Способ иммунологического прогнозирования острых нарушений мозгового кровообращения Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и неврологии, может быть использовано для предикции острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК).

По данным Всемирной организации здравоохранения (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death), инсульт является второй ведущей причиной летальности населения (11% от общего числа смертей).

По данным Росстата (https://rosinfostat.ru/smertnost/), болезни системы кровообращения являются одними из основных причин смертности людей как в возрасте от 20 до 40 лет, так и старше 40 лет. Отмечено, что в 2018 году в России цереброваскулярные болезни (в том числе инсульт) привели к 14,4% всех смертей.

Известен способ прогнозирования неврологического восстановления после ишемического инсульта головного мозга по определению сывороточных концентраций основного белка миелина и антител к нему, васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), нейротрофического фактора мозга, оценке функциональной независимости по шкале Рэнкин и неврологического дефицита по Скандинавской шкале инсульта (SSS) (RU 2764355, МПК А61В 5/1468, опубл. 17.01.2022).

Но упомянутый способ направлен на предикцию неврологического восстановления и не позволяет прогнозировать развитие ОНМК.

Ранее предложено через 30 дней после ОНМКопределять наличие/отсутствие артериальной гипертензии, фибрилляции или трепетания предсердий, уровень холестерина крови, выясняют назначенные на постоянный прием препараты, курит ли пациент и злоупотребляет ли он алкоголем с начислением баллов и расчетом индекса повторного геморрагического ОНМК (RU 2597990, МПК А61В 5/00, опубл. 20.09.2016).

Однако, предложенный способ не предполагает прогнозирование развития ишемического инсульта и не будет эффективен при предикции первичного ОНМК.

Также известен способ прогнозирования течения геморрагического инсульта по содержанию антител к ДНК в ликворе и сыворотке больных в острейшем периоде ОНМК (RU 2195667, МПК, G01N 33/53, G01N 33/48, опубл. 27.12.2002).

Недостатком вышеуказанного способа является необходимость проведения спинномозговой пункции для получения ликвора, что может быть сопряжено с развитием осложнений и повреждением спинного мозга.

Анализируя источники информации, авторами не найдено прототипа способа иммунологического прогнозирования ОНМК.

Техническим результатом изобретения является малоинвазивный, не требующий больших материальных затрат, способ иммунологического прогнозирования ОНМК. Преимущества предлагаемого способа: предупреждение ОНМК; улучшение прогнозирования транзиторных ишемических атак; уменьшение экономических и временных затрат за счет определения трех маркеров; повышение специфичности и чувствительности применяемых параметров.

Сущность изобретения заключается в том, что способ включает иммунологическое исследование параметров крови. Для этого определяют в сыворотке крови количественные уровни VEGF и интерлейкина (IL)-8, в плазме крови D-димера. При комбинации значений VEGF, больших 550 пг/мл, IL-8, больших 14 пг/мл, D-димера, больших 245 нг/мл, прогнозируют развитие острых нарушений мозгового кровообращения.

Диагностический критерий, чувствительность и специфичность определения VEGF при ОНМК отражены на фиг.1; IL-8 - на фиг.2; D-димера - на фиг.3; на фиг.4 изображены ROC кривые зависимости развития ОНМК от количеств VEGF, IL-8, D-димера; в таблице 1 отражено количество VEGF и IL-8 в сыворотке крови, D-димера в плазме крови здоровых лиц и больных с ОНМК; в таблице 2 представлены количественные изменения VEGF, IL-8, D-димера у больных в зависимости от формы ОНМК; таблица 3 демонстрирует диагностическую ценность VEGF, IL-8, D-димера при ОНМК.

Способ осуществляют следующим образом: забор 10 мл крови для исследования проводят в утренние часы натощак из локтевой вены в пробирку с активатором свертывания (для получения сыворотки) и в пробирку с антикоагулянтом цитратом натрия (для получения плазмы). Отделяют плазму и сыворотку с помощью центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут. Определение количественного уровня VEGF и IL-8 в сыворотке, D-димера в плазме проводят с помощью иммуноферментного анализа.

В работе использовали соответствующие тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия).

Для определения количественного уровня VEGF во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем последовательно вносят по 100 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 120 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 1-й инкубации лунки планшета тщательно промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл конъюгата №1, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 60 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз, внося по 350 мкл промывочного раствора, затем вносят по 100 мкл конъюгата №2, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 30 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 3-й инкубации содержимое лунок планшета удаляют и промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина плюс и инкубируют в темноте при температуре 18-25°С в течение 25 мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Процедура исследования количественного уровня IL-8 практически идентична определению содержания VEGF за исключением различия в температуре при первых трех инкубациях в термошейкере: 37°С вместо 18-25°С.

