Способы детектирования вариантов нуклеиновых кислот Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6816 C12Q1/6818 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей представляющие интерес нуклеотиды, в частности для детектирования мутаций зародышевой линии и соматических мутаций, а также микросателлитной нестабильности. Также описаны способы предсказания эффективности лекарства и детектирования присутствия клинического расстройства у субъекта, а также репортерные олигонуклеотиды и наборы для осуществления способов.

Предпосылки изобретения

Наследственные (относящиеся к зародышевой линии) или ненаследственные (соматические) мутационные события, такие как однонуклеотидные замещения, делеции, вставки, переносы, и дупликации, оказывают инструментальное влияние на биологию человека. Определение генетического профиля обеспечивает выявление информации, связанной с реакцией на внешние факторы, такие как физические упражнения и диета, а также используется в рамках диагностики и прогнозирования заболеваний и применяемых схемах лечения. Генетический анализ обычно осуществляется с применением таких инструментов как секвенирование ДНК или аллель-специфическая ПЦР. Способы, включающие вариабельное связывание молекулярных зондов, могут применяться в рамках вариаций зародышевой линии, однако при комбинировании с такими технологиями как HRM также могут применяться в рамках соматических мутаций с низкой частотой аллелей.

Повторяющиеся нуклеотидные последовательности, такие как прямые или обратные повторы, наблюдаются у многих организмов. В качестве примера, сотни тысяч микросателлитных локусов распределены по всему геному человека и, таким образом, встречаются статистически приблизительно один раз на каждые 100000 пар оснований. Микросателлитный локус представляет собой участок геномной ДНК, который включает короткие тандемные повторы, в которых наиболее короткие повторяющиеся единицы обычно имеют длину от одного до пяти нуклеотидов. Соответственно, повторяющаяся единица конкретного микросателлитного локуса обычно обозначается как моно-, ди-, три-, тетра-, или пентанукпеотидный повторяющийся локус, соответственно. Отдельный микросателлитный локус обычно включает приблизительно от 10 до 40 данных повторяющихся единиц, расположенных в виде тандема. Далее, каждый микросателлитный локус нормальной геномной ДНК большинства диплоидных видов, такой как геномная ДНК млекопитающих, включает два аллеля в каждом локусе. Данные два аллеля могут являться идентичными или различающимися относительно друг друга в плане длины и могут являться различными у разных людей.

Микросателлитная нестабильность (MSI) или ошибка репликации (RER) представляет собой пример геномной нестабильности, которая возникает при определенных неоплазмах человека, в рамках которых опухолевые клетки снизили способность обеспечивать точную репликацию ДНК. MSI представляет собой общий маркер лежащей в основе функциональной деактивации гена репарации несовпадений ДНК человека (MMR). Считается, что функциональная потеря гена MMR возникает вследствие биаллельной деактивации за счет мутаций кодирующего участка, потери гетерозиготности (LOH), и/или метилирования промоторов. Далее, известно, что мутации зародышевой линии генов MMR представляют собой аутосомальный доминантный генетический дефекту большинства родственников больных наследственным неполипозным раком толстой кишки (HNPCC). Другие мутации, вызываемые опухолевыми клетками у субъектов с HNPCC, приводят к биаллельной деактивации определенного гена MMR, вызывая потерю точной репликации микросателлитной ДНК в опухолях Таким образом, MSI представляет собой маркер лежащего в основе дефекта репарации несовпадений ДНК и также ассоциирован с повышенными показателями мутаций в кодирующей ДНК. Данный мутаторный фенотип, который является результатом дефекта MMR, вызывает как замещения оснований кодирующего участка, так и мутации сдвига рамки считывания в прямых повторах с равной частотой, помимо того, что он вызывает MSI. Считается, что продуцирование дефектов MMR и возникающий в результате этого мутаторный фенотип представляют собой раннее событие при онкогенезе.

MSI не только связана с дефектом зародышевой линии у семей с HNPCC, но также присутствует при приблизительно от 15 до 20% случаев спорадического рака толстой кишки, при этом данное открытие также отражает общее повышение геномной нестабильности (также измеряемое в виде бремени связанных с опухолями мутаций). Обнаружение связанных с MSI дефектов в опухолях также было ассоциировано с лучшим прогнозом при опухолях одной и той же стадии. Таким образом, является клинически важным идентифицировать опухоли с MSI не только в плане дефектов MMR зародышевой линии (у семей с HNPCC), но также для прогностической стратификации. В то время как клинические (руководства Bethesda(Rodriguez-Bigas etal., 1997) и гистопатологические признаки могут вызывать подозрение, что опухоль толстой кишки связана с микросателлитной нестабильностью и вероятно возникла у семьи с HNPCC, клиникопатологические признаки зачастую являются недостаточными для диагностирования присутствия MSI. Соответственно, для определения связанного с MSI статуса клинически подозрительной опухоли может применяться молекулярное тестирование (Boland et al., 1998).

Помимо опухолей толстой кишки MSI также была ассоциирована с другими типами рака и другими генетическими заболеваниями. В качестве иллюстрации они включают, помимо прочих, карциномы поджелудочной железы, карциномы желудка, рак мочевого пузыря, карциномы простаты, рак легкого, карциномы матки и рак груди. Другие примеры генетических заболеваний, которые, как считается, связаны с микросателлитной нестабильностью, включают, например, Болезнь Хантингтона (HD), дентаторубро-паллидолюисову атрофию (DRPLA), спинобульбарную и мышечную атрофию (SBMA), миотоническую дистрофию (DM), синдром ломкой Х-хромосомы, умственную отсталость FRAXE и спиноцеребеллярную атаксию (SCA), Х-сцепленную агаммаглобулинемию (болезнь Брутона), синдром Блума (BS), краниофронтоназальный синдром (CFNS), и идиопатический фиброз легких (IPF).

В связи с вышеизложенным является очевидным, что анализ вариантов нуклеотидных последовательностей, например повторяющихся нуклеотидных последовательностей, таких как микросателлиты, имеет множество диагностических и прогностических вариантов использования, помимо прочих видов применения. Таким образом, существует потребность в чувствительных, объективных и надежных видах анализов.

Краткое описание изобретения

Изобретение соответствует описанному в формуле изобретения. Описанные здесь способы относятся к быстрому, легкому, объективному и чувствительному способу анализа мутаций зародышевой линии и соматических мутаций, а также микросателлитной нестабильности.

Здесь предусмотрен способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, включающую NOI;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление анализа плавления, такого как высокочувствительный анализ кривых плавления (HRM), первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление анализа плавления, такого как HRM анализ, второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом анализ плавления включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

где репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации H,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты,

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его З'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

g) Сравнение первого профиля с контрольным профилем, при этом различие между первым профилем и контрольным профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

Здесь предусмотрен способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ следующие включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление высокочувствительного анализа кривых плавления (HRM) первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого HRM профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление HRM анализа второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго HRM профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй HRM профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом HRM анализ включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления; при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и

при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты, Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и д) Сравнение первого HRM профиля с контрольным HRM профилем, при этом разница между первым HRM профилем и контрольным HRM профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

Здесь также предусмотрен набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

а) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от З'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты.

Здесь также предусмотрен набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

а) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать нуклеиновую кислоту-мишень.

Здесь также предусмотрен репортерный олигонуклеотид, который может гибридизироваться с одной цепью нуклеиновой кислоты-мишени, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанный репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации М,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его З'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться со второй цепью первого и второго ампликона, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

Здесь также предусмотрен репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

Здесь также предусмотрены способы предсказания эффективности лечения клинического состояния у субъекта, которые могут включать следующие этапы:

a. получение образца от указанного субъекта;

b. осуществление способа детектирования присутствия варианта последовательности, как описано здесь, для определения того, включает ли образец вариант последовательности

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, является ли указанное лекарство эффективным в плане лечения указанного клинического состояния у указанного субъекта.

Здесь также предусмотрены способы, которые могут применяться для предсказания или даже диагностирования присутствия любого клинического состояния, ассоциированного с определенной мутацией у субъекта, включающие следующие этапы:

a) получение образца от указанного субъекта;

b) детектирование присутствие мутации, ассоциированной с клиническим состоянием, в образце путем осуществления описанных здесь способов детектирования варианта последовательности;

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, что указанный субъект имеет указанное клиническое состояние.

Описание фигур

Фиг. 1 Принцип способа детектирования варианта последовательности нуклеиновой кислоты, включающей NOI. (А) Нуклеиновая кислота-мишень (цепи черного цвета). Вторая цепь включает NOI (отмечены светло-серым цветом). Первая цепь является комплементарной (черная линия). Стрелки обозначают праймеры. Первый праймер гибридизируется со второй цепью и осуществляется амплификация праймера (пунктирная линия). Второй праймер гибридизируется со первой цепью и осуществляется амплификация праймера (пунктирная линия). Для простоты показана только подвергнутая амплификации часть нуклеиновой кислоты-мишени. Второй праймер присутствует здесь в избытке по сравнению с первым праймером (асимметричная ПЦР). Таким образом, обеспечивается продуцирование большего количества ДНК, которая включает последовательность с NOI (пунктирная черная линия и пунктирная серая линия). (В) Амплифицированная ДНК состоит из смеси двуцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней и одноцепочечных нуклеиновых кислот-мишеней, включающих NOI. Здесь показана одноцепочечная последовательность, включающая NOI (отмечена светло-серым цветом). С этой цепью гибридизируется репортерный олигонуклеотид (RO). Он включает здесь флуорофор F (окружность) и гасители Q (квадраты). Получают кривую плавления (ось X: Т обозначает температуру; ось Y: F обозначает флуоресценцию).

Фиг. 2 Микросателлитная нестабильность не обязательно приводит к значительным изменениям температуры плавления. ВАТ25 анализ с использованием асимметричной ПЦР. На оси X показана температура. (А) Кривые плавления, где были использованы билинейная нормализация и температурный сдвиг с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ (RFU, относительные единицы флуоресценции). Разность между кривыми, измеряемая в виде максимальной разности амплитуды между кривыми, составляла -0,07 ОЕФ. (В) Кривые первой отрицательной производной без применения температурного сдвига, Т_m нормальной ткани составляла 57,31°С, Т_m опухолевой ткани составляла 57,41°С.

Фиг. 3 Билинейная нормализация сдвигает кривые плавления ближе к 0 до и после фактической фазы плавления. Микросателлит NR22 анализируется с помощью асимметричной ПЦР и репортерного олигонуклеотида. На оси X показана температура. HRM кривые получали с помощью: (А) стандартной нормализации без температурного сдвига; (В) билинейной нормализации без температурного сдвига.

Фиг. 4 Билинейная нормализация сдвигает кривые плавления ближе к 0 до и после фактического плавления. HRM кривые разности на основе кривых плавления Фиг. 3, где контрольная HRM кривая используется в качестве базового уровня, который вычитается из другой (здесь - первой) кривой плавления. На оси X показана температура. (А) без билинейной нормализации без температурного сдвига; (В) с билинейной нормализацией без температурного сдвига.

Фиг. 5В теории не должно быть каких-либо различий в плане температуры плавления между образцами нормальной и опухолевой ткани, полученными от человека с микросателлитной стабильностью. Однако различия в плане количества, концентрации солей, примесей и других показателей между образцами могут приводить к малым различиям в плане температуры плавления. Тем не менее, билинейная нормализация и температурный сдвиг могут снижать разницу между нормальной и опухолевой тканью пациента с микросателлитной стабильностью. NR24 анализ с помощью асимметричной ПЦР и репортерного олигонуклеотида. На оси X показана температура. (A) HRM профили, в рамках которых применялась стандартная нормализация. Разность между кривыми, измеренная в виде максимальной разности флуоресценции при определенной температуре, между нормализованными областями на графиках разности составляла ~0,04 ОЕФ. На оси X показана температура. (В) HRM профили, где использовалась билинейная нормализация, но не использовалось пороговое значение температурного сдвига. Разность между кривыми составляла ~0,02 ОЕФ. (С) HRM кривые, где были использованы билинейная нормализация и сдвиг температуры с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ. Разность между кривыми составляла ~0,01 ОЕФ.

Фиг. 6 Температурный сдвиг может обеспечивать нейтрализацию изменения температуры плавления, вызванного различными концентрациями солей в ДНК буферах. NR24 анализ с помощью асимметричной ПЦР и репортерного олигонуклеотида. На оси X показана температура. (A) HRM профили, где использовалась билинейная нормализация, но не использовался температурный сдвиг.Разность между кривыми, измеренная в виде максимальной разности флуоресценции при определенной температуре, между нормализованными областями на графиках разности составляла ~0,07 ОЕФ. (В) HRM кривые, где были использованы билинейная нормализация и температурный сдвиг с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ. Разность между кривыми составляла ~0,01 ОЕФ.

Фиг. 7 Анализ для определения микросателлита MON027 с помощью асимметричной ПЦР для 16 образцов ДНК нормальной ткани. HRM кривые получали с помощью: (А) билинейной нормализации без температурного сдвига; (В) билинейной нормализации и температурного сдвига с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ. На оси X показана температура. Применение температурного сдвига обеспечивает возможность использования одного образца в качестве универсального контроля.

Фиг. 8 Графики разности HRM кривых Фиг. 7. (А) Билинейная нормализация без температурного сдвига; (В) билинейная нормализация и температурный сдвиг с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ. На оси X показана температура.

Фиг. 9 Асимметричная ПЦР обеспечивает получение большего количества одноцепочечного ампликона-мишени. NR22 анализы с использованием симметричной и асимметричной ПЦР. На оси X показано количество циклов ПЦР, а на оси Y - флуоресценция.

Фиг. 10 Асимметричная ПЦР обеспечивает получение большего соотношения сигнал/шум и более резкой кривой плавления (то есть более узких пиков плавления). NR22 анализ с использованием симметричной и асимметричной ПЦР. (А) кривые плавления; (В): кривые плавления, нормализованные с применением стандартной нормализации. На оси X показана температура.

Фиг. 11 Асимметричная ПЦР облегчает различение пациентов с MSS и MSI. Показаны данные, полученные с помощью NR22 анализа. HRM кривые были получены после применения стандартной нормализации с асимметричной ПЦР (А) или симметричной ПЦР (В). На оси X показана температура.

Фиг. 12 Асимметричная ПЦР облегчает различение пациентов с MSS и MSI. Показаны данные, полученные с помощью NR22 анализа. Графики разности HRM кривых Фиг. 11. (А) асимметричная ПЦР; (В): симметричная ПЦР. На оси X показана температура.

Фиг. 13 Односторонний выступ в репортерном олигонуклеотиде может приводить к повышению температуры плавления. Показаны данные на основе NR22 анализа с применением асимметричной ПЦР с использованием репортерного олигонуклеотида с двумя различными репортерными олигонуклеотидами. (A) HRM кривые. (В) Кривые первой отрицательной производной HRM. На оси X показана температура.

Фиг. 14 Двойное гашение репортерного олигонуклеотида повышает соотношение сигнал/шум. Показаны данные, полученные с помощью ВАТ26 анализа с применением асимметричной ПЦР. HRM кривые (А) и кривые первой отрицательной производной (В) с использованием репортерных олигонуклеотидов с одиночным гашением ("отличный от DQ зонд") и двойным гашением ("DQ зонд"). На оси X показана температура.

Фиг. 15 Дополнительные нуклеотидные повторы в последовательности гибридизации репортерного олигонуклеотида обеспечивают возможность детектировать более длинные микросателлиты. Показаны данные, полученные с помощью NR21 анализа с применением асимметричной ПЦР. На оси X показана температура.

Фиг. 16 Точечная мутация приводит к изменению температуры плавления на несколько градусов. В рамках эксперимента использовали анализ на основе экзона 13 гена KIT. ПЦР осуществляли в виде асимметричной ПЦР. На оси X показана температура. Пунктирные линии обозначают результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени дикого типа, а цельная линия обозначает результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени, включающей мутацию. (А) Нормализованные НТМ кривые; на оси Y показана флуоресценция. (В) Пики плавления (первые отрицательные производные кривых плавления). Y ось представляет собой -dF/dT.

