ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Область изобретения относится к способам получения композиций, пригодных для снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Метан (СН4) представляет собой парниковый газ (ПГ), образуемый преимущественно метаногенными микроорганизмами, которые встречаются в природных экосистемах (например, водно-болотных угодьях, океанах и озерах) и желудочно-кишечном тракте беспозвоночных и позвоночных, таких как термиты и жвачные животные. Каждый год ~429-507 Тг СН4 удаляется из атмосферы и ~40 Тг из стратосферы вследствие реакций с гидроксильными (ОН) радикалами; и ~30 Тг окисляющими СН4 бактериями в почве.
Однако антропогенные выбросы парниковых газов быстро увеличиваются, при этом концентрация CH4 в атмосфере в настоящее время более чем в два раза выше, чем в начале 1800-х годов. Метан очень эффективно поглощает солнечное инфракрасное излучение и обладает потенциалом глобального потепления в 25 раз большим, чем CO2. Следовательно, его накопление в атмосфере в значительной степени способствует изменению климата. К одному из основных источников антропогенного CH4 можно отнести сельскохозяйственную деятельность, включающую разведение жвачных животных.
Согласно недавнему отчету ООН, скотоводство продуцирует больше парниковых газов, вызывающих глобальное потепление, в эквиваленте CO2, чем транспорт. В Австралии, по оценкам, на долю жвачных животных приходится ~10% от общего объема выбросов парниковых газов. Жвачные животные продуцируют CH4 в качестве побочного продукта анаэробной микробиологической ферментации кормов в рубце и в меньшей степени в толстом кишечнике. Сообщество микроорганизмов рубца очень разнообразно и состоит из бактерий, простейших, грибов и бактериофагов, которые действуют коллективно, ферментируя потребляемое органическое вещество (ОВ), в результате чего образуются СО2, Н2, летучие жирные кислоты (ЛЖК) и формиаты. Метаногенные археи, присутствующие в рубце, используют эти конечные продукты и продуцируют CH4. Несмотря на то, что продуцирование CH4 снижает парциальное давление H2, которое в противном случае могло бы ингибировать ферментацию в рубце, оно также снижает количество энергии и углерода, доступных для образования ЛЖК, необходимых для питания жвачных животных. Большая часть CH4, продуцируемого жвачными животными, выдыхается и отрыгивается животными и представляет собой потерю до 12% от общего потребления энергии.
Стратегии снижения риска, сокращающие образование CH4 в кишечнике, важны, и способы снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных представляют собой серьезную проблему.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения масляной композиции Asparagopsis, указанный способ включает стадии: обеспечения биомассы Asparagopsis; обеспечения, по меньшей мере, одного масла; и контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом в условиях экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного вещества из биомассы, по меньшей мере, в одно масло с образованием масляной композиции Asparagopsis.
В одном варианте осуществления способа стадия контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом может включать гомогенизацию биомассы, по меньшей мере, в одном масле. В другом варианте осуществления способа биомассу можно отделить, по меньшей мере, от одного масла после стадии контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом.
В другом аспекте способа соотношение биомассы (в граммах) и, по меньшей мере, одного масла (в миллилитрах) может составлять более 0,3:1. В одном варианте осуществления соотношение биомассы (в граммах) и, по меньшей мере, одного масла (в миллилитрах) может составлять более 0,6:1.
В другом варианте осуществления соотношение биомассы (в граммах) и, по меньшей мере, одного масла (в миллилитрах) может составлять более 0,9:1. В другом варианте осуществления соотношение биомассы (в граммах) и, по меньшей мере, одного масла (в миллилитрах) может составлять более 1,2:1.
В другом аспекте способа условия экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного вещества из биомассы, по меньшей мере, в одно масло могут выполняться в течение, по меньшей мере, 1 дня. В одном варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 2 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 3 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 4 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 5 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 6 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 7 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 8 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 9 дней. В другом варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 10 дней. В еще одном варианте осуществления экстрагирование проводят в течение 11 дней.
В другом аспекте способа условия экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного вещества из биомассы, по меньшей мере, в одно масло могут выполняться при температуре около 4°C.
В одном варианте осуществления способа перед стадией отделения биомассы, по меньшей мере, от одного масла биомассу, контактирующую, по меньшей мере, с одним маслом, можно нагревать. В этом варианте осуществления нагревание проводят таким образом, что гель, который может содержать, по меньшей мере, одно биологически активное вещество, высвобождает, по меньшей мере, одно биологически активное вещество, по меньшей мере, в одно масло. В одном варианте осуществления нагревание можно проводить при температуре 60°C. В приведенных выше вариантах осуществления нагревание можно проводить в течение одного часа.
В одном аспекте настоящего изобретения биомасса Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis taxiformis. В другом аспекте биомасса Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis armata. В другом аспекте биомасса Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis taxiformis и Asparagopsis armata.
В одном варианте осуществления способа стадия обеспечения биомассы Asparagopsis не включает сушку биомассы на воздухе. В другом варианте осуществления стадия обеспечения биомассы Asparagopsis включает введение биомассы, по меньшей мере, в одно масло.
В другом аспекте, по меньшей мере, одно масло включает пищевое масло. В одном варианте осуществления пищевое масло можно выбирать из группы, состоящей из миндального масла, абрикосового масла, арганового масла, масла авокадо, масла бразильского ореха, канолового масла, масла кешью, кокосового масла, сурепного масла, кукурузного масла, масла копры, хлопкового масла, диацилглицеринового масла, льняного масла, масла косточек грейпфрута, виноградного масла, масла фундука, конопляного масла, лимонного масла, масла льняных семян, масла макадамии, горчичного масла, оливкового масла, апельсинового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, арахисового масла, масла ореха пекан, масла кедрового ореха, фисташкового масла, масла семян тыквы, рапсового масла, масла рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла, подсолнечного масла, масла грецкого ореха и растительного масла или любой их комбинации.
В другом аспекте, по меньшей мере, одно биологически активное вещество может представлять собой антиметаногенный компонент. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одно биологически активное вещество можно выбирать из группы, состоящей из бромхлоруксусной кислоты (BCA), бромоформа (BF), дибромуксусной кислоты (DBA) и дибромхлорметана (DBCM). В другом варианте осуществления антиметаногенный компонент представляет собой BF. В другом варианте осуществления антиметаногенный компонент представляет собой DBCM. В другом варианте осуществления антиметаногенные компоненты представляют собой BF и DBCM.
В другом аспекте концентрация, по меньшей мере, одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы, по меньшей мере, в одно масло, увеличивается по сравнению с концентрацией, по меньшей мере, одного биологически активного вещества, экстрагированного из эквивалентного количества биомассы в воду. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одно биологически активное вещество представляет собой антиметаногенный компонент, где концентрация антиметаногенного компонента, экстрагированного из биомассы, по меньшей мере, в одно масло, не снижается более чем на 20% после хранения в течение 65 недель при 25°C, при этом, по меньшей мере, один антиметаногенный компонент представляет собой BF и/или DBCM.
В одном варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы, по меньшей мере, в одно масло, существенно не снижается после хранения в течение 12 недель при 25°C. В другом варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы, по меньшей мере, в одно масло, существенно не снижается после хранения в течение 65 недель при 4°C.
В другом аспекте масляная композиция Asparagopsis, полученная данным способом, содержит, по меньшей мере, 0,1 миллиграмма бромоформа на миллилитр экстракта. В одном варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis, полученная данным способом, содержит, по меньшей мере, 1 миллиграмм бромоформа на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis, полученная данным способом, содержит, по меньшей мере, 2 миллиграмма бромоформа на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis, полученная данным способом, содержит, по меньшей мере, 3 миллиграмма бромоформа на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis, полученная данным способом, содержит, по меньшей мере, 4 миллиграмма бромоформа на миллилитр экстракта.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к масляной композиции Asparagopsis, содержащей, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, один антиметаногенный компонент. В одном варианте осуществления Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis taxiformis. В другом варианте осуществления Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis armata. В другом варианте осуществления Asparagopsis может представлять собой Asparagopsis taxiformis и Asparagopsis armata.
В приведенных выше вариантах осуществления, по меньшей мере, одно масло может содержать пищевое масло. В этом варианте осуществления пищевое масло можно выбирать из группы, состоящей из миндального масла, абрикосового масла, арганового масла, масла авокадо, масла бразильского ореха, канолового масла, масла кешью, кокосового масла, сурепного масла, кукурузного масла, масла копры, хлопкового масла, диацилглицеринового масла, льняного масла, масла косточек грейпфрута, масла виноградных косточек, масла фундука, конопляного масла, лимонного масла, масла льняных семян, масла макадамии, горчичного масла, оливкового масла, апельсинового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, арахисового масла, масла ореха пекан, масла кедрового ореха, фисташкового масла, масла семян тыквы, рапсового масла, масла рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла, подсолнечного масла, масла грецкого ореха и растительного масла или любой их комбинации.
В другом аспекте масляной композиции Asparagopsis, по меньшей мере, один антиметаногенный компонент можно выбирать из группы, состоящей из бромхлоруксусной кислоты (BCA), бромоформа (BF), дибромуксусной кислоты (DBA) и дибромхлорметана (DBCM).
В одном варианте осуществления масляной композиции Asparagopsis концентрация, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента существенно не снижается после хранения в течение 12 недель при 25°C. В другом варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента существенно не снижается после хранения в течение 65 недель при 4°C. В другом варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента не снижается более чем на 20% после хранения в течение 65 недель при 25°C. В приведенных выше вариантах осуществления, по меньшей мере, один антиметаногенный компонент может представлять собой BF и/или DBCM. В другом варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента не снижается более чем на 50% после хранения в течение 65 недель при 4°C или 25°C. В этом варианте осуществления, по меньшей мере, один антиметаногенный компонент может представлять собой DBA.
В одном варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis может иметь концентрацию, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента, по меньшей мере, 0,1 миллиграмм на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis может иметь концентрацию, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента, по меньшей мере, 1 миллиграмм на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis может иметь концентрацию, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента, по меньшей мере, 2 миллиграмма на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis может иметь концентрацию, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента, по меньшей мере, 3 миллиграмма на миллилитр экстракта. В другом варианте осуществления масляная композиция Asparagopsis может иметь концентрацию, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента, по меньшей мере, 4 миллиграмма на миллилитр экстракта.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к кормовой добавке для снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, указанная добавка содержит эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к корму для жвачных животных, где указанный корм обогащают кормовой добавкой, как описано здесь.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, включающий введение указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь. В одном варианте осуществления способ может включать поддержание эффективной концентрации требуемой летучей жирной кислоты. В этом варианте осуществления требуемая летучая жирная кислота может включать ацетат и пропионат, и при этом поддержание включает снижение соотношения ацетата к пропионату. В другом варианте осуществления способ может включать поддержание концентрации расщепленного органического вещества и/или сухого вещества.
В другом аспекте способа масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 3% органического вещества, вводимого жвачным животным. В одном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 2% органического вещества, вводимого жвачному животному. В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 0,5% органического вещества, вводимого жвачному животному. В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 0,25% органического вещества, вводимого жвачному животному. В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis может вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 0,125% органического вещества, вводимого жвачному животному. В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis можно вводить в дозе, эквивалентной, по меньшей мере, 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному.
В другом аспекте вышеуказанного способа жвачное животное можно выбирать из представителей подотрядов жвачные (Ruminantia) и мозоленогие (Tylopoda). В одном варианте осуществления этого аспекта жвачным животным может быть крупный рогатый скот или овца. В другом варианте осуществления жвачное животное представляет собой крупный рогатый скот.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показано количество биологически активного вещества, бромоформа (антиметаногенного компонента), в композициях, приготовленных экстрагированием биомассы Asparagopsis в масло или воду, включая композиции, приготовленные гомогенизацией биомассы A. taxiformis в масле или воде («измельченная»), или негомогенизированной биомассы в масле или воде («интактная») в течение 1, 3, 5, 7 и 10 дней. Каменный уголь представляет стандартный метод экстрагирования с использованием лиофилизированной биомассы, вымоченной в метаноле в течение 72 часов. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.2 показана потеря (%) биологически активного вещества, бромоформа (антиметаногенного компонента), в композиции при хранении в различных условиях в течение 6 месяцев: при условиях окружающей среды (25°C±10°C); в кондиционируемом помещении; в холодильнике при 4°C; и в морозильной камере при -20°C. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.3 показано удерживание биологически активного вещества, бромоформа (антиметаногенного компонента), в композициях, полученных экстрагированием биомассы Asparagopsis в масло или воду, включая композиции, полученные гомогенизацией биомассы A. taxiformis в масло или воду («измельченная») или негомогенизированной биомассы в масле или воде («интактная») при t=0 и через 4, 8, 12 и 65 недель хранения (при 4°C или 25°C). Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.4 показано удерживание биологически активного вещества, DBCM (антиметаногенного компонента), в композициях, полученных экстрагированием интактной биомассы Asparagopsis в масло, при t=0 и через 4, 8, 12 и 65 недель хранения (при или 4°C; «Холодильник» или 25°C; «RT»). Приведено соотношение DBCM:нафталин (IS) в масле. Столбцы с одинаковыми надстрочными буквами существенно не отличаются. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.5 показано удерживание биологически активного вещества, DBCM (антиметаногенного компонента), в композициях, приготовленных экстрагированием биомассы Asparagopsis в масло, приготовленных гомогенизацией биомассы A. taxiformis в масле, при t=0 и через 4, 8, 12 и 65 недель хранения (при 4°C; «Холодильник» или 25 °C; «RT»). Приведено соотношение DBCM:нафталин (IS) в масле. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3. Эти данные не показывают статистических различий в соотношениях DBCM:IS.
