Способ экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из кожуры клубней картофеля клубненосного Solanum tuberosum L., f. Solanaceae Российский патент 2024 года по МПК B01D11/02 A61K36/81 A61K125/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакогнозии, в частности к области получения веществ, обладающих потенциальной фармакологической активностью.

Изобретение относится к способу извлечения суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из высушенной кожуры картофеля для дальнейшего исследовании их фармакологической активности и рационального использования нереализуемого в иных экономических отраслях (пищевая промышленность, сельское хозяйство и пр.) отходов производства картофелепродуктов и картофельного крахмала для изготовления лекарственного препарата растительного происхождения, обладающего противомикробной, противоопухолевой и противогрибковой активностью.

Как и многие растения, картофель содержит вещества, которые защищают его от животных и насекомых. Одними из них являются гликоалкалоиды, обладающие потенциальной фармакологической активностью - альфа-соланин и альфа-чаконин. В исследованиях in vitro они проявляют противоопухолевую (I. Zupkò, J. Molnár, B. Réthy, et al., Molecules, 19(2), 2061 - 2076 (2014), противомикробную (R. C. Hennessy, N. O. Jørgensen, C. Scavenius, et al., Front. Microbiol., 9, 2648 (2018) и противогрибковую активности (Sánchez-Maldonado, A. F., Schieber, A., & Gänzle, M. G. (2016). Antifungal activity of secondary plant metabolites from potatoes (Solanum tuberosum L.): Glycoalkaloids and phenolic acids show synergistic effects. Journal of Applied Microbiology, 120(4), 955-965).

Технический результат

Разработан эффективный, экологичный и доступный способ экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из кожуры клубней картофеля клубненосного.

Существует ряд принципиально отличающихся способов экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из кожуры картофеля клубненосного.

1. Способ экстракции из высушенной кожуры осуществляется смесью метанола и уксусной кислоты с использованием электромембранной экстракции (Wan, L., Gao, H., Gao, H., Du, R., Wang, F., Wang, Y., & Chen, M. (2022). Selective extraction and determination of steroidal glycoalkaloids in potato tissues by electromembrane extraction combined with LC-MS/MS. Food Chemistry, 367, 130724.). Метанол относится к растворителям второго класса токсичности (ГФ 15), веществом общетоксического действия. Электромембранная экстракция - дорогостоящий, требующий дополнительного оборудования.

2. Еще один способ - экстракции этанолом из высушенной кожуры (Lee, Kyoung-Goo, et al. "α-Chaconine isolated from a Solanum tuberosum L. cv Jayoung suppresses lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory mediators via AP-1 inactivation in RAW 264.7 macrophages and protects mice from endotoxin shock." Chemico-Biological Interactions 235 (2015): 85-94). Спирт этиловый находится на предметно-количественном учете согласно приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 22 апреля 2014 г. №183н «Об утверждении перечня лекарственных средств для медицинского применения, подлежащих предметно-количественному учету». Несмотря на использовании в фармацевтической технологии при производстве настоек, экстрактов и т.д. относится к третьему классу токсичности (ГФ 15).

3. Другой способ экстракции с применением водного раствора уксусной кислоты с применением блендера нерационально для исследования фармакологической активности, так как помимо целевых (альфа-соланин и альфа-чаконин) в значительной степени происходит экстракция сопутствующих веществ (патент «Способ извлечения гликоалкалоидов из очищенной кожуры картофеля при производстве картофелепродуктов для использования в качестве инсектицида и подавления патогенной микрофлоры при вегетации сельскохозяйственных растений»).

Недостатком многих описанных способов является нестандартность используемой кожуры. Не описана методика высушивания (Wan, L., Gao, H., Gao, H., Du, R., Wang, F., Wang, Y., & Chen, M. (2022). Selective extraction and determination of steroidal glycoalkaloids in potato tissues by electromembrane extraction combined with LC-MS/MS. Food Chemistry, 367, 130724), не указана степень измельчения растительного сырья (Aziz, A., Randhawa, M. A., Butt, M. S., Asghar, A., Yasin, M., & Shibamoto, T. (2012). Glycoalkaloids (α-chaconine and α-solanine) contents of selected Pakistani potato cultivars and their dietary intake assessment. Journal of Food Science, 77(3), T58-T61), не учитывается коэффициент поглощения сырьем экстрагента.