Фиг. 17 Сильная хелперная последовательность помогает обеспечивать различение дикого типа и мутанта. В рамках эксперимента использовали NR24 анализ. ПЦР осуществляли в виде асимметричной ПЦР. На оси X показана температура, на оси Y показана флуоресценция. Пунктирные линии обозначают результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени дикого типа, а цельная линия обозначает результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени, включающей мутацию. (А) Нормализованные HRM кривые с первым репортерным олигонуклеотидом, включающим первую хелперную последовательность. (В) Нормализованные НТМ кривые со вторым репортерным олигонуклеотидом, включающим вторую хелперную последовательность, которая является более сильной, чем первая хелперная последовательность.

Фиг. 18 Сильная хелперная последовательность помогает обеспечивать различение дикого типа и мутанта. В рамках эксперимента использовали NR24 анализ. ПЦР осуществляли в виде асимметричной ПЦР. На оси X показана температура, на оси Y показана флуоресценция. Пунктирные линии обозначают результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени дикого типа, а цельная линия обозначает результаты относительно нуклеиновой кислоты-мишени, включающей мутацию. (А) Графики разности с первым репортерным олигонуклеотидом, включающим первую хелперную последовательность. (В) Графики разности со вторым репортерным олигонуклеотидом, включающим вторую хелперную последовательность, которая является более сильной, чем первая хелперная последовательность.

Подробное описание изобретения

Определения

Ампликон Термин "ампликон" обозначает молекулу, полученную путем копирования или транскрибирования другой молекулы. Примеры процессов, с помощью которых могут быть получены ампликоны, включают транскрипцию, клонирование, и/или полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или другой способ амплификации нуклеиновых кислот (например ПЦР-амплификацию на основе вытеснения цепей (SDA), дуплексную ПЦР-амплификацию, и так далее). Как правило, ампликон представляет собой копию выбранной нуклеиновой кислоты (например матрицы или нуклеиновой кислоты-мишени) или является комплементарным по отношению к ней.

Билинейная Нормализация Термин "Билинейная нормализация" используется здесь для обозначения математической трансформации, применяемой к кривой (кривым) путем масштабирования связанных с флуоресценцией данных различных кривых до нормализованных кривых. Это обеспечивает возможность сравнения различных кривых с устранением других факторов, которые могут влиять на сигнал флуоресценции (например различной силы флуоресценции при различных положениях в инструменте, различной прозрачности пластика и других факторов, вносящих вариабельность в плане измерения флуоресценции). Билинейная нормализация заставляет кривую (кривые) иметь одно и то же значение (в рамках среднего значения области нормализации) и как можно более горизонтальный (плоский) ход кривой в выбранных областях нормализации. В данной области известно несколько алгоритмов, которые могут применяться в отношении кривой для трансформации кривой (кривых) в кривую (кривые), которые обеспечивают возможность сравнения различных кривых плавления. Нормализация также снижает влияние различных оптических и механических различий между лунками.

Гидрофобный нуклеотид Термин "гидрофобный нуклеотид" в соответствии с используемым здесь значением обозначает гидрофобные нуклеотиды, подробно описанные здесь ниже в разделе "гидрофобный нуклеотид". В частности, гидрофобный нуклеотид в соответствии с изобретением содержит интеркалятор, присоединенный к нуклеотиду/аналогу нуклеотида/единице мономера каркаса с помощью линкера.

Температура плавления Термин "температура плавления" в соответствии с используемым здесь значением обозначает температуру в градусах Цельсия, при которой присутствуют 50% спиральных (гибридизированных) относительно клубкообразных (негибридизированных) форм. Температура плавления может быть также обозначена как (Т_m). Плавление нуклеиновых кислот и аналогов нуклеиновой кислоты обозначает термальное разделение двух цепей молекулы двуцепочечной нуклеиновой кислоты.

Микросателлит Термины "микросателлит", "микросателлитный маркер" или "микросателлитный локус" обозначает участок геномной ДНК, который включает тандемные нуклеотидные повторы. Данные повторы или "повторяющиеся единицы" обычно имеют длину от около одной до около семи пар оснований. Микросателлитные локусы обычно включают приблизительно от 10 до 40 подобных повторяющихся единиц, расположенных в виде тандема. Помимо мононуклеотидных повторов, которые представляют собой повторы одного нуклеотида, другие примеры повторяющихся нуклеотидных последовательностей включают динуклеотидные повторы, например AT повторы и GC повторы, тринуклеотидные повторы, например CGG повторы, CGC повторы, ТАТ повторы, АТТ повторы, тетрануклеотидные повторы, пентануклеотидные повторы и/или их комплементарные повторы.

Аналог нуклеотида Термин "аналог нуклеотида" включает все аналоги нуклеотидов, способные быть встроенными в каркас нуклеиновой кислоты и способные обеспечивать специфическое спаривание оснований, по существу подобно встречающимся в природе нуклеотидам. Аналоги нуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением включают, но без ограничения, аналоги нуклеотидов, выбранные из группы, состоящей из ПНК (PNA, пептидно-нуклеиновой кислоты), 1~HK(HNA, гекситольной нуклеиновой кислоты), МНК (MNA, морфолино-нуклеиновой кислоты), АНК (ANA, арабино-нуклеиновой кислоты), ЗНК (LNA, заблокированной нуклеиновой кислоты), КНК (XNA, ксено-нуклеиновой кислоты), MHK(INA, интеркаляторной нуклеиновой кислоты), БНК (CAN, бесклеточной нуклеиновой кислоты), ЦНК (CeNA, циклогексен-нуклеиновой кислоты), ТНК (TNA, треозо-нуклеиновой кислоты), (2'-NH)-THK, (3'-NH)-THK, α-L-рибо-ЗНК, α-L-ксило-ЗНК, β-D-ксило-ЗНК, α-D-рибо-ЗНК, [3.2.1]-ЗНК, бицикло-ДНК, 6-амино-бицикло-ДНК, 5-эпи-бицикло-ДНК, α-бицикло-ДНК, трицикло-ДНК, бицикло[4.3.0]-ДНК, бицикло[3.2.1]-ДНК, бицикло[4.3.0]амид-ДНК, β-D-рибопиранозил-нуклеиновой кислоты, α-L-ликсопиранозил-нуклеиновой кислоты, 2'-R₁-PHK, 2'-OR₁PHK (R₁ представляет собой заместитель), α-L-PHK, α-D-PHK, и β-D-PHK.

Представляющий интерес нуклеотид Термин "представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды)" в соответствии с используемым здесь значением обозначает нуклеотид (нуклеотиды) с рамках последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, которые могут присутствовать в двух различных вариантах. Термин "представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды)" также может быть обозначен здесь как "NOI". Таким образом, NOT может состоять из варианта последовательности или может состоять из контрольной последовательности, также обозначаемой здесь как "контрольная последовательность". В некоторых вариантах осуществления контрольная последовательность может представлять собой последовательность дикого типа.

Нуклеотид Термин "нуклеотид" в соответствии с используемым

здесь значением обозначает встречающиеся в природе нуклеотиды, например встречающиеся в природе рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды или встречающиеся в природе производные рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов. Встречающиеся в природе нуклеотиды включают дезоксирибонуклеотиды, включающие одно из четырех азотистых оснований: аденин (А), тимин (Т), гуанин (G), или цитозин (С), и рибонуклеотиды, включающие одно из четырех азотистых оснований: аденин (А), урацил (U), гуанин (G), или цитозин (С).

Олигонуклеотиды Термин "олигонуклеотид" в соответствии с используемым здесь значением обозначает олигомеры нуклеотидов и/или аналоги нуклеотидов и/или гидрофобные нуклеотиды. Предпочтительно, олигонуклеотид представляет собой олигомер нуклеотидов, необязательно включающий один или несколько гидрофобных нуклеотидов.

Контрольная последовательность-мишень Термин "контрольная последовательность-мишень" обозначает фрагмент последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающий контрольную последовательность.

Стандартная нормализация Термин "стандартная нормализация" обозначает масштабирование связанных с флуоресценцией данных различных кривых до нормализованных кривых и обеспечивает возможность сравнения различных кривых с устранением других факторов, которые могут влиять на сигнал флуоресценции (например различной силы сигнала флуоресценции при различных положениях в инструменте, различной прозрачности пластика и других факторов, вносящих вариабельность в плане измерения флуоресценции).

Последовательность-мишень нуклеиновой кислоты Термин "последовательность-мишень нуклеиновой кислоты" в соответствии с используемым здесь значением обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI). Последовательность-мишень нуклеиновой кислоты может быть амплифицирована с помощью набора праймеров.

Температурный сдвиг Термин "температурный сдвиг" в соответствии с используемым здесь значением обозначает математический инструмент, которые применяется в отношении двух или более нормализованных кривых, обеспечивая их сдвиг в соответствующем температуре направлении для получения одинакового значения Т_m при определенном ограничении флуоресценции (пороговом значении интенсивности). Применение подобного трансформационного алгоритма в отношении набора данных снижает влияние вследствие, например, различных концентраций солей в различных образцах.

Вариант последовательности Термин "вариант последовательности" в соответствии с используемым здесь значением обозначает нуклеотид (нуклеотиды) в рамках последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, которые отличаются от контрольной последовательности. Таким образом, последовательность-мишень нуклеиновой кислоты может содержать NOI, который представляет собой вариант последовательности, или последовательность-мишень нуклеиновой кислоты может содержать NOI, который представляет собой контрольную последовательность, или NOI может представлять собой даже еще один вариант последовательности. Вариант последовательности может представлять собой, например, мутацию, такую как мутация одного нуклеотида, или может представлять собой вставку или делецию. Вариант последовательности и контрольная последовательность могут накладываться, так что последовательность одного включает всю последовательность другого. В подобных случаях вариант последовательности и контрольная последовательность могут отличаться в плане количества нуклеотидов, составляющих последовательность.

Способы детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты

Изобретение относится к способам детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты Таким образом, данные способы являются особенно полезными в плане детектирования присутствия определенной последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в виде двух или более различных последовательностей. Данные способы могут применяться, например, для различения последовательности дикого типа и мутантной последовательности и для различения различных полиморфных последовательностей. Данные способы являются особенно полезными для детектирования вариантов последовательностей, возникающих вследствие микросателлитной нестабильности, за счет детектирования присутствия вариантов последовательностей, имеющих длину, отличающуюся от длины последовательности дикого типа или контрольной последовательности. Таким образом, данные способы могут полезным образом использоваться для детектирования последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей повторы, в особенности микросателлиты.

Здесь предусмотрен способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, включающую NOI;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление анализа плавления, такого как высокочувствительный анализ кривых плавления (HRM), первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление анализа плавления, такого как HRM анализ, второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом анализ плавления включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации М,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты,

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

g) Сравнение первого профиля с контрольным профилем, при этом различие между первым профилем и контрольным профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

Здесь предусмотрен способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление высокочувствительного анализа кривых плавления (HRM) первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого HRM профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление HRM анализа второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго HRM профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй HRM профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом HRM анализ включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и

g) Сравнение первого HRM профиля с контрольным HRM профилем, при этом разница между первым HRM профилем и контрольным HRM профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

Соответственно, при присутствии двух или более различных последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты данные способы могут использоваться для различения, по меньшей мере, двух различных последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, то есть последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности, и последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, не включающей вариант последовательности. Последняя также может обозначаться как "контрольная последовательность". Способы необязательно могут применяться для различения также последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, включающих другие варианты последовательностей. Общий принцип способа показан в виде примера на Фиг. 1. Кратко, разность между первым и вторым профилем, в частности разность между анализируемым профилем плавления и контрольным профилем плавления, указывает на то, что протестированный образец (первый образец) содержит вариант последовательности; очевидно, что в рамках данного описания разность предпочтительно обозначает значительную разность.

В рамках вариантов осуществления изобретения при использовании данных способов для различения последовательности дикого типа и мутантной последовательности мутантная последовательность может представлять собой контрольную последовательность. Однако зачастую последовательность дикого типа будет представлять собой контрольную последовательность. Способы по изобретению также могут применяться для различения последовательности дикого типа и нескольких различных мутантных последовательностей, при этом в таком случае последовательность дикого типа обычно будет представлять собой контрольную последовательность, а несколько различных мутантных последовательностей будут представлять собой варианты последовательностей. В некоторых вариантах осуществления способов контрольная последовательность представляет собой микросателлитную последовательность. Вариант последовательности в этом случае может представлять собой микросателлитную последовательность, состоящую из ряда тандемных повторов с количеством тандемных повторов, отличным от количества тандемных повтором контрольной последовательности. Например, вариант последовательности может являться результатом микросателлитной нестабильности - в этих случаях вариант последовательности может представлять собой множество вариантов последовательностей, имеющих различное количество тандемных повторов. С другой стороны, в этом случае контрольная последовательность будет иметь неизменное количество тандемных повторов.

В некоторых вариантах осуществления вариант последовательности может представлять собой мутацию, что свидетельствует о свеянном с заболеванием состоянии, или может обеспечивать предсказание эффективности определенного вида лечения.

Представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), вариант последовательности и контрольная последовательность Вариант последовательности может представлять собой любую последовательность, которая отличается от другой последовательности, в частности контрольной последовательности. Зачастую вариант последовательности представляет собой мутантную последовательность, например последовательность, которая отличается от последовательности дикого типа, например вследствие присутствия мутаций, вызывающих замещение одного нуклеотида другим, и/или вследствие вставки и/или делеции нуклеотидов по сравнению с контрольной последовательностью. Однако вариант последовательности также может представлять собой полиморфную последовательность или любую другую последовательность, которая отличается от контрольной последовательности. Предпочтительно, вариант последовательности представляет собой вариант микросателлита, имеющий длину, отличную от нормальной длины микросателлита. Настоящие способы действительно являются особенно полезными в плане детектирования микросателлитной нестабильности. Они могут применяться для детектирования нестабильности коротких микросателлитов (длиной менее 15 нуклеотидов), а также более длинных микросателлитов (длиной более 15 нуклеотидов). У субъекта с микросателлитной нестабильностью более длинные микросателлиты будут подвергаться мутированию быстрее более коротких микросателлитов - поэтому может являться полезным применять нуклеиновую кислоту-мишень, которая представляет собой более длинный микросателлит, имеющий длину 15 нуклеотидов или более.

Вариант последовательности может состоять, по меньшей мере, из одного, например 1, например 2, например 3, например 4, например 5, например 6, например 7, например 8, например 9, например 10, например от 10 до 20, например от 20 до 50, например более чем 50 нуклеотидов. Предпочтительно, вариант последовательности состоит из 10 нуклеотидов или более, например 15 нуклеотидов или более. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вариант последовательности состоит из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19,20 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. Например, вариант последовательности состоит из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант последовательности основан на мутации одного нуклеотида или полиморфизме одного нуклеотида (SNP).

Вариант последовательности может быть основан на изменении одного или нескольких нуклеотидов на один или несколько других нуклеотидов по сравнению с контрольной последовательностью-мишенью. Более того, термин "вариант последовательности" может обозначать делецию или вставку нуклеотидов в рамках нуклеиновой кислоты, например делецию или вставку нуклеотидов по сравнению с контрольной последовательностью-мишенью.

Последовательность-мишень нуклеиновой кислоты может включать сайт полиморфизма (см. более подробно ниже) и, таким образом, контрольная последовательность-мишень может включать один полиморфизм, в то время как "вариант последовательности" может соответствовать другому полиморфизму.

