Ускоренный способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением иммуноферментного анализа Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 G01N1/28 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, к послеубойной диагностике заболевания лейкоза крупного рогатого скота. Применяемый способ выявляет антитела к антигену gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в присутствующей мышечно-тканевой жидкости в туше и субпродуктах животного. Представленный способ может использоваться в области ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и субпродуктов животных и имеет ряд преимуществ в послеубойной диагностике лейкоза крупного рогатого скота: высокую чувствительность метода иммуноферментного анализа (ИФА), кратчайшие сроки постановки и анализа реакции (3-5 ч), простота в применении ИФА в лабораторных условиях.

Лейкоз крупного рогатого скота или энзоотический лейкоз крупного рогатого скота (ЭЛКРС) имеет широкое распространение в разных странах мира, в том числе и в субъектах Российской Федерации. Основным источником, вызывающим эпизоотию лейкоза крупного рогатого скота, являются инфицированные ВЛКРС животные на разных стадиях заболевания. По данным международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses) ВЛКРС или bovine leukemia virus (BLV) относится к семейству Retroviridae [1]. Особенностью ВЛКРС является то, что заболевание в организме животного протекает в основном в хронической форме и характеризуется безудержным ростом неопластических клеток крови, поражая практически все органы целого организма крупного рогатого скота. Сначала процесса инфицирования ВЛКРС животного до появления клинической картины лейкоза крупного рогатого скота проходит ряд стадий: инкубационный период (длится от 8 до 15 дней), стадия бессимптомного вирусоносительства (антителоносительство или серопозитивные животные), гематологическая стадия (меняется состав форменных элементов крови), опухолевая (клиническая) стадия. Во всех стадиях (кроме инкубационного периода) в организме животного вырабатываются антитела к антигену ВЛКРС, что прижизненно диагностируется существующими серологическими методами (РИД, методом иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д.). Помимо серологических методов в прижизненной диагностике лейкоза крупного рогато скота существуют и другие способы: гематологический, клинический, цитоморфологический, биопроба на животных (овцах) и т.д. [2-4].

Постановка послеубойного диагноза на лейкоз крупного рогатого скота от вынужденно убойных или павших животных осуществляется следующими методами: патоморфологическим, гистологическим и молекулярно-генетическим (с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)). Последний метод (ПЦР) применяется и в прижизненной диагностике лейкоза крупного рогатого скота. При патоморфологическом

(патологоанатомическом) методе исследование туш и органов от вынуждено убитых или павших животных при наличии патологического процесса были отмечены лейкозные (опухолевые) разрастания, увеличение лимфатических узлов, увеличение внутренних органов. В разных формах лейкоза крупного рогатого скота наблюдаются патологические изменения в органах и в различных системах организма. При лимфоидной, недифференцированной и миелоидной формах лейкоза лимфатические узлы увеличены, на разрезе серо-белого цвета, сочные и саловидные, увеличена в размере селезенка. При миелоидной форме лейкоза пульпа селезенки красно-малинового цвета, ткань органа рыхлой консистенции с кровоизлияниями. В гематосаркоме селезенка бывает увеличена лишь (при лимфогранулематозе) около у 50% животных. В любых формах лейкоза были отмечены очаговые (диффузные) разрастания серо-белого или серо-розового цвета в органах (печени, почках, скелетной мускулатуре и т.д.) в случае их поражения. При неполной картине патоморфологических исследований проводятся гистологические срезы кусочков органов (костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и т.д.) и тканей мышц (соединительной, мышечной и т.д.) убойного животного по предусмотренной методике.

После приготовления срезов в окуляре с увеличением 20^× и в объективе с увеличением 40^× выявляются детали изменений. Особое внимание обращается на характер клеток пролиферата и выраженность патологогистологических изменений в тканях и органах животного [5-8].

Недостатками данных методов (патоморфологического, гистологического) является то, что эти способы не выявляют ранние стадии серопозитивных к ВЛКРС животных. Для проведения гистологических срезов требуется определенное время (3-4 суток), что затрудняет ход реализации мясной продукции на рынке или в магазинах.

Существует молекулярно-генетический метод послеубойной диагностики с применением ПЦР. Сущность данной методики заключается в том, что в кусочках ткани органов, мышцах, полученных из туш животного, находят ДНК-провирус (ВЛКРС), встроенный в геном клетки хозяина.

