Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения композиций, содержащих секреторный IgA и один или более пробиотиков. В частности, изобретение относится к способам получения композиций, в которых ассоциированы секреторный IgA и один или более пробиотиков. Изобретение также относится к композициям, полученным такими способами, и применениям таких композиций, например, для ослабления или профилактики невирусной инфекции и/или воспаления.
Предпосылки создания изобретения
Инфекции в целом представляют собой нежелательные колонизации организма-хозяина посторонними видами. Обычно инфицирующий организм пытается использовать ресурсы организма-хозяина для своего собственного размножения. Тем самым инфицирующий организм, или патоген, может нарушать нормальное функционирование организма-хозяина и может приводить к дополнительным связанным с инфицированием расстройствам, которые могут иметь различную степень тяжести и в худшем случае могут привести к смерти.
Воспаление представляет собой комплексный биологический ответ тканей на опасные стимулы, такие как патогены, поврежденные клетки или раздражители. В целом воспаление является защитной попыткой организма удалить вредоносные стимулы, а также запустить процесс восстановления пораженной ткани. Однако нарушение регуляции воспаления может привести к серьезным заболеваниям независимо от возраста субъекта.
Одним из путей достижения целей по профилактике и лечению инфекции и/или воспаления является введение композиции, содержащей пробиотики.
Известно, что пробиотические микроорганизмы оказывают благоприятный эффект на здоровье и общее состояние организма-хозяина. Использование бактерий-пробиотиков привлекает значительное внимание как безопасная и доступная форма профилактики или лечения, например, заболеваний пищеварительной системы s (Isolauri E, et al., Dig Dis Sci 1994,39:2595-2600). Типичные используемые для этого бактерии-пробиотики принадлежат родам Lactobacillus или Bifidobacterium.
Эффективность пробиотиков, во-первых, частично зависит от их способности выдерживать условия пищеварительного тракта и закрепляться на кишечном эпителии. Дополнительными критическими аспектами, определяющими потенциальную пользу пробиотиков для организма-хозяина, являются их влияние на барьерную функцию эпителия и их взаимодействие с иммунной системой слизистой оболочки организма-хозяина.
Хотя некоторые пробиотики уже достигли впечатляющих результатов в отношении стимулирования или смягчения реакции иммунной системы организма-хозяина, желательно дополнительно повысить эффективность, с которой микроорганизмы-пробиотики могут взаимодействовать со слизистой оболочкой организма-хозяина и тем самым оказывать на него положительное воздействие.
Антитела часто являются гликопротеинами, которые специфически распознают свои антигены. У позвоночных описаны пять классов иммуноглобулинов, включая иммуноглобулины IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, все из которых различаются по своей функции в иммунной системе.
Одной из наиболее характерных особенностей иммунной системы слизистой оболочки у большинства млекопитающих является доминирующее присутствие секреторных антител, в частности секреторного IgA (SIgA) — класса антител, уникального для слизистых оболочек. Биосинтез полимерного IgA (pIgA) происходит в собственной пластинке слизистой оболочки, а его транспорт через выстилающий поверхности слизистой оболочки эпителий обеспечивает рецептор полимерного Ig (pIgR), экспрессируемый на базолатеральной стороне крипт и столбчатых клеток эпителия. Во время транспорта комплекса pIgR-pIgA к апикальной поверхности клеток внеклеточная часть pIgR, называемая секреторным компонентом (SC), отщепляется и остается ассоциированной с полимерным IgA, тем самым высвобождая SIgA в просвет слизистой.
Часть авторов настоящего изобретения ранее идентифицировали антитела SIgA, способные ассоциироваться и образовывать комплексы со штаммами комменсальных бактерий. В частности, было обнаружено, что антитела SIgA, будучи ассоциированными с пробиотиками, стимулируют взаимодействие и последующее взаимное влияние пробиотиков на организм-хозяин, что способствует повышению полезного для здоровья эффекта пробиотиков, такого как запуск иммунностимулирующего эффекта против инфекций или профилактика любого потенциально опасного воспалительного процесса (WO2009/156301 и WO2009/156307).
Весьма сложно получать детские смеси, содержащие биоактивные ингредиенты, такие как SIgA, при этом следуя требованиям действующих стандартов качества и нормативных документов, а именно в отношении микробиологического загрязнения. Действительно, обычно используемые в настоящее время способы получения коммерческих порошковых детских смесей применяют высокотемпературную обработку (такую как, например, 145°C в течение 6 с), которая абсолютно губительна для биоактивного SIgA. Таким образом, желательно предложить способ, который позволит получать SIgA, имеющий требуемый уровень стерильности для детского питания, сохраняя при этом его биоактивность и, таким образом, способность усиливать полезный для здоровья эффект пробиотиков после ассоциирования с ними. Также желательно оптимизировать способ производства питательных композиций, содержащих биоактивный SIgA, ассоциированный с пробиотиками. Действительно, SIgA не присутствует в существующих детских смесях (ДС) из-за входящих в способ производства детских смесей этапов термообработки.
Также имеется потребность в улучшении условий ассоциирования SIgA и пробиотиков с образованием комплексов, в частности, для получения комплексов, имеющих оптимизированную биоактивность. Действительно, сложность матричного окружения и температура могут оказывать большое влияние на динамику ассоциирования пробиотиков и SIgA и тем самым эффективность комплексов.
Изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали улучшенный способ для получения композиций, содержащих биоактивный SIgA и один или более пробиотиков, в частности способ, который приводит к оптимизированному ассоциированию SIgA и пробиотика. Такой способ приводит к композициям, содержащим комплексы пробиотик-SIgA с оптимизированной биоактивностью для усиления полезных для здоровья эффектов пробиотиков и с уровнем микробиологической безопасности, подходящей для применения в продуктах для потребителей с повышенной чувствительностью, таких как детские смеси.
В одном аспекте в изобретении предложен способ получения композиции, содержащей секреторный IgA и пробиотик, причем способ включает стадии:
(a) обеспечения источника SIgA в форме молока или его фракции;
(b) необязательно микрофильтрации молока;
(c) пастеризации молока при температуре 61–200°C;
(d) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C;
(e) смешивания с пробиотиком, причем смешивание выполняют при температуре 1–45°C в течение 10–1440 мин; и
(f) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C.
В другом аспекте в изобретении предложена композиция, полученная или получаемая с использованием способа настоящего изобретения.
В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям, получаемым или полученным с использованием способа настоящего изобретения, для применения в модуляции, ослаблении, профилактике и/или лечении инфекций и/или воспаления.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предложен продукт, содержащий композицию, полученную с использованием способа настоящего изобретения.
Описание графических материалов
Фиг. 1 - схематическое изображение предполагаемого механизма, приводящего к улучшению эффектов пробиотиков от SIgA при ассоциировании с ними, за счет усиления взаимодействия со слизистой оболочкой кишечника организма-хозяина. Показаны возможные и задокументированные пути взаимодействия SIgA, ассоциированного с комменсальными бактериями, со слизистой оболочкой кишечника организма-хозяина.
Фиг. 2 - результаты валидационного испытания, разработанного для проверки способности биологического анализа экскреции тимусного стромального лимфопоэтина (TSLP) оценивать улучшение эффективности пробиотиков при их ассоциировании с SIgA, как указано во вводной части раздела с примерами. По сравнению с обычными клетками эпителия (без пробиотиков), добавление только пробиотиков стимулировало продукцию тимусного стромального лимфопоэтина (TSLP) клетками эпителия. Ассоциирование увеличиваемого количества очищенного интактного SIgA с одним и тем же количеством пробиотиков повышает продукцию TSLP клетками эпителия дозозависимым образом.