Для определения количественного уровня D-димера в плазме крови в лунки планшета последовательно вносят по 10 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов. Время внесения образцов не должно превышать 10 мин. Затем вносят по 100 мкл раствора конъюгата. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем в лунки вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина плюс и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 15 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Концентрацию исследуемых параметров определяют при построении соответствующих калибровочных графиков на прилагаемых трафаретах. Достоверность результатов анализа оценивают по количествам показателей в контрольных образцах и последовательному нарастанию оптических плотностей в калибровочных образцах.

Способ апробирован на 90 больных неврологического профиля и 30 здоровых добровольцах (контрольная группа). Разделение больных на группы осуществляли в зависимости от формы нарушения мозгового кровообращения. В 1 группу вошли 30 пациентов с транзиторной ишемической атакой, во 2 группу - 30 пациентов с ишемическим инсультом, в 3 группу - 30 пациентов с геморрагическим инсультом. Статистически значимых возрастных и гендерных различий среди больных и здоровых лиц не наблюдалось.

Диагноз определяли на основании клинических данных, результатов инструментальных исследований (компьютерная томография (КТ) головного мозга, цветовое дуплексное сканирование (ЦДС) сосудов головного мозга, брахиоцефальных артерий).

Кровь для исследования брали при получении информированного согласия обследуемых лиц. В качестве сравнения использовали серологические показатели, полученные в контрольной группе у здоровых добровольцев (n=30), средний возраст которых составил 32,14±1,84 года, из них 16 (53,3%) мужчин и 14 (46,7%) женщин.

Определение концентраций VEGF, IL-8, D-димера у здоровых добровольцев позволило установить интервал нормы (таблица 1).

Анализ изменений уровней VEGF, IL-8, D-димера у обследованных больных выявил увеличение их содержания, зависящее от формы нарушения мозгового кровообращения, превышение дискриминационного уровня маркеров наблюдалось в 96,67%, 83,33%, 63,33% случаев соответственно (таблицы 1,2).

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют прогнозировать развитие ОНМК по уровням VEGF и IL-8 в сыворотке, D-димера в плазме.

Пример 1. Больной М., 40 лет, поступил на стационарное лечение в нейрохирургическое отделение №9 Республиканской клинической больницы №4 03.08.2022 г. с жалобами на головную боль, головокружение, тошноту, шаткость при ходьбе, боли в шейном и поясничном отделах позвоночника, усиливающиеся при движении, с иррадиацией в правую ногу, онемение в правой стопе. После обследования выставлен диагноз: Транзиторная ишемическая атака в вертебробазиллярном бассейне (от 03.08.2022 г.), вестибуло-атактический синдром. Распространенный остеохондроз позвоночника с преимущественным поражением шейного и поясничного отделов, обострение. Синдром вертебро-базиллярной недостаточности. Гипертоническая болезнь II ст., риск III.

Неврологический статус (при поступлении): Сознание ясное. Зрачки, глазные щели D=S. Нистагм отсутствует. Лицевая мускулатура асимметрична - слегка сглажена левая носогубная складка. Язык по средней линии. Речь не нарушена. Сухожильные рефлексы с верхних и нижних конечностей, тонус мышц D=S. Парезов нет. Пальценосовая проба с мимопопаданием с обеих сторон. В позе Ромберга - атаксия.

Неврологический статус (при выписке): Сознание ясное. Зрачки, глазные щели D=S. Нистагм отсутствует. Лицевая мускулатура симметричная. Язык по средней линии. Речь не нарушена. Сухожильные рефлексы с верхних и нижних конечностей, тонус мышц D=S. Парезов нет. Пальценосовая проба с незначительной интенцией. В позе Ромберга - легкая атаксия.

КТ головного мозга от 03.08.2022 г.: Данных за органическое поражение головного мозга не получено.

Транскраниальное ДС сосудов основания мозга от 03.08.2022 г.: Снижение кровотока по сосудам правой каротиды и левой передней мозговой артерии (МА), а также по позвоночным артериям с обеих сторон. Гемоднамически значимой асимметрии линейных скоростей кровотока не выявлено.

ЦДС брахиоцефальных артерий от 03.08.2022 г.: Макроангиопатия («S» изгиб правой внутренней сонной артерии (ВСА) и «С» изгиб левой ВСА). Незначительная непрямолинейность хода позвоночных артерий в поперечных отростках шейных позвонков.

Иммунологическое исследование от 04.08.2022 г.: количество VEGF - 390 пг/мл, IL-8 - 12 пг/мл, D-димера - 200 нг/мл.

На фоне лечения состояние с положительной динамикой. Выписан в удовлетворительном состоянии с улучшением. Реабилитационный и иммунологический прогноз благоприятный. При контроле КТ головного мозга через 3 месяца после госпитализации признаков ишемии головного мозга не обнаружено.