На фиг.6 показано количество биологически активного вещества, DBA, в композициях, приготовленных экстрагированием интактной биомассы Asparagopsis в масло в течение 10 дней с последующим текущим хранением (неделя 0) при указанных температурах (25°C/«RT» или 4°C/«Холодильник»). Приведено соотношение DBA:нафталин (IS) в масле. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.7 показано количество биологически активного вещества, DBA, в композициях, приготовленных экстрагированием гомогенизированной биомассы Asparagopsis в масло в течение 10 дней с последующим текущим хранением (неделя 0) при указанных температурах (25°C/«RT» или 4°C/«Холодильник»). Приведено соотношение DBA:нафталин (IS) в масле. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.8 показано количество биологически активного вещества, бромоформа (антиметаногенного компонента), экстрагированного в масло с использованием различных количеств биомассы, гомогенизированной в одном и том же объеме масла. Нагревание гелеобразных образцов способствовало выделению биологически активного вещества в масляную фракцию, которую можно было отделить от геля. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
На фиг.9 показаны концентрации (мг/г сухого веса биомассы) биологически активного вещества, бромоформа (антиметаногенного компонента), в композициях, приготовленных экстрагированием биомассы Asparagopsis в масло гомогенизацией биомассы A. taxiformis в масле с использованием различных количеств биомассы гомогенизированной в том же объеме масла. Нагревание гелеобразных образцов способствовало выделению биологически активного вещества в масляную фракцию, которую можно было отделить от геля. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка, n=3.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам получения биологически активных масляных композиций Asparagopsis, включая масляные композиции Asparagopsis, подходящие для снижения общего образования газа (TGP) и/или образования метана (CH4) жвачным животным. В частности, авторы настоящего изобретения показали, что можно получить масляные композиции Asparagopsis, содержащие галогенированные вторичные метаболиты с биоактивными свойствами, и, что важно, авторы настоящего изобретения также показали, что концентрации галогенированных вторичных метаболитов в масляных композициях Asparagopsis стабильны в течение длительных периодов времени.
На фиг.1 показано, что масляные композиции Asparagopsis, содержащие биологически активную молекулу, можно получить контактированием биомассы Asparagopsis с маслом, и что концентрации биологически активного вещества повышаются гомогенизацией биомассы в масле. На фиг.3 показано, что масляные композиции Asparagopsis, полученные контактированием биомассы Asparagopsis с маслом, с гомогенизацией или без нее, сохраняют высокие концентрации биологически активного вещества в течение длительных периодов времени при хранении или при комнатной температуре (25°C), или при 4°C.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения масляной композиции Asparagopsis, указанный способ включает стадии:
(а) обеспечения биомассы Asparagopsis;
(b) обеспечения, по меньшей мере, одного масла; а также
(c) контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом в условиях экстрагирования, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента из биомассы, по меньшей мере, в одно масло.
Asparagopsis имеет гетероморфный цикл развития с двумя фазами свободноживущего цикла развития - гаметофит (макроталломная форма) и спорофит (или тетраспорофит - более мелкая, нитчатая форма). Исторически тетраспорофит был признан отдельным родом (Falkenbergia). Следовательно, используемый здесь термин «Asparagopsis» относится к роду Asparagopsis и другим таксономическим классификациям, которые в настоящее время известны как принадлежащие к роду Asparagopsis.
Существует, по меньшей мере, два признанных вида Asparagopsis, один тропический/субтропический (Asparagopsis taxiformis) и один умеренный (Asparagopsis armata), которые встречаются по всему миру.
В одном варианте осуществления вид Asparagopsis выбирают из Asparagopsis taxiformis или Asparagopsis armata.
В другом аспекте биомасса, по меньшей мере, одного вида красных морских макроводорослей, выбранных из видов, принадлежащих к другим родам красных морских водорослей семейства Bonnemaisoniaceae, к которому принадлежит Asparagopsis (например, Bonnemaisonia, Delisea, Ptilonia, Leptophyllis и Pleuroblepharidella) используется вместо биомассы Asparagopsis в способах и композициях, представленных здесь. Не желая быть связанными теорией, шесть родов красных морских водорослей семейства Bonnemaisoniaceae (например, Asparagopsis, Bonnemaisonia, Delisea, Ptilonia, Leptophyllis и Pleuroblepharidella) продуцируют и накапливают биологически активные галогенированные вторичные метаболиты с биологически активными свойствами, включая описанные здесь антиметаногенные соединения.
Используемый здесь термин «обеспечение биомассы» включает предоставление или использование биомассы Asparagopsis, удаленной из воды непосредственно перед контактированием биомассы, по меньшей мере, с одним маслом. В одном варианте осуществления биомассу Asparagopsis получают из окружающей среды и помещают непосредственно, по меньшей мере, в одно масло. В другом варианте осуществления биомасса Asparagopsis контактирует, по меньшей мере, с одним маслом в течение 5, 4, 3, 2 или 1 часа с момента удаления биомассы из окружающей среды.
В одном варианте осуществления воду удаляют из биомассы высушиванием промоканием биомассы до контакта биомассы, по меньшей мере, с одним маслом.
В одном варианте осуществления биомасса Asparagopsis не является лиофилизированной биомассой Asparagopsis.
В другом варианте осуществления биомасса Asparagopsis не является высушенной на воздухе биомассой Asparagopsis.
Используемый здесь термин «по меньшей мере, одно масло» включает один вид масла, или композиции, содержащие один вид масла, или смесь двух или более масел, или композицию, содержащую смесь двух или более масел. По меньшей мере, одно масло включает масло, подходящее для применения, введения или кормления животного.
В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одно масло представляет собой пищевое масло.
В одном варианте осуществления пищевое масло выбирают из группы, состоящей из миндального масла, абрикосового масла, арганового масла, масла авокадо, масла бразильского ореха, канолового масла, масла кешью, кокосового масла, сурепного масла, кукурузного масла, масла копры, хлопкового масла, диацилглицеринового масла, льняного масла, масла косточек грейпфрута, масла виноградных косточек, масла фундука, конопляного масла, лимонного масла, масла льняных семян, масла макадамии, горчичного масла, оливкового масла, апельсинового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, арахисового масла, масла ореха пекан, масла кедрового ореха, фисташкового масла, масла семян тыквы, рапсового масла, масла рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла, подсолнечного масла, масла грецкого ореха и растительного масла или любой их комбинации.
Используемый здесь термин «масло» означает любое неполярное гидрофобное вещество, которое обычно представляет собой жидкость при температуре и давлении окружающей среды. Масла могут быть получены из животных, овощей или нефтехимических продуктов и обычно имеют высокое содержание углерода и водорода. Масло предпочтительно представляет собой пищевое масло и предпочтительно переваривается жвачным животным. Обычно масло растительного происхождения экстрагируется из семян или плодов растений и обычно преимущественно состоит из триглицеридов. Термин «растительное масло» является общим термином, указывающим на то, что масло имеет преимущественно или исключительно растительное происхождение и может включать смесь одного или более масел растительного происхождения или различного происхождения.
Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что биологически активные вещества быстро экстрагируются из биомассы Asparagopsis в масло. Например, на фиг.1 показано, что в течение 24 часов концентрации бромоформа, экстрагированного из гомогенизированной смеси биомассы/масла, превышают концентрации бромоформа, экстрагированного из лиофилизированной биомассы с использованием метанола. На фиг.1 также показано, что в течение 72 часов концентрация бромоформа, экстрагированного из негомогенизированной смеси биомассы/масла, является такой же, как концентрация бромоформа, экстрагированного из лиофилизированной биомассы. На фиг.1 также показано, что в течение 120 часов концентрации бромоформа, экстрагированного из негомогенизированной смеси биомассы/масла, превышают концентрации бромоформа, экстрагированного из лиофилизированной биомассы с использованием метанола.
Используемый здесь термин «контактирование» включает смешивание биомассы, по меньшей мере, с одним маслом с образованием смеси биомассы/масла и выдерживание смеси биомассы/масла в течение периода времени и при температуре, подходящих для экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного вещества из биомассы в масло смеси биомасса/масло.
Термин контактирование включает выдерживание масляной смеси биомассы при различных подходящих температурах.
Температура, при которой биомасса может контактировать, по меньшей мере, с одним маслом, не ограничена, поскольку антиметаногенный компонент значительно не испаряется/возгоняется из масла и/или значительно не разлагается при температуре, при которой происходит контактирование. Температуру можно выбирать из группы, состоящей из интервалов от -78°C до -50°C, от -50°C до -20°C, от -20°C до -5°C, от -5°C до 0°C, от -5°C до 4°C, от 0°C до 4°C, от 4°C до 10°C, от 10°C до 20°C, от 20°C до 25°C, от 25°C до 30°C, от 30°C до 40°C, от 40°C до 50°C, от 50°C до 60°C, от 60°C до 70°C, от 70°C до 80°C, от 80°C до 90°C и от 90°C до 100°C. В некоторых вариантах осуществления температуру можно выбирать из группы, состоящей из -78°C, -20°C, -5°C, 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C и 30°C. В одном варианте осуществления температура предпочтительно составляет около 4°C. В другом варианте осуществления температура предпочтительно составляет около 25°C. Подходящие температуры можно достигать с использованием морозильников, холодильников, кондиционеров и тому подобного.
Используемый здесь термин «комнатная температура» применяется для обозначения нормальной температуры окружающей среды. Как понятно специалисту в данной области, условия окружающей среды будут отличаться в зависимости от географического положения и времени года таким образом, что комнатные температуры могут изменяться от ниже нуля по Цельсию до выше 40°C. Обычно считается, что комнатная температура находится в диапазоне от около 20°C до около 25°C, а для целей экспериментов, проведенных в Таунсвилле, штат Квинсленд, комнатная температура была принята равной около 25°C.
Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что при контактировании большого количества биомассы Asparagopsis с относительно небольшим объемом масла происходит образование геля, который препятствует экстрагированию одного или более биологически активных веществ в масло. Для увеличения выхода экстрагированного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента гель и/или биомассу, и/или масло можно нагревать для высвобождения большего количества, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, по меньшей мере, в одно масло. Например, на фиг.8 и 9 показано, что нагревание образца биомассы, контактирующей, по меньшей мере, с одним маслом, при температуре 60°C в течение 1 часа, приводило к увеличению на 20% количества биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, экстрагированного в масло, по сравнению с не подвергнутыми нагреванию образцами (смотри данные для «120 г+нагревание» в сравнении с «120 г» на фиг.8 и 9).
Температура, при которой биомассу, контактирующую, по меньшей мере, с одним маслом, можно нагревать для высвобождения, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, по меньшей мере, в одно масло, не ограничена, поскольку, по меньшей мере, один биологически активный (например, антиметаногенный) компонент значительно не испаряется/возгоняется из масла и/или значительно не разлагается при температуре, при которой происходит нагревание. Температуру можно выбирать из группы, состоящей из интервалов от 25°C до 30°C, от 30°C до 40°C, от 40°C до 50°C, от 50°C до 60°C, от 60°C до 70°C, от 70°C до 80°C, от 80°C до 90°C и от 90°C до 100°C. В некоторых вариантах осуществления температуру можно выбирать из группы, состоящей из 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. В одном варианте осуществления температура предпочтительно составляет около 60°C.
Время, в течение которого биомассу, контактирующую, по меньшей мере, с одним маслом, можно нагревать до высвобождения, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, по меньшей мере, в одно масло, не ограничено, поскольку, по меньшей мере, один биологически активный (например, антиметаногенный) компонент значительно не испаряется/возгоняется из масла и/или значительно не разлагается при нагревании. Период времени можно выбирать из группы, состоящей из интервалов от 1 секунды до 1 минуты, от 1 минуты до 2 минут, от 2 минут до 5 минут, от 5 минут до 10 минут, от 10 минут до 20 минут, от 20 минут до 30 минут, от 30 минут до 40 минут, от 40 минут до 50 минут, от 50 минут до 60 минут, от 60 минут до 70 минут, от 70 минут до 80 минут, от 80 минут до 90 минут, от 1,5 часов до 2 часов, от 2 часов до 3 часов, от 3 часов до 4 часов и от 4 часов до 5 часов. В некоторых вариантах осуществления период времени можно выбирать из группы, состоящей из 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут, 40 минут, 50 минут, 1 часа, 2 часов и 3 часов. В одном варианте осуществления период времени, в течение которого биомассу, контактирующую, по меньшей мере, с одним маслом, нагревают, предпочтительно составляет около 1 часа.
Если смесь биомассы/масла не нагревается для высвобождения, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, по меньшей мере, в одно масло, то время, в течение которого биомасса может находиться в контакте, по меньшей мере, с одним маслом в условиях экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента из биомассы, по меньшей мере, в одно масло, не ограничено особым образом. Как понятно специалисту в данной области, предпочтительно концентрация, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента в масле достигает или почти достигает равновесного уровня, вследствие чего количество, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенный) компонента, по меньшей мере, в одном масле будет максимальным. Таким образом, контактирование биомассы, по меньшей мере, с одним маслом в условиях экстрагирования, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента из биомассы, по меньшей мере, в одно масло можно проводить в течение периода, выбранного из группы, состоящей из интервалов от 1 минуты до 1 часа, от 1 часа до 2 часов, от 2 часов до 3 часов, от 3 часов до 4 часов, от 4 часов до 5 часов, от 5 часов до 6 часов, от 6 часов до 12 часов, от 12 часов до 24 часов, от 1 дня до 2 дней, от 2 дней до 3 дней, от 3 дней до 4 дней, от 4 дней до 5 дней, от 5 дней до 6 дней, от 6 дней до 7 дней, от 7 дней до 8 дней, от 8 дней до 9 дней, от 9 дней до 10 дней, от 10 дней до 14 дней, от 2 недель до 3 недель и от 3 недель до 1 месяца. В некоторых вариантах осуществления контактирование можно проводить в течение периода, выбранного из группы, состоящей из 1 минуты, 2 минут, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 5 часов, 10 часов, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней и 2 недель. В некоторых вариантах осуществления контактирование можно проводить в течение периода, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 4, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.