Фиг. 3 - результаты выхода SIgA по данным ИФА (фиг. 3A) и логарифмическое снижение микробиологической нагрузки (фиг. 3B) в молоке после микрофильтрации с различными мембранами при температуре от 52 до 55°C, как описано в примере 2.
Фиг. 4 - результаты количественного измерения методами полуколичественного ИФА и биологического анализа экскреции TSLP в молоке после термообработки в различных условиях по продолжительности и температуре, как описано в примере 3, позволяющие провести относительное сравнение между количественными данными ИФА и биоактивности для различных образцов по сравнению с необработанным методом RO молоком (стандартный образец).
Фиг. 5 - результаты биологического анализа экскреции TSLP после проведения стадии ассоциирования путем инкубации обезжиренного методом RO молока и смесей BL818 в различных условиях по продолжительности и температуре, как описано в примере 4, по сравнению только с BL (BL818, не ассоциированные с SIgA) и с контролем из обычных клеток, причем в биоанализ не добавляют ни BL, ни SIgA.
Фиг. 6 - результаты биологического анализа экскреции TSLP после проведения стадии ассоциирования с различными концентрациями BL818, как описано в примере 5.
Фиг. 7 - результаты биологического анализа экскреции TSLP комплексов, образованных между SIgA и жидкой либо высушенной распылительной сушкой биомассой, как описано в примере 6.
Фиг. 8 - результаты измерений методом иммуноферментных пятен (ELISPOT), позволяющие провести оценку влияния на формирование иммунной системы как на уровне слизистой оболочки (PP; фиг. 8A), так и на системном уровне (кровь; фиг. 8B) при дополнительном употреблении в раннем возрасте прототипов различных детских смесей, содержащих только пробиотики, только SIgA или их сочетание, как описано в примере 7.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе термины «содержащий», «содержит» и «состоящий из» являются синонимами терминов «включающий в себя» или «включает в себя»; или «заключающий в себе» или «заключает в себе», и они являются включающими, или неограничивающими, и не исключают дополнительных неприведенных членов, элементов или стадий. Термины «содержащий», «содержит» и «состоящий из» также включают в себя термин «имеющий в составе».
Способ
В изобретении предложен способ получения композиции, содержащей секреторный IgA и пробиотик, причем способ включает стадии:
(a) обеспечения источника SIgA в форме молока или его фракции;
(b) необязательно микрофильтрации молока;
(c) пастеризации молока при температуре 61–200°C;
(d) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C;
(e) смешивания с пробиотиком, причем смешивание выполняют при температуре 10–45°C в течение 10–1440 мин; и
(f) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C.
Обеспечение источника SIgA
Иммуноглобулин A (IgA) представляет собой антитело, которое играет важную роль в иммунной функции слизистых оболочек. IgA можно разделить на сывороточный IgA и секреторный IgA.
Было обнаружено, что секреторный IgA (SIgA), который является преобладающим и более стабильным иммуноглобулином в секретах слизистой оболочки кишечника, особенно эффективен для настоящей цели.
Секреторный IgA может состоять из 2–4 мономеров IgA, которые могут быть связаны двумя дополнительными цепями. Одна из дополнительных цепей, называемая J-цепью (соединительная), богата цистеином и структурно отличается от других цепей иммуноглобулина и формируется в клетках, секретирующих IgA.
Предпочтительно секреторный IgA представляет собой биоактивный секреторный IgA (т.е. секреторный IgA, способный выполнять свои естественные функции, например связывание с эпитопами; например, биоактивный секреторный IgA не является денатурированным).
Источник SIgA представлен в форме молока или фракции молока. В некоторых вариантах осуществления молоко представляет собой коровье молоко, овечье молоко, козье молоко, человеческое грудное молоко, лошадиное молоко или верблюжье молоко. В предпочтительных вариантах осуществления молоко представляет собой коровье молоко. В предпочтительном варианте осуществления молоко представляет собой обезжиренное молоко. В некоторых вариантах осуществления молоко представляет собой молозиво. В некоторых вариантах осуществления фракция молока представляет собой молочную сыворотку.
В одном варианте осуществления молоко, используемое в качестве источника SIgA, представляет собой концентрированное молоко. В предпочтительном варианте осуществления молоко сначала обезжиривают центрифугированием, а затем концентрируют обратным осмосом.
В некоторых вариантах осуществления молоко, обеспеченное на стадии (a), не подвергают воздействию температуры выше 70°C, предпочтительно 58°C после сцеживания. В предпочтительных вариантах осуществления молоко, обеспеченное на стадии (а), после сцеживания не подвергали воздействию температуры более 15°C. В одном варианте осуществления молоко или фракция молока, используемые в качестве источника SIgA, не были пастеризованы.
В некоторых вариантах осуществления молоко, обеспеченное на стадии (a), содержит 9–30%, предпочтительно 18–26% от общего содержания твердых веществ.
В некоторых вариантах осуществления смесь, обеспеченная на стадии (e), содержит 15–50% от общего содержания твердых веществ.
Микрофильтрация
Микрофильтрация (MF) представляет собой процесс физического разделения, в котором исходную жидкость пропускают через мембрану с определенными размерами пор для отделения микроорганизмов и взвешенных частиц от технологической жидкости.
Микрофильтрацию обычно используют в молочной промышленности, в частности, для обработки молока и молочной сыворотки. Например, микрофильтрация способствует удалению бактерий и спор из молока.
Микрофильтрация позволяет увеличивать срок хранения продукта. Кроме того, микрофильтрацию также можно использовать для отделения казеина от сывороточных белков. Это приводит к получению обогащенного казеином концентрата, который можно использовать для изготовления сыра, а также потока молочной сыворотки / сывороточного белка, который можно дополнительно обрабатывать для получения концентрата белка молочной сыворотки.
Способы микрофильтрации хорошо известны в данной области. Например, микрофильтрацию можно проводить с использованием полимерной мембраны или керамических мембран.
Авторы настоящего изобретения установили, что размер пор микрофильтрующей мембраны оказывает влияние на удержание SIgA в композиции. Малые размеры пор обеспечивают наибольшее снижение микробного загрязнения, но приводят к наибольшей потере SIgA, тогда как более крупные поры менее эффективны для снижения микробиологического загрязнения, но приводят к сохранению большего количества SIgA в композиции. Таким образом, предпочтительно использовать размер пор, который обеспечивает хороший баланс между уменьшением микробиологического загрязнения и удержанием SIgA, что приводит к получению композиции, которая имеет содержание микроорганизмов, допустимое для применения в «чувствительных» продуктах, таких как, например, детская смесь, и имеет достаточные количества SIgA. Таким образом, предпочтительно использовать мембраны с размером пор более 500 нм, предпочтительно от 1000 до 1400 нм.
В некоторых вариантах осуществления стадию микрофильтрации (b) выполняют при температуре 10–70°C. В предпочтительных вариантах осуществления микрофильтрацию на стадии (b) выполняют при температуре 10–62°C.
В случаях, когда молоко или фракцию молока концентрируют, например, методом обратного осмоса (RO), стадию микрофильтрации можно выполнять до или после стадии концентрирования. В вариантах осуществления, в которых в качестве источника SIgA используют цельное молоко, обезжиренное путем центрифугирования и концентрирования, стадию микрофильтрации можно выполнять до или после стадии концентрирования (такой как RO), предпочтительно после стадии концентрирования (такой как RO).