В одном варианте осуществления контрольная последовательность-мишень представляет собой последовательность дикого типа, то есть наиболее часто встречающуюся в природе последовательность, в то время как вариант последовательности включает одну или несколько мутаций, вставок или делеций по сравнению с указанной последовательностью дикого типа. Соответственно, вариант последовательности в соответствии с настоящим изобретением может в рамках одного варианта осуществления быть основан на полиморфизме, например полиморфизме одного нуклеотида (SNP). Например, полиморфизм может указывать на определенный ДНК профиль. Известность определенного ДНК профиля может быть использована, например, для идентификации субъекта. Например, определенный ДНК профиль может быть использован для идентификации преступника или потенциального преступника или для идентификации трупа или части трупа. Более того, определенный ДНК профиль может быть использован для определения родства между субъектами, например родства типа родитель-ребенок или более дальних видов родства. Родство также может представлять собой родство между разными видами или разными популяциями определенного вида.

В некоторых вариантах осуществления контрольная последовательность представляет собой или включает микросателлит, имеющий определенное количество повторов. Затем вариант последовательности может представлять собой один из вариантов последовательностей, имеющий количество повторов, отличное от количества, наблюдаемого в контрольной или относящейся к дикому типу последовательности.

В одном варианте осуществления вариант последовательности может указывать на клиническое состояние или мутация может указывать на повышенный риск клинического состояния. В частности, вариант последовательности может представлять собой микросателлит, а клиническое состояние может быть ассоциировано с микросателлитной нестабильностью.

Указанное клиническое состояние может быть выбрано, например, из группы, состоящей из неопластических заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и метаболических расстройств, включая диабет.

Более того, вариант последовательности может свидетельствовать об определенном ответе на лечение предварительно определенным лекарством. Например, присутствие варианта последовательности может указывать на то, будет ли субъект отвечать положительно на лечение указанным лекарством или на способность/неспособность субъекта переносить лечение определенным лекарством. Например, детектирование MSI может быть использовано в процессе принятия решения для назначения использования ингибиторов контрольных точек, таких как, например, Keytruda® (пембролизумаб, Merck & Со. Inc.) или Opdivo (ниволумаб, Bristol-Myers Squibb).

Вариант последовательности может располагаться в определенном гене, сегменте гена, микросателлите, или любой другой ДНК-последовательности. Более того, вариант последовательности может быть расположен в иРНК, микроРНК, или любой другой РНК-последовательности. Описанные здесь способы обеспечивают возможность детектирования определенных ДНК, которые могут быть эукариотического, прокариотического, архейного, или вирусного происхождения. Например, изобретение может облегчать диагностирование и/или генотипирование различных инфекционных заболеваний за счет анализа определенных последовательностей, в отношении которых известно, что они ассоциированы с определенным микроорганизмом.

Последовательность-мишень нуклеиновой кислоты

Настоящие способы предназначены для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI). В то время как последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из двух цепей и, как правило, представляет собой ДНК, является очевидным, что настоящие способы могут быть легко адаптированы для детектирования присутствия варианта последовательности в нуклеиновой кислоте-мишени путем амплификации одной цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты - например если амплификация представляет собой амплификацию РНК. Таким образом, настоящие способы также могут применяться для детектирования варианта последовательности в РНК-мишени, который возникает, например, вследствие транскрипции последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей.

Таким образом, нуклеиновая кислота-мишень представляет собой представляющую интерес последовательность, в отношении которой предполагается, что она включает вариант последовательности. Другими словами, она зачастую соответствует определенному локусу.

Последовательность-мишень нуклеиновой кислоты может состоять, по меньшей мере, из одного, например 1, например 2, например 3, например 4, например 5, например 6, например 7, например 8, например 9, например 10, например от 10 до 20, например от 20 до 50, например более чем 50 нуклеотидов. Предпочтительно, последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из 15 нуклеотидов или более. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. Например, последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более. Поскольку настоящие способы являются особенно полезными в плане детектирования вариантов последовательностей микросателлитов, особенно микросателлитов, имеющих длину 15 нуклеотидов или более, при этом последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой контрольную последовательность, ее длина предпочтительно составляет 15 нуклеотидов или более.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень представляет собой микросателлит, включающий ряд тандемных повторов. Для контрольной последовательности количество тандемных повторов равно М, при этом М представляет собой целое число. Для контрольной последовательности полная длина составляет n нуклеотидов. Вариант последовательности имеет М' тандемный повторов и полную длину n' нуклеотидов. М и М' представляют собой различающиеся целые числа, n и n' представляют собой различающиеся целые числа. Однако является возможным, что некоторые из вариантов последовательностей имеют М тандемных повторов и полную длину n нуклеотидов, однако в данном случае некоторые или большинство вариантов последовательностей все равно будут иметь различающееся количество повторов и различающуюся полную длину по сравнению с контрольной длиной, что будет обеспечивать способность настоящих способов детектировать присутствие вариантов последовательностей, которые отличаются от контрольной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления n и/или n' представляет собой 1, например 1, например 2, например 3, например 4, например 5, например 6, например 7, например 8, например 9, например 10, например от 10 до 20, например от 20 до 50, например более чем 50 нуклеотидов. Предпочтительно n и/или n' представляет собой 15 нуклеотидов или более; в некоторых вариантах осуществления n представляет собой, по меньшей мере, 15 нуклеотидов или более. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления n и/или n' состоит из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. Например, п и/или п' состоит из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более. Предпочтительно, п состоит из, по меньшей мере, 15, 16, 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или более, например 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. В некоторых вариантах осуществления n' представляет собой 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более.

Настоящие способы могут применяться для детектирования варианта последовательности, который может свидетельствовать об определенном расстройстве. Например, расстройство может быть ассоциировано с микросателлитной нестабильностью.

Зачастую является полезным проанализировать образец на предмет присутствия нескольких различных вариантов последовательностей. Соответственно, настоящие способы могут быть адаптированы, так что несколько вариантов последовательностей будут детектироваться одновременно. Иногда является достаточным определить присутствие лишь, по меньшей мере, одного из нескольких вариантов последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, включающих один или несколько из ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, которые представляют собой микросателлитные маркеры, включающие мононуклеотидные повторы. Способы обеспечивают возможность детектирования вариантов последовательностей, имеющих количество повторов, отличное от количества данных последовательностей - мишеней нуклеиновой кислоты контрольной последовательности, и, таким образом, различную полную длину.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность ВАТ25 соответствует указанной в SEQ ID NO: 1. Мононуклеотидные повторы ВАТ25 соответствуют положениям от 147 до 171 SEQ ID NO: 1. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=25.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность ВАТ26 соответствует указанной в SEQ ID NO: 2. Мононуклеотидные повторы ВАТ26 соответствуют положениям от 222 до 248 SEQ ID NO: 2. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=27.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность NR21 соответствует указанной в SEQ ID NO: 3. Мононуклеотидные повторы NR21 соответствуют положениям от 189 до 209 SEQ ID NO: 3. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=21.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность NR22 соответствует указанной в SEQ ID NO: 4. Мононуклеотидные повторы NR22 соответствуют положениям от 152 до 172 SEQ ID NO: 4. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=21.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность NR24 соответствует указанной в SEQ ID NO: 5. Мононуклеотидные повторы NR24 соответствуют положениям от 165 до 187 SEQ ID NO: 5. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=23.

Контрольная или относящаяся к дикому типу последовательность MON027 соответствует указанной в SEQ ID NO: 6. Мононуклеотидные повторы MON027 соответствуют положениям от 300 до 327 SEQ ID NO: 6. Таким образом, контрольная последовательность имеет М мононуклеотидных повторов, при этом М=28.

В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25, как указано в SEQ ID NO: 1, a NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 147 до 171 SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ26, как указано в SEQ ID NO: 2, а NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 222 до 248 SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой NR21, как указано в SEQ ID NO: 3, a NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 189 до 209 SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой NR22, как указано в SEQ ID NO: 4, a NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 152 до 172 SEQ ID NO: 4. В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой NR24, как указано в SEQ ID NO: 5, a NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 165 до 187 SEQ ID NO: 5. В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляют собой MON027, как указано в SEQ ID NO: 6, a NOI соответствует последовательности, определенной положениями от 300 до 327 SEQ ID NO: 6.

В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой две последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Например, две последовательности-мишени нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25 и ВАТ26; ВАТ25 и NR21; ВАТ25 и NR22; ВАТ25 и NR24; ВАТ25 и MON027; ВАТ26 и NR21; ВАТ26 и NR22; ВАТ26 и NR24; ВАТ26 и MON027; NR21 и NR22; NR21 и NR24; NR21 и MON027; NR22 и NR24; NR22 и MON027; NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой три последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Например, три последовательности-мишени нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25, ВАТ26 и NR21; ВАТ25, ВАТ26 и NR22; ВАТ25, ВАТ26 и NR24; ВАТ25, ВАТ26 и MON027; ВАТ25, NR21 и NR22; ВАТ25, NR21 и NR24; ВАТ25, NR21 и MON027; ВАТ25, NR22 и NR24; ВАТ25, NR22 и MON027; ВАТ25, NR24 и MON027; ВАТ26, NR21 и NR22; ВАТ26, NR21 и NR24; ВАТ26, NR21 и MON027; ВАТ26, NR22 и NR24; ВАТ26, NR22 и MON027; ВАТ26, NR24 и MON027; NR21, NR22 и NR24; NR21, NR22 и MON027; NR21, NR24 и MON027; NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой четыре последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Например, четыре последовательности-мишени нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25, ВАТ26, NR21 и NR22; ВАТ25, ВАТ26, NR21 и NR24; ВАТ25, ВАТ26, NR21 и MON027; ВАТ25, ВАТ26, NR22 и NR24; ВАТ25, ВАТ26, NR22 и MON027; ВАТ26, NR21, NR22 и NR24; ВАТ26, NR21, NR22 и MON027; ВАТ26, NR21, NR24 и MON027; NR21, NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой пять последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты. Например, пять последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22 и NR24; ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22 и MON027; ВАТ25, ВАТ26, NR22, NR24 и MON027; ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

В других вариантах осуществления последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой шесть последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты. Например, шесть последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты представляют собой ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень представляет собой пять нуклеиновых кислот-мишеней, предпочтительно ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22 и NR24; или ВАТ25, ВАТ26, NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше. В других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень представляет собой шесть нуклеиновых кислот-мишеней, предпочтительно ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, где NOI определены как описано выше.

Образцы

На первом этапе способа получают первый образец, который включает нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают подвергаемый детектированию вариант последовательности. На втором этапе способа получают второй образец, который включает контрольную последовательность. Таким образом, второй образец представляет собой контрольный образец, при этом данные термины будут использоваться здесь взаимозаменяемым образом.

Образец может включать клетки, включающие указанные нуклеиновые кислоты. Клетки могут представлять собой, например, прокариотические клетки или эукариотические клетки, например клетки растений или клетки млекопитающих.

Образец может представлять собой, например синтетически подготовленный образец, который мог или не мог быть далее обработан in vitro, однако наиболее часто образец представляет собой образец, полученный от субъекта.

В некоторых вариантах осуществления первый образец представляет собой образец, полученный от субъекта, страдающего или предположительно страдающего заболеванием или расстройством, характеризуемым присутствием варианта последовательности, а второй образец представляет собой образец, полученный от здорового субъекта. Также является возможным использовать первый образец, включающий клетки, например, подвергнутой заболеванию ткани, например клетки, предположительно содержащие вариант последовательности, являющийся характерным для заболевания, от одного субъекта, предположительно страдающего заболеванием, и второй образец, включающий клетки здоровой ткани, то есть клетки, которые не содержат вариант последовательности, от того же субъекта. Настоящие способы в рамках некоторых вариантов осуществления обеспечивают возможность использования универсального контрольного образца.

Таким образом, зачастую является желательным тестировать ДНК или РНК субъекта, например млекопитающего, например человека. В этом случае образец представляет собой образец, полученный от указанного субъекта. Таким образом, образец может, например, включать нуклеиновые кислоты, выбранные из группы, состоящей из ДНК, иРНК, микроРНК, или любой другой РНК-последовательности. Образец может быть получен из образца биологической жидкости, например образца крови, биопсии, образца волос, ногтей, или им подобных, или любого другого подходящего образца. В рамках вариантов осуществления изобретения, в которых субъект страдает раком, образец может представлять собой образец раковой опухоли, удаленной у субъекта хирургическим образом, или биопсию указанной опухоли. Однако в рамках вариантов осуществления изобретения, в которых субъект страдает раком, образец также может представлять собой образец крови, который обычно может содержать ЦОК (циркулирующие опухолевые клетки, СТС) и вкДНК (внеклеточную ДНК, cfDNA).

Образец может быть обработан in vitro перед детектированием присутствия варианта последовательности. Например, образец может быть подвергнут одному или нескольким этапам очистки, которые могут обеспечивать удаление нуклеиновых кислот из образца полностью или частично. Более того, затем образец может быть подвергнут обратной транскрипции.

Образец может включать сложную биологическую смесь нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) и ненуклеиновых кислот, например интактную клетку или сырой клеточный экстракт.

Если ДНК-мишень является двуцепочечной или иным образом имеет вторичную и/или третичную структуру, которая может затруднять ее детектирование, она может требовать нагревания перед реализацией способов по изобретению. Также в некоторых случаях может являться желательным экстрагировать нуклеиновые кислоты из сложных биологических образцов перед осуществлением амплификации с помощью любых способов, известных в данной области.

Образец может включать широкий ряд эукариотических и прокариотических клеток, включая протопласты; или иные биологические материалы, которые могут нести дезоксирибонуклеиновые кислоты-мишени. Таким образом, данные способы могут применяться для клеток культуры ткани животных, клеток животных (например, крови, сыворотки, плазмы, ретикулоцитов, лимфоцитов, мочи, ткани костного мозга, спинномозговой жидкости или любого продукта, полученного из крови или лимфы) или любого типа биопсии ткани (например, биопсии мышц, биопсии печени, биопсии почки, биопсии мочевого пузыря, биопсии кости, биопсии хряща, биопсии кожи, биопсии поджелудочной железы, биопсии кишечного тракта, биопсии тимуса, биопсии млекопитающего, биопсия матки, биопсии яичка, биопсии глаза или биопсии мозга, гомогенизированной в лизисном буфере), клеток растений или других клеток, чувствительных к осмотическому шоку, и клеток бактерий, дрожжей, вирусов, микоплазм, простейших, риккетсий, грибов и других мелких микробных клеток и им подобных. Процедуры анализа и выделения по настоящему изобретению могут применяться, например, для детектирования представляющих интерес непатогенных или патогенных микроорганизмов. Путем детектирования присутствия варианта последовательности в биологическом образце может быть определено присутствие микроорганизмов.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, первый образец получают от субъекта, страдающего или предположительно страдающего заболеванием или расстройством, которое характеризуется присутствием варианта последовательности, как подробно описано выше, в частности присутствием варианта микросателлитной последовательности или присутствием мутантной последовательности. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой рак или генетическое заболевание, например карциному поджелудочной железы, карциному желудка, рак мочевого пузыря, карциному простаты, рак легкого, карциному матки, рак груди, наследственный неполипозный рак толстой кишки. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой генетическое расстройство, такое как синдром Линча, Болезнь Хантингтона (HD), дентаторубро-паллидолюисову атрофию (DRPLA), спинобульбарную и мышечную атрофию (SBMA), миотоническую дистрофию (DM), синдром ломкой Х-хромосомы, умственную отсталость FRAXE и спиноцеребеллярную атаксию (SCA), Х-сцепленную агаммаглобулинемию (болезнь Брутона), синдром Блума (BS), краниофронтоназальный синдром (CFNS), и идиопатический фиброз легких (IPF).

Амплификация

Настоящие способы требуют амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей NOI, из первого образца и второго образца. Это требует получения набора праймеров. Набор праймеров состоит из первого праймера и второго праймера, которые совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, включающую NOI, как известно в данной области.