К недостаткам, относящимся к молекулярно-генетическому методу (ПЦР), относятся неспецифические реакции, высокая ценовая стоимость исследований, необходимость соблюдения температурных параметров внешней среды (высокая t-°С пагубно влияет на ВЛКРС).

Наиболее близко к заявленному способу относится серологический метод послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением реакции иммунодиффузии (РИД) (патент RU №2744706), который заключается в послеубойной диагностике лейкоза крупного рогатого скота, включающий отбор проб путем смывов с тканевой жидкостью с надрезов туш и субпродуктов животных одноразовым стерильным скальпелем при помощи стерильных сухих тампонов из ваты, которые затем помещают в пронумерованные стерильные пробирки и добавляют 0,5-0,7 мл 0,85% раствора NaCl в зависимости от размеров тампонов и оставляют их на 3-4 часа, после чего проводят постановку реакции иммунодиффузии, учет которой проводят после 48 часов инкубации и по линиям преципитации выявляют наличие антител к антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота [9-10].

К недостаткам данной реакции (РИД) (способа) в послеубойной диагностике относятся: сроки завершения РИД (учет реакции проводится только через 48 часов), низкая чувствительность и сомнительные показатели учета реакции.

Целью предполагаемого изобретения является использование нового ускоренного способа послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением иммуноферментного анализа (ИФА).

Исходя из поставленной цели, были отобраны пробы из органов и туш крупного рогатого скота в виде смывов. Смывы отбирались из разных мест туш или субпродуктов крупного рогатого скота. Для отбора проб использовались стерильные скальпели, вата, 5 мл пробирки с колпачком. Из стерильной ваты делались маленькие тампоны, с помощью которых путем надрезов туш и органов послеубойных животных были получены смывы. В дальнейшем, полученные тампоны со смывом были помещены в одноразовые пробирки. Пробирки в обязательном порядке маркируются, и доставляются с сопроводительным документом в лабораторию. К пробиркам со смывами была добавлена дистиллированная вода (можно использовать изотонический раствор (0,85% раствор NaCl)) в количестве от 0,1 до 0,2 мл, в зависимости от размера сделанного тампона. Тампоны со смывами были оставлены в помещении на несколько часов (1,5-2 ч) при комнатной температуре (22-26°С). Периодически их немного встряхивали. Полученный однородный субстрат из пробирки был использован для постановки реакции ИФА (по инструкции по применению набора для выявления антител к ВЛКРС методом ИФА (организацией-производителем - ООО «Ветбиохим», г. Москва)).

Постановка реакции ИФА проводилась предусмотренным порядком производителем ООО «Ветбиохим». Так, в начале анализа в стрипованый планшет (из 96-луночной микропанели с адсорбированной в лунках специфическим антигеном gp51 ВЛКРС) в количестве 75 лунок было внесено по 100 мкл буфера для разведения образцов (БР). Из 75 используемых лунок в четыре были внесены контрольные сыворотки (К⁺ и К^-) в двух повторах (4 мкл), а в остальные (71 лунок) была внесена однородный субстрат (смыв с тканевой жидкостью, диффундированной дистиллированной водой) в количестве также по 4 мкл. После внесения проб содержимое лунок тщательно перемешивалось, планшет накрывался липкой пленкой и инкубировался 1 ч. в термостате при температуре - 37°С. Через час инкубации планшет 3 раза промывался заранее подготовленным рабочим раствором ФСБТ (фосфатно-солевым буфером, содержавшем твин-20) вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость удалялась, а планшет подсушивался постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. В последующем в лунки микропанели вносился по 100 мкл раствор конъюгата (моноклональных антител к lgG крупного рогатого скота, меченных пероксидазой), накрывался липкой пленкой и инкубировался в термостате при температуре - 37°С течение 1 ч. По истечении 1 ч. лунки микропанели промывались по 3 раза промывочным раствором ФСБТ (300 мкл/лунку). Затем планшет подсушивался постукиванием на сложенной фильтровальной бумаге. После этого в лунки микропанели вносилось по 100 мкл раствора субстрата (раствора тетраметилбензидина, содержащего перекись водорода) и выдерживался 10 минут в темном месте при комнатной температуре (22°С). Реакция (ИФА) была остановлена добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора (1NH₂SO₄). Учет реакции проводили путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Общая оценка результатов ИФА проводилась путем определения среднего значения оптической плотности (ОП) отрицательных и положительных контролей. Относительное содержание антител к ВЛКРС, выраженное в международных ИФА единицах (EU) в отрицательном контроле (К^-) и в испытуемых образцах, вычислялось по формуле:

Результат проведенных исследований с применением ИФА показал высокую чувствительность реакции к ВЛКРС в испытуемого субстрата. Так, из 71 пробы (смывов), исследованных в реакции (ИФА), в 6 лунках микропанели были выявлены специфические антитела к ВЛКРС. Таким образом, заявленную тест-систему (реакцию) ИФА можно отнести к ускоренному новому способу послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что соответствует критерию «новизна».