Пастеризация
Пастеризация представляет собой широко применяемый способ, в котором продукты, такие как пищевые продукты (например, молоко и фруктовый сок), подвергают термообработке для устранения патогенов. Этот процесс, по существу, предназначен для того, чтобы сделать пищевые продукты более безопасными за счет разрушения или инактивации организмов, которые могут являться патогенами или иным образом способствовать порче продуктов, включая вегетативные бактерии, но не бактериальные споры.
Пастеризацию широко используют в молочной промышленности и других отраслях по обработке пищевых продуктов для сохранения и обеспечения безопасности пищевых продуктов.
Различные способы выполнения пастеризации хорошо известны в данной области и включают применение непрямых теплообменников и впрыска острого пара (DSI).
В некоторых вариантах осуществления пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 61–120°C в течение 0,1–200 с. В предпочтительных вариантах осуществления пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 70–90°C в течение 2–70 с, предпочтительно 75–85°C в течение 5–15 с. В предпочтительных вариантах осуществления пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 82–84°C в течение 5–7 с.
В других вариантах осуществления пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 120–200°C.
В некоторых вариантах осуществления пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 120–200°C в течение 0,3–2 с.
Распылительная сушка
Распылительная сушка — часто используемый способ получения сухого порошка из жидкости или суспензии путем быстрого высушивания горячим газом, и его регулярно используют для высушивания чувствительных к нагреву материалов, таких как пищевые продукты и фармацевтические материалы. В качестве нагретой среды для высушивания может быть использован воздух; хотя можно также использовать инертные газы, такие как азот. В распылительных сушилках жидкость или суспензия обычно диспергируется с помощью атомайзера или распылительного сопла с получением потока капель контролируемого размера.
Распылительную сушку широко используют в пищевой и фармацевтической промышленности, а оборудование, подходящее для распылительной сушки, широко доступно.
В предпочтительных вариантах осуществления распылительную сушку на стадии (d) и/или стадии (f) выполняют при температуре жидкого концентрата менее 15°C.
В некоторых вариантах осуществления распылительную сушку на стадии (d) и/или стадии (f) выполняют при температуре воздушного потока 40–90°C.
Ассоциирование пробиотиков и SIgA
В некоторых вариантах осуществления смешивание на стадии (e) выполняют при температуре 12–45°C, предпочтительно 15–45°C в течение 10–360 мин, предпочтительно в течение 10–200 мин.
В некоторых вариантах осуществления смешивание на стадии (e) выполняют при температуре 30–38°C, предпочтительно 36–38°C.
В некоторых вариантах осуществления смешивание на стадии (e) выполняют в течение 25–60 мин, предпочтительно 25–40 мин, более предпочтительно 28–32 мин.
В предпочтительных вариантах осуществления смешивание на стадии (e) выполняют при температуре 36–38°C в течение 28–32 мин.
В соответствии с изобретением могут быть использованы все пробиотические микроорганизмы. При использовании в настоящем документе термин «пробиотик» означает клетки и препараты микроорганизмов или компоненты клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или состояние организма-хозяина (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al «Probiotics: how should they be defined» Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107–10).
В некоторых вариантах осуществления пробиотик выбран из группы, состоящей из Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus и Saccharomyces, или содержит их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления пробиотик выбран из группы, состоящей из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii и Lactobacillus reuteri, или содержит их комбинацию.
В предпочтительных вариантах осуществления пробиотик выбран из группы, состоящей из Lactobacillus johnsonii (NCC533; CNCM I-1225), Bifidobacterium longum (NCC490; CNCM I-2170), Bifidobacterium longum (NCC2705; CNCM I-2618), Bifidobacterium lactis (2818; CNCM I-3446), Lactobacillus paracasei (NCC2461; CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus (NCC4007; CGMCC 1.3724) и Enterococcus faecium SF 68 (NCIMB10415), или содержит их комбинацию.
В предпочтительных вариантах осуществления пробиотик представляет собой Bifidobacterium longum, предпочтительно Bifidobacterium longum подвид infantis. В других предпочтительных вариантах осуществления пробиотик представляет собой Bifidobacterium lactis, предпочтительно Bifidobacterium lactis CNCM I-3446.
Комбинация пробиотиков и SIgA особенно эффективна, если SIgA и пробиотики комбинируются в комплексы перед введением. Это дает преимущество в том, что оказывающим благоприятный эффект комплексам не нужно образовываться после употребления продукта, они уже присутствуют в продукте. Способы получения настоящего изобретения обеспечивают оптимальное образование комплексов.
В некоторых вариантах осуществления SIgA и по меньшей мере один пробиотик ассоциированы в композиции. Предпочтительно они ассоциированы в форме комплекса. В таком комплексе или ассоциации SIgA связан с бактериями-пробиотиками.
В некоторых вариантах осуществления количество SIgA на 2E7 КОЕ пробиотика в смеси на стадии (e) составляет от 0,34 нг до 20 мкг. В предпочтительных вариантах осуществления количество SIgA на 2E7 КОЕ пробиотика в смеси на стадии (e) составляет от 3,4 нг до 10 мкг, предпочтительно от 34 нг до 5 мкг, более предпочтительно от 340 нг до 2 мкг. В предпочтительном аспекте такие количества SIgA относятся к биоактивному SIgA. Предпочтительно биоактивный SIgA определяется как SIgA, повышающий индуцируемую пробиотиком продукцию TSLP, после ассоциирования с пробиотиком, до уровня выше продукции, индуцируемой только пробиотиком, по результатам измерения с использованием биоанализа, описанного в представленных примерах.
В некоторых вариантах осуществления концентрация пробиотика в смеси на стадии (e) составляет 1E6–1E11 КОЕ/мл. В предпочтительных вариантах осуществления концентрация пробиотика в смеси на стадии (e) составляет 1E8–1E10 КОЕ/мл.
Конкретные аспекты способа
В предпочтительных вариантах осуществления способ включает стадии:
(a) обеспечения источника SIgA в форме молока или его фракции;
(b) необязательно микрофильтрации молока при температуре 10–65°C;
(c) пастеризации молока при температуре 82–84°C в течение 5–7 с;
(d) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 15°C;
(e) смешивания с пробиотиком, причем смешивание выполняют при температуре 36–38°C в течение 28–32 мин; и
(f) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 15°C.
Композиция
В настоящем изобретении предложена композиция, получаемая или полученная с использованием способа настоящего изобретения, как описано выше.
Изобретение также относится к композиции, содержащей SIgA и по меньшей мере один пробиотический микроорганизм. SIgA и пробиотический микроорганизм могут предпочтительно быть объединены в композиции. SIgA и пробиотический микроорганизм могут предпочтительно присутствовать в количественном соотношении (количество молекул SIgA на КОЕ бактерий) по меньшей мере 10 : 1, предпочтительно по меньшей мере 100 : 1, наиболее предпочтительно по меньшей мере от 2000 : 1 до 100 000 : 1. Чем больше молекул SIgA закреплены на поверхности пробиотического микроорганизма, тем более эффективной будет такая комбинация. Верхний предел насыщения по SIgA определяется поверхностью пробиотического микроорганизма и количеством доступных сайтов связывания для SIgA.
В предпочтительных вариантах осуществления SIgA и пробиотик по меньшей мере частично ассоциированы в композиции.
В некоторых вариантах осуществления детская смесь содержит комплекс пробиотик : секреторный IgA.
В некоторых вариантах осуществления композиция соответствует требованиям, предъявляемым к детской смеси, таким как описаны Организацией ROН по продовольствию и сельскому хозяйству (FAO) в Приложениях I и/или II Гигиенических норм и правил для порошковых смесей для младенцев и детей младшего возраста CAC/RCP 66-2008. Этого результата достигают, в частности, в результате стадии пастеризации, которой необязательно предшествует микрофильтрация.