Стадия контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом может также включать гомогенизацию биомассы, по меньшей мере, в одном масле. Используемый здесь термин «гомогенизация» означает расщепление биомассы для облегчения высвобождения, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента из биомассы, который затем можно экстрагировать, по меньшей мере, в одно масло. Гомогенизацию можно осуществлять любыми способами, известными в данной области, такими как дробление, перемалывание, измельчение, смешивание, резка, нарезание ломтиками или нарезание кубиками.
В одном варианте осуществления гомогенизацию можно проводить для получения гомогенной смеси, в результате чего облегчается равномерное распределение биомассы, биологически активного вещества и/или масла в композиции, в источнике корма для животного.
В одном варианте осуществления биологически активное вещество представляет собой вещество, которое оказывает биологическое действие на животное, предпочтительно жвачное животное. Биологическое воздействие может быть любым воздействием на поведение или физиологию животного или может даже влиять на микроорганизмы внутри указанного животного. Например, биологическое воздействие может заключаться в ингибировании метаногенеза. Биологически активное вещество, ответственное за ингибирование метаногенеза, не ограничено особым образом, и предназначено для включения всех веществ, которые ингибируют метаногенез, в том числе, но не ограничиваясь ими, вторичные метаболиты. Asparagopsis продуцирует вторичные метаболиты, включая галогенированные низкомолекулярные соединения, в частности бромированные и хлорированные галоформы. Многие из этих соединений обладают сильными антимикробными свойствами и подавляют жизнедеятельность широкого спектра микроорганизмов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также микобактерии и грибы, и поэтому могут участвовать в содействии описанному здесь воздействию. Вторичные метаболиты Asparagopsis также подавляют простейших.
В одном варианте осуществления биологически активное вещество представляет собой вещество, которое снижает общее образование газа (TGP), и/или вещество, которое снижает метан, продуцируемый жвачным животным.
Используемый здесь термин «снижение» включает снижение количества вещества по сравнению с эталоном. Например, снижение общего количества газа и/или метана, продуцируемых жвачным животным или животными, которым вводили масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, по сравнению с животным или животными, которым не вводили композицию, содержащую масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь. Снижение можно измерить in vitro с использованием системы искусственного рубца, имитирующей анаэробную ферментацию, или in vivo с использованием животных, содержащихся в дыхательных камерах. Оценка метаногенеза в кишечнике жвачных животных находится в пределах знаний и компетентности специалистов в данной области.
Используемый здесь термин «снижение общего образования газа» относится к снижению общего количества продуцируемого газа, например, общего количества газа, продуцируемого в желудочно-кишечном тракте. Термин включает совокупный объем всех газов, образующихся в результате анаэробной ферментации, например, в описанных здесь системах. Ферментация в рубце и кишечнике жвачного животного приводит к образованию газа, в том числе метана. Целью настоящего изобретения является снижение этого процесса, например, снижение общего количества газа, продуцируемого в желудочно-кишечном тракте. Оценка общего образования газа жвачным животным находится в пределах знаний и компетентности специалистов в данной области.
Используемый здесь термин «снижение образования метана» относится к снижению образования метана в желудочно-кишечном тракте. Термин включает удельный объем метана, образующегося в результате анаэробной ферментации, например, в описанных здесь системах. Ферментация в рубце и кишечнике жвачного животного приводит к образованию метана. Целью настоящего изобретения является снижение этого процесса, например, снижение общего количества метана, продуцируемого в желудочно-кишечном тракте. Оценка образования метана жвачным животным находится в пределах знаний и компетентности специалистов в данной области.
Используемый здесь термин «анаэробная ферментация» означает анаэробную ферментацию in vivo, например, у жвачного животного.
Используемый здесь термин «антиметаногенный компонент» означает любое биологически активное соединение, которое ингибирует метаногенез у жвачного животного. Такие соединения обычно представляют собой галогенированные вторичные метаболиты, включая, по меньшей мере, следующие: бромхлоруксусную кислоту, бромхлорметан, 2-бромэтансульфоновую кислоту, хлоралгидрат, хлороформ, йодпропан, бромоформ (BF), дибромуксусную кислоту (DBA) и дибромхлорметан (DBCM).
Например, авторы настоящего изобретения продемонстрировали на фиг.4, 5, 6 и 7, что масляные композиции Asparagopsis, содержащие дибромхлорметан (DBCM) и/или дибромуксусную кислоту (DBA), можно получить контактированием биомассы Asparagopsis с маслом посредством гомогенизации. Высокие концентрации биологически активного вещества экстрагируются в масло, и, как показано для DBCM, эти концентрации поддерживаются в течение продолжительных периодов времени при хранении или при комнатной температуре (RT), или при 4°C (холодильник).
В одном варианте осуществления антиметаногенный компонент выбирают из группы, состоящей из бромхлоруксусной кислоты (BCA), бромоформа (BF), дибромуксусной кислоты (DBA) и дибромхлорметана (DBCM).
В одном варианте осуществления после контактирования биомассы, по меньшей мере, с одним маслом в условиях экстрагирования, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента из биомассы, по меньшей мере, в одно масло указанную биомассу отделяют от указанного, по меньшей мере, одного масла. Отделение биомассы, по меньшей мере, от одного масла можно осуществлять любым способом, известным в данной области. Способы отделения включают, но не ограничиваются ими, центрифугирование, декантацию, фильтрование, перегонку или использование делительной воронки или других эквивалентных способов.
Количества биомассы и, по меньшей мере, одного масла, которые контактируют, могут изменяться таким образом, чтобы изменить количество, по меньшей мере, одного биологически активного вещества, экстрагированного, по меньшей мере, в одно масло.
Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что количества, по меньшей мере, одного биологически активного вещества можно регулировать изменением соотношения биомассы Asparagopsis, по меньшей мере, к одному маслу. Например, на фиг.8 и 9 показано, что концентрации бромоформа можно повысить увеличением соотношения биомассы Asparagopsis по отношению к, меньшей мере, одному маслу.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления соотношение биомассы, по меньшей мере, к одному маслу можно выбирать из группы, состоящей из 0,01 г:1 мл, 0,05 г:1 мл, 0,1 г:1 мл, 0,2 г:1 мл, 0,3 г:1 мл, 0,4 г:1 мл, 0,5 г:1 мл, 0,6 г:1 мл, 0,7 г:1 мл, 0,8 г:1 мл, 0,9 г:1 мл, 1 г:1 мл, 1,1 г:1 мл, 1,2 г:1 мл, 1,3 г:1 мл, 1,4 г:1 мл и 1,5 г:1 мл. Предпочтительно соотношение биомассы, по меньшей мере, к одному маслу выбирают из группы, состоящей из более чем 0,3 г:1 мл, более чем 0,6 г:1 мл, более чем 0,9 г:1 мл и более чем 1,2 г:1 мл.
В одном варианте осуществления изобретения предлагается масляная композиция Asparagopsis, полученная описанными здесь способами.
Авторы настоящего изобретения ранее показали, что лиофилизированные измельченные виды Asparagopsis могут эффективно снижать общее образование газа и образование метана in vivo у крупного рогатого скота по сравнению с положительным контролем очищенными семенами хлопчатника (DCS). Важно отметить, что очищенные семена хлопчатника используют в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота, поскольку они значительно снижают образование CH4 по сравнению с другими высокоэнергетическими зернами. Снижение общего образования газа по сравнению с DCS было одинаковым для разных видов, указывая на то, что макроводоросли, такие как Asparagopsis, снижают продуцирование TGP и CH4 у жвачных животных по сравнению с высокоэнергетическими зернами, а некоторые макроводоросли снижают продуцирование TGP и CH4 у жвачных животных по сравнению с положительным контролем DCS. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что образование CH4 в целом происходит по той же схеме, что и TGP.
Соответственно, в одном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, полученную описанными здесь способами, можно использовать для снижения общего количества образующегося газа и/или метана, продуцируемого жвачным животным.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачного животного, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis по настоящему изобретению.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения общее количество образующегося газа снижается, по меньшей мере, на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% или 10% по сравнению с контролем. В одном варианте осуществления контроль представляет собой общее количество газа, образующегося в случае, когда животным не вводят эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь. В другом варианте осуществления контроль представляет собой количество общего газа, образующегося при введении животным очищенных семян хлопчатника. В другом варианте осуществления контроль представляет собой общее количество газа, образующегося в случае, когда очищенные семена хлопчатника подвергают анаэробной ферментации in vitro.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения количество образующегося метана снижается, по меньшей мере, на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% или 10% по сравнению с контролем. В одном варианте осуществления контроль представляет собой количество метана, образующегося в случае, когда животным не вводят эффективное количество масляной композиции Asparagopsis. В другом варианте осуществления контроль представляет собой количество метана, образующегося при введении животным очищенных семян хлопчатника. В другом варианте осуществления контроль представляет собой количество метана, образующегося при введении животным гранулированного имеющегося на рынке поставляемого рациона на основе люпина, овса, ячменя, пшеницы с соломой зерновых культур в качестве грубого компонента [химический состав (г/кг СВ) золы, 72 ; сырой протеин (СП) 112; нейтральная детергентная клетчатка (aNDFom) 519; кислотное детергентная клетчатка (ADFom) 338 и без кобальта, селена и рубцовых модификаторов] с дополнительным количеством измельченного люпина, называемого здесь «люпиновый рацион». В другом варианте осуществления контроль представляет собой количество метана, образующегося в случае, когда люпиновый рацион подвергают анаэробной ферментации in vitro.
В одном варианте осуществления количество метана, образующегося при ферментации в рубце in vitro, снижается, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с количеством метана, образующимся в случае, когда очищенные семена хлопчатника подвергают ферментации в рубце in vitro.
В одном варианте осуществления количество образующегося метана снижается, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с количеством метана, образующимся при введении жвачному животному очищенных семян хлопчатника.
Авторы настоящего изобретения также ранее продемонстрировали, что высушенный на воздухе измельченный Asparagopsis может эффективно снижать продуцирование метана по сравнению с положительным контролем люпиновым рационом у овец.
В одном варианте осуществления количество образующегося метана снижается, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с количеством метана, образующимся при введении жвачному животному люпинового рациона.
Под «эффективным количеством» подразумевается количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, достаточное для обеспечения улучшения, например, снижения количества образующегося метана по сравнению с эталоном или контролем, снижения общего количества образующегося газа по сравнению с эталоном или контролем, поддержания эффективной концентрации одной или более требуемых летучих жирных кислот по сравнению с эталоном или контролем, снижения соотношения ацетата к пропионату по сравнению с эталоном или контролем, поддержания живой массы, потребления сухого вещества и/или потребления органического вещества по сравнению с эталоном или контролем. В соответствии со смыслом настоящего изобретения сниженное воздействие метана можно измерить в рубце с использованием системы искусственного рубца, такой как описанная в T. Hano, J. Gen. Appl. Microbiol., 1993, 39, 35-45, или посредством перорального введения in vivo жвачным животным.
Следовательно, в одном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 16,67, 10, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному.
Для расчета объема масла, необходимого для достижения дозы, эквивалентной требуемой концентрации в % органического вещества, вводимого жвачным животным, количество в % органического вещества в масляных композициях Asparagopsis, описанных здесь, рассчитывают исходя из сырого веса (fw) биомассы Asparagopsis, контактирующей с определенным объемом, по меньшей мере, одного масла. Соотношение сырого веса и сухого веса (dw) подвергнутого промоканию насухо Asparagopsis составляет 10 (то есть 30 г сырого веса=3 г сухого веса). Предполагая, что содержание органического вещества (ОВ) составляет 80% сухого веса на основе ранее полученных данных, можно рассчитать соответствующее содержание ОВ, происходящего из Asparagopsis, в биомассе/масле. Например, для масляной композиции Asparagopsis, содержащей 30 г сырого веса (fw), биомасса Asparagopsis в 100 мл, по меньшей мере, одного масла эквивалентна 0,024 органического вещества Asparagopsis/мл. Если требуемая концентрация включения в корм составляет 0,1% ОВ Asparagopsis в 100 г корма, то на 100 г корма требуется 4,17 мл масляной композиции Asparagopsis 30 г/100 мл.
Соответствующее содержание ОВ, происходящего из Asparagopsis, в биомассе/масле можно рассчитать по различному содержанию органического вещества (ОВ) в % сухого веса. Например, содержание органического вещества (ОВ) 50%, 55%, 60%, 70%, 75% сухого веса на основе ранее полученных данных можно использовать для расчета соответствующего содержания ОВ, происходящего из Asparagopsis, в биомассе/масле.
Как указано выше, в предпочтительном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 или 0,067% органического вещества, вводимого жвачным животным. Соответственно, при использовании масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано здесь, на 100 г корма требуется, по меньшей мере, 125 мл, 83,3 мл, 41,7 мл, 20,8 мл, 10,4 мл, 5,2 мл или 2,8 мл. При использовании масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано здесь, на 100 г корма требуется, по меньшей мере, 62,5 мл, 41,7 мл, 20,8 мл, 10,4 мл, 5,2 мл, 2,6 мл или 1,4 мл. При использовании масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано здесь, на 100 г корма требуется, по меньшей мере, 31,25 мл, 20,8 мл, 10,4 мл, 5,2 мл, 2,6 мл, 1,3 мл или 0,69 мл.