Набор праймеров способен обеспечивать праймирование амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты при применении в рамках, например, ПЦР, например ПЦР в реальном времени, в присутствии указанной последовательности-мишени нуклеиновой кислоты и с реагентами, как известно в данной области. Подобные реагенты хорошо известны специалисту в данной области и были описаны, например, в Sambrook J et al. 2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Habor Laboratory Press. Затем реакция приводит к получению ампликона. Ампликон, полученный при осуществлении амплификации в присутствии первого образца, обозначается как "первый ампликон". Ампликон, полученный при осуществлении амплификации в присутствии второго (или контрольного) образца, обозначается как "второй ампликон" или "контрольный ампликон".

Для придания набору праймеров специфичности в отношении последовательности-мишени нуклеиновой кислоты праймеры включают последовательность, которая идентична фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. В частности, 3'-конец первого и второго праймеров может включать последовательность из, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, которая идентична фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность или вариант последовательности, за исключением не более чем одного несовпадения.

Точная длина последовательности праймеров, идентичная фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, может быть скорректировать для соответствия праймеру, имеющему температуру плавления, которая может использоваться в рамках ПЦР-амплификации. Температура плавления праймера зависит от нескольких факторов, но в особенности от содержания GC и длины. Поскольку праймеры должны быть предпочтительно идентичны фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности (или последовательность, комплементарную варианту последовательности), существуют ограничения в плане определенной последовательности праймера. Соответственно, температура плавления может быть определенным образом скорректирована путем корректирования длины праймера. Специалист в данной области будет способен сконструировать праймер с подходящей температурой плавления, при этом способное быть использованным для этого программное обеспечение является публично доступным.

Таким образом, 3'-конец праймеров может включать последовательность из, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере, 20 нуклеотидов, например, по меньшей мере, 25 нуклеотидов, например в диапазоне от 15 до 50 нуклеотидов, например в диапазоне от 20 до 40 нуклеотидов, которая идентичная последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности за исключением не более чем одного несовпадения.

В одном варианте осуществления изобретения первый и/или второй праймер состоит из последовательности из, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере, 20 нуклеотидов, например, по меньшей мере, 25 нуклеотидов, например в диапазоне от 15 до 50 нуклеотидов, например в диапазоне от 20 до 40 нуклеотидов, которая идентичная последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности за исключением не более чем одного несовпадения.

Как указано выше, последовательность праймеров включает или состоит из последовательности, идентичной (или комплементарной) последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности за исключением не более чем одного несовпадения. В некоторых вариантах осуществления присутствует одно несовпадение в одном или обоих из первого и второго праймера, поскольку это может дополнительно повышать специфичность анализа. В частности, указанное несовпадение может быть расположено в положении 2, 3, или 4 от З'-конца праймеров.

В некоторых вариантах осуществления может являться полезным конструировать праймеры, которые гибридизируется с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты вне участка, соответствующего варианту последовательности. Например, если последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой микросателлит, а вариант последовательности отличается от контрольной последовательности количеством нуклеотидных повторов, то праймеры предпочтительно гибридизируются выше и ниже участка, состоящего из тандемных повторов, поскольку в противном случае амплификация может являться неспецифичной и приводить к получению ряда ампликонов с различающейся длиной.

Праймеры могут включать, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как описано здесь.

Этап амплификации может представлять собой ПЦР, например ПЦР в реальном времени. В некоторых вариантах осуществления реакция амплификации (например ПЦР или ПЦР в реальном времени) представляет собой асимметричную реакцию. Термин "асимметричная" означает, что реакция направлена в сторону амплификации большей длины одной цепи матрицы, чем другой. Это осуществляется за счет использования различных количеств праймеров в рамках пары праймеров.

Первый праймер гибридизируется с первой цепью последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность с NOI. Второй праймер гибридизируется со второй цепью последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, которая комплементарна последовательности с NOI. На более позднем этапе осуществляется детектирование присутствия варианта последовательности путем анализа профиля плавления ампликонов, который включает последовательность, идентичную последовательности с NOI, в присутствии репортерного зонда, как описано ниже. Как показано в примерах, анализ профилей плавления осуществляется когда цепь ампликона, с которой может гибридизироваться репортерный олигонуклеотид, присутствует в большем количестве, чем цепь ампликона, которая комплементарна репортерному олигонуклеотиду. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления этап амплификации является асимметричным, то есть осуществляется с большим количеством второго праймера, чем первого праймера. Это направляет амплификацию в сторону продуцирования большего количества цепи ампликона, с которой гибридизируется репортерный олигонуклеотид.

Анализ плавления (включая HRM анализ)

Анализ плавления, в частности HRM анализ (высокочувствительный анализ кривых плавления), основан на анализе связанных с плавлением свойств (в частности профиля перехода от двуцепочечной к одноцепочечной фазе) образованных гетеродуплексных ампликонов. Профиль плавления ампликонов зависит от содержания гуанин-цитозина, длины, последовательности, и гетерозиготности. Изменения нуклеотидной последовательности приводят к образованию гетеродуплексов, которые изменяют форму кривой плавления по сравнению с профилем плавления дикого типа.

После получения первого ампликона и второго ампликона, например путем использования реакции асимметричной ПЦР, способ включает этап осуществления анализа плавления, в частности HRM анализа, для получения профилей плавления (например HRM профилей) для каждого ампликона. Первый профиль плавления (или первый HRM профиль) получают для первого ампликона, а второй профиль плавления (или второй HRM профиль), также обозначаемый как контрольный профиль (или контрольный HRM профиль) получают для второго ампликона. Профили плавления (или HRM профили) затем сравнивают, как подробно описано ниже.

Каждый профиль плавления (например HRM) характеризуется кривой плавления. Первый профиль плавления (например HRM) первого ампликона характеризуется первой кривой плавления, а второй профиль плавления (например HRM) второго ампликона характеризуется второй (или контрольной) кривой плавления.

Анализ плавления (например HRM) каждого ампликона включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида, включающего, по меньшей мере, один флуорофор и один гаситель, с одной цепью каждого ампликона (имеющего последовательность, идентичную последовательности с NOI), например второй цепью. Репортерный олигонуклеотид описан более подробно ниже. После гибридизации сигнал, испускаемый флуорофором, детектируется для получения первой и второй кривой плавления, как известно в данной области. Способ может дополнительно включать этап трансформации кривых плавления перед проведением дальнейшего анализа. Например, кривые плавления могут быть трансформированы в кривые первой отрицательной производной, которые затем сравнивают.

Затем сравнивают первый профиль плавления (например HRM) и второй профиль плавления (например HRM). Если первый образец содержит вариант последовательности, то первая кривая плавления (и необязательно кривые разности и производные кривых плавления) будут отличаться от второй кривой плавления (и необязательно ее производных), соответствующей контрольному образцу. Таким образом, детектирование различия между первым и вторым профилем плавления (например HRM) указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

Различие между профилями плавления (например HRM) может представлять собой различие в плане формы кривых плавления или кривых разности или формы производных кривых плавления. Например, в некоторых вариантах осуществления первая кривая плавления имеет форму, отличную от контрольной кривой плавления. Как правило, производные кривых плавления представляют собой нормальные кривые (или кривые в форме колокола) с максимальным значением. Наклон первой кривой плавления может быть менее "резким", чем наклон второй кривой, что вызывает изменение в форме первой кривой плавления по сравнению со второй кривой плавления. Наклон производной первой кривой плавления может быть более "резким", чем наклон производной второй кривой, например абсолютное значение наклона является большим для производной первой кривой плавления, чем абсолютное значение наклона производной для второй кривой плавления, по меньшей мере, в точке (точках) ее перегиба. Для определения различия между профилями плавления (например HRM) анализ может включать этап получения кривой разности, где одна из кривых плавления взята в качестве контроля и вычитается из другой кривой плавления, предпочтительно где кривая плавления контрольного образца взята в качестве контрольной и вычитается из кривой плавления образца с вариантом.

Две кривые (или кривые разности или производные) при каждой температуре Т могут располагаться на расстоянии D_T друг от друга. Расстояние D_T определяется для каждой температуры, при этом абсолютное значение наибольшего расстояния maxD_т указывает на различие между двумя кривыми, если оно превышает предварительно определенное пороговое значение.

Специалисту в данной области будет известно, как определить подходящее значение данного порогового значения. Пороговое значение представляет собой значение D_T, которое обеспечивает возможность различения субъекта, демонстрирующего микросателлитную нестабильность, и нормальных субъектов. Значение Dt представляет собой разность, например отрицательную разность или положительную разность, между профилем плавления, полученным для контроля (или последовательности дикого типа), и профиля плавления, полученного для варианта последовательности (вариантов последовательностей). Для определения подходящего порогового значения определяют профили плавления ряда субъектов (обычно 100-500 пациентов), в отношении которых известно, имеют ли они микросателлитную нестабильность или нет. С помощью данных профилей плавления определяют пороговое значение в виде значения, которое обеспечивает возможность желаемого или подходящего различения последовательностей дикого типа и вариантов последовательностей.

Таким образом, различие между проанализированными профилями плавления вычисляют и сравнивают с пороговым значением; таким образом, данное различие может представлять собой количественную разность, которая может быть сравнена с количественным пороговым значением. Если эта разность между проанализированными профилями плавления, например HRM профилями, превышает пороговое значение, то образец, для которого определен первый профиль плавления, классифицируют в качестве включающего вариант последовательности. Таким образом, когда последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой микросателлит, то субъект, от которого был получен данный образец, рассматривается в качестве имеющего микросателлитную нестабильность. Если эта разность между проанализированными профилями плавления, например HRM профилями, ниже порогового значения, то образец классифицируют в качестве включающего последовательность дикого типа. Таким образом, когда последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой микросателлит, то субъект, от которого был получен данный образец, рассматривается в качестве не имеющего микросателлитную нестабильность.

Альтернатива заключается в определении площади между кривыми. Если данная площадь превышает предварительно определенное пороговое значение, то первая и вторая кривые плавления рассматриваются в качестве различающихся. В это случае специалисту в данной области также будет известно, как определить значение данного порогового значения.

Другие способы характеризации различия между двумя кривыми плавления или их кривыми разности или их производными будут очевидны специалисту в данной области.

Любые из указанных выше различий между первой и второй кривой плавления или между их кривыми разности или производными первой и второй кривой плавления указывают на различие между первым и вторым HRM профилем и, таким образом, указывают на присутствие варианта последовательности в первом образце.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая кривая плавления и/или их производные и/или их кривые разности являются нормализованными. Например, поблизости отточки или в точке наиболее низкой температуры, для которой было измерено плавление, например в диапазоне от 0,5 до 20°С от точки наиболее низкой температуры кривая нормализована до первого значения, а поблизости от точки или в точке наиболее высокой температуры кривая нормализована до второго значения. Например, первое значение равно 1, а второе значение равно 0.

Для того, чтобы сделать различия между кривыми более видимыми, анализ плавления, например HRM анализ, может включать этап стандартной нормализации, которая соответствует выравниванию кривых по оси Y на основе средней интенсивности окрашивания в исходных и конечных участках нормализации.

Также к каждой кривой (кривой плавления, графику разности или производным) возможно применять билинейную нормализацию. Первая линейная функция соответствует первоначальной интенсивности окрашивания и применяется в качестве верхнего предела конечной скорректированной шкалы. Вторая линейная функция соответствует конечной интенсивности окрашивания и применяется в качестве нижнего предела скорректированной шкалы.

Анализ плавления, например HRM анализ, может дополнительно включать или включать в качестве альтернативы этап применения корректирования температуры (температурного сдвига) в отношении кривых (кривых плавления или кривых разности) при определенной интенсивности флуоресценции. Подобные этапы также могут снижать риск ложноположительных результатов. В предпочтительных вариантах осуществления анализ плавления включает, по меньшей мере, этап применения температурного сдвига в отношении кривых плавления при определенной интенсивности флуоресценции.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления этап сравнения первого профиля с контрольным профилем включает или состоит из следующих этапов:

i) выравнивания первой и второй кривой плавления при определенной интенсивности флуоресценции вдоль оси температуры, тем самым обеспечивая устранение различий в плане температуры плавления между первой и второй кривой плавлений при указанной интенсивности флуоресценции;

ii) определения различия сигнала, испускаемого флуорофором, между первой и второй кривой плавления; и

iii) сравнения разности, определенной на этапе ii), с пороговым значением, при этом превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает вариант последовательности, а не превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает контрольную последовательность.

Пороговое значение определяют как описано выше. Разность представляет собой количественную разность, которую сравнивают с количественным пороговым значением как описано выше. Таким образом, на этапе iii), если пороговое значение представляет собой положительное пороговое значение, то разность, превышающая указанное пороговое значение, свидетельствует о том, что первый образец включает вариант последовательности. Если пороговое значение представляет собой отрицательное пороговое значение, то разность, не превышающая указанное пороговое значение, свидетельствует о том, что первый образец включает вариант последовательности.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы не включают этап определения точной длины и/или последовательности варианта последовательности. Это связано с тем, что зачастую не требуется определять точную длину и/или последовательности вариантов последовательностей для определения того, что субъект, у которого был обнаружен вариант последовательности, страдает заболеванием или расстройством, как описано здесь. Вместо этого, зачастую является достаточным определить наличие различия, при этом точная природа различия не всегда является значимой. В предпочтительных вариантах осуществления описанные здесь способы не включают этап определения точной длины и/или последовательности варианта последовательности. Это связано с тем, что детектирование варианта последовательности может являться достаточным для выбора образцов для дальнейшего анализа; обычно не требуется определять точную длину и/или последовательность вариантов последовательностей.

Репортерный олигонуклеотид

Настоящие способы требуют репортерный олигонуклеотид для осуществления HRM анализа. Репортерный олигонуклеотид включает, по меньшей мере, первый флуорофор и, по меньшей мере, первый гаситель. Они являются полезными в плане анализа плавления, такого как HRM анализ. Предпочтительно, репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, по меньшей мере, на его 5'-конце или, по меньшей мере, на его 3'-конце, или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца. Репортерный олигонуклеотид предпочтительно включает первый гаситель, по меньшей мере, на его 5'-конце или, по меньшей мере, на его 3'-конце, или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца. Таким образом, флуорофор и гаситель могут быть расположены на 5'-конце или 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца, но не обязательно расположены на последнем нуклеотиде репортерного олигонуклеотида. Предпочтительно, если первый флуорофор расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, то первый гаситель не расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца. Вместо этого он расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца или во внутреннем участке репортера. Наоборот, если первый флуорофор расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, то первый гаситель не расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца. Вместо этого он расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или во внутреннем участке репортера. Термин "внутренний участок" обозначает здесь участок репортерного олигонуклеотида, который не включает 5 концевых нуклеотидов на каждом конце. Предпочтительно, первый флуорофор и первый гаситель не являются расположенными близко относительно друг друга.

Пригодные флуорофоры и гасители являются доступными для специалиста в данной области, которому не составит труда выбрать их для реализации настоящих способов.

Репортерный олигонуклеотид применяется для анализа плавления (или HRM анализа). Так, последовательность репортерного нуклеотида подвергается некоторым ограничениям, которые зависят от последовательности, гибридизацию и детектирование которой она обеспечивает.Репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, которая, например, идентична NOI и которая гибридизируется с цепью, являющейся комплементарной NOI. Другими словами, репортерный олигонуклеотид гибридизируется с цепью первого и второго ампликона, которая включает NOI. Таким образом, в рамках вариантов осуществления, в которых NOI включает повторы, репортерный олигонуклеотид также включает повторы, то есть последовательность гибридизации Н также включает повторы, как более подробно описано ниже.