Продукт
В одном варианте осуществления в изобретении предложен продукт, содержащий композицию, полученную с использованием способа настоящего изобретения, как описано выше. Получаемая способом настоящего изобретения композиция может представлять собой пищевой продукт, продукт для питания животных или фармацевтическую композицию. Например, продукт может представлять собой питательную композицию, нутрицевтик, напиток, питательную добавку, обогатитель или лекарственное средство.
В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой питательную композицию или фармацевтическую композицию.
В предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт выбран из детской смеси, смеси последующего уровня или смеси для прикармливаемых детей, молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, зернового продукта для младенцев, детского питания, добавки или обогатителя.
В некоторых вариантах осуществления композиция предназначена для употребления в пищу людьми или не относящимися к человеку животными, предпочтительно композиция предназначена для употребления в пищу людьми.
В некоторых вариантах осуществления композиция предназначена для употребления в пищу младенцами, подростками, взрослыми или пожилыми людьми.
Новорожденные дети, у которых эндогенные антитела SlgA с трудом обнаруживаются, зависят от материнского IgG, переданного через плаценту, и экзогенного поступления SlgA, который в большом количестве присутствует в грудном молоке. Вместе это обеспечивает пассивную иммунизацию пищеварительного тракта, которая важна для защиты организма-хозяина во время фазы построения и формирования иммунной системы желудочно-кишечного тракта.
В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения предназначена для употребления в пищу новорожденными детьми и младенцами (вплоть до 2 лет), предпочтительно не находящимися на грудном вскармливании новорожденными детьми и младенцами (вплоть до двух лет). Действительно, максимальный полезный для здоровья эффект от введения композиций, содержащих оптимизированные комплексы пробиотик-SIgA, достигается в ситуациях, когда естественный SIgA отсутствует или присутствует в ограниченных количествах. Такова ситуация, например, в случае не находящихся на грудном вскармливании новорожденных детей и младенцев вплоть до двух лет.
В предпочтительных вариантах осуществления композиция представляет собой детскую смесь, питательную добавку для младенцев или обогатитель молока.
Питательная добавка или лекарственное средство может быть представлена, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости. Питательная добавка или лекарственное средство предпочтительно предложены в виде составов с замедленным высвобождением, обеспечивая постоянное поступление SIgA и пробиотиков в течение длительного времени.
Композиция предпочтительно выбрана из группы, состоящей из продуктов на основе молочного порошка; растворимых напитков; готовых к употреблению питьевых составов; порошковых питательных добавок; жидких питательных добавок; продуктов на основе молока, в частности, йогуртов или мороженого; злаковых продуктов; напитков; воды; кофе; капучино; солодовых напитков; напитков с шоколадным вкусом; кулинарных продуктов; супов; таблеток; и/или сиропов.
Композиция может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующиие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие вещества (масла, жиры, воски, лецитины и т.п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, смачивающие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты, гелеобразующие агенты, антиоксиданты и противомикробные вещества.
Композиция также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, аравийскую камедь, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, смачивающие агенты, наполнители и т.п.
Кроме того, композиция может содержать органический или неорганический материал-носитель, подходящий для перорального или энтерального введения, а также витамины, минералы, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.
Композиция изобретения может содержать источник белка, источник углеводов и/или источник липидов.
Можно использовать любой подходящий пищевой белок, например животные белки (такие как молочные белки, мясные белки и яичные белки); растительные белки (такие как соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и гороховый белок); смеси свободных аминокислот; или их комбинации. Особенно предпочтительными являются молочные белки, такие как казеин и сывороточный белок, и соевые белки.
Если композиция включает в себя источник жира, источник жира предпочтительно обеспечивает от 5% до 40% энергетической ценности состава; например от 20% до 30% энергетической ценности. Может быть добавлена докозагексаеновая кислота (DHA). Подходящий профиль жира можно получить с использованием смеси масла канолы, кукурузного масла и подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты.
Источник углеводов предпочтительно обеспечивает от 40% до 80% энергетической ценности композиции. Можно применять любой подходящий углевод, например сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу, сухой кукурузный сироп, мальтодекстрины и их смеси.
Композиция также может содержать пребиотики. Добавление пребиотиков дает полезный для здоровья эффект, поскольку в сочетании с пробиотиками они могут давать синергетические эффекты в отношении полезных для здоровья эффектов. Композиция, содержащая комбинацию пребиотиков и пробиотиков, обычно называется симбиотической композицией.
При использовании в настоящем документе термин «пребиотик» означает пищевые вещества, которые способствуют росту полезных бактерий, таких как бифидобактерии или лактобациллы, и/или пробиотиков в кишечнике. Пребиотики не расщепляются в желудке и не всасываются в желудочно-кишечном тракте принимающего их внутрь человека, а ферментируются микрофлорой желудочно-кишечного тракта и/или пробиотиками.
Пребиотики, которые можно использовать в соответствии с изобретением, не имеют конкретных ограничений и включают в себя все пищевые вещества, которые способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Предпочтительно пребиотик выбран из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащих фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности растворимых волокон, соевых волокон; инулина; или их смесей. Предпочтительными пребиотиками являются олигосахариды грудного молока (HMO), олигосахариды коровьего молока (BMO), фруктоолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), изомальтоолигосахариды, ксилоолигосахариды, олигосахариды сои, гликозилсахароза (GS), лактосахароза (LS), лактулоза (LA), палатинозоолигосахариды (PAO), мальтоолигосахариды, пектины и/или их гидролизаты.
Композиции также могут содержать по меньшей мере один другой тип других пригодных для использования в пищевых продуктах бактерий, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из молочнокислых бактерий, бифидобактерий, энтерококков или их смесей. Такие другие пригодные для использования в пищевых продуктах бактерии могут способствовать обеспечению здоровой микрофлоры кишечника и тем самым будут способствовать еще более эффективному достижению цели настоящего изобретения.
Количество SIgA, требуемого для достижения эффекта, не ограничено. В целом предпочтительно, чтобы продукт содержал от 0,0001 мг SIgA до 100 мг SIgA, например от 0,0001 мг SIgA до 10 мг SIgA на суточную дозу. В предпочтительных вариантах осуществления композиция содержит 0,001–0,1 мг секреторного IgA на суточную дозу.
Как правило, пробиотики будут эффективны в широком диапазоне их количеств. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 1E2 до 1E12, предпочтительно от 1E2 до 1E10 клеток пробиотиков на суточную дозу.
В предпочтительных вариантах осуществления продукт представляет собой композицию для употребления внутрь для младенцев.
При использовании в настоящем документе термин «композиция для употребления внутрь для младенцев» означает композицию, подходящую для употребления в пищу младенцем. Примеры композиций для употребления внутрь для младенцев включают в себя, без ограничений, детские питательные добавки и детские смеси.
В течение первых четырех месяцев жизни грудные дети обычно не могут употреблять твердые продукты питания. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев может быть предложена и/или может быть употреблена в жидкой форме. В некоторых вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев предназначена для кормления грудных детей, которые не могут есть твердые продукты питания.
В предпочтительных вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев представляет собой детскую питательную добавку. Добавка может быть предложена в дополнение к грудному молоку и/или детской смеси. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев представляет собой детскую пищевую добавку, подходящую для употребления в пищу младенцами в возрасте 0–12 месяцев, от 6 недель до 12 месяцев, 0–6 месяцев, от 6 недель до 6 месяцев, 4–6 месяцев, предпочтительно 0–4 месяцев или от 6 недель до 4 месяцев.