Пример 2. Больная В., 66 лет, поступила на стационарное лечение в нейрохирургическое отделение №9 Республиканской клинической больницы №4 23.11.2021 г. с жалобами на головную боль, головокружение, двоение в глазах, тошноту, шаткость при ходьбе, боли за грудиной, слабость. После обследования выставлен диагноз: ОНМК по ишемическому типу в правой затылочной доле головного мозга (от 23.11.2021 г.). Ишемическая болезнь сердца. Стенокардия напряжения III ФК. Гипертоническая болезнь III ст., риск IV.

Неврологический статус (при поступлении): Сознание ясное. Зрачки, глазные щели D=S. Нистагм горизонтальный. Диплопия. Лицевая мускулатура симметричная. Язык по средней линии. Речь не нарушена. Сухожильные рефлексы с верхних и нижних конечностей D<S, тонус мышц D=S. Координаторные пробы с атаксией с обеих сторон. В позе Ромберга - атаксия. Симптом Бабинского положительный с обеих сторон.

КТ головного мозга от 23.11.2021 г.: Зона острой ишемии в правой затылочной доле головного мозга.

Иммунологическое исследование от 24.11.2021 г.: количество VEGF - 720 пг/мл, IL-8 - 20 пг/мл, D-димера - 342 нг/мл.

На фоне лечения состояние с положительной динамикой. Выписана в удовлетворительном состоянии с улучшением. Реабилитационный прогноз сомнительный. Иммунологический прогноз: не благоприятный.

1.08.2022 г. больная была госпитализирована в нейрохирургическое отделение №9 Республиканской клинической больницы №4 с жалобами на головную боль, головокружение, двоение в глазах, тошноту, шаткость при ходьбе, боли за грудиной, слабость. После обследования выставлен диагноз: Повторное ОНМК по ишемическому типу в вертебробазиллярном бассейне (от 30.07.2022 г.), атактический синдром, диплопия. Дисциркуляторная (смешанная) энцефалопатия III ст. Ишемическая болезнь сердца. Стенокардия напряжения III ФК. Гипертоническая болезнь III ст., риск IV.

КТ головного мозга от 01.08.2022 г.: Картина ОНМК по ишемическому типу в районе левой задней МА, хронической ишемии вещества головного мозга с кистозно-глиозными изменениями.

ЦДС сосудов головного мозга от 01.08.2022 г.: Затруднение венозного оттока из полости черепа слева.

Не благоприятный иммунологический прогноз подтвердился развитием повторного ОНМК спустя 8 месяцев после первичной госпитализации.

Пример 3. Больная П., 40 лет, поступила на стационарное лечение в нейрохирургическое отделение №9 Республиканской клинической больницы №4 30.07.2022 г. с жалобами на интенсивную головную боль в затылочной области, головокружение, тошноту, рвоту, появившихся на фоне повышения систолического артериального давления до 260 мм рт. ст. После обследования выставлен диагноз: ОНМК по типу субарахноидально-паренхиматозного кровоизлияния (от 29.07.2022 г.), с образованием паренхиматозной гематомы правой гемисферы головного мозга, прорывом в желудочковую систему вследствие разрыва артериальной аневризмы правой внутренней сонной артерии. Левосторонний гемипарез. Гипертоническая болезнь III ст., риск IV.

Неврологический статус (при поступлении): Сознание на уровне легкого оглушения. Зрачки, глазные щели D=S. Нистагм отсутствует. Лицевая мускулатура симметричная. Язык по средней линии. Речь не нарушена. Сухожильные рефлексы с верхних и нижних конечностей D<S, тонус мышц D=S. Левосторонний гемипарез. Координаторные пробы с интенцией с обеих сторон. В позе Ромберга - не проводилась. Симптом Бабинского положительный с обеих сторон. Менингеальные знаки положительные.

Неврологический статус (при выписке): Сознание ясное. Несколько заторможена, несколько не критична к состоянию. Зрачки, глазные щели D=S. Нистагм отсутствует. Лицевая мускулатура симметричная. Язык по средней линии. Речь не нарушена. Сухожильные рефлексы с верхних и нижних конечностей D<S, тонус мышц D=S. Левосторонний легкий гемипарез. Симптом Бабинского положительный с обеих сторон. Менингеальные знаки отрицательные.

КТ головного мозга от 30.07.2022 г.: Картина ОНМК по геморрагическому типу.

КТ головного мозга от 03.08.2022 г.: Картина субарахноидального кровоизлияния с прорывом в желудочковую систему.