Например, если жвачное животное 400 кг (например, бычок) потребляет от 2,5% до 3% своего живого веса в день корма, то масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, пропорциональной количеству органического вещества, вводимого жвачному животному. В случае жвачного животного 400 кг, и при этом 80% корма составляет органическое вещество, если животное потребляет около 2,5% своего живого веса в день (10 кг, содержащие 8 кг органического вещества), то требуется 3,3 литра масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 1,6 литра масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 1,1 литра масляной композиции Asparagopsis 90 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 833 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 666 мл масляной композиции Asparagopsis 150 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному.
330 мл масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 167 мл масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 111 мл масляной композиции Asparagopsis 90 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 83 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 67 мл масляной композиции Asparagopsis 150 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному.
Для расчета композицию, включающую биомассу, необходимой для достижения дозы, эквивалентной требуемой концентрации в % органического вещества, вводимого жвачному животному, количество в % органического вещества в описанных здесь масляных композициях Asparagopsis, в настоящем документе, рассчитывают исходя из сырого веса (fw) биомассы Asparagopsis, контактирующей с определенным объемом, по меньшей мере, одного масла. Соотношение сырого веса и сухого веса (dw) подвергнутого промоканию насухо Asparagopsis составляет 10 (то есть 30 г сырого веса=3 г сухого веса). Предполагая, что содержание органического вещества (ОВ) составляет 80% сухого веса на основе ранее полученных данных, можно рассчитать соответствующее содержание ОВ, происходящего из Asparagopsis, в биомассе/масле. Например, для масляной композиции Asparagopsis, содержащей 30 г сырого веса (fw), биомасса Asparagopsis в 100 мл, по меньшей мере, одного масла эквивалентна 0,024 органического вещества Asparagopsis/мл, а количество органического вещества в общем конечном объеме рассчитывается и включается в расчет.
Эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, можно определить описанными здесь методами, включающими исследования доза-эффект in vitro и in vivo, описанные здесь. Например, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что ферментацию в рубце in vitro можно использовать для исследования влияния количеств лиофилизированного измельченного Asparagopsis на концентрации летучих жирных кислот, включая ацетат и пропионат, образование метана и общее образование газа. Следовательно, ферментацию в рубце in vitro можно использовать для определения доз масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, которые могут представлять собой эффективное количество, достаточное для обеспечения улучшения, например, снижения количества образующегося метана по сравнению с эталоном или контролем, снижения общего количества образующегося газа по сравнению с эталоном или контролем, поддержания эффективной концентрации одной или более требуемых летучих жирных кислот по сравнению с эталоном или контролем, или снижения соотношения ацетата к пропионату по сравнению с эталоном или контролем.
Жвачное животное является млекопитающим отряда Artiodactyla, которое переваривает растительную пищу, сначала размягчая и частично ферментируя ее в первых камерах желудка животного, затем срыгивая полупереваренную массу, теперь известную как жвачка, и снова ее пережевывая.
Процесс пережевывания жвачки для дальнейшего расщепления растительного вещества и стимуляции пищеварения называется «жеванием». У жвачных животных пищеварительный тракт состоит из четырех камер, а именно рубца, сетки, книжки и сычуга. В первых двух камерах, рубце и сетке, пища смешивается со слюной и разделяется на слои твердого и жидкого материала. Твердые частицы слипаются, образуя жвачку или болюс. Затем жвачка срыгивается, медленно разжевывается, чтобы полностью смешать ее со слюной, которая в дальнейшем разрушает волокна. Волокно, особенно целлюлоза, расщепляется на глюкозу в этих камерах симбиотическими анаэробными бактериями, простейшими и грибами. Расщепленное волокно, которое теперь находится в жидкой части содержимого, затем проходит через рубец в следующую камеру желудка, книжку. Пища в сычуге переваривается так же, как в моногастральном желудке. Переваренное содержимое желудка, наконец, отправляется в тонкую кишку, где происходит всасывание питательных веществ. Почти вся глюкоза, образующаяся при расщеплении целлюлозы, используется симбиотическими бактериями. Жвачные животные получают свою энергию из летучих короткоцепочечных жирных кислот (ЛЖК), вырабатываемых бактериями, а именно ацетата, пропионата, бутирата, валерата и изовалерата.
Важно отметить, что авторы изобретения показали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis обладает свойством снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных без нарушения ферментации в рубце.
Например, авторы изобретения показали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis обладает свойством снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных без нарушения ферментации в рубце, например, при поддержании эффективной концентрации одной или более требуемых летучих жирных кислот. Авторы изобретения также показали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis обладает свойством снижать общее образование газа и/или образование метана у жвачных животных без нарушения ферментации в рубце, например, без оказания значительного влияния на ежедневное потребление корма и/или живой вес животных.
Используемый здесь термин «поддержание эффективной концентрации» означает количество вещества у животного или животных после обработки (например, введения масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь), которое существенно не отличается от контроля или этанола, включая количество вещества у животного или животных, которым не вводили масляную композицию Asparagopsis по настоящему изобретению.
Например, «эффективная концентрация требуемой летучей жирной кислоты» предназначен для обозначения того, что количество требуемой летучей жирной кислоты является достаточным для улучшения состояния, такого как снижение количества образования метана по сравнению с эталоном или контролем; снижение общего количества продуцируемого газа по сравнению с эталоном или контролем; снижение соотношения ацетата к пропионату по сравнению с эталоном или контролем; или поддержание живого веса, потребления сухого вещества и/или потребления органических веществ по сравнению с эталоном или контролем.
Углеводный обмен обеспечивает энергию для роста микроорганизмов рубца преимущественно за счет ферментации целлюлозы и крахмала. Нерастворимые полимеры превращаются в олигосахариды и растворимые сахара внеклеточными ферментами микроорганизмов рубца. Затем полученные сахара ферментируются до одной из различных форм летучих жирных кислот, углекислого газа и водорода. Используемые здесь летучие жирные кислоты - уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота - также называются ацетатом, пропионатом и бутиратом соответственно.
Летучие жирные кислоты используются животными в качестве основных источников углерода и энергии с различной степенью эффективности. Высокие концентрации пропионовой кислоты требуются, поскольку пропионовая кислота является основным метаболическим предшественником глюконеогенеза у животных. Ферментация 6-углеродных сахаров в уксусную кислоту является относительно неэффективной, поскольку в этом процессе углерод и водород теряются в результате отрыжки в виде углекислого газа или, что важно, метана. С другой стороны, продуцирование пропионовой кислоты использует водород и не приводит к потере углерода или метана.
Таким образом становится возможным повысить эффективность использования корма и/или скорость роста жвачных животных за счет увеличения молярной доли пропионовой кислоты относительно уксусной кислоты или, в другом варианте осуществления, за счет увеличения общей концентрации летучих жирных кислот (то есть суммарного количества уксусной, пропионовой и масляной кислот) в рубце.
Авторы настоящего изобретения продемонстрировали снижение общего количества продуцируемого газа и/или метана, образующегося при анаэробной ферментации in vitro и in vivo в присутствии лиофилизированного измельченного Asparagopsis, без отрицательного воздействия на общее продуцирование ЛЖК у крупного рогатого скота. Важно отметить, что авторы настоящего изобретения показали, что Asparagopsis не снижает количество ЛЖК у крупного рогатого скота; в дозах Asparagopsis, которые не снижают количество потребляемого/расщепляемого органического вещества или сухого вещества; в дозах, снижающих соотношение ацетата к пропионату; в дозах, снижающих количество ацетата; в дозах, повышающих количество пропионата; и/или в дозах Asparagopsis, ингибирующих общее образование газа и метана in vitro и in vivo.
Важно отметить, что авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество ЛЖК в дозах Asparagopsis, которые ингибируют общее образование газа и метана у крупного рогатого скота. Авторы настоящего изобретения также показали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество потребления/расщепления органического вещества или сухого вещества у овец; в дозах, снижающих соотношение ацетата к пропионату; в дозах, снижающих количество ацетата; в дозах, повышающих количество пропионата; и/или в дозах Asparagopsis, ингибирующих образование метана in vitro и in vivo. Например, авторы настоящего изобретения показали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество потребляемого/расщепляемого органического вещества или сухого вещества у овец, которым скармливают в 1,2 раза больше поддерживающей энергии.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis по настоящему изобретению, при этом поддерживаются эффективные концентрации требуемых летучих жирных кислот.
В одном варианте осуществления требуемыми летучими жирными кислотами являются ацетат и пропионат.
Используемый здесь термин «летучие жирные кислоты» («ЛЖК») включает конечный продукт анаэробной микробиологической ферментации кормовых компонентов в рубце. Обычные ЛЖК включают ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерат и изовалерат. ЛЖК абсорбируются рубцом и используются животным для получения энергии и синтеза липидов.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения общее количество ЛЖК, образующихся при ферментации в рубце в присутствии эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, составляет, по меньшей мере, 80 ммоль/л.
В других вариантах осуществления изобретения общее количество ЛЖК, образующихся при ферментации в рубце в присутствии эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, составляет, по меньшей мере, 65 ммоль/л.
Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество ЛЖК у крупного рогатого скота в дозах лиофилизированного измельченного Asparagopsis, которые не снижают количество органического вещества или сухого вещества, расщепленного в результате ферментации в рубце, или потребления сухого вещества. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество потребляемого сухого вещества или живой вес овец. Например, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis не снижает количество потребляемого сухого вещества или живой вес у овец, скармливают в 1,2 раза больше поддерживающей энергии. Это указывает на то, что красные морские макроводоросли, такие как Asparagopsis, снижают общее образование газа и/или образования метана у жвачных животных без нарушения ферментации в рубце.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь. В одном варианте осуществления поддерживается эффективная концентрация требуемой летучей жирной кислоты. В другом варианте осуществления соотношение ацетата к пропионату снижается. В другом варианте осуществления поддерживается концентрация расщепляемого органического вещества и/или сухого вещества. В другом аспекте изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, при этом поддерживается количество потребляемого сухого вещества.
Используемые здесь термины «органическое вещество» и «сухое вещество» означают количество корма (на органической основе или без содержания влаги, соответственно), которое животное потребляет за определенный период времени, обычно 24 часа. В данной области известно, как рассчитать потребление и/или расщепление органического вещества и сухого вещества. Например, сухое вещество и органическое вещество могут составлять 90% и 80% от количества корма соответственно.
В одном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 16,67%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному.
В предпочтительном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимому жвачному животному для поддержания количества расщепляемого органического вещества и/или сухого вещества.
В другом варианте осуществления поддерживается количество как расщепляемого органического вещества, так и сухого вещества, и поддерживаются эффективные концентрации требуемых летучих жирных кислот.
В предпочтительном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному, для поддержания эффективных концентраций требуемых летучих жирных кислот.
Важно отметить, что авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что лиофилизированный измельченный Asparagopsis повышает количество пропионата в дозах Asparagopsis, ингибирующих общее образование газа и метана, и лиофилизированный измельченный Asparagopsis повышает количество пропионата в дозах лиофилизированного измельченного Asparagopsis, которые не снижают количество расщепляемого органического вещества и сухого вещества.
Соответственно, в другом аспекте изобретение относится к способу снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачного животного, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, при этом поддерживается количество расщепляемого органического вещества или сухого вещества и/или снижается соотношение ацетата к пропионату.
В предпочтительном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, эквивалентной предпочтительно, по меньшей мере, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному, для снижения соотношения ацетата к пропионату.
В одном варианте осуществления соотношение ацетата к пропионату (соотношение C2/C3) после введения масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, не оказывает отрицательного влияния. В другом варианте осуществления соотношение ацетата к пропионату (соотношение C2/C3) после введения масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, снижается.
В другом варианте осуществления молярная концентрация пропионата не оказывает отрицательного влияния.
Ферментация в рубце низкокачественных волокнистых кормов является основным источником образования метана у жвачных животных.
Примеры жвачных животных приведены ниже. Однако предпочтительно масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, используют в качестве добавки к кормовым продуктам для домашнего скота, такого как крупный рогатый скот, козы, овцы и ламы. Настоящее изобретение особенно подходит для крупного рогатого скота и овец. Следовательно, в одном варианте осуществления указанное жвачное животное выбирают из представителей подотряда жвачные (Ruminantia) и мозоленогие (Tylopoda). В другом варианте осуществления указанным жвачным животным является крупный рогатый скот или овца. В другом варианте осуществления указанным жвачным животным является крупный рогатый скот.
Под «вводить» и «введением» подразумевается действие по введению масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, в желудочно-кишечный тракт животного. В частности, это введение представляет собой пероральный путь введения. Это введение можно, в частности, осуществлять посредством добавления в предназначенный для животного корм масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, обогащенный таким образом корм затем потребляется животным. Масляная композиция Asparagopsis, как описано здесь, вводится в желудочно-кишечный тракт животного.
Как обсуждалось выше, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, составляет, по меньшей мере, 16,67%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному.
Например, масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе предпочтительно, по меньшей мере, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, имеющегося в рационе жвачного животного.
Например, если жвачное животное потребляет приблизительно 2,5-3% от своего живого веса корма в день, то жвачное животное весом 400 кг может потреблять 10-12 кг корма в день. Например, если жвачное животное весом 400 кг (например, бычок) потребляет от 2,5% до 3% от своего веса тела в день корма, то масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе, пропорциональной количеству органического вещества, вводимого жвачному животному. В случае жвачного животного весом 400 кг и когда 80% корма составляет органическое вещество, если животное потребляет около 2,5% от своего веса тела в день (10 кг, содержащие 8 кг органического вещества), 3,3 литра масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 1,6 литра масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 1,1 литра масляной композиции Asparagopsis 90 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 833 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 666 мл масляной композиции Asparagopsis 150 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 330 мл масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 167 мл масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 111 мл масляной композиции Asparagopsis 90 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 83 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 67 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному.