Детская добавка может дополнительно содержать один или более из следующих элементов: белок; жир (липиды); углеводы; и незаменимые витамины, и минеральные вещества. Детская добавка может дополнительно содержать подслащивающие, ароматизирующие и/или окрашивающие агенты.
В других вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев не содержит дополнительный белок; жир; углеводы; и/или незаменимые витамины, и минеральные вещества.
В других вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев представляет собой детскую смесь или смесь для прикармливаемых детей. Термин «детская смесь» означает продукт питания, предназначенный для употребления в пищу младенцами в течение первых четырех–шести месяцев жизни и сам по себе удовлетворяющий потребности в питании этой категории людей. Термин «смесь для прикармливаемых детей» означает продукт питания, предназначенный для употребления в пищу младенцами старше четырех месяцев и составляющий основной жидкий компонент в рационе питания этой категории лиц, который предполагает постепенно увеличиваемое разнообразие.
Требования к детским смесям хорошо известны специалистам. Например, рекомендации и требования предлагаются Европейским обществом детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания (ESPGHAN), например, в Koletzko, B., et al., 2005. «Global standard for the composition of infant formula: recommendations of an ESPGHAN coordinated international expert group», Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 41(5), pp. 584–599. Как правило, детская смесь в готовой к употреблению жидкой форме (например, растворенная из порошка) обеспечивает 60–70 ккал/100 мл. Детская смесь, как правило, содержит на 100 ккал: около 1,8–4,5 г белка; около 3,3–6,0 г жиров (липидов); около 300–1200 мг линолевой кислоты; около 9–14 г углеводов, выбранных из группы, состоящей из лактозы, сахарозы, глюкозы, глюкозного сиропа, крахмала, мальтодекстринов и мальтозы и их комбинаций; и незаменимые витамины, и минеральные вещества.
В некоторых вариантах осуществления композиция для употребления внутрь для младенцев дополнительно содержит один или более носителей. При использовании в настоящем документе термин «носитель» означает любое вещество, пригодное в качестве эксципиента, наполнителя, объемообразующего агента, разбавителя, окрашивающего агента, стабилизатора, загустителя, связующего вещества, ароматизирующего агента и т.п. Предпочтительно один или более носителей содержат порошок обезжиренного молока и/или лактозу. Наиболее предпочтительно носитель представляет собой порошок обезжиренного молока и/или лактозу.
Композиция для употребления внутрь для младенцев может находиться в порошкообразной форме, причем перед употреблением порошкообразная форма может быть восстановлена в жидкую форму. В предпочтительных вариантах осуществления композицию для употребления внутрь для младенцев перед употреблением восстанавливают водой. Предпочтительно композицию восстанавливают водой для получения одной порции.
В других предпочтительных вариантах осуществления композиция находится в готовой к употреблению питьевой форме. Готовая к употреблению питьевая композиция может быть предложена в бутылке.
Первое и второе медицинские применения
Первое медицинское применение
В одном варианте осуществления в изобретении предложена композиция для применения в терапии.
Второе медицинское применение против инфекции
В другом аспекте в изобретении предложена композиция для применения в профилактике и/или для ослабления невирусной инфекции, причем композиция получена или может быть получена с использованием способа изобретения.
В некоторых вариантах осуществления невирусная инфекция представляет собой бактериальную инфекцию, паразитарную инфекцию или грибковую инфекцию.
Невирусная инфекция может представлять собой бактериальную инфекцию, выбранную из инфекции Escherichia coli, инфекции Vibrio cholerae, инфекции сальмонеллой, инфекции клостридией, инфекции шигеллой, паразитарной инфекции, включая Giardia lamblia, Entamoeba histolytica и Cryptosporidium spp, или их смеси.
Типичные бактериальные инфекционные заболевания, для лечения или профилактики которых можно применять изобретение, включают в себя сальмонеллез, шигеллез, брюшной тиф, бактериальный менингит, сибирскую язву, ботулизм, бруцеллез, кампилобактериоз, болезнь кошачьих царапин, холеру, дифтерию, эпидемический сыпной тиф, гонорею, импетиго, легионеллез, проказу (болезнь Хансена), лептоспироз, листериоз, болезнь Лайма, мелидоидоз, ревматический полиартрит, стафилококковую инфекцию (метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA)), нокардиоз, коклюш (судорожный кашель), чуму, пневмококковую пневмонию, пситтакоз, Q риккетсиоз, американскую пятнистую лихорадку (RMSF), скарлатину, сифилис, столбняк, трахому, туберкулез, туляремию, тиф и/или инфекции мочеполовой системы.
Типичные паразитарные инфекционные заболевания, для лечения или профилактики которых можно применять изобретение, включают в себя африканский трипаносомоз, амебиаз, аскаридоз, бабезиоз, болезнь Чагаса, клонорхоз, криптоспоридиоз, цистицеркоз, дифиллоботриоз, драконулез, эхинококкоз, энтеробиоз, фасциолез, фасциолопсиаз, филяриоз, инфицирование свободноживущими амебами, гиардиоз, гнатостомоз, гименолепидоз, изоспороз, лихорадку «дум-дум», лейшманиоз, малярию, метагонимоз, миаз, онхоцеркоз, педикулез, энтеробиоз, чесотку, шистомоз, тениоз, токсокариаз, токсоплазмоз, трихинеллез, трихиноз, трихиуриаз, трихомониаз и/или трипаносомоз.
Типичные грибковые инфекционные заболевания, для лечения или профилактики которых можно применять изобретение, включают в себя аспергиллез, бластомикоз, кандидоз, кокцидиоидомикоз, криптококкоз, гистоплазмоз и/или дерматофитию стоп.
В другом аспекте в изобретении предложена детская смесь изобретения для применения в ослаблении или профилактике невирусной инфекции.
В другом аспекте в изобретении предложен способ ослабления или профилактики невирусной инфекции, включающий стадию введения композиции или детской смеси изобретения нуждающемся в этом субъекту.
Второе медицинское применение против воспаления
В другом аспекте в изобретении предложена композиция для применения в профилактике и/или для ослабления воспаления, причем композиция получена или может быть получена с использованием способа изобретения.
Типичные воспалительные состояния, для лечения или профилактики которых можно применять изобретение, включают в себя, без ограничений, острые воспаления, такие как сепсис, инфекции, ожоги, и хронические воспаления, такие как воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, некротизирующий энтероколит, воспаления кожи, такие как вызванное УФ-облучением или химическим агентом воспаление кожи, экзема, чувствительная кожа, псориаз, витилиго, прыщи, воспаление печени, алкогольный цирроз, аллергию, атопию, воспаление кости, ревматоидный артрит, системную волчанку, синдром Гужеро-Шегрена, болезнь Рейтера, полиомиелит, дерматомиозит, тиреоидит, Базедову болезнь, болезнь Хашимото, диабет I типа, болезнь Аддисона, аутоиммунный гепатит, глютеиновую болезнь, болезнь Бирмера, множественный склероз, миасетнию, энцефаломиелит, воспаление глаз, связанное с ожирением воспаление, возрастное воспаление низкой степени, болезнь Блау, болезнь Альцгеймера, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, метаболический синдром, гингвинит, пародонтит и их комбинации.
Композиция изобретения особенно эффективна для профилактики и/или лечения воспалительных состояний, выбранных из хронических воспалительных состояний, таких как воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, некротизирующий энтероколит, экзема, аллергия и атопия.