ЦДС сосудов головного мозга от 03.08.2022 г.: У3-признаки церебральной ангиодистонии со склонностью к ангиоспазму в бассейне средней МА и передней МА. Увеличение индексов периферического сопротивления сосудов головного мозга (признаки периферического вазоспазма).

Иммунологическое исследование от 03.08.2022 г.: количество VEGF - 600 пг/мл, IL-8 - 24 пг/мл, D-димера - 550 нг/мл.

Проведено оперативное лечение 09.08.2022 г.: Эндоваскулярная эмболизация артериальной аневризмы правой ВСА микроспиралями.

КТ головного мозга от 16.08.2022 г.: Картина после эмболизация аневризмы правой ВСА, гематомы правой височной доли в стадии лизирования.

На фоне лечения состояние с положительной динамикой. Выписана в удовлетворительном состоянии с улучшением. Реабилитационный прогноз сомнительный. Иммунологический прогноз: не благоприятный.

Через 3 месяца после выписки на фоне жалоб на головную боль, головокружение, тошноту, шаткость при ходьбе, слабость проведена КТ головного мозга (18.11.2022 г.): Картина ОНМК по ишемическому типу в бассейне задней МА, хронической ишемии вещества головного мозга. Данные подтвердили не благоприятный иммунологический прогноз.

При корреляционном анализе результатов определены статистически значимые сильные положительные взаимосвязи развития ОНМК с иммунными параметрами: коэффициент корреляции Пирсона составил для VEGF 0,766, IL-8 0,893, D-димера 0,742. У обследованных больных были выявлены положительные корреляционные связи между VEGF и IL-8: при ишемическом инсульте коэффициент корреляции Пирсона составил 0,536 (Р=0,0022), при геморрагическом инсульте - 0,490 (Р=0,006). При транзиторной ишемической атаке коэффициент корреляции Пирсона между VEGF и D-димером - 0,457 (Р=0,0111), тогда как при геморрагическом инсульте - -0,373 (Р=0,0426).

Регрессионный анализ полученных результатов установил чувствительность, специфичность показателей (табл.3), способствовал построению receiver operating characteristic (ROC) кривых (фиг.4) с определением индекса согласованности модели по площади (area) под (under) ROC кривыми (AUC).

Диагностический критерий, чувствительность и специфичность определения VEGF при ОНМК отражены на фиг.1; IL-8 - на фиг.2; D-димера - на фиг.3. При этом к негативным результатам (0) отнесли значения больных с транзиторной ишемической атакой, к позитивным (1) - данные больных с ОНМК по ишемическому или геморрагическому типам.

При анализе результатов больных 1-3 групп было составлено уравнение логистической регрессии, верно предсказывающее развитие ОНМК в 100% случаев:

logit (р) = -176,85548+0,011607×VEGF+9,21382×IL-8+0,091160×D-димер.

χ² составил 114,573 при Р < 0,0001, AUC 1,000, 95% доверительный интервал 0,960-1,000.

Способ предусматривает сочетанное определение концентрации васкулоэндотелиального фактора роста, интерлейкина-8 в сыворотке крови, D-димера в плазме крови. При комбинации значений VEGF больших 550 пг/мл, IL-8 больших 14 пг/мл, D-димера больших 245 нг/мл прогнозируют развитие ОНМК. Данный способ может быть использован для иммунодиагностики, прогнозирования течения и развития неврологических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний (ОНМК), а также при проведении профилактических осмотров работников различных учреждений, подверженных действию факторов риска. Применение предлагаемого способа позволит своевременно назначить или скорректировать персонализированную терапию больным, способствуя увеличению длительности и улучшению качества жизни.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и неврологии, и может быть использовано для иммунологического прогнозирования острых нарушений мозгового кровообращения при определении иммунологических параметров крови. Определяют количества васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина (IL)-8 в сыворотке крови, D-димера в плазме крови. При комбинации значений VEGF, больших 550 пг/мл, IL-8, больших 14 пг/мл, D-димера, больших 245 нг/мл, прогнозируют развитие острых нарушений мозгового кровообращения. Способ обеспечивает возможность малоинвазивного, не требующего больших материальных затрат иммунологического прогнозирования острых нарушений мозгового кровообращения, повышения специфичности и чувствительности определения трех параметров за счет повышения специфичности и чувствительности определения трех маркеров крови: VEGF, IL-8 и D-димера. 4 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ иммунологического прогнозирования острых нарушений мозгового кровообращения при определении иммунологических параметров крови, отличающийся тем, что определяют количества васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина (IL)-8 в сыворотке крови, D-димера в плазме крови, при комбинации значений VEGF, больших 550 пг/мл, IL-8, больших 14 пг/мл, D-димера, больших 245 нг/мл, прогнозируют развитие острых нарушений мозгового кровообращения.