Осуществление изобретения

В качестве сырья использовалась кожура клубней картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L., f. Solanaceae), подвергнутых воздействию естественного солнечного излучения в течение 2 недель, срезанная толщиной в 5 мм и высушенная до постоянной массы при 60°С.

Проводилась стандартизация сырья по таким показателям как микро- и макроскопические признаки, качественный состав (флавоноиды, дубильные вещества, хлорофилл, органические кислоты, общий белок, сумма полисахаридов), влажность, зола общая и зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте, радионуклиды, тяжелые металлы, остаточные пестициды, микробиологическая чистота (ГФ XV).

Для экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина отвешивали 50,0 г кожуры клубней картофеля, измельчали до 5 мм, контроль за измельчением осуществляли методом ситового анализа через пробивное сито с диаметром отверстий 5 мм (ГФ XV). Экстракция проводилась 5%-м водным раствором уксусной кислотой в соотношении 3:1 по отношению к растительному сырью с учетом коэффициента водопоглощения (K=2,85) - 412,6 мл. Приготовление 5%-й уксусной кислоты: 390,3 мл воды деионизированной, 22,3 мл ледяной уксусной кислоты. Помещали сырье в колбу на 1 л. Заливали приготовленным экстрагентом. Настаивали при перемешивании на шейкере в течение 10 мин. Фильтровали полученное извлечение через бумажный складчатый фильтр, помещенный в стеклянную воронку, под вакуумом для получения первой фракции экстракта.

Данную процедуру проводили трижды с тем же растительным сырьем.

Полученные извлечения объединяли. Доводили pH извлечения до 9,0 25%-м раствором аммиака водного для осаждения суммы альфа-соланина и альфа-чаконина с потенциометрическим контролем.

Выдерживали извлечение при комнатной температуре в течение 1 ч для протекания реакции осаждения суммы альфа-соланина и альфа-чаконина. Центрифугировали полученную суспензию в течение 10 мин при 1660 g. Надосадочную жидкость сливали. В полученный осадок добавляли 5-6 мл этилацетата в качестве вспомогательной жидкости для осуществления переноса осадка из центрифужной пробирки. Этилацетат с находящимся в нем осадком переливали в выпарительную фарфоровую чашку. Этилацетат отгонялся при комнатной температуре до сухой консистенции экстракта (остаточная влажность 5%).

Содержание суммы альфа-соланина и альфа-чаконина анализировалось методом высокоэффективной жидкостной хроматографией с тандемной масс-спектрометрией в градиентном режиме элюирования в положительном режиме ионизации с использованием внутреннего стандарта (фексофенадин - 1 нг/мл). В качестве подвижной фазы применялись 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты и метанол. Колонка Selectra C18 4.6mm x 100mm, 3 μm, 100 Å с предколонкой Selectra C18 SLC-18GDC46-3UM. Для построения калибровочной кривой использовались стандарты альфа-соланина и альфа-чаконина (Sigma, Germany). Статистический анализ проводился в программе Statistica 13.0.

Разработанный способ извлечения суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из стандартизированного растительного сырья - высушенной измельченной кожуры клубней картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L., f. Solanaceae) - привел к получению экстракта, содержащего 82,64±22,75 мг суммы альфа-соланина и альфа-чаконина на 100 г кожуры, и составил 46,19±6,91% от массы полученного сухого экстракта.

Пример

В качестве объекта для апробации методики был выбран картофель клубненосный (Solanum tuberosum L., f. Solanaceae), который подвергали воздействию естественного солнечного излучения в течение 2 недель. Затем с клубней срезали кожуру толщиной 5 мм и высушивали до постоянной массы при 60°С.