Композицию настоящего изобретения также можно использовать для контроля и/или облегчения воспалительной реакции организма.
Композицию настоящего изобретения дополнительно можно использовать для выработки, улучшения или усиления гомеостаза и оральной переносимости.
В другом аспекте в изобретении предложена детская смесь изобретения для применения в ослаблении или профилактике воспаления.
В другом аспекте в изобретении предложен способ ослабления или профилактики воспаления, включающий стадию введения композиции или детской смеси изобретения нуждающемся в этом субъекту.
Другие виды медицинского применения
В некоторых вариантах осуществления композиция обеспечивает выработку, улучшение или усиление гомеостаза и оральной переносимости.
В некоторых вариантах осуществления композиция обеспечивает контроль и/или облегчение воспалительной реакции.
В некоторых вариантах осуществления композиция обеспечивает повышение иммунной функции у субъекта.
В другом аспекте в изобретении предложена композиция для применения в повышении иммунной функции у субъекта, причем композиция может быть получена с использованием способа изобретения.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложена детская смесь изобретения для применения в повышении иммунной функции у субъекта.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ повышения иммунной функции у субъекта, включающий стадию введения композиции или детской смеси изобретения нуждающемся в этом субъекту.
Способ лечения
Следует понимать, что все ссылки на лечение в настоящем документе включают в себя лечебное, паллиативное и профилактическое лечение. Предпочтительным является лечение млекопитающих, в частности людей. Способы лечения человека и животных входят в объем изобретения.
При использовании в настоящем изобретении термин «профилактика» включает в себя профилактику и снижение риска некоторого состояния.
Субъект
Термин «субъект» относится либо к человеку, либо к не относящемуся к человеку животному.
Композицию можно вводить людям или не относящимся к человеку животным, в частности, животным-компаньонам или домашнему скоту. Композиция обладает положительными эффектами для любой возрастной группы. Предпочтительно композиция предназначена для младенцев, подростков, взрослых или пожилых людей. Однако ее можно вводить матерям во время беременности и кормления грудью для лечения младенца.
Примеры не относящихся к человеку животных включают в себя позвоночных, например млекопитающих, таких как не относящиеся к человеку приматы (в частности, высшие приматы), собаки, грызуны (например, мыши, крысы или морские свинки), свиньи и кошки.
Термин «животное-компаньон» означает любое домашнее животное, включая (без ограничения) кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и т.п.
Предпочтительно субъект представляет собой человека.
Специалистам в данной области будет понятно, что можно свободно комбинировать все элементы изобретения, описанные в настоящем документе, без отступления от описанного объема изобретения.
Ниже описаны предпочтительные элементы и варианты осуществления изобретения в виде не имеющих ограничительного характера примеров.
При практическом применении настоящего изобретения, если не указано иное, будут использованы стандартные методы, применяемые в химии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие методы описаны в литературе. См., например, J. Sambrook, E. F. Fritsch и T. Maniatis, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 и периодические дополнения) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен в настоящий документ путем ссылки.
Все публикации, указанные в описании выше, включены в настоящий документ путем ссылки. Специалисту в данной области будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов, композиций и вариантов применения без выхода за рамки сущности и объема изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявляемое изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Фактически подразумевается, что в объем приведенной далее формулы изобретения входят различные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области.
Примеры
Вводная часть: описание количественных определений SIgA посредством ИФА (наличие SIgA) и биологического анализа экскреции TSLP (биоактивность SIgA)
Наличие и количество молекул SIgA (или по меньшей мере частей молекул SIgA) измеряли посредством ИФА с использованием коммерчески доступного набора для бычьего IgA (Bovine IgA ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories Inc., cat no E10-131). Использовали рекомендуемый протокол для набора с адаптацией в том, что стандартный образец IgA набора заменили на нативный бычий SIgA (очищенный с помощью классической гель-проникающей хроматографии в нативных условиях, как описано, например, в Favre et al., 2003, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., Mar 25;786(1–2):143–51) для обеспечения корректного количественного определения SIgA (а не только IgA). Стандартную кривую для SIgA получали для покрытия, как правило, диапазона концентраций SIgA от 1000 до 10 нг/мл. Валидационные проверки набора показали, что матрица молока не мешает количественному определению при используемых для образцов разбавлениях (обычно от 1 : 1000 до 1 : 20 000).
Следует отметить, что обнаружение молекул SIgA посредством ИФА вовсе не является индикатором целостности молекул SIgA, и, следовательно, их биологической активности. Например, деградировавшая молекула SIgA будет обнаружена, если она все еще распознается поликлональными детекторными антителами, используемыми в наборе для ИФА. Более того, деградировавшие или даже расщепленные молекулы SIgA могут открывать эпитопы, обычно недоступные детекторным антителам, когда молекулы SIgA находятся в своей нативной форме. Все это может приводить к искусственно завышенным количествам определяемого SIgA (как показано в примере 3 и на фиг. 5 ниже).
Для решения этой проблемы и согласно с исходной концепцией повышения эффективности пробиотиков за счет их ассоциирования с нативными молекулами биоактивного SIgA, был разработан биоанализ для оценки биоактивности молекул SIgA (подробное описание экспериментальной процедуры см. в Mathias et al, 2010, JBC, vol. 285, no. 44, pp. 33906–33913). Вкратце, клетки аденокарциномы эпителия толстой кишки человека Caco-2 (HTB 37, американская коллекция тканевых культур) выращивали при 37°C в полной модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (C-DMEM), состоящей из среды DMEM-Glutamax (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Sigma), 1% заменимых аминокислот (Sigma), 10 ммоль буфера HEPES (pH 7,0, Sigma), 0,1% трансферрина (Invitrogen AG, г. Базель, Швейцария) и 1% стрептомицина/пенициллина (Sigma), и использовали на пассажах между 23 и 37. Культивированные до степени конфлюентности, равной 80%, клетки высевали на фильтры Transwell (диаметр 12 мм; размер пор 0,4 мкм; Corning Costar, г. Кембридж, штат Массачусетс, США) с плотностью 0,8E5 клеток/см2. Культуральную среду меняли каждые 2 дня. Образование поляризованного монослоя клеток Caco-2 на 3 неделе выявляли по морфологии и контролю трансэпителиального электрического сопротивления (TER; Ом x см2) с использованием прибора Millicell-ERS (Millipore, г. Бедфорд, штат Массачусетс, США). Величины TER хорошо дифференцированных монослоев находились в диапазоне 380–450 Ом x см2. Следует отметить, что этот процесс приводит к созданию in vitro плотного эпителия с разделенными апикальными и базолатеральными культуральными отделами, соответствующими люминальному и мукозальному отделам в кишечнике соответственно. Перед воздействием пробиотиком или комплексами пробиотики-SIgA, апикальный отдел монослоев клеток Caco-2 дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; 116,3 ммоль NaCl, 10,4 ммоль Na2HPO4, 3,2 ммоль KH2PO4, pH 7,4), а среду C-DMEM заменяли на, как правило, 500 мкл такой же среды без FBS и антибиотиков (DMEM-A-).
Добавление пробиотиков в апикальный отдел культуральной системы (см. подробный протокол ниже) приводит к секреции нескольких иммунных факторов в базолатеральном отделе, включая тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP), который, как известно, играет важную роль в поддержании невоспалительной среды в кишечнике со стимулированием созревания дендритных клеток — ключевых агентов любого иммунного ответа. Таким образом, после ночной инкубации с пробиотиками, высвобождение TSLP фиксируется ИФА с использованием коммерчески доступного набора для белков человека.
