 - Калий сернокислый......... 8,36 - Магний сернокислый 7-водный...... 2,64 - Калий фосфорнокислый однозамещенный... 1,1 - Калий фосфорнокислый двузамещенный... 1,1 - Фенозан-кислота...... 0,0275 - Бутилгидрокситолуол............... 0,0825 - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн.... 0,25 - Агар бактериологический...... 11,0 - Натрий углекислый............ 0,25 - Вода дистиллированная 1000 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

- Панкреатический гидролизат рыбной муки... 14,0 - Калий сернокислый............... 6,08 - Магний сернокислый 7-водный...... 1,92 - Калий фосфорнокислый однозамещенный... 0,8 - Калий фосфорнокислый двузамещенный...... 0,8 - Фенозан-кислота............... 0,02 - Бутилгидрокситолуол............... 0,06 - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн. 0,1 - Агар бактериологический............ 5,0 - Натрий углекислый.... 0,1 - Вода дистиллированная 1000 мл

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к ухудшению ростовых свойств в отношении псевдомонад и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

- Панкреатический гидролизат рыбной муки...... 26,0 - Калий сернокислый............... 9,12 - Магний сернокислый 7-водный......... 2,88 - Калий фосфорнокислый однозамещенный... 1,2 - Калий фосфорнокислый двузамещенный...... 1,2 - Фенозан-кислота............ 0,03 - Бутилгидрокситолуол............ 0,09 - N-цетилпиридиний хлористый 1 водн.... 0,3 - Агар бактериологический......... 13,0 - Натрий углекислый............ 0,3 - Вода дистиллированная 1000 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и показывают ухудшение ростовых свойств среды для выделения псевдомонад.

Из таблиц видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает высокой чувствительностью, стабильностью ростовых свойств и пигментообразования в отношении псевдомонад, подавляет рост сопутствующих микроорганизмов. Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предлагаемой селективной среды для выделения псевдомонад.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примером 4 наблюдается увеличение диаметра колоний контрольных тест-штаммов псевдомонад, колонии приобретают R -форму, а также наблюдается роение протея. В случае приготовления среды в соответствии с примером 5 - снижается чувствительность среды в отношении штамма Pseudomonasa eruginosa АТСС 9027 (NCTC 12924), уменьшается размер колоний.

Таким образом, по сравнению со средой прототипом предлагаемая питательная среда является отечественной, конкурентоспособной средой для селективного выделения и дифференциации псевдомонад, обладает высокой чувствительностью и пигментообразованием, обеспечивает ингибицию сопутствующей микрофлоры

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии. Питательная среда для выделения бактерий Pseudomonas aeruginosa содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, калий сернокислый, магний сернокислый 7-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, фенозан-кислоту, бутилгидрокситолуол, N-цетилпиридиний хлористый 1 водный (ЦГГХ), натрий углекислый, агар бактериологический и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получать объективные результаты бактериологического контроля, сократить время культивирования бактерий рода Pseudomonas. 3 табл., 5 пр.

Питательная среда для выделения бактерий Pseudomonas aeruginosa, содержащая питательную основу, сернокислые магний и калий, N-цетилпиридиний хлористый, фенозан-кислоту, натрий углекислый и агар бактериологический, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, дополнительно содержит бутилгидрокситолуол для повышения селективности и усиления чувствительности среды в отношении псевдомонад, в качестве стабилизаторов рН среды - калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый двузамещенный при следующем содержании компонентов:

панкреатический гидролизат рыбной муки 20,0±3,0 г калий сернокислый 7,6±0,76 г магний сернокислый 7-водный 2,4±0,24 г

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0±0,1 г

калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 г

фенозан-кислота 0,025±0,0025 г бутилгидрокситолуол 0,075±0,0075 г

N-цетилпиридиний хлористый 1 водный 0,2±0,05 г

агар бактериологический 9,0±2,0 г Натрий углекислый 0,2±0,05 г вода дистиллированная 1000 мл.