Репортерный олигонуклеотид может, помимо последовательности, которая идентична NOI, также включать дополнительные нуклеотиды в последовательности гибридизации. Например, как показано в примерах ниже, это может быть особенно актуальным в случаях, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой микросателлит, или если ожидается, что вариант последовательности включает вставку. Если микросателлит имеет М тандемных повторов, имеющих полную длину п нуклеотидов в контрольной последовательности, то последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно имеет М"тандемных повторов, при этом М"≥М+1, предпочтительно М"≥М+1 или М"≥М+2. Если тандемный повтор представляет собой мононуклеотидный повтор, то последовательность гибридизации имеет длину n" нуклеотидов, при этом n"≥n+1, предпочтительно n"≥n+1 или n"≥n+2. Другими словами, последовательность гибридизации может включать, по меньшей мере, один или два дополнительных нуклеотида. Это обеспечивает более чувствительное различение между более длинным вариантом последовательности и контрольной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления, в частности где NOI представляет собой микросателлит, последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно включает последовательность, которая состоит из повторов, являющихся идентичными или комплементарными повторам NOI, и может полезным образом также включать концевую последовательность, которая обозначается здесь как хелперная последовательность, которая гибридизируется с первым и вторым ампликоном непосредственно выше или непосредственно ниже данных повторов, когда с ними гибридизируется последовательность гибридизации. Другими словами, последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно включает повторы и дополнительно включает от 1 до 10 нуклеотидов, например 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, которые гибридизируются с NOI или их комплементарной цепью непосредственно выше или непосредственно ниже повторяющейся последовательности. Таким образом, хелперная последовательность при гибридизации с первом и вторым ампликоном обеспечивает гибридизацию последовательности гибридизации с указанной повторяющейся последовательностью. Хелперная последовательность зачастую будет иметь более высокую аффинность в отношении ее комплементарной последовательности, чем последовательность гибридизации в отношении ее комплементарной последовательности. Другими словами, хелперная последовательность зачастую будет гибридизироваться быстрее со своей комплементарной последовательностью, чем последовательность гибридизации будет гибридизироваться со своей комплементарной последовательностью.

Хелперная последовательность может быть 3'-концевой или 5'-концевой. Предпочтительно, репортерный олигонуклеотид включает 5'-концевую хелперную последовательность, которая гибридизируется с первым и вторым ампликоном непосредственно выше или непосредственно ниже данных повторов, когда с ними гибридизируется последовательность гибридизации. Хелперная последовательность обеспечивает различение профилей плавления, как показано в примере 13. Хелперная последовательность обозначается как сильная, если она приводит к высокому повышению Т_m последовательности гибридизации, когда хелперная последовательность гибридизируется с первым или вторым ампликоном. Специалисту в данной области хорошо известно, что гибридизация между двумя последовательностями является более сильной, если последовательности включают более высокое соотношение G/C по сравнению с двумя гибридизированными последовательностями, включающими более высокое соотношение А/Т; таким образом, хелперная последовательность, включающая более высокое соотношение G/C, чем А/Т, будет более сильной, чем хелперная последовательность, включающая более низкое соотношение G/C, чем А/Т. Также известно, что более длинные последовательности обеспечивают более сильную гибридизацию, чем более короткие последовательности, поэтому сила хелперной последовательности может быть скорректирована путем увеличения длины, которая гибридизируется с первым и/или вторым ампликоном. Повышение силы хелперной последовательности может являться хорошим способом обеспечения различения между вариантом последовательности и контрольной последовательностью. Предпочтительно, хелперная последовательность не включает повторы, даже в вариантах осуществления, где NOI включает повторы.

В некоторых вариантах осуществления, в частности где последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой микросателлит, хелперная последовательность повышает Т_m последовательности гибридизации, по меньшей мере, на 5°С, например, по меньшей мере, на 6°С, например, по меньшей мере, на 7°С, например, по меньшей мере, на 8°С, например, по меньшей мере, на 9°С, например, по меньшей мере, на 10°С, например, по меньшей мере, на 11°С, например, по меньшей мере, на 12°С, например, по меньшей мере, на 13°С, например, по меньшей мере, на 14°С, например, по меньшей мере, на 15°С или более по сравнению с Т_m той же последовательности гибридизации без хелперной последовательности. Таким образом, Т_m последовательности гибридизации, включающей хелперную последовательность, может быть на 5-25°С выше, например на 10-20°С выше, например на 12.5-17.5°С выше, чем Т_m последовательности гибридизации без хелперной последовательности.

Репортерный олигонуклеотид может включать второй гаситель. Предпочтительно, второй гаситель представляет собой неконцевой участок, то есть расположенный во внутреннем участке репортерного олигонуклеотида. Другими словами, второй гаситель не расположен на 5'-конце или на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов о 5'-конца или 3'-конца. В некоторых вариантах осуществления включение второго гасителя может обеспечивать возможность различения между вариантом последовательности и контрольной последовательностью.

В то время как в рамках определенного HRM анализа может применяться любой репортерный олигонуклеотид, который может обеспечивать возможность анализа плавления, то есть любой репортерный олигонуклеотид с описанными выше свойствами, некоторые репортерные олигонуклеотиды являются особенно полезными. Включение гидрофобных нуклеотидов в определенных положениях репортерного олигонуклеотида представляет особенный интерес.Как видно из примеров, репортерные олигонуклеотиды, включающие подобные гидрофобные нуклеотиды, повышают чувствительность способа.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления помимо описанных выше признаков репортерный олигонуклеотид включает, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, расположенный на его 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца, и/или репортерный олигонуклеотид включает, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, расположенный на его 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца.

Гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор.

Единица мономера каркаса X может представлять собой любую из единиц мономера каркаса, описанных здесь ниже в разделе "Единица мономера каркаса".

Интеркалятор Q может представлять собой любой из интеркаляторов, описанных здесь ниже в разделе "Интеркалятор".

Гидрофобные нуклеотиды, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, подробно описаны в международной заявке WO 2017/045689, в частности в разделе, озаглавленном "Гидрофобные нуклеотиды" на стр. 30, строки 2-25.

В некоторых вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_d-Z-(N)_e-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

полное количество нуклеотидов или нуклеотидных аналогов составляет, по меньшей мере, 10; и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

d и е по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 19; и

a+b+d+e равно, по меньшей мере, 10;

и (N)_a-(N)_d-(N)_e-(N)_b идентичен контрольной последовательности.

В других вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_f-Z-(N)_g-Z-(N)_h-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

f, g и h по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 18; и

a+b+f+g+h равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50;

и (N)_a-(N)_f-(N)_g-(N)_h-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_i-Z-(N)_j-Z-(N)_k-Z-(N)_i-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

i, j, к и I по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 17; и

a+b+i+j+k+I равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50;

и (N)_a-(N)_i-(N)_j-(N)_k-(N)_I-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_m-Z-(N)_n-Z-(N)_o-Z-(N)_p-Z-(N)_q-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

m, n, о, р и q по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 16; и

a+b+m+n+o+p+q равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_m-(N)_n-(N)_o-(N)_p-Z-(N)_q-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность.

В некоторых вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид предназначен для детектирования микросателлита. В подобных вариантах осуществления последовательность гибридизации охватывает, по меньшей мере, тандемные пептиды. Предпочтительно, последовательность гибридизации также включает хелперную последовательность, состоящую из от 1 до 20 нуклеотидов непосредственно выше или ниже тандемных повторов, например 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов непосредственно выше или ниже тандемных повторов, предпочтительно в которую был вставлен, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как описано здесь. Хелперная последовательность может состоять из, по меньшей мере, одного, например, по меньшей мере, 1, например 2, например 3, например 4, например 5, например 6, например 7, например 8, например 9, например 10, например от 10 до 20, например от 20 до 50, например более чем 50 нуклеотидов. Например, хелперная последовательность состоит из 15 нуклеотидов или более. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления хелперная последовательность состоит из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 19, 20 нуклеотидов ли более, например 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. Например, хелперная последовательность состоит из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более. Например, хелперная последовательность состоит из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов или более, например 9 нуклеотидов.

В вариантах осуществления, где репортерный олигонуклеотид предназначен для применения для детектирования микросателлита, например ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 или MON027, как описано здесь.

Интеркалятор

Термин "интеркалятор" в контексте настоящих способов обозначает любой молекулярный фрагмент, включающий, по меньшей мере, одну по существу плоскую конъюгированную систему, которая способна обеспечивать совместную укладку с азотистыми основаниями нуклеиновой кислоты. Интеркалятор предпочтительно по существу состоит из, по меньшей мере, одной по существу плоской конъюгированной системы, которая способна обеспечивать совместную укладку с азотистыми основаниями нуклеиновой кислоты.

Интеркалятор включает, по меньшей мере, одну систему тг-электронов, которая, согласно настоящему изобретению, может взаимодействовать с другими молекулами, включающими систему тт-электронов. Данные взаимодействия могу вносить вклад положительным или отрицательным образом в гидрофобные взаимодействия указанных интеркаляторов. Hunter и Sanders (1990) J, Am Chem. Soc. 112: 5525-5534 предложили ряд различных ориентаций и условий, при которых две системы тг-электронов могут положительно взаимодействовать друг с другом.

Интеркалятор предпочтительно включает химическую группу, выбранную из группы, состоящей из полиароматических и гетерополиароматических соединений, и еще более предпочтительно интеркалятор по существу состоит из полиароматического или гетерополиароматического соединения. Наиболее предпочтительно интеркалятор выбран из группы, состоящей из полиароматических и гетерополиароматических соединений.

Полиароматические и гетерополиароматические соединения согласно настоящему изобретению могут состоять из любого подходящего количества колец, например 1, например 2, например 3, например 4, например 5, например 6, например 7, например 8, например более чем 8. Более того, полиароматические и гетерополиароматические соединения могут быть замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидроксила, бром-, фтор-, хлор-, йод-, меркапто-, тио-, циано-, алкилтио-, гетероцикла, арила, гетероарила, карбоксила, карбоалкила, алкила, алкенила, алкинила, нитро, амино, алкоксила, карбонила и амидо.

Соответственно, интеркалятор Q может представлять собой, например, интеркалятор, выбранный из группы, состоящей из фенантролина, феназина, фенантридина, антрахинона, пирена, антрацена, нафтена, фенантрена, пикена, хризена, нафтацена, акридонов, бензантраценов, стилбенов, оксало-пиридокарбазолов, азидобензенов, порфиринов, псораленов, и любых из вышеупомянутых интеркаляторов, замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидроксила, бром-, фтор-, хлор-, йод-, меркапто-, тио-, циано-, алкилтио-, гетероцикла, арила, гетероарила, карбоксила, карбоалкила, алкила, алкенила, алкинила, нитро, амино, алкоксила, карбонила и/или амидо.

Предпочтительно интеркалятор выбран из группы, состоящей из фенантролина, феназина, фенантридина, антрахинона, пирена, антрацена, нафтена, фенантрена, пикена, хризена, нафтацена, акридонов, бензантраценов, стилбенов, оксало-пиридокарбазололов, азидобензенов, порфиринов и псораленов.

В предпочтительном варианте осуществления интеркалятор выбран из группы, состоящей из фенантролина, феназина, фенантридина, антрахинона, пирена, антрацена, фенантрена, хризена, нафтацена, нафтацена, бензантраценов, стилбенов, и порфиринов.

В другом предпочтительном варианте осуществления интеркалятор включает пирен или пиридо[3',2':4,5]тиено[3,2-d]пиримидин-4(1 Н)-он или 7,9-диметил-пиридо[3',2',4,5]тиено[3,2-d]пиримидин-4(3Н)-он. Интеркалятор может также состоять из пирена или пиридо[3',2':4,5]тиено[3,2-d]пиримидин-4(1 Н)-она или 7,9-диметил-пиридо[3',2',4,5]тиено[3,2-d]пиримидин-4(3Н)-она.

Гидрофобный нуклеотид может включать другие интеркаляторы, в частности интеркаляторы, описанные в WO 2017/045689 в разделе, озаглавленном "интеркалятор", на стр. 30, строка 26 до стр. 40, строка 4, или в международной заявке WO 03/052132 в разделе "интеркалятор" на стр. 46, строка 10 до стр. 54, строка 13.

Единица мономера каркаса

X может также представлять собой единицу мономера каркаса, которая может быть встроена в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты. Термин "единица мономера каркаса" нуклеотида или аналога нуклеотида обозначает здесь часть нуклеотида, которая принимает участие во встраивании в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты. Единица мономера каркаса (X) предпочтительно ковалентно связана с линкером (Y), который ковалентно связан с интеркалятором. Для встраивания интеркалятора в аналоги олигонуклеотидов может использоваться любая подходящая единица мономера каркаса. Также может использоваться любой вид линкера, связывающего указанную единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор. Кроме того, единица мономера каркаса может включать одну или несколько покидающих групп, защитных групп, и/или реактивных групп, которые могут быть удалены или изменены любым образом при синтезе или после синтеза олигонуклеотида или аналога олигонуклеотида, включающего указанную единицу мономера каркаса.

Единица мономера каркаса может представлять собой любую подходящую единицу мономера каркаса. В одном варианте осуществления единица мономера каркаса может быть выбрана, например, из группы, состоящей из единиц мономера каркаса ДНК, РНК, ПНК (PNA, пептидно-нуклеиновой кислоты), ГНК (HNA, гекситольной нуклеиновой кислоты), KHK(XNA, ксено-нуклеиновой кислоты), МНК (MNA, морфолино-нуклеиновой кислоты), АНК (ANA, арабино-нуклеиновой кислоты), 3HK(LNA, заблокированной нуклеиновой кислоты), БНК (CAN, бесклеточной нуклеиновой кислоты), ЦНК (CeNA, циклогексен-нуклеиновой кислоты), ТНК (TNA, треозо-нуклеиновой кислоты), (2'-NH) -ТНК, (3'-NH)-TNA, α-L-рибо-ЗНК, α-L-ксило-ЗНК, β-D-ксило-ЗНК, α-D-рибо-ЗНК, [3.2.1]-ЗНК, бицикло-ДНК, 6-амино-бицикло-ДНК, 5-эпи-бицикло-ДНК, α-бицикло-ДНК, трицикло-ДНК, бицикло[4.3.0]-ДНК, бицикло[3.2.1]-ДНК, бицикло[4.3.0]амид-ДНК, β-D-рибопиранозил-нуклеиновой кислоты, α-L-ликсопиранозил-нуклеиновой кислоты, 2'-R-PHK, α-L-PHK или α-D-PHK, β-D-PHK и их смесей и их гибридов, а также их модификаций атома фосфора, таких как, но без ограничения, фосфортиоаты, метилфосфолаты, фосфорамидиаты, фосфордитиаты, фосфорселеноаты, фосфотриэфиры и фосфобораты. Кроме того, для связывания с нуклеотидами могут использоваться не содержащие фосфор соединения, такие как, но без ограничения, метилиминометил, формацетат, тиоформацетат, и связывающие группы, включающие амиды.

Ряд единиц мономера каркаса описан в международной заявке WO 2017/045689 в разделе, озаглавленном "Единица мономера каркаса", на стр. 40, строка 5 до стр. 56, строка 3 и в международной заявке WO 03/052132 в разделе, озаглавленном "Единица мономера каркаса" на стр. 24, строка 27 до стр. 43, строка 14. В них также описан ряд различных единиц мономера каркаса нуклеотидов и аналогов нуклеотидов, которые могут использоваться с настоящим изобретением, и то, как они связаны с азотистыми основаниями с помощью линкеров, которые присоединены в одном или двух положениях единицы мономера каркаса.

Линкер

Линкер интеркаляторного нуклеотида представляет собой фрагмент, соединяющий интеркалятор и мономер каркаса указанного гидрофобного нуклеотида, предпочтительно ковалентно соединяющий указанный интеркалятор и единицу мономера каркаса. Линкер может включать один или несколько атомов или связь (связи) между атомами.

На основе указанных выше определений каркаса и интеркалятора, линкер соответствует наиболее короткому расстоянию, связывающему каркас и интеркаляторы. Если интеркалятор соединен напрямую с каркасом, то линкер представляет собой связь.

Линкер обычно состоит из цепи атомом или разветвленной цепи атомов. Цепи могут являться насыщенными, а также ненасыщенными. Линкер также может представлять собой кольцевую структуру с/без конъюгированных связей.