Сравнительные данные по оценке послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота были получены по результатам проведенных диагностических исследований полученных смывов с мяса (туш крупного рогатого скота) и субпродуктов (почек, печени, сердца, и т.д.) в серологических реакциях с использованием ИФА и РИД (Таблица №1).

Таким образом, при сравнительном аспекте проведенных исследований с применением РИД и ИФА, реакция ИФА показала свою высокую чувствительность в выявлению специфических антител к антигену ВЛКРС в постановке послеубойного диагноза лейкоза крупного рогатого скота. Предложенный способ (метод) с применением ИФА выявляет специфические антитела, содержащиеся в тканевой жидкости (в плазме и лимфе), полученной из туш и субпродуктов животных к антигену gp51 ВЛКРС в лунках микропанели, что существенно сокращает время послеубойной диагностики.

Список литературы

1. Международный комитет по таксономии вирусов [электронный ресурс], режим доступа: https://ictv.global/taxonomy

2. Гулюкин М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в товарных и племенных хозяйствах Российской Федерации за 2014-2015 годы / М.И. Гулюкин[и др.] // Ветеринария и кормление. - М.: - 2016. - №4. - С. 5-39.

3. Донник И.Н. Лейкоз крупного рогатого скота - диагностика, оздоровление, антропозоонозный потенциал (история вопроса) (обзор). / И.Н. Донник [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - М.: - 2021. - №2. - 230-244.

4. Gillet N. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. / Gillet N., Florins A., Boxus M. // Retrovirology. -2007. - Vol. 4. -N. 18. - P. 1-32.

5. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота: утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 23.08.2000. - М.: -№13-7-2/2130.-22 с.

6. Симонян Г.А. Гематосаркомы - опухолевые формы проявления гематобластозов//Ветеринария - М.:- 2014. - 5. - С. 21-27

7. Ветеринарная гематология / Симонян Г.А., Хисамудинов Ф.Ф. // - М.: «Колос». - 1995. - 256 с.

8. Симонян Г.А. Дифференциальная диагностика различных форм гемобластозов // Ветеринария. - М. - 2013. - №9. - С. 21-25.

9. Патент №RU 2744706 С1, Российской Федерации, МПК. Способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Мустафаев А.Р. Дата публикации 15.03.2021 г.

10. Мустафаев А.Р. Применение реакции иммунодиффузии как один из способов послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. // Ветеринария сегодня. - Владимир. - 2022 - Т. 11. - №. 1. - С. 49-52.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарно-санитарной экспертизе мяса и субпродуктов крупного рогатого скота. Способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа включает отбор проб смывов с туш или субпродуктов животных с помощью ватных тампонов путем надрезов туш и органов послеубойных животных стерильными скальпелями, помещение тампонов со смывами в пробирки, добавление к пробам, в зависимости от размеров тампонов, 0,1-0,2 мл дистиллированной воды и оставление на 1,5-2 часа. Полученный однородный субстрат из пробирки используют для иммуноферментного анализа для выявления специфических антител к антигену gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Предложенный способ выявляет специфические антитела, находящиеся в мышечно-тканевой жидкости (в плазме и лимфе), к антигену gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в кратчайшие сроки (3-5 ч). 1 табл.

Способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, включающий отбор проб смывов с туш или субпродуктов животных с помощью ватных тампонов путем надрезов туш и органов послеубойных животных стерильными скальпелями, помещение тампонов со смывами в пробирки, отличающийся тем, что к пробам, в зависимости от размеров тампонов, добавляют 0,1-0,2 мл дистиллированной воды и оставляют на 1,5-2 часа, полученный однородный субстрат из пробирки используют для иммуноферментного анализа для выявления специфических антител к антигену gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.