Использовали измельченную кожуру с остаточной влажностью менее 6%, золой общей - менее 15%, нерастворимой в хлористоводородной кислоте - менее 2%. Содержание радионуклидов, тяжелых металлов, остаточных пестицидов, микробиологическая не превышали нормативы общей фармакопейной статьи на лекарственное растительное сырье.

Качественный анализ подтвердил наличие органических кислот, общего белка, полисахаридов и гликоалкалоидов.

Для экстракции отвешивали 50,0 г стандартизированной кожуры клубней картофеля, прибавляли 412,6 мл 5%-го водного раствора уксусной кислоты, настаивали при перемешивании на шейкере в течение 10 мин. Фильтровали полученное извлечение через бумажный складчатый фильтр, помещенный в стеклянную воронку, под вакуумом для получения первой фракции экстракта. Процедуру проводили трижды с тем же растительным сырьем с новыми порциями экстрагента. Полученные извлечения объединяли. Доводили pH извлечения до 9,0 25%-м раствором аммиака водного с потенциометрическим контролем. Выдерживали извлечение при комнатной температуре в течение 1 ч. Центрифугировали суспензию 10 мин при 1660 g. Надосадочную жидкость сливали. К осадку добавляли 5 мл этилацетата, переносили суспензию в выпарительную фарфоровую чашку. Этилацетат отгоняли при комнатной температуре до сухой консистенции экстракта.

Содержание суммы альфа-соланина и альфа-чаконина анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографией с тандемной масс-спектрометрией и составило 83,71 мг на 100 г кожуры или 45,14% в сухом экстракте.

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакогнозии, в частности к области получения веществ, обладающих потенциальной фармакологической активностью. Способ экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из кожуры клубней картофеля клубненосного Solanum tuberosum L., f. Solanaceae предусматривает экстракцию подготовленного сырья в дробном режиме 3 раза по 10 мин тремя порциями экстрагента. После чего полученные экстракты фильтруют, фильтраты объединяют, смешивают с 25%-м водным раствором аммиака, выдерживают извлечение при комнатной температуре в течение 1 ч для протекания реакции осаждения. Далее проводят центрифугирование в течение 10 мин 1660 g, сливают надосадочную жидкость, смешивают осадок с этилацетатом, перемешивают, отгоняют этилацетат с получением высушенного экстракта влажностью 5%. При этом в качестве источника целевых веществ используют кожуру клубней картофеля, который в течении 2 недель подвергают воздействию солнечного излучения, затем срезают кожуру толщиной 5 мм, высушивают при 60°С до постоянной массы с остаточной влажностью 6% и измельчают, а в качестве экстрагента используют 5%-й водный раствор уксусной кислоты. Выход суммы альфа-соланина и альфа-чаконина составляет 46,19±6,91% суммы сухих веществ в экстракте. Предлагаемый способ экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина обеспечивает повышение выхода целевого продукта высокого качества, прост в осуществлении, не требует использования дорогостоящего оборудования и токсичных экстрагентов. 1 пр.

Способ экстракции суммы альфа-соланина и альфа-чаконина из кожуры клубней картофеля клубненосного Solanum tuberosum L., f. Solanaceae, характеризующийся тем, что в качестве источника целевых веществ используют кожуру клубней картофеля, который в течении 2 недель подвергают воздействию солнечного излучения, затем срезают кожуру толщиной 5 мм, высушивают при 60°С до постоянной массы с остаточной влажностью 6%, измельчают, 50 г подготовленного сырья экстрагируют в дробном режиме 3 раза по 10 мин тремя порциями экстрагента по 412,6 мл, полученные экстракты фильтруют, фильтраты объединяют, смешивают с 25%-м водным раствором аммиака, выдерживают извлечение при комнатной температуре в течение 1 ч для протекания реакции осаждения, центрифугируют в течение 10 мин 1660 g, сливают надосадочную жидкость, смешивают осадок с 5-6 мл этилацетата, перемешивают, отгоняют этилацетат с получением высушенного экстракта влажностью 5%, при этом в качестве экстрагента используют 5%-й водный раствор уксусной кислоты, и выход суммы альфа-соланина и альфа-чаконина составляет 46,19±6,91% суммы сухих веществ в экстракте.