Эффективное количество можно вводить указанному жвачному животному в одной или более дозах.
Эффективное количество также можно вводить указанному жвачному животному в одной или более дозах ежедневно.
Дозировки, определенные здесь как количество на кг веса тела в день, относятся к среднему количеству масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, вводимой в течение данного периода обработки, например, в течение недели или месяца обработки. Таким образом, масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, можно вводить каждый день, через день и так далее, без отступления от объема изобретения. Однако предпочтительно способ включает ежедневное введение масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, в требуемых дозах. Еще более предпочтительно масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят во время кормления животного каждый раз, когда животному скармливают количества, обеспечивающие вышеуказанные суточные дозы.
Настоящий способ может включать введение масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, в соответствии с вышеописанными режимами дозирования в течение периода, по меньшей мере, 5, 10, 25, 50, 100, 250 или 350 дней. Аспект изобретения заключается в том, что настоящие способы обеспечивают очень устойчивую эффективность в снижении метаногенеза в кишечнике, например, эффект не снижается в течение длительного периода обработки, например, в результате повышения резистентности микроорганизмов рубца или кишечника, что делает долгосрочную обработку жвачных животных особенно подходящей.
Соответственно, учитывая существенное воздействие лиофилизированной измельченной Asparagopsis, включая снижение общего образования газа и выхода CH4, в одном варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, предпочтительно вводить в форме, которая приводит к эффектам, описанным здесь (например, для снижения выхода CH4), без оказания влияния на важные в питательном отношении параметры ферментации.
Из всего разнообразия вторичных метаболитов, продуцируемых Asparagopsis, бромоформ (CHBr3) является одним из наиболее распространенных и биологически активных. Однако бромоформ и химически родственные соединения (например, бромхлорметан) в качестве очищенных химических веществ небезопасны и запрещены для применения людьми и животными, включая ингибирование метаногенеза у жвачных животных.
В то время как интактную лиофилизированную измельченную биомассу Asparagopsis можно использовать в качестве кормовой добавки для ингибирования метаногенеза у жвачных животных, она требует тщательной обработки перед кормлением для сведения к минимуму потери биологически активных соединений, таких как бромоформ, и поддержания активности. Наиболее эффективным в настоящее время способом получения биомассы Asparagopsis является немедленное замораживание и последующее замораживание сухой биомассы для применения в качестве кормовой добавки. Однако авторы настоящего изобретения ранее обнаружили, что существуют значительные потери бромоформа, если интактная биомасса не будет сразу заморожена и/или высушена на воздухе. Кроме того, через 6 месяцев возникают значительные потери, если лиофилизированная биомасса хранится при температуре окружающей среды (потери 66%) или даже в условиях охлаждения (потери 32%), при этом замораживание лиофилизированного материала (потеря 20%) является единственным практическим вариантом для длительного хранения (˃6 месяцев) (фиг.2). Эти условия обработки и хранения описаны в Vucko и др. (J. Appl. Phycol. 2017, 29, 1577-1586).
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что масляные композиции Asparagopsis, полученные контактированием биомассы Asparagopsis с маслом, сохраняют высокие концентрации биологически активного вещества в течение длительных периодов времени, даже при хранении или при комнатной температуре, или при 4°C. Например, как описано выше, на фиг.3 показано, что масляные композиции Asparagopsis, полученные контактированием биомассы Asparagopsis с маслом, с гомогенизацией или без нее, сохраняют высокие концентрации биологически активного вещества в течение длительных периодов времени при хранении или при комнатной температуре, или при 4°C. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют получать масляные композиции Asparagopsis в форме, подходящей для длительного хранения (˃6 месяцев) при комнатной температуре.
Настоящее изобретение приводит к значительному снижению потерь биологически активных компонентов, которые в противном случае возникали бы во время транспортировки, сушки и/или хранения биомассы Asparagopsis, собранной в дикой природе. Настоящее изобретение также сокращает количество стадий для получения смешанного продукта из консервированной интактной биомассы или биологически активного экстракта и, следовательно, представляет собой значительнное улучшение существующих технологий обработки.
В другом варианте осуществления масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, предпочтительно вводят в форме, в которой вторичные метаболиты остаются эффективными (например, терапевтически эффективными).
Масляные композиции Asparagopsis, как описано здесь, можно вводить жвачным животным одним из многих способов. Масляные композиции Asparagopsis, как описано здесь, можно вводить в твердой форме в качестве лекарственного средства для ветеринарного применения, можно распределять во вспомогательных веществах и непосредственно скармливать животному, можно физически смешивать с кормовым материалом в сухой форме, или масляная композиция Asparagopsis, как описано здесь, может быть предоставлена в виде раствора и затем распылена на кормовой материал. Считается, что способ введения масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, животному находится в пределах компетенции специалиста в данной области.
При использовании в комбинации с кормовым материалом кормовой материал предпочтительно представляет собой зерно/сено/силос/траву. В число таких кормовых материалов входят улучшенные корма и/или корма на основе тропических трав или бобовых, или непосредственно выращенные, приготовленные в виде консервированного кормового сена, любые кормовые компоненты и побочные продукты пищевой или кормовой промышленности, а также побочные продукты биотопливной промышленности и кукурузная мука и их смеси, или партии кормов и рационы молочных коров, такие как с высоким содержанием зерна.
Время введения не имеет решающего значения при условии, что показан эффект снижения образования метана. В случае, если корм остается в рубце, введение возможно в любое время. Однако, поскольку масляная композиция Asparagopsis, как описано здесь, предпочтительно присутствует в рубце примерно в то время, когда образуется метан, то масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, предпочтительно вводят с кормом или непосредственно перед кормлением.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, вводят жвачным животным добавлением в предназначенный для указанного животного корм указанного эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь. Под «добавлением» в значении изобретения подразумевается действие по включению эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, непосредственно в корм, предназначенный для животного. Таким образом, животное при кормлении потребляет масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, которое затем может влиять на повышение, например, усвояемости волокон и/или злаков, содержащихся в корме животного.
Таким образом, другой объект изобретения относится к кормовой добавке для жвачных животных, содержащей масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к кормовой добавке для снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, указанная добавка содержит эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь.
В одном варианте осуществления эффективное количество масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, вводят указанному жвачному животному добавлением в предназначенный для указанного животного корм указанного эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь.
Как обсуждалось выше, в одном варианте осуществления настоящее изобретение поддерживает концентрации ЛЖК у жвачных животных. Таким образом, этот способ позволяет жвачному животному поддерживать энергию из корма на основе, например, волокон и злаков, и в результате, начиная с аналогичного потребления калорий, поддерживать энергию, подходящую для метаболизма, при одновременном снижении общего образования газа и CH4.
Это выгодно для животноводов, которые, таким образом, могут оптимизировать стоимость корма на единицу соответствующей метаболической энергии. Это также представляет собой существенную экономическую выгоду.
Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что введение эффективного количества лиофилизированного измельченного Asparagopsis жвачному животному не оказывает отрицательного влияния на добровольное потребление корма. Следовательно, настоящее изобретение включает способы, в которых поддерживается концентрация расщепляемого органического вещества и/или сухого вещества.
Используемый здесь термин «кормовая добавка для животных» относится к концентрированному дополнительному премиксу, содержащему активные компоненты, причем премикс или добавку можно добавить в корм или рацион животного для создания обогащенного корма в соответствии с настоящим изобретением. Термины «кормовой премикс для животных», «дополнительный корм для животных» и «кормовая добавка для животных» обычно считаются имеющими сходные или идентичные значения и обычно считаются взаимозаменяемыми. Обычно кормовая добавка для животных по настоящему изобретению находится в форме порошка или прессованного или гранулированного твердого вещества. На практике домашний скот обычно можно кормить кормовой добавкой для животных, добавляя ее непосредственно в рацион, например в качестве так называемой подкормки, или ее можно использовать при приготовлении или производстве продуктов, таких как комбикорма для животных или блоки-лизунцы, которые будут описаны более подробно ниже. В этом отношении изобретение особо не ограничивается. Добавку по изобретению обычно скармливают животному в количестве 16-2500 г/животное/день.
В одном варианте осуществления добавку по изобретению вводят в количестве из расчета фактического индивидуального потребления животным (например, потребление г/кг СВ).
Настоящая кормовая добавка для животных содержит масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, и приготовлена, таким образом, что при добавлении в корм масляная композиция Asparagopsis присутствует в количестве, эквивалентном, по меньшей мере, 0,067%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10% или 16,67% органического вещества корма.
Например, если жвачное животное потребляет приблизительно 5 кг органического вещества в день, то кормовая добавка для животных содержит масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, и приготовлена таким образом, что при добавлении в корм масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, вводят в дозе 208 мл в день. 208 мл масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 104 мл масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 52 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 0,1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 2082 мл масляной композиции Asparagopsis 30 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 1041 мл масляной композиции Asparagopsis 60 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному. 520 мл масляной композиции Asparagopsis 120 г сырого веса/100 мл, как описано, требуется для получения дозы, эквивалентной 1% органического вещества, вводимого жвачному животному.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения добавка содержит масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, в количестве 10-100 вес.%, предпочтительно указанное количество превышает 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 или 99 вес.%.
В компетенцию квалифицированного специалиста входит точное определение идеального количества компонентов, которые должны быть включены в добавку, и количество добавки, которое будет использоваться при приготовлении рациона или комбикорма для животных и тому подобное, с учетом конкретного вида животного и условий его содержания. Здесь приведены предпочтительные дозировки каждого из компонентов.
Кормовые добавки для животных по настоящему изобретению могут содержать любой дополнительный компонент без отступления от объема изобретения. Обычно она может содержать хорошо известные вспомогательные вещества, которые необходимы для приготовления требуемой формы продукта, и может содержать дополнительные компоненты, направленные на улучшение качества корма и/или улучшение продуктивности животного, потребляющего добавку. Подходящие примеры таких вспомогательных веществ включают носители или наполнители, такие как лактоза, сахароза, маннит, крахмальная кристаллическая целлюлоза, гидрокарбонат натрия, хлорид натрия и тому подобное, а также связующие вещества, такие как аравийская камедь, трагакантная камедь, альгинат натрия, крахмал, производные ПВП и целлюлозы и так далее. Примеры кормовых добавок, известных специалистам в данной области, включают витамины, аминокислоты и микроэлементы, усилители перевариваемости и стабилизаторы кишечной микрофлоры и тому подобное.
Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что лиофилизированные измельченные Dictyota, Oedogonium и Cladophora patentiramea снижают общее образование газа и образование CH4 вследствие ферментации в рубце. Следовательно, в другом варианте осуществления способы дополнительно включают введение указанному жвачному животному эффективного количества, по меньшей мере, одного вида макроводорослей, выбранных из группы, состоящей из Asparagopsis armata, Asparagopsis taxiformis, Dictyota spp (например, Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp и C. patentiramea.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения общее образования газа и/или образования метана у жвачных животных, включающему стадию введения указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, и композиции, содержащей морские макроводоросли или масляный экстракт морских макроводорослей.
В одном варианте осуществления морские макроводоросли, входящие в состав композиции, выбирают из группы, состоящей из Asparagopsis armata, Asparagopsis taxiformis, Dictyota spp (например, Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp и C.patntiramea.
Еще один аспект изобретения относится к таким продуктам, как комбикорм для животных и блоки-лизунцы, содержащие добавку, как определено здесь ранее.
Термин «композиция комбикорма для животных», используемый здесь, означает композицию, которая подходит для использования в качестве корма для животных и которую смешивают из различных натуральных или ненатуральных исходных или сырьевых материалов и/или добавок. Следовательно, в частности, термин «комбикорм» используется здесь для отличия настоящих кормовых композиций от любого натурального сырья. Эти смеси или комбикорма готовят в соответствии с конкретными потребностями целевого животного. Основные компоненты, используемые в промышленно приготовленных комбикормах, обычно включают пшеничные отруби, рисовые отруби, кукурузную муку, зерновые культуры, такие как ячмень, пшеница, рожь и овес, соевую муку, люцерновую муку, хлопковую муку, пшеничный крахмал и тому подобное. Промышленный комбикорм обычно содержит не менее 15% сырого протеина и не менее 70% общих перевариваемых питательных веществ, хотя изобретение не ограничено особым образом в этом отношении. Жидкие, твердые, а также полутвердые композиции комбикормов для животных охватываются объемом настоящего изобретения, твердые и полутвердые формы являются особенно предпочтительными. Эти композиции обычно производятся в виде муки, гранул или крупки. На практике домашний скот обычно можно кормить комбинацией комбикорма, такой как корм по настоящему изобретению и силос, сено или тому подобное. Обычно комбикорм для животных скармливают в количестве в пределах 0,3-10 кг/животное/день. В компетенцию квалифицированного специалиста входит определение необходимого количества этих компонентов, которые должны быть включены в комбикорм для животных, с учетом вида животного и условий его содержания.
Композиции комбикормов для животных по изобретению могут содержать любую дополнительную кормовую добавку, обычно используемую в данной области. Как известно специалистам в данной области, термин «кормовая добавка» в данном контексте относится к продуктам, используемым в питании животных с целью улучшения качества корма и качества пищевых продуктов животного происхождения или для улучшения продуктивности животных, например, обеспечение повышенной перевариваемости кормов. Неограничивающие примеры включают технологические добавки, такие как консерванты, антиоксиданты, эмульгаторы, стабилизаторы, регуляторы кислотности и добавки для силоса; сенсорные добавки, в частности ароматизаторы и красители; (далее) питательные добавки, такие как витамины, аминокислоты и микроэлементы; и (далее) зоотехнические добавки, такие как усилители перевариваемости и стабилизаторы кишечной флоры.
