Кормовая добавка для рыб, обеспечивающая коррекцию кишечной микробиоты Российский патент 2024 года по МПК A23K50/80 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к рыбоводству и может быть использовано для кормления рыб.

Установлено, что ультрадисперсные частицы (УДЧ) металлов могут проявлять способность к коррекции кишечной микробиоты за счет подавления плотностно-зависимой коммуникации у бактерий через подавление синтеза автоиндукторов (АИ), внеклеточное связывание АИ и блокирование комплекса «сигнальная молекула-рецепторный белок» (Sadekuzzaman M., Yang S., Mizan M.F.R., Ha S.D. Current and recent advanced strategies for combating biofilms // Compr Rev Food Sci Food Saf. - 2015. - Vol.14(4). - P.491-509. doi:10.1111/1541-4337.12144; Hayat S., Muzammil S., Shabana, Aslam B., Siddique M.H., Saqalein M., Nisar M.A. Quorum quenching: role of nanoparticles as signal jammers in Gram-negative bacteria // Future Microbiol. - 2019. - Vol.14. - P.61-72. doi:10.2217/fmb-2018-0257).

Одним из перспективных способов коррекции кишечной микробиоты является использование УДЧ SiO₂, активность которых обусловлена образованием активных форм кислорода (Chu Z., Huang Y., Li L., Tao Q., Li Q. Physiological pathway of human cell damage induced by genotoxic crystalline silicananoparticles // Biomaterials. - 2012. - Vol.33(30). - P.7540-7546. doi:10.1016/j.biomaterials.2012.06.073). УДЧ SiO₂ способны перехватывать сигнальные молекулы (АГЛ) и в итоге вести к тушению биолюминесценции V. fischeri (Miller K.P., Wang L., Chen Y.P., Pellechia P.J., Benicewicz B.C., Decho A.W. Engineering nanoparticles to silence bacterial communication // Front Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P.189. doi:10.3389/fmicb.2015.00189; Miller E.L., Kjos M., Abrudan M.I., Roberts I.S., Veening J.W., Rozen D.E. Eavesdropping and crosstalk between secreted quorum sensing peptide signals that regulate bacteriocin production in Streptococcus pneumoniae // ISME J. - 2018. Vol.12(10). P.2363-2375. doi:10.1038/s41396-018-0178-x). Высокая биосовместимость УДЧ SiO₂ открывает возможность повышения эффективности коррекции кишечной микробиоты с помощью сочетанного применения с пробиотическими штаммами бактерий, способных активно подавлять рост патогенных микроорганизмов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является использование фитосоединений природного происхождения и пробиотических штаммов бактерий.

Известен способ подавления плотностно-зависимой коммуникации бактерий (WO 2009114810, A61K 31/357, A61P 31/12, 2009 г.) с использованием компонентов лекарственных растений - эллагитанинов (вескалагина и касталагина).

Недостатком данного способа является трудоемкость процесса получения эллагитанинов из растений Conocarpus erectus L. (Combretaceae).

Известна кормовая добавка из бактерий штамма Bacillus subtilis 111 с титром 2⋅10⁶-6⋅10⁹ КОЕ/г. и наполнителя (диатомит в виде обожженной крошки), подавляющая развитие патогенных микроорганизмов и способствующая формированию полезной микрофлоры в пищеварительном тракте (RU 2569002, A23K 1/16, A23K 1/175, 2015 г.).

Известна композиция на основе фитоэкстрактов, подавляющая чувство кворума у бактерий (RU 2542464, A61K 36/61, A61K 36/185, A61K 36/49, A61P 31/04, 2015 г.), состоящая из высушенных водных или спиртовых экстракта коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae), листьев эвкалипта (Eucalyptus folia).

Известен способ модуляции кишечной микробиоты (RU 2738265, A61K 38/00, A61K 38/16, C07K 14/47, A23L 33/00, 2020 г.), который предусматривает пероральное введение α- и/или β-дефензинов млекопитающих.