Способные быть использованными линкеры подробно описаны в международной заявке WO 2017/045689, в частности в разделе, озаглавленном "Линкер" на стр. 56, строка 5 до стр. 59, строка 10 и в WO 03/052132 в разделе "Линкер" на стр. 54, строка 15 до стр. 58, строка 7.

Набор

Здесь также предусмотрен набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающие повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

a) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его З'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от З'-конца,

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его З'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты.

Здесь также предусмотрен набор, включающий:

a) репортерный олигонуклеотид, который может представлять собой любой из репортерных олигонуклеотидов, описанных здесь ниже в разделе "Репортерный олигонуклеотид"

b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, который может быть любым из наборов праймеров, описанных здесь выше в разделе "Амплификация".

Набор является особенно полезным при реализации настоящих способов.

Таким образом, здесь предусмотрен набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

а) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его З'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от З'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать нуклеиновую кислоту-мишень.

Помимо указанного репортерного олигонуклеотида и указанного набора праймеров набор может также включать дополнительные компоненты. Например, набор может дополнительно включать ПЦР реагенты. Набор может также включать зонд для детектирования, например зонд, обеспечивающий детектирование продуцирования ПЦР продукта в реальном времени.

Указанные выше наборы являются особенно полезными для реализации описанных здесь способов, в частности для детектирования вариантов последовательностей последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, предпочтительно включающей повторы, например микросателлиты. В частности, микросателлиты, где последовательность дикого типа или контрольная последовательность имеет длину 15 нуклеотидов или более, как более подробно описано выше.

Репортерный олигонуклеотид

Как подробно описано выше, настоящие способы требуют репортерный олигонуклеотид для осуществления анализа плавления, например для осуществления HRM анализа. Без связи с теорией, авторы обнаружили, что репортерные олигонуклеотиды, включающие гидрофобные нуклеотиды, являются особенно полезными для реализации настоящих способов, поскольку они могут повышать чувствительность анализа. Таким образом, подобные репортерные олигонуклеотиды также описаны здесь.

Здесь также предусмотрен репортерный олигонуклеотид, который может гибридизироваться с одной цепью нуклеиновой кислоты-мишени, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанный репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться со второй цепью первого и второго ампликона, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними.

Здесь также предусмотрен репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его З'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

Репортерный олигонуклеотид может включать второй гаситель. Предпочтительно, второй гаситель представляет собой неконцевой участок, то есть расположенный во внутреннем участке репортерного олигонуклеотида. Другими словами, второй гаситель не расположен на 5'-конце или на З'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов о 5'-конца или З'-конца.

Единица мономера каркаса X может представлять собой любую из единиц мономера каркаса, описанных здесь выше в разделе "Единица мономера каркаса".

Интеркалятор Q может представлять собой любой из интеркаляторов, описанных здесь выше в разделе "Интеркалятор".

Гидрофобные нуклеотиды, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, подробно описаны в международной заявке WO 2017/045689, в частности в разделе, озаглавленном "Гидрофобные нуклеотиды" на стр. 30, строки 2-25.

В некоторых вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_d-Z-(N)_e-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

полное количество нуклеотидов или нуклеотидных аналогов составляет, по меньшей мере, 10; и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

d и е по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 19; и

a+b+d+e равно, по меньшей мере, 10;

и (N)_a-(N)_d-(N)_e-(N)_b идентичен контрольной последовательности.

В других вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_f-Z-(N)_g-Z-(N)_h-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

f, g и h по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 18; и

a+b+f+g+h равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50;

и (N)a-(N)_f-(N)_g-(N)_h-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_i-Z-(N)_j-Z-(N)_k-Z-(N)_i-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

i, j, к и I по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 17; и

a+b+i+j+k+I равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_i-(N)_j-(N)_k-(N)_I-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_m-Z-(N)_n-Z-(N)_o-Z-(N)_p-Z-(N)_q-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1; и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от О до 4; и

m, n, о, р и q по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 16; и

a+b+m+n+o+p+q равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_m-(N)_n-(N)_o-(N)_p-Z-(N)_q-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность.

Репортерный олигонуклеотид может включать выступ, то есть он может включать нуклеотиды на одном из его концов, которые не гибридизируются с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты. Выступ может быть 3'-концевым или 5'-концевым. Предпочтительно, репортерный олигонуклеотид включает 5'-концевую последовательность, которая образует 5'-выступ относительно цепи первого и второго ампликона, с которыми может гибридизироваться последовательность гибридизации.

Репортерный олигонуклеотид включает, по меньшей мере, первый флуорофор и, по меньшей мере, первый гаситель. Они являются полезными в плане анализа плавления и/или HRM анализа. Предпочтительно, репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, по меньшей мере, на его 5'-конце или, по меньшей мере, на его 3'-конце, или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца. Репортерный олигонуклеотид предпочтительно включает первый гаситель, по меньшей мере, на его 5'-конце или, по меньшей мере, на его 3'-конце, или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца. Таким образом, флуорофор и гаситель могут быть расположены на 5'-конце или 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или 3'-конца, но не обязательно расположены на последнем нуклеотиде репортерного олигонуклеотида. Предпочтительно, если первый флуорофор расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, то первый гаситель не расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца. Вместо этого он расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца или во внутреннем участке репортера. Наоборот, если первый флуорофор расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, то первый гаситель не расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца. Вместо этого он расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца или во внутреннем участке репортера. Термин "внутренний участок" обозначает здесь участок репортерного олигонуклеотида, который не включает 5 концевых нуклеотидов на каждом конце. Предпочтительно, первый флуорофор и первый гаситель не являются расположенными близко относительно друг друга.

Пригодные флуорофоры и гасители являются доступными для специалиста в данной области, которому не составит труда выбрать их для реализации настоящих способов.

Репортерный олигонуклеотид применяется для реализации анализа плавления, например HRM анализа. Так, последовательность репортерного нуклеотида подвергается некоторым ограничениям, которые зависят от последовательности, гибридизацию и детектирование которой она обеспечивает.Репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, которая, например, идентична NOI и которая гибридизируется с цепью, являющейся комплементарной NOI. Таким образом, в рамках вариантов осуществления, в которых NOI включает повторы, репортерный олигонуклеотид также включает повторы, то есть последовательность гибридизации Н также включает повторы, как более подробно описано ниже.

Репортерный олигонуклеотид может, помимо последовательности, которая идентична NOI, также включать дополнительные нуклеотиды в последовательности гибридизации. Например, как показано в примерах ниже, это может быть особенно актуальным в случаях, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой микросателлит.Если микросателлит имеет М тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов в контрольной последовательности, то последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно имеет М" тандемных повторов, при этом М"≥М+1, предпочтительно М"≥М+1 или М"≥М+2. Если тандемный повтор представляет собой мононуклеотидный повтор, то последовательность гибридизации имеет длину n" нуклеотидов, при этом n"≥n+1, предпочтительно n"≥n+1 или n"≥n+2. Другими словами, последовательность гибридизации может включать, по меньшей мере, один или два дополнительных нуклеотида.

Это обеспечивает более чувствительное различение между вариантом последовательности и контрольной последовательностью, особенно когда вариант последовательности включает вставку.

В некоторых вариантах осуществления, в частности где NOI представляет собой микросателлит, последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно включает последовательность, которая состоит из повторов, являющихся идентичными или комплементарными повторам NOI, и может полезным образом также включать концевую последовательность, например одну или две концевые последовательности, которая обозначается здесь как хелперная последовательность (хелперные последовательности), которые гибридизируются с первым и вторым ампликоном непосредственно выше или непосредственно ниже данных повторов, когда с ними гибридизируется последовательность гибридизации. Другими словами, последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида предпочтительно включает повторы и дополнительно включает от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, которые гибридизируются с NOI или их комплементарной цепью непосредственно выше или непосредственно ниже повторяющейся последовательности.

Хелперная последовательность может быть 3'-концевой или 5'-концевой. Предпочтительно, репортерный олигонуклеотид включает 5'-концевую хелперную последовательность, которая гибридизируется с цепью первого и второго ампликона непосредственно выше или непосредственно ниже данных повторов, когда с ними гибридизируется последовательность гибридизации. Хелперная последовательность обеспечивает различение профилей плавления, как показано в примере 13. Хелперная последовательность обозначается как сильная, если она имеет высокую Т=_m при гибридизации с первым или вторым ампликоном. Специалисту в данной области хорошо известно, что гибридизация между двумя последовательностями является более сильной, если последовательности включают более высокое соотношение G/C по сравнению с двумя гибридизированными последовательностями, включающими более высокое соотношение А/Т; таким образом, хелперная последовательность, включающая более высокое соотношение G/C, чем А/Т, будет более сильной, чем хелперная последовательность, включающая более низкое соотношение G/C, чем А/Т. Также известно, что более длинные последовательности обеспечивают более сильную гибридизацию, чем более короткие последовательности, поэтому сила хелперной последовательности может быть скорректирована путем увеличения длины, которая гибридизируется с первым и/или вторым ампликоном.

В некоторых вариантах осуществления репортерный олигонуклеотид может применяться для детектирования варианта последовательности, свидетельствующего о микросателлитной нестабильность, то есть контрольная последовательность включает микросателлитную последовательность. Когда контрольная последовательность включает микросателлитную последовательность из М тандемных повторов, имеющую полную длину п нуклеотидов, то длина последовательности гибридизации Н репортерного олигонуклеотида представляет собой n", при этом n"≥n+1, предпочтительно n"≥n+1 или n"≥n+2.

Указанные выше репортерные олигонуклеотиды могут включать второй гаситель. Предпочтительно, второй гаситель представляет собой неконцевой участок, то есть расположенный во внутреннем участке репортерного олигонуклеотида. Другими словами, второй гаситель не расположен на 5'-конце или на 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов о 5'-конца или 3'-конца.

Способные быть использованными флуорофоры и гасители известны в данной области и доступны для специалиста, которому не составит труда выбрать подходящие флуорофоры и гасители.

Здесь также предусмотрено применение подобных репортерных олигонуклеотидов, включающих гидрофобные нуклеотиды в рамках способов для детектирования варианта нуклеиновой кислоты, в частности их применение в рамках описанных здесь способов. Репортерные олигонуклеотиды также могут применяться в рамках способов предсказания эффективности лечения клинического состояния и в рамках способов предсказания присутствия клинического состояния, в частности как описано здесь ниже.

Предсказание эффективности лечения клинического состояния

Настоящее изобретение также относится к способам предсказания эффективности лечения клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта предварительно определенным лекарством, при этом эффективность лечения указанного клинического состояния указанным лекарством ассоциирована с присутствием варианта последовательности.

Таким образом, некоторые мутации могут свидетельствовать о том, может ли определенное лекарство быть эффективным для лечения субъекта. В частности, определенные мутации могут свидетельствовать об определенном ответе на лечение предварительно определенным лекарством. Например, присутствие варианта последовательности может свидетельствовать о том, будет ли субъект отвечать положительно на лечение указанным лекарством, о сопротивлении заболевания субъекта лечению соответствующим лекарством, или о способности/неспособности субъекта переносить лечение определенным лекарством.

Способы предсказания эффективности лечения клинического состояния у субъекта могут включать следующие этапы:

a. получение образца от указанного субъекта

b. осуществление способа детектирования присутствия варианта последовательности, как описано здесь, для определения того, включает ли образец вариант последовательности

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, является ли указанное лекарство эффективным в плане лечения указанного клинического состояния у указанного субъекта.

Клиническое состояние может представлять собой, например, рак, или любое из описанных здесь клинических состояний, заболеваний или расстройств. Были идентифицированы многие мутации, которые свидетельствуют о том, является ли определенное лекарство или комбинация лекарств для лечения рака эффективной при лечении определенного вида рака.

В некоторых вариантах осуществления вариант последовательности представляет собой вариант микросателлита, как подробно описано выше.

Предсказание присутствия клинического состояния

Настоящие способы также могут применяться для предсказания или даже диагностирования присутствия любого клинического состояния, ассоциированного с определенной мутацией у субъекта.

Такие способы могут включать следующие этапы:

a) получение образца от указанного субъекта

b) детектирование присутствие мутации, ассоциированной с клиническим состоянием, в образце путем осуществления описанных здесь способов детектирования варианта последовательности;

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, что указанный субъект имеет указанное клиническое состояние.

Известно, что многие клинические состояния ассоциированы с определенными мутациями, при этом могут быть сконструированы репортерные олигонуклеотиды и наборы праймеров для детектирования любой подобной мутации. Настоящие способы являются особенно полезными для детектирования состояний, ассоциированных с микросателлитной нестабильностью, когда они применяются для детектирования варианта последовательности микросателлита, предпочтительно где соответствующая последовательность дикого типа или контрольная последовательность имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, как подробно указано выше.

В одном варианте осуществления клиническое состояние представляет собой рак, например наследственный неполипозный рак толстой кишки. В другом варианте осуществления клиническое состояние представляет собой синдром Линча.

Способ может дополнительно включать этап лечения указанного клинического состояния. При детектировании варианте последовательности, свидетельствующего о присутствии клинического состояния, субъекта классифицируют в качестве страдающего указанным клиническим состоянием, при этом способ может дополнительно включать этап введения терапевтического агента в эффективном количестве указанному субъекту.

Примеры

Пример 1: Микросателлитная нестабильность не обязательно приводит к изменениям температуры плавления.

ВАТ25 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в ВАТ25 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на З'-конце, а также внутренний гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 142-171 SEQ ID NO: 1 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК нормальной ткани и ДНК опухолевой ткани из CRC или внутриматочных образцов от пациента с микросателлитной нестабильностью. Исходный интервал нормализации составлял 39-40°С, а конечный интервал нормализации составлял 63-64°С. Были получены две кривые плавления (Фиг. 2А), которые были трансформированы в кривые первой отрицательной производной (Фиг. 2В). Данные две кривые не были идентичными (максимальная разность между амплитудами двух кривых составляла -0,07 ОЕФ (абсолютное значение), не показана) при применении билинейной нормализации и корректирования температуры путем применения порогового значения интенсивности температурного сдвига 0,1 ОЕФ, который превышает пороговое значение 0,05 ОЕФ. Разность в виде 0,07 превышает пороговое значение 0,05 ОЕФ, установленное для данного конкретного анализа, и, таким образом, образец классифицирован в качестве нестабильного в плане ВАТ25. Кривые первой отрицательной производной показаны на Фиг. 2 В. Как видно, нормальная ткань имела Т_m 57,31°С, а опухолевая ткань имела Т_m 57,41°С. Подобное малое различие обычно является несущественным и может быть связано с различными концентрациями солей в образцах или вариабельностью инструмента.

На основе данного примера можно сделать вывод о том, что температура плавления не обязательно значительно меняется от образца нормальной ткани к связанному с мутацией образцу опухолевой ткани, однако форма кривой плавления меняется, что еще более легко визуально определяется при применении билинейной нормализации и температурного сдвига. Таким образом, образцы нормальной и опухолевой ткани могут быть различены на основе различающейся формы HRM кривых даже при очень малых различиях в плане

Т_m.

Пример 2: Билинейная нормализация

NR22 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR22 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на З'-конце, а также внутренний BHQ-1 гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 143-172 SEQ ID NO: 4 и имеет выступ (2 нуклеотида) на его 3'-конце и хелперную последовательность (9 нуклеотидов; приводит к повышению Т_m на 14,2°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК очищенной FFPE нормальной и опухолевой ткани от пациента с микросателлитной нестабильностью. Были получены две кривые плавления (Фиг. 3). На Фиг. 3А показана кривая плавления без применения билинейной нормализации или температурного сдвига. На Фиг. 3В показана кривая плавления после применения билинейной нормализации (без температурного сдвига).

На Фиг. 4. показано различие D_t во флуоресценции между контролем (флуоресценция, равная нулю при любой температуре; образец из здоровых клеток пациента) и образцом опухолевой ткани в зависимости от температуры.