Препарат свежей биомассы пробиотика, как правило, получали путем ночного культивирования бактериального штамма Bifidobacterium lactis CNCM I-3446, далее обозначаемого BL818, в питательной среде де Мана — Рогоза — Шарпа ((MRS) Difco Laboratories, г. Детройт, штат Мичиган, США) с добавкой 0,05% L-цистеина, при 37°C и без перемешивания. Оценку количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на миллилитр, полученных в таких условиях культивирования, проводили путем корреляции результатов измерения оптической плотности на длине волны 600 нм с высеванием последовательных разбавлений ночных инкубаций.
Для оценки биоактивности SIgA смешивали пробиотики (как правило, 2E7 КОЕ свежей биомассы или 2E8 КОЕ высушенных распылительной сушкой бактерий) и SIgA в итоговом объеме 100–500 мкл PBS в пробирке с низкой связываемостью с белком объемом 1,5 мл и инкубировали в течение 30 минут при 37°C, если не указано иное. В альтернативном варианте осуществления только пробиотики (стандартный образец) или заранее сформированные комплексы пробиотики-SIgA просто разбавляли в PBS для получения требуемого количества пробиотиков в итоговом объеме 100–500 мкл. Комплексы пробиотики-SIgA, сформировавшиеся в ходе данной стадии инкубации и уже существовавшие заранее, затем осаждали центрифугированием (как правило, 6000 g в течение 5 минут), а содержащий несвязанный SIgA супернатант отбрасывали. Комплексы пробиотики-SIgA ресуспендировали в 500 мкл культуральной среды DMEM-A- и затем добавляли в апикальный отдел культуры клеток Caco-2 для ночной инкубации (как правило, 16 часов) при 37°C в инкубаторе для клеточных культур.
После ночной инкубации собирали культуральную среду из базолатерального отдела поляризованных клеток Caco-2 и измеряли стимулированную продукцию TSLP (концентрацию выражали как пикограммы на мл культуральной среды) посредством ИФА с использованием коммерчески доступных наборов для TSLP человека (Biolegend, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США).
Предварительное ассоциирование SIgA с пробиотиками повышало продукцию TSLP клетками Caco-2 дозозависимым образом по сравнению только с пробиотиками. Поэтому в качестве стандартного образца для дозирования количества биоактивного SIgA, присутствующего в тестируемом образце, на основании индуцированной продукции TSLP (фиг. 2) использовали стандартную кривую, полученную с фиксированным количеством пробиотика, ассоциированного с увеличиваемым количеством нативного бычьего SIgA (того же, что использовали для количественных определений посредством ИФА). В альтернативном варианте осуществления биоанализ проводили без стандартной кривой, что позволяет проводить только полуколичественное сравнение биоактивности SIgA между различными тестируемыми образцами. Тесты биоанализа проводили в по меньшей мере двух технических повторах, предпочтительно в трех повторах.
Пример 1. Способ в соответствии с настоящим изобретением
Сырое молоко получали со швейцарской фермы и центрифугировали при 15°C для получения сырого обезжиренного молока. Сырое обезжиренное молоко концентрировали до 24% сухого вещества при 15°C с использованием концентрирующей установки обратного осмоса (RO) (Tetra Alcross RO со спиральной мембраной Alfa Laval RO98pHt-3838/30 — TetraPak, г. Лунд, Швеция). Обезжиренное методом RO 24% молоко предварительно нагревали в пластинчатом теплообменнике до 55°C и затем нагревали до 83°C впрыском острого пара. После прохождения через трубчатый выдерживатель со средней продолжительностью пребывания, равной 6 с, обезжиренное методом RO молоко мгновенно охлаждали до 55°C с использованием сосуда мгновенного испарения, как общепринято в молочной промышленности. Обезжиренное методом RO молоко дополнительно охлаждали до 5°C в пластинчатом теплообменнике и затем высушивали распылительной сушкой в мягких условиях без предварительного нагрева на распылительной сушилке с открытым верхом, как описано в US2353495, с образованием порошка обезжиренного методом RO молока. Температура воздушного потока и относительная влажность воздуха в сушилке Egron составляли 65°C и 12%. Порошок обезжиренного методом RO молока содержал 139 мкг SIgA/г порошка по результатам определения посредством ИФА и 25 мкг биоактивного SIgA/г порошка по результатам биоанализа.
Параллельно ферментацией получали пробиотики BL818, центрифугировали их для концентрирования бактерий и получали жидкую свежую биомассу при 5 °C с 1,4E11 КОЕ/г BL818 по результатам измерения методом проточной цитометрии, позже подтвержденным подсчетом на чашках.
Порошок обезжиренного методом RO молока растворяли в теплой воде и добавляли к нему жидкую суспензию BL818 с образованием суспензии с 34% сухого вещества, содержащей 5E8 КОЕ/г BL818 и 340 нг биоактивного SIgA на 2E7 КОЕ BL818. Суспензию выдерживали при 37°C в течение 30 минут и охлаждали до 5°C в пластинчатом теплообменнике, а затем высушивали распылительной сушкой в распылительной сушилке в мягких условиях, как описано выше. Это дало порошок, содержащий пробиотики с более высокой биоактивностью, чем у только высушенных распылительной сушкой пробиотиков, как определено в тестах биоанализа (136,7 ± 1,8 против 77,7 ± 4,8 пг/мл продукции TSLP соответственно).
Пример 2. Влияние микрофильтрации обезжиренного молока на содержание SIgA
Для этих экспериментов использовали сырое обезжиренное молоко (общее содержание твердых веществ 8,0–8,7%) и обезжиренное методом обратного осмоса молоко (RO) (общее содержание твердых веществ около 24%). Оба типа молока подвергали микрофильтрации (МФ) с использованием различных мембран при температуре от 52 до 55°C. Содержание SIgA в молоке до фильтрации и после фильтрации в разных фазах измеряли посредством ИФА, как описано выше. Рассчитывали процентное содержание SIgA в пермеате после микрофильтрации (выход SIgA [%]) по сравнению с количеством SIgA в молоке до фильтрации. Также оценивали микробиологическое загрязнение молока и рассчитывали логарифмическое снижение количества бактерий в молоке (снижение общего количества на чашках [log]). Полученные результаты представлены в приведенной ниже таблице 2 и на фиг. 3.
Испытание с мембраной, показавшей наилучшие результаты, повторяли при температуре 14°C, чтобы оценить влияние температуры на сохранение SIgA и на снижение микробиологического загрязнения.
Оба типа молока нагревали до температуры обработки на пластинчатом теплообменнике и выполняли микрофильтрацию на установке для микрофильтрации с использованием различных мембран.
Более подробное описание используемых мембран и ключевых параметров обработки представлено в приведенной ниже таблице 1.
Таблица 1. Поставщик и тип мембраны, параметры обработки при проведении испытания по микрофильтрации
ность
м2
°C
Бар
Ø 25 мм, 8 каналов, 19 модулей, длина 1178 мм
(фторполимер)
Ø 25 мм, 23 канала, длина 1178 мм
Перед применением устройство обеззараживали для проведения оценки влияния способа на бактериальную нагрузку в ретентате и пермеате. Для этого устройство промывали 1%-м раствором P3-Oxonia (Ecolab, г. Сент-Пол, штат Миннесота, США) в течение ночи.
Результаты экспериментов по микрофильтрации представлены в приведенной ниже таблице.