Известен способ для ингибирования различных систем «кворум сенсинга» lux/luxr типа у бактерий (RU 2744456, A61K 31/37, A61P 31/04, 2021 г.) с помощью кумарина.

Недостатком данных способов является её ограниченная область применения, так как используется для сельскохозяйственных животных и птицы.

Известен способ применения хвойно-энергетической добавки в кормлении рыб (RU 2676727, A23K 50/80, 2019 г.).

Недостатком данного способа является необходимость непосредственно перед кормлением, вымачивать корм в течение 3-х минут в хвойно-энергетической добавке, что может привести к изменению физических свойств корма и снижению усвояемости некоторых питательных веществ.

Известен способ коррекции микробиома кишечника рыб (RU 2785408, A23K 50/80, 2022 г.), который предусматривает введение в основной рацион пробиотического препарата «Соя-бифидум», в количестве 0,7 мл/кг корма.

Недостатком данного способа является низкая продуктивность рыб.

Известна кормовая добавка (RU 2794794, A23K 50/10, A23K 10/30, 2023), состоящая из трех высушенных водных экстракта - коры дуба, листьев березы и травы зверобоя, для профилактики заболеваний и регулирования пищеварительных процессов в желудочно-кишечном тракте - увеличить грамположительные бактерии Ruminococcaceae, Lachnospiraceae и снизить грамотрицательные бактерии класса Negativicutes.

Недостатком добавки является её ограниченная область применения, так как используется только для жвачных животных.

Задачей изобретения является коррекция кишечной микробиоты кишечника рыб, с целью повышения продуктивности рыб.

Поставленная задача решается путем скармливания комбикорма, тонкий слой которого опрыскивают пробиотическим препаратом «Бифидобиом» (с содержанием не менее 1 х 10¹⁰ КОЕ/г Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis), в количестве 0,7 мг/кг корма предварительно растворенный в дистиллированной воде и ультрадисперсными частицами SiO₂ полученными методом плазмохимического синтеза, размером 126,5±9,7 нм, в дозе 200 мг/кг корма, предварительно обработанные ультразвуком в дистиллированной воде в течение 30 мин с частотой 35 кГц.

Для осуществления способа проведены экспериментальные исследования в условиях кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры Оренбургского государственного университета, в рамках которого методом пар-аналогов было сформированы 2 группы (n=30) молоди карпа. Контрольная группа (контроль) получала основной рацион (ОР), а опытная группа (опытная) - ОР + пробиотический препарат «Бифидобиом» (доза 0,7 мг/кг) + УДЧ SiO₂ (доза 200 мг/кг).

В качестве ОР использовался сбалансированный по основным питательным веществам корм для карповых рыб КРК-110-1 производства ОАО «Оренбургский комбикормовый завод» (г. Оренбург). Пробиотический препарат «Бифидобиом» производства ООО «Провита-Лактис» (г. Бугуруслан). УДЧ SiO₂ получены методом плазмохимического синтеза (ООО «Плазмотерм», г. Москва), размером 126,5±9,7 нм, Z-потенциал - 29±0,1 мВ.

Биологическое разнообразие микробиома кишечника рыб проводили по средству выделения ДНК с использованием набор реагентов QIAamp® DNA Mini Kit. Были отобраны по три образца с каждой группы содержимого кишечника. Секвенирование образцов выполнено в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург). Результаты исследований обработаны с применением общепринятых методик при помощи приложения «Excel 2010» и «Statistica 10.0».

В результате экспериментальных исследований зафиксирован ростостимулирующий эффект от включения в рацион рыб пробиотического препарата «Бифидобиом» и УДЧ SiO₂ (табл. 1). Установлено достоверное повышение живой массы карпа опытной группы на 8 - 9,8 % относительно контроля, начиная с 3 недели эксперимента.