Как будет понятно специалистам в данной области, настоящие композиции комбикормов для животных могут содержать любой дополнительный компонент или добавку без отступления от объема изобретения.
В дополнительном аспекте изобретение относится к камню-лизунцу или блоку-лизунцу, содержащему масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь. Как известно специалистам в данной области, такие камни или блоки-лизунцы особенно удобны для скармливания минеральных добавок (а также белков и углеводов) жвачным животным, пасущимся или на естественных, или на культурных пастбищах, или и на тех и на других одновременно. Такие блоки-лизунцы или камни-лизунцы в соответствии с настоящим изобретением обычно содержат, в дополнение к масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь, различные виды связующих веществ, например цемент, гипс, известь, фосфат кальция, карбонат и/или желатин; и необязательно другие добавки, такие как витамины, микроэлементы, минеральные соли, сенсорные добавки и тому подобное.
Еще один аспект изобретения относится к способу снижения образования метана в желудочно-кишечном тракте жвачных животных, указанный способ включает введение композиции, содержащей масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь.
Используемые здесь термины «снижение метаногенеза в желудочно-кишечном тракте» и «снижение образования метана в желудочно-кишечном тракте» относятся к снижению образования газа метана в желудочно-кишечном тракте. Как объяснялось выше, ферментация в рубце и кишечнике жвачного животного приводит к образованию газа метана так называемыми метаногенами. Настоящее изобретение направлено на сокращение этого процесса, например, на снижение выделения метана непосредственно из желудочно-кишечного тракта. Оценка выделения метана животным находится в пределах знаний и компетенции специалиста в данной области. Как объяснялось ранее, образование метана в рубце и кишечнике представляет собой процесс, обычно происходящий у здоровых животных, и снижение метаногенеза не улучшает и не ухудшает общее состояние здоровья или самочувствия жвачных животных.
Таким образом, настоящие способы обработки не являются терапевтическими методами лечения, то есть способы не улучшают здоровье животного, страдающего определенным расстройством, не предотвращают конкретное заболевание или расстройство и ни в какой степени не влияют на здоровье жвачного животного никаким другим способом, то есть по сравнению с жвачным животным, не подвергавшимся настоящим способам обработки. Как объяснялось ранее, преимущества настоящих способов ограничиваются экологическими и/или экономическими аспектами.
Как будет ясно из вышеизложенного, настоящий способ включает пероральное введение масляной композиции Asparagopsis, как описано здесь. Предпочтительно обработка включает пероральное введение композиции комбикорма для животных и/или дополнительных кормовых продуктов для животных, как определено выше, даже если могут использоваться другие жидкие, твердые или полутвердые композиции для перорального приема без отклонения от объема изобретения, как это будет понятно специалистам в данной области.
В соответствии с вышеизложенным еще один аспект изобретения относится к применению композиции, содержащей масляную композицию Asparagopsis, как описано здесь, для нетерапевтического снижения образования метана в желудочно-кишечном тракте жвачных животных.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к корму для жвачных животных, где указанный корм обогащен кормовой добавкой, описанной здесь.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения образования метана жвачным животным, указанный способ включает стадию введения указанному животному кормовой добавки, описанной здесь, или корма, описанного здесь.
Используемый здесь термин «срок хранения» применяется для обозначения того, что количество или концентрация биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, по меньшей мере, в одном масле значительно не снижается в течение периода времени и температуры, при которой композиция хранится. Другими словами, количество времени, проходящее до того, как произойдет значительное снижение концентрация биологически активного (например, антиметаногенного) компонента, считается показателем срока хранения. Термин «стабильность» также используется в качестве показателя срока хранения. «Стабильность», по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента можно оценить посредством измерения концентрации антиметаногенного компонента с течением времени.
Концентрация биологически активного (например, антиметаногенного) компонента обычно будет снижаться с течением времени после его экстрагирования в масло, и это будет зависеть от условий хранения. Снижение концентрации может быть вызвано многими причинами, такими как испарение или возгонка биологически активного (например, антиметаногенного) компонента из масла. Это также может быть связано с реакцией биологически активного (например, антиметаногенного) компонента с самим собой, остаточной водой в масляном экстракте, кислородом или другими газами в воздухе, другими компонентами в масле или реакцией с самим маслом, и может быть опосредовано светом и/или нагреванием, как это типично для многих галогенированных соединений. Концентрация, на которую снижается биологически активный (например, антиметаногенный) компонент, чтобы он оставался приемлемым для потребления, будет изменяться в зависимости от ряда факторов, таких как конечное применение продукта и побочные продукты разложения, которые могут образовываться. Например, концентрация, на которую может снижаться хотя бы один биологически активный (например, антиметаногенный) компонент, может составлять не более чем 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% после хранения при температуре или 4°C или 25°C, и это все равно будет приемлемым для применения. В одном варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного биологически активного (например, антиметаногенного) компонента может снижаться не более чем на 20% после 65 недель хранения при 25°C. В другом варианте осуществления концентрация, по меньшей мере, одного антиметаногенного компонента может снижаться не более чем на 50% после 65 недель хранения при 4°C или 25°C.
СОКРАЩЕНИЯ
В описании используется ряд сокращений. Для предотвращения сомнений, эти сокращения определены ниже:
Далее изобретение будет дополнительно описано в виде примеров, которые предназначены для оказания помощи специалисту в данной области при осуществлении изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ МАСЛЯНОЙ КОМПОЗИЦИИ ASPARAGOPSIS
Asparagopsis taxiformis (стадия гаметофита) собирали на Магнитном острове (Квинсленд, Австралия). Asparagopsis armata собирают в Облачном заливе, остров Бруни, Тасмания, 43°43’94 ю.ш., 147°21’52 в.д. Сырую биомассу промокали насухо, и образцы (6×30,0 г сырого веса (fw)) собирали в отдельные стеклянные бутылки объемом 250 мл (Schott), каждую из которых предварительно заполняли 100 мл растительного масла (купарижированное растительное масло Homebrand, масло канолы 95%, подсолнечное масло 5%). Сравнительные образцы (6×30,0 г сырого веса (fw)) также собирали в 100 мл воды Milli-Q вместо растительного масла. Все бутылки прочно закрывали и хранили на льду для немедленной транспортировки в лабораторию с целью дальнейшей обработки.
Образцы биомассы (6×30,0 г сырого веса) также собирали в пакеты со струнным зажимом zip lock для определения сухого веса (dw) и определения содержания бромоформа в биомассе (3×30,0 г сырого веса).
В лаборатории (менее 4 часов с момента сбора) биомассу в каждом растворителе (масле или воде) гомогенизировали измельчением с использованием IKA ultra-turrax T-25 в течение 60 с (n=3 для масла и n=3 для воды), при этом биомасса в оставшихся трех повторностях для каждого растворителя оставалась неизменной. Затем все бутылки с биомассой (n=12) хранили в холодильнике (4°C). Образцы анализировали на содержание бромоформа, представляющего собой антиметаногенные компоненты, присутствующие в водорослях, на 1, 3, 5, 7 и 10 дни после сбора (день 0).
Для анализа бромоформа 1,5 мл экстракционного растворителя (масла или воды) отбирали из каждой повторности бутылки и центрифугировали (12000 g, 1 мин) для удаления твердых частиц. Бромоформ (BF) экстрагировали из 1,0 мл полученных осветленных растворов, используя или метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ), или метанол, как описано ниже.
Для образцов, в которых в качестве растворителя использовали воду, бромоформ экстрагировали из 1,0 мл суб-образцов из каждой повторности бутылки с использованием 1,0 мл раствора нафталина-простого эфира (10 мкг/мл нафталина в метил-трет-бутиловом эфире (МТБЭ)). Нафталин выполнял функцию внутреннего стандарта, а МТБЭ был экстракционным растворителем. Фазу МТБЭ собирали и анализировали методом ГХ/МС, как описано ниже.
Для образцов, в которых в качестве растворителя использовали масло, бромоформ экстрагировали из 1,0 мл суб-образцов из каждой повторности бутылки с использованием 1,0 мл раствора нафталин-метанол (10 мкг/мл нафталина в метаноле для ВЭЖХ). Образцы выдерживали для разделения в течение 2 часов при 4°C перед анализом слоя метанола. Условия разделения выбирали на основе предыдущих экспериментов с использованием различных растворителей (гексана, метанола, МТБЭ, DCM) и периодов времени (от 30 минут до 48 часов). Фазу метанола собирали и анализировали методом ГХ/МС, как описано ниже.
Экспериментальная схема экстрагирования галогенированных метаболитов из интактной или гомогенизированной биомассы A. taxiformis в масло или воду показана ниже.
Эксперимент 1: обработка
Для определения сухого веса и содержания бромоформа биомассу сразу же замораживали, а затем лиофилизировали (Virtiz benchtop 2K, -55°C, 120 мкбар, 48 ч). Высушенную биомассу взвешивали для определения сухого веса, затем измельчали до частиц размером 1 мм и хранили при -20°C в герметичных банках.
Бромоформ количественно определяли методом ГХ/МС (Agilent 7890c, оборудованный капиллярной колонкой Zebron ZB-WAX, 30 м × 0,25мм × 0,25 мкм, Phenomenex, Австралия), согласно Paul и др. (Mar. Ecol. Prog. Ser., 306 (2006) 87-101) с модификациями, описанными Machado и др. (J Appl Phycol, 28 (2016) 3117-3126). Вкратце, аналитические условия представляли собой импульсные инъекции (1 мкл, 35 фунтов на кв. Дюйм) в режиме без разделения со следующими температурными параметрами: порт инъекции (250°C), интерфейс ГХ/МС (300°C) и термостат (выдержка при 40°C в течение 1 мин, быстрое увеличение на 16°C⋅мин-1 до 250°C, затем выдержка при 250°C в течение 2 мин), как описано Paul и др. Гелий использовали в качестве газа-носителя при 2 мл⋅мин-1. Для каждого метода были построены отдельные стандартные кривые (вода, масло, биомасса), и концентрация целевых соединений в каждом образце была рассчитана по отношению площадей пиков целевого соединения к внутреннему стандарту. Бромоформ идентифицировали сравнением с имеющимся на рынке стандартом (Sigma Aldrich, Австралия) и на основе его характерных ионных фрагментов (молекулярный ионный кластер при m/z 250, 252, 254, 256 [1:2:2:1]). Концентрацию бромоформа в растворах стандартизировали к количеству экстрагированной сухой биомассы и выражали в мг бромоформа/г сухого веса биомассы.
Сухой вес 30 г образца подвергнутого промоканию насухо Asparagopsis определили равным около 3 г. На фиг.1 приведены результаты различных методов экстрагирования (с использованием воды в качестве растворителя по сравнению с маслом в качестве растворителя; и с использованием интактной биомассы по сравнению с гомогенизированной/измельченной биомассой), где биомасса контактирует с растворителем (водой или маслом) в течение периода времени до 10 дней. Результаты представлены в виде количества экстрагированного BF (мг) на грамм сухого веса водорослей. BF также экстрагировали с использованием ранее описанного метода для сравнения. Этот метод включал лиофилизацию образца биомассы и экстрагирование BF в метанол путем контактирования биомассы с метанолом в течение 72 часов.
На фиг.1 показано, что биомасса Asparagopsis, экстрагированная водой, давала меньше BF, чем биомасса Asparagopsis, экстрагированная маслом; концентрация BF, экстрагированного из биомассы Asparagopsis в масло, увеличивается по сравнению с концентрацией BF, экстрагированного из эквивалентного количества биомассы в воду. Эти данные демонстрируют экстрагирование BF, биологически активного вещества, из биомассы Asparagopsis в масло с образованием масляной композиции Asparagopsis.
При использовании в качестве экстракционного растворителя интактная или гомогенизированная биомасса давала аналогичные результаты. Количество BF, экстрагированного из этих образцов, было примерно на 50% ниже, чем при использовании масла в качестве растворителя (через 24 ч), и оставалось примерно на 30-40% ниже в течение времени замачивания (до 10 дня).
На фиг.1 также показано, что гомогенизация биомассы в масле привела к получению наибольшего количества бромоформа, экстрагированного за самый короткий промежуток времени (1 день), при этом содержание BF в интактной биомассе в масле достигает концентраций, аналогичных гомогенизированной биомассе, только после примерно семи дней замачивания/экстрагирования. Эти данные демонстрируют, что скорость экстрагирования BF, биологически активного вещества, из биомассы Asparagopsis в масло увеличивается за счет гомогенизации биомассы, по меньшей мере, в одном масле.
На фиг.1 также показано, что эффективность экстрагирования при использовании масла зависела от того, была ли биомасса интактной или гомогенизированной. Неожиданно оказалось, что гомогенизированная биомасса, экстрагированная маслом, давала намного больше BF даже через 24 ч по сравнению с методами экстрагирования лиофилизированной биомассы метанолом в течение 72 ч. Как видно из фиг.1, лиофилизированный образец, экстрагированный замачиванием в метаноле в течение 72 ч, давал только около 15 мг BF/г водорослей (dw), в то время как гомогенизированный образец водорослей, замоченный в масле только в течение 24 ч, давал около 17,8 мг BF/г водорослей (dw), что представляет собой значительное улучшение по сравнению с экстрагированием лиофилизированной биомассы метанолом. Эти данные демонстрируют, что степень экстрагирования BF, биологически активного вещества, из биомассы Asparagopsis в масло увеличивается за счет гомогенизации биомассы, по меньшей мере, в одном масле.