Это также называется графиком разности или кривой разности. Максимальная разность, maxD_т, измеряется в виде абсолютного значения максимальной амплитуды кривой разности. Данные показаны после применения стандартной нормализации (Фиг. 4А) или после применения билинейной нормализации (без температурного сдвига) (Фиг. 4В).

Этот пример показывает, что билинейная нормализация может обеспечивать компенсирование различных снижений интенсивности флуоресценции, наблюдаемых до и после плавления различных образцов, и обеспечивает различение HRM профилей для образца нормальной (здоровой) ткани и образца опухолевой ткани.

Пример 3: Билинейная нормализация и температурный сдвиг могут снижать различие между кривыми плавления

NR24 анализ с использованием асимметричной ПЦР. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR24 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 158-187 SEQ ID NO: 5 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность (приводящую к повышению Т_m на 14,8°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК нормальной ткани и ДНК опухолевой ткани от одного микросателлитно стабильного пациента. Применяли стандартную нормализацию с исходным интервалом 44-45°С (установлен как значение 1) и конечным интервалом 66-67°С (установлен как значение 0). Результаты показаны на Фиг. 5.

Когда билинейная нормализация и пороговое значение интенсивности температурного сдвига не применялись, различие между кривыми составляло ~0,04 ОЕФ (Фиг. 5А). При применении билинейной нормализации, но не порогового значения интенсивности температурного сдвига, различие между кривыми составляло ~0,02 ОЕФ (Фиг. 5В). При применении билинейной нормализации и порогового значения интенсивности температурного сдвига 0,1 ОЕФ различие между кривыми составляло ~0,01 ОЕФ (Фиг. 5С).

На основе данного примера можно сделать вывод о том, что билинейная нормализация и температурный сдвиг могут обеспечивать уменьшение различий между кривыми плавления образцов здоровой и нормальной ткани микросателлитно стабильных пациентов. Это снижает риск ложноположительных результатов.

Пример 4: Пороговое значение интенсивности температурного сдвига может обеспечивать нейтрализацию изменения температуры плавления, вызванного различными концентрациями солей в ДНК буферах

NR24 анализ с использованием асимметричной ПЦР. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR24 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний BHQ-1 гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 158-187 SEQ ID NO: 5 и имеет выступ на его 3'-конце (2 нуклеотида) и хелперную последовательность (приводящую к повышению Т_m на 14,8°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. ДНК нормальной ткани разбавляли с 40 нг/мкл до 2 нг/мкл в воде и ТЕ буфере, соответственно. Исходную нормализацию осуществляли в области 44-45°С, а конечную нормализацию осуществляли в области 66-67°С. Результаты показаны на Фиг. 6.

При применении билинейной нормализации, но не температурного сдвига, максимальное различие, maxD_т, между кривыми составляло ~0,07 ОЕФ (Фиг. 6А). При применении билинейной нормализации и температурного сдвига с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ maxD_т составляло ~0,01 ОЕФ (Фиг. 6В).

На основе данного примера можно сделать вывод о том, что применение температурного сдвига может снижать различие между двумя образцами, когда данное различие вызвано различной концентрацией солей в ДНК буферах. Таким образом, после применения билинейной нормализации и температурного сдвига аликвоты одного образца могут обеспечивать получение идентичных HRM профилей, даже если аликвоты были получены с использованием других буферов. Это значительно снижает риск ложноположительных результатов, поскольку анализ является менее уязвимым в плане варьирующихся концентраций солей и буферов между подвергаемыми сравнению образцами.

Пример 5: Температурный сдвиг создает возможность использовать один универсальный контрольный образец

MON027 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в MON27 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний BHQ-1 гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 300-333 SEQ ID NO: 6 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность (приводящую к повышению Т_m на 10,8°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК нормальной очищенной FFPE ткани от 16 различных пациентов. Исходный интервал нормализации составлял 44-45°С, а конечный интервал нормализации составлял 66-67°С.

На Фиг. 7А показаны HRM кривые, где применялась билинейная нормализация, но не применялся температурный сдвиг.Максимальная разность maxD_T между кривыми составляла ~0,25 ОЕФ. На Фиг. 7В показаны HRM кривые, где применялась билинейная нормализация и температурный сдвиг с пороговым значением интенсивности 0,1 ОЕФ, при этом maxDT снижалась до ~0.06 ОЕФ.

На Фиг. 8А и Фиг. 8В показаны графики разности HRM кривых Фиг. 7А и Фиг. 7В, соответственно.

На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что применение температурного сдвига снижает различие между образцами здоровой ткани от различных субъектов. Это создает возможность использовать один универсальный контрольный образец вместо пар образцов нормальной и опухолевой ткани для каждого пациента.

Пример 6: Асимметричная ПЦР обеспечивает получение большего количества одноцепочечного ампликона NR22 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR22 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на З'-конце, а также внутренний BHQ-1 гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 142-172 SEQ ID NO: 4 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность (приводящую к повышению Т_m на 14,2°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца.

Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК крови нормальной очищенной ткани. На фигуре показаны кривые ПЦР в реальном времени. Кривая симметричной ПЦР перестает повышаться в плане ОЕФ после цикла 45, а для асимметричной ПЦР амплификация продолжается после экспоненциальной фазы в виде линейной амплификации.

На основе данного эксперимента видно, что асимметричная ПЦР обеспечивает создание большего количество одной цепи ДНК, включающей последовательность, с которой может связываться последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида.

Пример 7: Асимметричная ПЦР обеспечивает получение большего соотношения сигнал/шум и более резких кривых плавления

Данный анализ проводили как описано в Примере 6. Были получены нормализованные HRM кривые, которые показаны на Фиг. 10.

На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что асимметричная ПЦР обеспечивает получение большего соотношения сигнал/шум и более "резкого" профиля плавления.

Пример 8: Асимметричная ПЦР облегчает различение пациентов с MSS и MSI.

NR22 анализ проводили как описано в Примере 6. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК очищенной FFPE нормальной и опухолевой ткани от пациента с микросателлитной нестабильностью.

На Фиг. 11 показаны HRM кривые, полученные после применения стандартной нормализации с асимметричной ПЦР (Фиг. 11А) или симметричной ПЦР (Фиг. 11В). Соответствующие кривые разности показаны на Фиг. 12А и Фиг. 12В, соответственно.

На основе данного примера можно сделать вывод о том, что амплификация с использованием асимметричной ПЦР создает большее различие между кривой нормальной и опухолевой ткани для пациента с микросателлитной нестабильностью по сравнению с симметричной ПЦР. Таким образом, асимметричная ПЦР облегчает различение пациентов с MSS и MSI.

Пример 9: Односторонний выступ в репортерном олигонуклеотиде может приводить к повышению температуры плавления

NR22 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR22 микросателлите.

В данном эксперименте использовали два различных репортерных олигопептида. Первый репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце. Первый репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 148-177 SEQ ID NO: 4. Последовательность гибридизации также включает хелперную последовательность длиной 4 нуклеотида (приводящую к повышению Т_т на 7,5°С) на 5'-конце и хелперную последовательность длиной 5 нуклеотидов (приводящую к повышению Т_m на 3,6°С) на 3'-конце, которые комплементарны участкам NR22 непосредственно выше и ниже данных повторов. Второй репортерный олигонуклеотид включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний гаситель. Второй репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 143-172 SEQ ID NO: 4 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность длиной 9 нуклеотидов только на его 5'-конце (приводящую к повышению Т_m на 14,2°С), которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, оба репортерных олигонуклеотида включают гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК крови нормальной очищенной ткани.

Результаты анализа с применением первого репортерного олигонуклеотида показаны в виде пунктирных линий на Фиг. 13; результаты с применением второго репортерного олигонуклеотида показаны в виде цельных линий. Кривые плавления показаны на Фиг. 13А, а производные кривые показаны на Фиг. 13В. Билинейную нормализацию и температурный сдвиг не применяли.

Видно, что температура плавления для второго репортерного олигонуклеотида является более высокой, чем для первого репортерного олигонуклеотида. Более низкая фоновая флуоресценция для второго репортерного олигонуклеотида вероятно связана с присутствием дополнительного внутреннего гасителя.

На основе данного эксперимента можно увидеть, что наличие одной более длинной хелперной последовательности на одном конце вместо двух более коротких хелперных последовательностей на каждом конце может повышать температуру плавления зонда и может представлять собой преимущество при анализе мононуклеотидных повторяющихся микросателлитов.

Пример 10: Двойное гашение репортерного олигонуклеотида повышает соотношение сигнал/шум

ВАТ26 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в ВАТ26 микросателлите. Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК крови нормальной очищенной ткани. A: HRM кривые с применением стандартной нормализации.

В данном примере использовали два репортерных олигонуклеотида, обе из которых включали FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце. В качестве примера репортерного олигонуклеотида с одиночным гашением, отличного от DQ, использовали ВАТ26 репортерный олигонуклеотид FAM 5'-CZCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAZC-3' BHQ-1 (SEQ ID NO: 7). ВАТ26 репортерный олигонуклеотид FAM 5'-CZCCTTTTTTTTTTXTTTTTTTTTTTTTTTTTTAZC-3' BHQ-1 (SEQ ID NO: 8) использовали в качестве примера репортерного олигонуклеотида с двойным гашением, DQ; X обозначает внутренний гаситель.

Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 220-251 SEQ ID NO: 2 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность как на его 5'-конце (приводящую к повышению Т_т на 5,2°С), так и на его 3'-конце (приводящую к повышению Т_т на 1,9°С), которая гибридизируется выше и ниже мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца.

HRM кривые и кривые первой отрицательной производной показаны на Фиг. 14А и В, соответственно. Видно, что фоновая флуоресценция репортерного олигонуклеотида с одиночным гашением (отличный от DQ зонд) является более высокой по сравнению с репортерным олигонуклеотидом с двойным гашением (DQ зонд). На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что DQ репортерные олигонуклеотиды снижают шум флуоресценции и делают кривые плавления более резкими по сравнению с репортерными олигонуклеотидами с одиночным гашением. Таким образом, применение репортерных олигонуклеотидов с двойным гашением может обеспечивать различение между образцами нормальной и опухолевой ткани.

Пример 11: Дополнительные нуклеотидные повторы в последовательности гибридизации репортерного олигонуклеотида обеспечивают возможность детектировать более длинные микросателлиты NR21 анализ проводили с помощью асимметричной ПЦР. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR21 микросателлите. Репортерный олигонуклеотид, использованный в данном примере, включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний гаситель. Репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 189-214 SEQ ID NO: 2 и имеет выступ на его 3'-конце и хелперную последовательность на его 5'-конце (приводящую к повышению Т_m на 15,2°С), которая гибридизируется ниже мононуклеотидных повторов. Кроме того, репортерный олигонуклеотид включает 2 гидрофобных нуклеотида на расстоянии не более 5 нуклеотидов от 5'-конца и один гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 5 нуклеотидов от 3'-конца. Последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает 22 Т нуклеотидных повторов; NR21 микросателлит состоит из 21 повторов в большинстве здоровых клеток. Таким образом, репортерный олигонуклеотид имеет один дополнительный Т по сравнению с контрольной последовательностью.

Репортерный олигонуклеотид был протестирован с применением искусственных мишеней из 21, 22, или 23 повторов аденина.

На Фиг. 15 показаны HRM кривые после применения билинейной нормализации, но без температурного сдвига. На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что добавление одного дополнительного повтора в последовательность гибридизации в репортерном олигонуклеотиде обеспечивает детектирование микросателлитов, имеющих длину, превышающую 21 повтор контроля.

Пример 12: Точечная мутация приводит к изменению температуры плавления на несколько градусов

Анализ на основе экзона 13 гена KIT для детектирования варианта последовательности в экзоне 13 гена KIT. ПЦР осуществляли в виде асимметричной ПЦР. Репортерный олигонуклеотид включал FAM флуорофор на его 5'-конце и BHQ1 гаситель на его 3'-конце. Тестировали 1 нг/мкл ДНК очищенной FFPE ткани из образца дикого типа и очищенной FFPE опухолевой ткани из образца от пациента. Исходный интервал нормализации составлял 70-71°С, а конечный интервал нормализации составлял 80-81°С. Результаты показаны на Фиг. 16. Ткань дикого типа обеспечивает Т_m 79,1°С, а опухолевая ткань обеспечивает два значения Т_m: 75,7°С и 79,1°С.

На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что температура плавления зонда изменяется на величину до 3,4°С, и что форма кривой плавления значительно меняется в случае одиночной точечной мутации. Таким образом, могут быть различены образцы здоровой и опухолевой ткани.

Пример 13: Более сильная одноконечная хелперная последовательность повышает различие и обеспечивает различение мутанта и дикого типа NR24 анализ с применением асимметричной ПЦР с праймерами, гибридизирующимися выше и ниже участка, включающего мононуклеотидные повторы. Данный анализ предназначен для детектирования варианта последовательности в NR24 микросателлите.

В данном эксперименте использовали два различных репортерных олигопептида. Первый репортерный олигонуклеотид включал FAM флуорофор на 5'-конце и BHQ-1 гаситель на 3'-конце, а также внутренний BHQ-1 гаситель. Первый репортерный олигонуклеотид гибридизируется с положениями 159-187 SEQ ID NO: 5 и имеет выступ на его 3'-конце (2 нуклеотида) и хелперную последовательность длиной 5 нуклеотидов (приводящую к повышению Т_m на 10,5°С) на его 5'-конце, которая гибридизируется выше мононуклеотидных повторов. Кроме того, он включает два гидрофобных нуклеотида на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца и гидрофобный нуклеотид на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца. Второй репортер описан в Примере 4.

Тестировали 1-2 нг/мкл ДНК очищенной FFPE нормальной и опухолевой ткани от пациента с микросателлитной нестабильностью.

Исходную нормализацию осуществляли в области 40,5-41,5°С, а конечную нормализацию осуществляли в области 66-67°С. Применяли билинейную нормализацию и температурный сдвиг при 0,05 ОЕФ. Результаты показаны на Фиг. 17 и 18; см. Фиг. 17А и 18А (результаты с применением первого репортерного олигонуклеотида) и Фиг. 17В и 18В (результаты с применением второго репортерного олигонуклеотида).

Вторая хелперная последовательность при гибридизации приводит к более высокому повышению Т_т (14,8°С, то есть на 4,3°С выше), чем первая хелперная последовательность, что помогает обеспечивать различение двух профилей плавления.

Видно, что более сильная хелперная последовательность повышает maxD_т мутанта. Первый репортерный олигонуклеотид со слабой хелперной последовательностью обеспечивал значение maxD_т ~0,03 ОЕФ между нормальной и опухолевой тканью. Это значение ниже порогового значения для NR24 маркера, поэтому мутант будет, таким образом, неправильно классифицирован в качестве относящегося к дикому типу (Фиг. 18А). Второй репортерный олигонуклеотид с более сильной хелперной последовательностью обеспечивал значение maxD_T ~0.17, и, таким образом, образец правильно классифицирован в качестве мутанта (Фиг. 18В).

На основе данного эксперимента можно сделать вывод о том, что более сильная хелперная последовательность будет повышать различие между диким типом и мутантов, что может быть полезным при анализе мононуклеотидных повторяющихся микросателлитов.

Ссылки

Boland et al. (1998) "A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer," Cancer Res 58:5248-5257 Rodriguez-Bigas et al. (1997) "A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines," J Natl Cancer Inst 89:1758-1762 Hunter and Sanders (1990) J, Am Chem. Soc. 112: 5525-5534 WO 2017/045689 WO 03/052132

Пункты

1. Способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление высокочувствительного анализа кривых плавления (HRM) первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого HRM профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление HRM анализа второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго HRM профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй HRM профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом HRM анализ включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н, при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и

g) Сравнение первого HRM профиля с контрольным HRM профилем, при этом разница между первым HRM профилем и контрольным HRM профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

2. Способ по п. 1., при этом NOI включает повторы, и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида состоит из повторяющейся последовательности и хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторов и может гибридизироваться с первой или второй цепью первого и второго ампликона, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними, предпочтительно при этом репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце.