Таблица 1 - Динамика живой массы карпа, г Группа Неделя эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 8 Контроль 54,1 ± 3,1 59,4 ± 3,2 62,0 ± 6,3 64,1 ± 5,7 75,2 ± 7,5 85,5 ± 9,5 96,8 ± 10,6 107,3 ± 11,5 Опытная 55,7 ± 3,0 59,9 ± 3,6 66,9 ± 4,2* 70,4 ± 4,0* 81,2 ± 5,9* 92,4 ± 6,6* 104,8 ± 9,6* 116,9 ± 10,1* Примечание: * Р≤0,05

По данным высокопроизводительного секвенирования тотальной ДНК, выделенной из кишечника рыб, в опытной группе установлено увеличение индексов разнообразия кишечной микробиоты по сравнению с контролем: индекса Шеннона (фиг. 1) и индекса Симпсона (фиг. 2). На 3D диаграмме ординации точки, соответствующие образцам кишечной микробиоты отмечены отдельные изолированные кластеры (фиг. 3).

Анализ микробиома кишечника подопытных рыб установил существенные изменения соотношений бактериальных таксонов в микробиоте кишечника карпа опытной группы на всех таксономических уровнях относительно контрольных значений. В частности, наблюдалось существенное увеличение доли фил Actinobacteria до 24,3 %, Firmicutes до 23,4 %, и значительное снижение доли филы Spirochaetes до 29,3 % (фиг. 4).

На уровне классов значительно возрастала доля Actinobacteria до 23,7 %, Bacilli до 20,6 %, Cyanobacteria до 1,9 %; существенно снижалась доля облигатно анаэробных бактерий классов Fusobacteriia до 11,3 % и Spirochaetia до 29,3 % (фиг. 5).

На уровне семейств существенно снижалась доля Aeromonadaceae до 10,2 %, Brevinemataceae до 29,3 %; полностью исчезло семейство Azospirillaceae; существенно возросли доли Micrococcaceae до 5,2 %, Pseudomonadaceae до 9,6 % (фиг. 6).

На уровне родов значительно снижались доли Aeromonas до 10,2 %, Brevinema до 29,3 %, Cetobacterium до 11,3 %; полностью исчез род Niveispirillum; возросли доли родов Micrococcus, Pseudomonas, Streptococcus (фиг.7).

Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы:

- Кормовая добавка для рыб состоящего из пробиотического препарата «Бифидобиом» (в количестве 0,7 мг/кг корма) и ультрадисперсных частиц SiO₂ (в количестве 200 мг/кг корма) обеспечивает коррекцию кишечной микробиоты, а именно снижает численность патогенной и условно-патогенной микрофлоры и увеличивает относительную численность потенциально полезных видов бактерий, и как следствие повышает продуктивность рыб;

- заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».

Изобретение относится к рыбоводству и может быть использовано для кормления рыб. Кормовая добавка включает пробиотический препарат «Бифидобиом» в количестве 0,7 мг/кг корма с содержанием не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и ультрадисперсные частицы SiO₂ размером 126,5±9,7 нм, в количестве 200 мг/кг корма. Препарат «Бифидобиом» предварительно растворяют в дистиллированной воде, а ультрадисперсные частицы SiO₂ предварительно обрабатывают ультразвуком в дистиллированной воде в течение 30 мин с частотой 35 кГц. Изобретение обеспечивает повышение продуктивности рыбы, подавляет патогенную и условно-патогенную микрофлору и увеличивает относительную численность потенциально полезных видов бактерий в кишечнике. 7 ил., 1 табл.

Кормовая добавка для рыб, обеспечивающая коррекцию кишечной микробиоты, включающая пробиотический препарат «Бифидобиом» в количестве 0,7 мг/кг корма с содержанием не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и ультрадисперсные частицы SiO₂ размером 126,5±9,7 нм, в количестве 200 мг/кг корма, причем препарат «Бифидобиом» предварительно растворяют в дистиллированной воде, а ультрадисперсные частицы SiO₂ предварительно обрабатывают ультразвуком в дистиллированной воде в течение 30 мин с частотой 35 кГц.