ПРИМЕР 2. СРОК ХРАНЕНИЯ МАСЛЯНОЙ КОМПОЗИЦИИ ASPARAGOPSIS
Оценивали срок хранения (например, стабильность) масляных композиций Asparagopsis по настоящему изобретению. Соотношение биологически активных соединений, таких как бромоформ (BF) и дибромхлорметан (DBCM), исследовали и сравнивали с внутренним стандартом (IS; нафталин) в зависимости от времени. Любое уменьшение соотношения указывает на потерю соединения и, следовательно, на снижение стабильности биологически активных масляных композиций, что приводит к сокращению срока хранения.
По истечении 10 дней экстрагирования биомассы Asparagopsis в масло или воду биомассу удаляли. Масляные композиции Asparagopsis (с биомассой) фильтровали через нейлоновую сетку размером 100 мкм с последующим центрифугированием (3200 g, 15 мин). Осветленный раствор от каждой повторности каждой обработки (масло или вода) затем разделяли на две стеклянные бутылки объемом 30 мл (Schott), причем одну из этих бутылок хранили при температуре 4°C, а другую при температуре 25°C (n=3 для каждой температуры, всего 24 бутылки). Суб-образцы (1 мл) отбирали через 0, 4, 8, 12 и 65 недель хранения и анализировали, как описано выше. Неделя 0 отсчитывалась от дня начала хранения, как показано в экспериментальной схеме ниже:
Эксперимент 2: срок хранения
Лиофилизированную биомассу также анализировали на содержание бромоформа в те же интервалы времени, причем неделя 0 отсчитывалась от дня удаления биомассы из лиофильной сушилки.
Лиофилизированная биомасса, хранившаяся при -20°C в соответствии со стандартным методом хранения, не демонстрировала потерь со временем при использовании стандартного метода экстрагирования метанолом (данные не представлены).
На фиг.3 показана стабильность масляной композиции Asparagopsis по настоящему изобретению с течением времени. Как можно видеть для водных экстрактов, наблюдались значительные потери биологически активного вещества, бромоформа, к 12 неделе хранения как при 4°C, так и при 25°C. Поэтому дальнейший анализ проб воды для этих образцов не проводился.
И наоборот, концентрация биологически активного вещества, бромоформа, экстрагированного в масло, для любой обработки (гомогенизированной или интактной) существенно не снижалась в течение 12 недель независимо от хранения при 4°C или 25°C (фиг. 3). Неожиданно через 65 недель не наблюдалось значительного снижения содержания бромоформа в масляных композициях Asparagopsis, хранящихся при 4°C для любой обработки (гомогенизированной или интактной). Масляные композиции Asparagopsis, хранящиеся при 25°C в течение 65 недель, потеряли от 15% до 20% экстрагированного исходного бромоформа. Очевидное «увеличение» BF с течением времени можно отнести к аналитической дисперсии. Эти данные демонстрируют, что масляные композиции Asparagopsis, образованные экстрагированием Asparagopsis в масло, стабильны в течение длительных периодов времени. В частности, эти данные демонстрируют, что концентрации биологически активного вещества, BF, в масляных композициях Asparagopsis, образованных экстрагированием Asparagopsis в масло, стабильны в течение длительных периодов времени.
Результаты определения соотношения DBCM:IS с течением времени показаны на фиг.4 (интактная биомасса) и фиг.5 (гомогенизированная биомасса). DBCM обнаруживали в течение периода хранения 65 недель. Важно отметить, что не было статистически значимого различия в соотношении DBCM:IS в каждой обработке (интактная биомасса по сравнению с гомогенизированной биомассой или хранение при 4°C по сравнению с 25°C), что демонстрирует превосходный срок хранения для всех образцов с использованием DBCM в качестве маркера для антиметаногенных компонентов. Очевидное «улучшение» соотношения DBCM:IS с течением времени можно отнести к аналитической дисперсии. Эти данные демонстрируют, что концентрации DBCM в масляных композициях Asparagopsis, образованных экстрагированием Asparagopsis в масло, стабильны в течение длительных периодов времени.
На фиг.6 и 7 показано экстрагирование DBA, биологически активного вещества, из биомассы Asparagopsis в масло с образованием масляной композиции Asparagopsis.
Учитывая приведенные выше результаты, можно видеть, что осветленные масляные композиции (то есть с удаленной биомассой Asparagopsis) имели стабильный срок хранения не менее одного года (65 недель) при 4°C и не менее 12 недель при комнатной температуре (25°C). Напротив, водные экстракты оставались стабильными в течение 8 недель и после этого ухудшались, независимо от температуры хранения. Этот результат является неожиданным, поскольку ожидается, что хранение при более низких температурах, независимо от носителя (на водной или масляной основе), должно обеспечить более длительный срок хранения.
ПРИМЕР 3. МАКСИМАЛЬНОЕ ЭКСТРАГИРОВАНИЕ БИОМАССЫ В МАСЛО
Для количественного определения максимального количества биомассы Asparagopsis, которое можно экстрагировать, использовали метод экстрагирования из примера 1, который обеспечивал самую высокую концентрацию биологически активного вещества (бромоформа), обнаруженную в масле за самый короткий промежуток времени (например, гомогенизация и экстрагирование в масло).
Asparagopsis taxiformis (стадия гаметофита) собирали на Магнитном острове (Квинсленд, Австралия). Сырую биомассу промокали насухо, и образцы нижеуказанного веса помещали в отдельные стеклянные бутылки объемом 250 мл, предварительно заполненные 100 мл растительного масла: 30,0 г, 60,0 г, 90,0 г и 120,0 г сырого веса (n=3 для каждого значения). Все бутылки прочно закрывали и хранили на льду для немедленной транспортировки в лабораторию с целью дальнейшей обработки и анализа. Повторности образцов (n=3) подвергнутой промоканию насухо биомассы (30,0 г сырого веса) также отбирали для определения сухого веса, как показано в приведенной ниже схеме эксперимента:
Эксперимент 3: максимальное увеличение соотношения биомасса:масло
В лаборатории биомассу гомогенизировали (IKA ultra-turrax T-25) в масле, и образцы хранили при 4°C в течение 24 часов до количественного определения бромоформа, как описано выше.
На фиг.8 и 9 показано количество биологически активного вещества (бромофор), экстрагированного из различных количеств биомассы Asparagopsis (в одинаковом объеме масла). На фиг.8 показано, что увеличение соотношения биомасса Asparagopsis:масло привело к соответствующему увеличению количества биологически активного вещества, экстрагированного в масло. Эти данные демонстрируют, что концентрация биологически активного вещества, бромоформа, из биомассы Asparagopsis в масло повышается за счет увеличения соотношения биомассы к маслу.
При более высоких соотношениях биомасса:масло образовывался твердый непрозрачный гель, и полностью гомогенизировать биомассу в масло не представлялось возможным. Например, твердый непрозрачный гель образовывался, когда 90 г или 120 г гомогенизированной биомассы гомогенизировали в 100 мл масла. Это гелеобразование также сильно затрудняло выделение 1 мл осветленного масла, которое требовалось для разделения метанолом для анализа ГХ/МС.
Суб-образцы из обработки 120 г, содержащие гель, нагревали (1 ч, 60°C, водяная баня) перед центрифугированием. Это привело к увеличению выхода биологически активных веществ в масле на 20% по сравнению с центрифугированием ненагретых образцов (см. фиг.8 и 9). Asparagopsis содержит сульфатированные полисахариды клеточных стенок, которые обычно растворимы в воде. Не желая быть связанными теорией, предполагается, что гель/эмульсия образуется между экстрагированными полисахаридами, маслом и остаточной внешней и внутренней водой сверху и внутри биомассы. Экстрагирование более высоких количеств полисахаридов при более высоком соотношении биомасса:масло приводило к образованию геля. Понятно, что гель содержит биологически активные вещества (такие как бромоформ); при нагревании гель высвобождает бромоформ, который затем переносится в масло из масляной композиции Asparagopsis.
ПРИМЕР 4. ИССЛЕДОВАНИЕ СНИЖЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ МЕТАНА МАСЛЯНОЙ КОМПОЗИЦИИ ASPARAGOPSIS IN VIVO
Фистулированные бычки (Bos indicus) используются в исследовании кормления in vivo. До начала экспериментального периода все животные проходят фистуляцию и тренировки в дыхательных камерах. Первоначально бычков держат на сене из травы Флиндерс в групповых загонах (скотных дворах) в течение четырех дней. Затем бычков разделяют на две группы и распределяют по группам обработки, контроля (только сено из травы Флиндерс) и добавления масляной композиции Asparagopsis. Выбор дозы масляной композиции Asparagopsis основан на результатах, полученных в предыдущем исследовании in vitro, изучающем способность снижения метана.
Соотношение сырого веса к сухому весу подвергнутой промоканию насухо Asparagopsis составляет 10 (то есть. 30 г сырого веса=3 г сухого веса). Предполагая, что содержание органического вещества (ОВ) составляет 80% от сухого веса (Machado и др., 2014), соответствующее содержание ОВ, происходящего из Asparagopsis, в испытуемых смесях биомассы/масла находится в диапазоне 0,024-0,096 г ОВ/мл (таблица 1):
Таблица 1.
Содержание органического вещества, происходящего из биомассы Asparagopsis, в смесях биомасса/масло при повышенных соотношениях и объеме**, необходимом для дозы в корме, эквивалентной 0,1-3% ОВ Asparagopsis
**Этот объем зависет от масла, отделяемого от биомассы. Например, добавление 120 г сырого веса морских водорослей в 100 мл масла увеличивает конечный объем смеси. Будучи на 90% водой (соотношение fw:dw равно 10), и для простоты расчета предполагается, что плотность Asparagopsis равна воде, и, следовательно, объем смеси биомасса:масло должен увеличиваться соответственно количеству добавленной биомассы (то есть 100 мл масла+150 г сырого веса Asparagopsis=250 мл смеси, что соответствует 15 г сырого веса Asparagopsis=12 г ОВ Asparagopsis/250 мл=0,048 г ОВ Asparagopsis/мл гомогенной смеси).
Исходя из данных, рассмотренных выше, за пределами соотношения биомасса:масло 150 г сырого веса:100 мл, гомогенная смесь может не образоваться. Доза 1% ОВ Asparagopsis применима при соотношении биомасса:масло ≥120 г/100 мл. Было продемонстрировано, что доза 0,2% ОВ Asparagopsis эффективна для ингибирования метаногенеза у животных in vivo, поэтому объем всего лишь 2,08 мл масла (или 4,6 мл смеси биомасса/масло) необходимо добавить в 100 г корма для смеси 120 г биомассы/100 мл масла.
Для расчета объема масла, необходимого для получения дозы, эквивалентной требуемой концентрации в % органического вещества, вводимого жвачному животному, количество в % органического вещества в масляных композициях Asparagopsis, описанных здесь, рассчитывают из сырого веса (fw) биомассы Asparagopsis, контактирующей с определенным объемом, по меньшей мере, одного масла. Соотношение сырого веса к сухому весу (dw) подвергнутой промоканию насухо Asparagopsis составляет 10 (те есть 30 г fw=3 г dw). Предполагая, что содержание органического вещества (ОВ) составляет 80% от dw на основе предыдущих данных, можно рассчитать соответствующее содержание ОВ, происходящего из Asparagopsis, в биомассе/масле. Например, для масляной композиции Asparagopsis, содержащей 30 г сырого веса (fw) биомассы Asparagopsis в 100 мл, по меньшей мере, одного масла эквивалентно 0,024 органического вещества Asparagopsis/мл. Если требуемая концентрация включения в корм составляет 0,1% ОВ Asparagopsis в 100 г корма, то на 100 г корма требуется 4,17 мл ОВ Asparagopsis 30 г fw/100 мл.
Бычков распределяют в отдельные загоны на исследовательской станции с неограниченным количеством сено из травы Флиндерс и воды. Животным, получающим добавку масляную композицию Asparagopsis, вводят дозу непосредственно в рубец перед утренним кормлением для обеспечения полностью потребления масляной композиции Asparagopsis и единообразия приема препарата животными, или масляную композицию Asparagopsis добавляют в корм, как описано выше. Перед входом в дыхательные камеры открытого цикла для измерения продуцирования метана в течение 48 часов проводится период адаптации в течение 14 дней к различным рационам. Продуцирование метана животными измеряют через 7, 14, 21 и/или 29 дней обработки для оценки эффективности масляной композиции Asparagopsis в снижении образования метана у животных с течением времени. Через 31 день масляная композиция Asparagopsis заканчивается, и животных переводят в загоны. Образцы рубца отбирают через 4 ч после введения масляной композиции Asparagopsis внутрь рубца или после кормления (например, на 1, 15, 22 и 30 день обработки масляной композиции Asparagopsis) для оценки изменений в продуцировании ЛЖК и соотношении ацетата к пропионату. Живой вес, а также предлагаемый и отвергнутый корм измеряются ежедневно, а общее потребление сухого вещества (СВ) и общее потребление органического вещества (ОВ) рассчитывается для определения среднего индивидуального потребления СВ и ОВ. Во всех контрольных моментах времени рассчитывается среднее продуцирование метана.
ПРИМЕР 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СНИЖЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ МЕТАНА МАСЛЯНОЙ КОМПОЗИЦИИ ASPARAGOPSIS IN VIVO У ОВЕЦ
Методология
Мериносовые кроссы выделяют в одну из пяти групп на основе суточной нормы включения (органическое вещество в пересчете на ОВ) масляной композиции Asparagopsis [0 (контроль), 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0%]. Коэффициенты включения (% потребления ОВ) рассчитываются, как показано, с использованием расчетов, приведенных в таблице 1 и примере 4.