3. Способ по п. 2, при этом хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, предпочтительно при этом хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный олигонуклеотид, как указано в пункте 1.

4. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в пункте 1, например 1, 2, или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены на расстоянии не более от 1 до 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида, например на расстоянии не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 3'-конца.

5. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в пункте 1, например 1, 2, или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены на расстоянии не более от 1 до 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида, например на расстоянии не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 5'-конца.

6. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты состоит из ВАТ25 и ВАТ26, предпочтительно множество состоит из ВАТ25 согласно SEQ ID NO:1 и ВАТ26 согласно SEQ ID NO: 2.

7. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, включающих один или несколько из ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, предпочтительно ВАТ25 согласно SEQ ID NO:1, ВАТ26 согласно SEQ ID NO: 2, NR21 согласно SEQ ID NO: 3, NR22 согласно SEQ ID NO: 4, NR24 согласно SEQ ID NO: 5 и MON027 согласно SEQ ID NO: 6.

8. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом нуклеиновые кислоты-мишени представляют собой множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, состоящее из ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22 и NR24, предпочтительно множество состоит из ВАТ25 согласно SEQ ID NO:1, ВАТ26 согласно SEQ ID NO: 2, NR21 согласно SEQ ID NO: 3, NR22 согласно SEQ ID NO: 4, и NR24 согласно SEQ ID NO: 5.

9. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом нуклеиновые кислоты-мишени представляют собой множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, состоящее из ВАТ25, ВАТ26, NR22, NR24 и MON027, предпочтительно множество состоит из ВАТ25 согласно SEQ ID NO:1, ВАТ26 согласно SEQ ID NO: 2, NR22 согласно SEQ ID NO: 4, NR24 согласно SEQ ID NO: 5 и MON027 согласно SEQ ID NO: 6.

10. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом нуклеиновые кислоты-мишени представляют собой множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, состоящее из ВАТ25, ВАТ26, NR21, NR22, NR24 и MON027, предпочтительно множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты состоит из ВАТ25 согласно SEQ ID NO:1, ВАТ26 согласно SEQ ID NO: 2, NR21 согласно SEQ ID NO: 3, NR22 согласно SEQ ID NO: 4, NR24 согласно SEQ ID NO: 5 и MON027 согласно SEQ ID NO: 6.

11. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом амплификация на этапе е) осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), предпочтительно с помощью асимметричной ПЦР, при которой первый и второй праймер присутствуют при различных количествах, тем самым направляя ПЦР к амплификации в большем количестве второй цепи каждого ампликона, чем первой цепи каждого ампликона.

12. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом первый образец был получен от субъекта, страдающего или предположительно страдающего заболеванием, например раком, при этом рак предпочтительно представляет собой наследственный неполипозный рак толстой кишки.

13. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом NOI представляет собой микросателлит.

14. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом контрольная последовательность включает микросателлитную последовательность из М тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов, и при этом вариант последовательности имеет М' тандемных повторов, имеющих полную длину n' нуклеотидов, при этом М и М' представляют собой различающиеся целые числа.

15. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом длина последовательности гибридизации Н репортерного олигонуклеотида представляет собой n", при этом n"≥n+1, предпочтительно n"≥n+1 или n"≥n+2.

16. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом репортерный олигонуклеотид включает второй гаситель, расположенный в неконцевом положении репортерного олигонуклеотида.

17. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом первый образец представляет собой образец ткани, включающей или предположительно включающей клетки с мутациями, характерными для указанного заболевания.

18. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом контрольный образец получают от того же субъекта, что и первый образец, необязательно из не подверженной заболеванию ткани, или при этом контрольный образец получают от здорового субъекта.

19. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом этап f) включает этап трансформирования первой и второй HRM кривой плавления для получения первой отрицательной производной первой и второй кривой плавления, при этом различие между первым HRM профилем и контрольным HRM профилем представляет собой различие между первыми отрицательными производными первой и второй кривой плавления.

20. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом флуоресценция первой кривой плавления и флуоресценция второй кривой плавления нормализованы и при этом различие между HRM профилями представляет собой различие между флуоресценцией указанной первой и второй кривой плавления в зависимости от температуры.

21. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом различие между первым HRM профилем и контрольным HRM профилем измеряется в виде абсолютной максимальной разности в относительных единицах флуоресценции в рамках верхней и нижней области нормализации между первой и второй HRM кривой.

22. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом HRM анализ включает этап билинейной нормализации первой и второй кривой плавления.

23. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом HRM анализ включает этап применения корректирования температуры при определенной интенсивности флуоресценции в отношении первой и второй кривой плавления и/или первых отрицательных производных первой и второй кривой плавления.

24. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом второй праймер включает последовательность длиной, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, которая комплементарна непрерывной последовательности последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

25. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом вариант последовательности включает или состоит из вставки одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с контрольной последовательностью.

26. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом вариант последовательности включает или состоит из делеции одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с контрольной последовательностью.

27. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_d-Z-(N)_e-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

полное количество нуклеотидов или нуклеотидных аналогов составляет, по меньшей мере, 10; и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

d и е по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 19; и

a+b+d+e равно, по меньшей мере, 10; и

(N)_a-(N)_d-(N)_e-(N)_b идентичен контрольной последовательности.

28. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом репортерный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру:

5'-(N)_a-Z-(N)_f-Z-(N)_g-Z-(N)_h-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от О до 4; и

f, g и h по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 18; и

a+b+f+g+h равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_f-(N)_g-(N)_h-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_i-Z-(N)_j-Z-(N)_k-Z-(N)_I-Z-(N)_b-3' при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

i, j, к и I по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 17; и

a+b+i+j+k+I равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_i-(N)_j-(N)_k-(N)r(N)b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность; или

имеет следующую общую структуру

5'-(N)_a-Z-(N)_m-Z-(N)_n-Z-(N)₀-Z-(N)_p-Z-(N)_q-Z-(N)_b-3'

при этом

N представляет собой любой нуклеотид или аналог нуклеотида; и

Z представляет собой гидрофобный нуклеотид, как определено в пункте 1;

и

а и b по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 0 до 4; и

m, n, о, р и q по отдельности представляют собой целые числа в диапазоне от 1 до 16; и

a+b+m+n+o+p+q равно, по меньшей мере, 10 и не превышает 50; и (N)_a-(N)_m-(N)_n-(N)_o-(N)_p-Z-(N)_q-(N)_b идентичен фрагменту последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей контрольную последовательность.

29. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом, по меньшей мере, один интеркалятор, Q, выбран из группы, состоящей из полиароматических и гетерополиароматических соединений, необязательно замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидроксила, бром-, фтор-, хлор-, йод-, меркапто-, тио-, циано-, алкилтио-, гетероцикла, арила, гетероарила, карбоксила, карбоалкила, алкила, алкенила, алкинила, нитро, амино, алкоксила, карбонила и амидо.

30. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом интеркалятор выбран из группы, состоящей из бензола, пенталена, индена, нафталина, азулена, as-индацена, s-индацена, бифенилена, аценафтилена, феналена, гепталена, фенантрана, фторантен, фенантролина, феназина, фенантридина, антрахинона, пирена, антрацена, нафтена, фенантрена, флурена, пикена, хризена, нафтацена, акридонов, бензантраценов, стилбенов, оксало-пиридокарбазенов, азидобензенов, порфиринов и псораленов и их производных.

31. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом, по меньшей мере, один, например все единицы мономера каркаса X представляют собой фосфорамидит.

32. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом, по меньшей мере, один линкер, Y, включает цепь изх атомов, выбранных из группы, состоящей из С, О, S, N и Р, необязательно при этом указанная цепь замещается одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из С, Н, О, S, N и Р.

33. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, при этом последовательность-мишень нуклеиновой кислоты представляет собой множество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты.

34. Набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

а) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени;

и b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать нуклеиновую кислоту-мишень.

35. Набор по пункту 34, при этом репортерный олигонуклеотид и первый праймер и второй праймер определены в любом одном из предыдущих пунктов.

36. Репортерный олигонуклеотид, который может гибридизироваться с одной цепью нуклеиновой кислоты-мишени, при этом указанный репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от З'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор; и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

37. Репортерный олигонуклеотид по пункту 36, при этом NOI включает повторы, и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида состоит из повторяющейся последовательности и хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторов и может гибридизироваться со второй цепью нуклеиновой кислоты-мишени, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ней, предпочтительно при этом репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце.

38. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пунктов 36-37, при этом хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, предпочтительно при этом хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный олигонуклеотид, как указано в пункте 1.

39. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пунктов 36-38, при этом контрольная последовательность включает микросателлитную последовательность из М тандемных повторов, имеющую полную длину n нуклеотидов, и при этом длина последовательности гибридизации Н репортерного олигонуклеотида представляет собой n", при этом n"≥n+1, предпочтительно n"≥n+1 или n"≥n+2.

40. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пунктов 36-39, при этом репортерный олигонуклеотид включает второй гаситель, расположенный в неконцевом положении репортерного олигонуклеотида.

41. Способ предсказания эффективности лечения клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта предварительно определенным лекарством, при этом эффективность лечения указанного клинического состояния указанным лекарством ассоциирована с присутствием варианта последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a. получение образца от указанного субъекта

b. реализацию способа по любому одному из пунктов 1-33 для определения присутствия указанного варианта последовательности;

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, является ли указанное лекарство эффективным в плане лечения указанного клинического состояния у указанного субъекта.

42. Способ предсказания присутствия клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанное клиническое состояние ассоциировано с присутствием последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a. получение образца от указанного субъекта

b. реализацию способа по любому одному из пунктов 1-33 для определения присутствия варианта последовательности;

при этом присутствие варианта последовательности свидетельствует о том, что указанный субъект имеет указанное клиническое состояние.

43. Способ по любому одному из пунктов 41-42, при этом клиническое состояние представляет собой рак, предпочтительно наследственный неполипозный рак толстой кишки.

44. Способ по любому одному из пунктов 41-43, дополнительно включающий этап введения терапевтического агента в эффективном количестве указанному субъекту.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид(ы). Также описаны набор и репортерный олигонуклеотид для реализации способа. Также описаны способы прогнозирования эффективности лечения клинического состояния и прогнозирования наличия клинического состояния. Технический результат заключается в обеспечении анализа для оценки/идентификации микросателлитов из ≥ 15 нуклеотидов с очень высокой чувствительностью. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 18 ил., 13 пр.

1. Способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид(ы) (NOI), где NOI представляет собой микросателлит, имеющий микросателлитную последовательность из M тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов, и при этом вариант последовательности имеет M’ тандемных повторов, имеющих полную длину n’ нуклеотидов, при этом M и M’ представляют собой различные целые числа, где n представляет собой 15 или более, и при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, включающую NOI;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление анализа плавления, такого как высокочувствительный анализ кривых плавления (HRM), первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление анализа плавления, такого как HRM анализ, второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом анализ плавления включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 16 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор и первый гаситель, и

при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации H,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и

где длина последовательности гибридизации H репортерного олигонуклеотида представляет собой n'', при этом n'' ≥ n + 1 или n'' ≥ n + 2;

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

g) Сравнение первого профиля с контрольным профилем, при этом различие между первым профилем и контрольным профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап g) включает или состоит из следующих этапов:

i) выравнивания первой и второй кривой плавления при определенной интенсивности флуоресценции вдоль оси температуры, тем самым обеспечивая устранение различий в плане температуры плавления между первой и второй кривой плавлений;

ii) определения различия сигнала, испускаемого флуорофором, между первой и второй кривой плавления, предпочтительно при этом различие представляет собой количественную разность; и

iii) сравнения разности, определенной на этапе ii), с пороговым значением, при этом превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает вариант последовательности, а не превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает контрольную последовательность.

3. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что контрольная последовательность имеет длину 15 нуклеотидов или более, например 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более.

4. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

5. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что

по меньшей мере, один из указанных гидрофобных нуклеотидов расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q,

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор.

6. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15, 16 ,17, 18, 19 или 20 нуклеотидов.

7. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в п. 5.

8. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в п. 5, например 1, 2, или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены на расстоянии не более от 1 до 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида, например на расстоянии не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 3'-конца.

9. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в п. 5, например 1, 2, или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены на расстоянии не более от 1 до 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида, например на расстоянии не более 1, 2, 5, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 5'-конца.

10. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что амплификация на этапе e) осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), предпочтительно с помощью асимметричной ПЦР, при которой первый и второй праймер присутствуют при различных количествах, тем самым направляя ПЦР к амплификации в большем количестве одной цепи каждого ампликона, чем другой цепи каждого ампликона.

11. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый образец был получен от субъекта, страдающего или предположительно страдающего заболеванием, например раком, при этом рак предпочтительно представляет собой наследственный неполипозный рак толстой кишки, или расстройством, предпочтительно расстройством, ассоциированным с микросателлитной нестабильностью.

12. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый образец представляет собой образец ткани, включающей или предположительно включающей клетки с мутациями, характерными для указанного заболевания или расстройства.

13. Набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид(ы) (NOI), где NOI представляет собой микросателлит, имеющий микросателлитную последовательность из M тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов, и при этом вариант последовательности имеет M' тандемных повторов, имеющих полную длину n’ нуклеотидов, при этом M и M' представляют собой различающиеся целые числа, где n представляет собой 15 или более, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

a) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, и первый гаситель,

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 16 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации H,

и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты; и

где длина последовательности гибридизации H репортерного олигонуклеотида представляет собой n'', при этом n'' ≥ n + 1 или n'' ≥ n + 2;

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты.

14. Набор по п. 13, предпочтительно отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид и первый праймер и второй праймер соответствуют определению в любом одном из пп. 1-12.

15. Набор по любому одному из пп. 13, 14, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

16. Набор по любому одному из пп. 13-15, отличающийся тем, что

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один из указанных гидрофобных нуклеотидов расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q,

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор.

17. Репортерный олигонуклеотид, который может гибридизироваться с одной цепью нуклеиновой кислоты-мишени, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид(ы) (NOI), где NOI представляет собой микросателлит, например микросателлитную последовательность из M тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов, и при этом вариант последовательности имеет M' тандемных повторов, имеющих полную длину n' нуклеотидов, при этом M и M' представляют собой различающиеся целые числа, где n представляет собой 15 или более, при этом указанный репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, и первый гаситель, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 16 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации H,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и

где длина последовательности гибридизации H репортерного олигонуклеотида представляет собой n'', при этом n'' ≥ n + 1 или n'' ≥ n + 2;

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться со второй цепью первого и второго ампликона, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними.

18. Репортерный олигонуклеотид по п. 17, где репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца.

19. Репортерный олигонуклеотид по п. 17, где репортерный олигонуклеотид включает первый гаситель на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца.

20. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пп. 17-19, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

21. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пп. 17-20, отличающийся тем, что

по меньшей мере, один из указанных гидрофобных нуклеотидов расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один из указанных гидрофобных нуклеотидов расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q,

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор.

22. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пп. 17-21, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, предпочтительно при этом хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в п. 5.

23. Способ прогнозирования эффективности лечения клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта предварительно определенным лекарством, при этом эффективность лечения указанного клинического состояния указанным лекарством ассоциирована с присутствием варианта последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) получение образца от указанного субъекта

b) реализацию способа по любому одному из пп. 1-12 для определения присутствия указанного варианта последовательности;

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, является ли указанное лекарство эффективным в плане лечения указанного клинического состояния у указанного субъекта.

24. Способ прогнозирования наличия клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанное клиническое состояние ассоциировано с присутствием последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) получение образца от указанного субъекта;

b) реализацию способа по любому одному из пп. 1-12 для определения присутствия варианта последовательности;

при этом присутствие варианта последовательности свидетельствует о том, что указанный субъект имеет указанное клиническое состояние.