Овец содержат в условиях помещений для животных и кормят гранулированным имеющимся на рынке поставляемым рационом на основе люпина, овса, ячменя, пшеницы с соломой зерновых культур в качестве грубого компонента [химический состав (г/кг СВ) золы, 72; сырой протеин (СП) 112; нейтральная детергентная клетчатка (aNDFom) 519; кислотное детергентная клетчатка (ADFom) 338 и без кобальта, селена и рубцовых модификаторов] при 1,2-кратном содержании на протяжении всего исследования. Всем овцам вводят дозу с использованием кобальтовой пилюли до начала экспериментального периода.
Овец постепенно адаптируют к масляной композиции Asparagopsis в течение первых двух недель путем смешивания измельченного материала с 200 г измельченного люпина (люпиновый рацион). Затем в гранулированный рацион добавляют смесь масляной композиции Asparagopsis и люпина, перемешивают и скармливают в течение еще 75 дней.
Потребление корма регистрируют ежедневно, а живую вес (ЖВ) измеряют с интервалом в 14 дней на протяжении всего испытания.
Проводят три измерения индивидуального продуцирования метана животными (потребление г/кг СВ), первое после 30 дней включения масляной композиции Asparagopsis, а затем с интервалом 21 день в течение всего периода испытания. При измерении метана в течение 24 часов с использованием дыхательных камер открытого цикла, как описано Li (2013) [PhD thesis; Eremophila glabra reduced methane production in sheep, University of Western Australia] предлагаемый корм (гранулы/люпин) пропорционально сокращается до 1,0-кратного содержания для обеспечения постоянного потребления.
После каждого измерения метана через желудочный зонд отбирают до 50 мл рубцовой жидкости для определения концентрации летучих жирных кислот (ЛЖК).
Статистический анализ
Статистический анализ проводится путем подгонки линейных смешанных моделей к каждой переменной отклика. Эти модели могут учитывать дизайн эксперимента (распределение животных по определенным группам и камерам), структуру данных (повторные измерения) и любые пропущенные значения, которые возникают. «Фиксированные эффекты» в смешанной модели включали эффект обработки (различные нормы включения Asparagopsis taxiformis), эффект времени (даты отбора проб), зависимость эффекта обработки от времени и любые ковариаты. Начальный живой вес включается в качестве ковариата при анализе живого веса. Он также проверяется в качестве потенциального ковариата для других переменных отклика.
Рассчитываются средние значения для всех комбинаций обработки и времени с поправкой на все остальные условия в модели. P-значения рассчитываются для проверки общего эффекта времени, обработки и их зависимости. Наименее статистически значимые различия (P=0,05) рассчитываются для сравнения пар средних значений.
Измеряются следующие показатели:
потребление корма, содержащего масляную композицию Asparagopsis,
сухое вещество, разрушенное in vivo,
живой вес животных,
общая концентрация ЛЖК,
молярные соотношения отдельных ЛЖК (включая ацетат, пропионат), исключая изобутират,
выбросы метана (потребление СВ г/кг).
Изобретение относится к сельскохозяйственной промышленности. Способ получения масляной композиции Asparagopsis, включающий стадии: обеспечения биомассы Asparagopsis; обеспечения по меньшей мере одного масла; и контактирования биомассы по меньшей мере с одним маслом в условиях экстрагирования по меньшей мере одного биологически активного вещества из биомассы по меньшей мере в одно масло с образованием масляной композиции Asparagopsis, где по меньшей мере одно биологически активное вещество включает бромоформ. Масляная композиция Asparagopsis, содержащая по меньшей мере одно экзогенное масло и по меньшей мере один антиметаногенный компонент, где по меньшей мере один антиметаногенный компонент включает бромоформ. Кормовая добавка для снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, указанная добавка содержит эффективное количество масляной композиции Asparagopsis. Корм для жвачных животных, где в указанный корм добавляют кормовую добавку, содержащую эффективное количество масляной композиции Asparagopsis. Способ снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачного животного, включающий введение указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis. 6 н. и 46 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.
1. Способ получения масляной композиции Asparagopsis, включающий стадии:
(а) обеспечения биомассы Asparagopsis;
(b) обеспечения по меньшей мере одного масла; и
(c) контактирования биомассы по меньшей мере с одним маслом в условиях экстрагирования по меньшей мере одного биологически активного вещества из биомассы по меньшей мере в одно масло с образованием масляной композиции Asparagopsis, где по меньшей мере одно биологически активное вещество включает бромоформ.
2. Способ по п.1, в котором стадия (с) включает гомогенизацию биомассы по меньшей мере в одном масле.
3. Способ по п.1, дополнительно включающий после стадии (с) стадию отделения указанной биомассы от указанной по меньшей мере одной масляной композиции Asparagopsis.
4. Способ по п.1, в котором соотношение биомассы по меньшей мере к одному маслу составляет более 0,3 г:1 мл, более 0,6 г:1 мл, более 0,9 г:1 мл или более 1,2 г:1 мл.
5. Способ по п.1, в котором стадию (с) проводят в течение периода по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.
6. Способ по п.1, в котором стадию (с) проводят при температуре около 4°С.
7. Способ по любому из пп.3-6, в котором до стадии отделения указанной биомассы от указанного по меньшей мере одного масла биомассу, контактирующую по меньшей мере с одним маслом, нагревают таким образом, что гель, содержащий по меньшей мере одно биологически активное вещество, высвобождает указанное по меньшей мере одно биологически активное вещество по меньшей мере в одно масло.
8. Способ по п.7, в котором биомассу, контактирующую по меньшей мере с одним маслом, нагревают до температуры 60°С.
9. Способ по п.7 или 8, в котором биомассу, контактирующую по меньшей мере с одним маслом, нагревают в течение одного часа.
10. Способ по п.1, в котором указанный Asparagopsis представляет собой Asparagopsis taxiformis и/или Asparagopsis armata.
11. Способ по п.1, в котором стадия обеспечения биомассы Asparagopsis не включает сушку биомассы на воздухе.
12. Способ по п.1, в котором стадия обеспечения биомассы Asparagopsis включает введение биомассы по меньшей мере в одно масло.
13. Способ по п.1, в котором по меньшей мере одно масло включает пищевое масло.
14. Способ по п.13, в котором пищевое масло выбирают из группы, состоящей из миндального масла, абрикосового масла, арганового масла, масла авокадо, масла бразильского ореха, канолового масла, масла кешью, кокосового масла, сурепного масла, кукурузного масла, масла копры, хлопкового масла, диацилглицеринового масла, льняного масла, масла косточек грейпфрута, масла виноградных косточек, масла фундука, конопляного масла, лимонного масла, масла льняных семян, масла макадамии, горчичного масла, оливкового масла, апельсинового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, арахисового масла, масла ореха пекан, масла кедрового ореха, фисташкового масла, масла семян тыквы, рапсового масла, масла рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла, подсолнечного масла, масла грецкого ореха и растительного масла или любой их комбинации.
15. Способ по п.1, в котором по меньшей мере одно биологически активное вещество дополнительно включает бромхлоруксусную кислоту (BCA), дибромуксусную кислоту (DBA) и/или дибромхлорметан (DBCM).
16. Способ по п.1, в котором концентрация по меньшей мере одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы по меньшей мере в одно масло, увеличивается относительно концентрации по меньшей мере одного биологически активного вещества, экстрагированного из эквивалентного количества биомассы в воду.
17. Способ по п.1, в котором концентрация по меньшей мере одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы по меньшей мере в одно масло, существенно не снижается после хранения в течение 12 недель при 25°C.
18. Способ по п.1, в котором концентрация по меньшей мере одного биологически активного вещества, экстрагированного из биомассы по меньшей мере в одно масло, существенно не снижается после хранения в течение 65 недель при 4°С.
19. Способ по любому из пп.1-18, в котором по меньшей мере одно биологически активное вещество является антиметаногенным компонентом.
20. Способ по п.19, в котором антиметаногенный компонент дополнительно включает DBCM.
21. Способ по п.19, в котором концентрация антиметаногенного компонента, экстрагированного из биомассы по меньшей мере в одно масло, не снижается более чем на 20% после хранения в течение 65 недель при 25°С, при этом по меньшей мере один антиметаногенный компонент представляет собой BF и/или DBCM.
22. Способ по п.1, в котором масляная композиция Asparagopsis содержит по меньшей мере 0,1 мг бромоформа на 1 мл масляной композиции Asparagopsis.
23. Способ по п.1, в котором масляная композиция Asparagopsis содержит по меньшей мере 1 мг бромоформа на 1 мл масляной композиции Asparagopsis.
24. Способ по п.1, в котором масляная композиция Asparagopsis содержит по меньшей мере 2 мг бромоформа на 1 мл масляной композиции Asparagopsis.
25. Способ по п.1, в котором масляная композиция Asparagopsis содержит по меньшей мере 3 мг бромоформа на 1 мл масляной композиции Asparagopsis.
26. Способ по п.1, в котором масляная композиция Asparagopsis содержит по меньшей мере 4 мг бромоформа на 1 мл масляной композиции Asparagopsis.
27. Масляная композиция Asparagopsis, полученная способом по любому из пп.1-26.
28. Масляная композиция Asparagopsis, содержащая по меньшей мере одно экзогенное масло и по меньшей мере один антиметаногенный компонент, где по меньшей мере один антиметаногенный компонент включает бромоформ.
29. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, где указанный Asparagopsis представляет собой Asparagopsis taxiformis и/или Asparagopsis armata.
30. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере одно масло включает пищевое масло.
31. Масляная композиция Asparagopsis по п.30, в которой пищевое масло выбирают из группы, состоящей из миндального масла, абрикосового масла, арганового масла, масла авокадо, масла бразильского ореха, канолового масла, масла кешью, кокосового масла, сурепного масла, кукурузного масла, масла копры, хлопкового масла, диацилглицеринового масла, льняного масла, масла косточек грейпфрута, масла виноградных косточек, масла фундука, конопляного масла, лимонного масла, масла льняных семян, масла макадамии, горчичного масла, оливкового масла, апельсинового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, арахисового масла, масла ореха пекан, масла кедрового ореха, фисташкового масла, масла семян тыквы, рапсового масла, масла рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла, подсолнечного масла, масла грецкого ореха и растительного масла или любой их комбинации.
32. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент выбирают из группы, состоящей из бромхлоруксусной кислоты (BCA), бромоформа (BF), дибромуксусной кислоты (DBA) и дибромхлорметана (DBCM).
33. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой концентрация по меньшей мере одного антиметаногенного компонента существенно не снижается после хранения в течение 12 недель при 25°С.
34. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой концентрация по меньшей мере одного антиметаногенного компонента существенно не снижается после хранения в течение 65 недель при 4°С.
35. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент представляет собой BF и/или DBCM.
36. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой концентрация по меньшей мере одного антиметаногенного компонента не снижается более чем на 20% после хранения в течение 65 недель при 25°С, при этом по меньшей мере один антиметаногенный компонент представляет собой BF и/или DBCM.
37. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой концентрация по меньшей мере одного антиметаногенного компонента не снижается более чем на 50% после хранения в течение 65 недель при 4°С или 25°С, при этом по меньшей мере один антиметаногенный компонент является DBA.
38. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент имеет концентрацию по меньшей мере 0,1 мг на 1 мл экстракта.
39. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент имеет концентрацию по меньшей мере 1 мг на 1 мл экстракта.
40. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент имеет концентрацию по меньшей мере 2 мг на 1 мл экстракта.
41. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент имеет концентрацию по меньшей мере 3 мг на 1 мл экстракта.
42. Масляная композиция Asparagopsis по п.28, в которой по меньшей мере один антиметаногенный компонент имеет концентрацию по меньшей мере 4 мг на 1 мл экстракта.
43. Кормовая добавка для снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачных животных, указанная добавка содержит эффективное количество масляной композиции Asparagopsis по п.27 или 28.
44. Корм для жвачных животных, где в указанный корм добавляют кормовую добавку по п.43.
45. Способ снижения общего образования газа и/или образования метана у жвачного животного, включающий введение указанному жвачному животному эффективного количества масляной композиции Asparagopsis по п.27 или 28.
46. Способ по п.45, в котором способ включает поддержание эффективной концентрации требуемой летучей жирной кислоты.
47. Способ по п.46, в котором требуемая летучая жирная кислота включает ацетат и пропионат и в котором поддержание включает уменьшение соотношения ацетата к пропионату.
48. Способ по любому из пп.45-47, где способ включает поддержание концентрации расщепленного органического вещества и/или сухого вещества.
49. Способ по любому из пп.45-48, в котором масляную композицию Asparagopsis вводят в дозе, эквивалентной по меньшей мере 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% или 0,067% органического вещества, вводимого жвачному животному.
50. Способ по любому из пп.45-49, в котором указанное жвачное животное выбирают из представителей подотряда жвачные (Ruminantia) и мозоленогие (Tylopoda).
51. Способ по любому из пп.45-49, в котором указанное жвачное животное представляет собой крупный рогатый скот или овцу.
52. Способ по любому из пп.45-49, в котором указанное жвачное животное представляет собой крупный рогатый скот.
| Способ получения профилактического продукта из черноморских водорослей рода Cystoseira (варианты) | 2016 |
|
RU2658705C2 |
| WO 2015109362 A3, 30.07.2015 | |||
| US 20170347684 A1, 07.12.2017 | |||
| Руководство по технологии получения и переработки растительных масел и жиров, Том 1, кн | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Наук проф | |||
| А | |||
| Г | |||
| Сергеева, Ленинград, 1974, стр | |||
| Прибор для промывания газов | 1922 |
|
SU20A1 |