Таблица 2. Сводка условий обработки и результаты экспериментов по микрофильтрации
[%]
Полученные результаты показывают, что малые размеры пор обеспечивают наибольшее снижение микробиологического загрязнения, но приводят к наибольшей потере SIgA в ходе процесса микрофильтрации. Поры большего размера менее эффективны для снижения микробиологического загрязнения, но позволяют сохранить большее количество SIgA (более высокий выход SIgA) в молоке после микрофильтрации. В частности, микрофильтрация с использованием мембраны с размером пор 500 нм или менее приводит к таким низким выходам SIgA в молоке после микрофильтрации, что молоко становится экономически невыгодным источником SIgA для применения в способе в соответствии с изобретением. Напротив, керамическая мембрана с размером пор 1400 нм (MMS) не так сильно повлияла на содержание SIgA, показав выход SIgA в молоке после микрофильтрации 69%. Снижение микробиологической нагрузки, хотя и меньшее чем у остальных протестированных мембран, было близко к 2 log. Такое снижение микробиологической нагрузки достаточно для использования полученного молока в способе настоящего изобретения. В частности, после последующего прохождения стадии термообработки, такой как описано в настоящей заявке и, в частности, в приведенном ниже примере 3, молоко, полученное микрофильтрацией с мембраной MMS, подходит для применения в «чувствительных» продуктах, таких как детская смесь. Достигаемое с мембраной MMS снижение микробиологической нагрузки 2 log достаточно для возможности применения мягких условий на стадии термообработки, чтобы сохранить биоактивный SIgA и при этом получить композицию категории детской смеси, начиная с любого молока стандартного микробиологического качества. Таким образом, мембрана с размером пор 1400 нм обеспечивает наилучший баланс между снижением микробиологической нагрузки и предотвращением потерь SIgA.
Пример 3. Сравнение различных условий для термообработки обезжиренного методом обратного осмоса (RO) молока
Сырое молоко центрифугировали при 15°C для получения сырого обезжиренного молока. Сырое обезжиренное молоко концентрировали с 9% сухого вещества до 22,9% сухого вещества при 15°C с использованием концентрирующей установки обратного осмоса (RO) (см. пример 1). С обезжиренным методом RO молоком проводили четыре различных процесса термообработки с использованием впрыска острого пара и мгновенного охлаждения:
- Образец 1: 74°C / 103 с
- Образец 2: 83°C / 6 с
- Образец 3: 87°C / 2 с
- Образец 4: 90°C / 0,96 с
Жидкое пастеризованное обезжиренное методом RO молоко охлаждали до 5°C, а холодный концентрат высушивали распылительной сушкой.
Присутствие молекул SIgA в исходном обезжиренном методом RO молоке (стандартный образец), термообработанном обезжиренном методом RO молоке (образцы 1–4) и в готовых порошках, полученных из образцов 1–4, оценивали посредством ИФА. Количественное определение биоактивности SIgA в термообработанном обезжиренном методом RO молоке и в готовых порошках проводили с использованием биологического анализа экскреции TSLP, как описано выше. Взаимосвязанные результаты ИФА и биологического анализа экскреции TSLP представлены на фиг. 4.
Результаты количественного определения SIgA посредством ИФА показывают, что термообработка при 90°C в течение 0,96 с (образец 4) привела к самым высоким количествам SIgA как в термообработанном молоке, так и в порошке. Анализ биоактивности SIgA (биологический анализ экскреции TSLP) неожиданно показал, что промежуточные условия более благоприятны для максимального сохранения биоактивного SIgA, а термообработка при 83°C в течение 6 с (образец 2) считается предпочтительным выбором. Это показывает, что часть SIgA, обнаруживаемая посредством ИФА в образцах, прошедших высокотемпературную обработку, на самом деле неактивна, и что используемый в настоящем документе биологический анализ экскреции TSLP представляется более надежным способом для определения количества действительно эффективного SIgA в композиции. Такие данные показывают, что количественное определение SIgA посредством ИФА не коррелирует с целостностью молекул SIgA и, таким образом, их биоактивностью.
В терминах микробиологии все описанные выше термообработки привели к снижению общего количества на чашках (TPC) 2,0–2,1 log, обеспечивая при этом уменьшение количества патогенов, которые более чувствительны к нагреву, чем остальные микроорганизмы, по меньшей мере на 7 log. Для порошок распылительной сушки было показано полное отсутствие Enterobacteriaceae, Enterobacter Sakazakii и Salmonella.
Пример 4. Влияние температуры и времени на образование и биоактивность комплексов SIgA-BL818
Ассоциирование SIgA и BL818 в обезжиренном методом RO молоке было протестировано при соотношении 34 нг SIgA на 2E7 КОЕ BL818 при различных временных и температурных условиях (37°C, 20°C и 12°C, в течение 60, 30 и 15 минут при каждой температуре). Следует отметить, что в этом эксперименте не проверяли ни температуры выше 37°C, поскольку такие температуры были бы опасны для пробиотика, ни температуры ниже 12°C, поскольку выполненные при температуре 4°C предварительные тесты не показали никакого ассоциирования (данные не показаны).
Эксперимент проводили на основе трех идентичных образцов обезжиренного методом RO молока, смешиваемого с жидкой биомассой BL818. Для каждого образца растворяли 41,9 г порошка обезжиренного молока, прошедшего термообработку в соответствии с предпочтительными условиями, выявленными в примере 3 (образец 2), содержащего 285 мкг биоактивного SIgA на грамм порошка (по результатам биологического анализа экскреции TSLP) в 65 мл дистиллированной воды. Затем добавляли 23,3 мл по объему биомассы пробиотика BL818 (размороженной замороженной стоковой биомассы), содержащей 3E11 КОЕ/мл, для достижения требуемого соотношения SIgA и BL818. Сразу после добавления биомассы BL818, три смеси инкубировали при 37°C, 20°C или 12°C соответственно при медленном перемешивании. Через 15, 30 или 60 минут инкубации, во время которой могло произойти ассоциирование пробиотиков с SIgA, из каждой смеси отбирали по два образца (повторные) и центрифугировали их на 6000 g в течение 5 минут при 4°C для осаждения уже сформировавшихся комплексов пробиотики-SIgA и для остановки процесса ассоциирования. После удаления содержащего несвязанный SIgA супернатанта осадок ресуспендировали в клеточной культуральной среде для биоанализа и проводили биоанализ для эквивалента 2E7 КОЕ из каждого образца, как описано выше.
Биоактивность комплексов SIgA, оцениваемая по результатам биологического анализа экскреции TSLP после стадии ассоциирования для каждого образца, дала косвенную оценку уровня ассоциирования SIgA с BL818 в форме комплексов.
Представленные на фиг. 5 результаты показывают, что образование комплексов пробиотики-SIgA возрастало с повышением температуры в ходе стадии ассоциирования. Наилучшей температурой для проведения стадии ассоциирования оказалась 37°C. Образование комплексов было менее эффективным при снижении температуры до 20°C и далее до 12°C. Однако комплексообразование при температуре 12°C все еще было достаточным для достижения биоактивности, превышающей биоактивность только BL818, на что указывает горизонтальная серая линия на фиг. 5.
Это испытание также показало, что выбранные продолжительности стадии ассоциирования, составлявшие от 15 до 60 минут, привели к успешному образованию комплексов, даже несмотря на то, что комплексообразование несколько снижалось в испытаниях с продолжительностью, равной 15 минутам.
Учитывая все полученные результаты, оптимальными условиями для проведения стадии ассоциирования пробиотиков с SIgA оказались 30 минут при температуре 37°C.
Пример 5. Влияние концентрации BL818 (в КОЕ/мл) на образование и биоактивность комплексов SIgA-BL818
Было проведено исследование влияния концентрации BL818 на эффективность образования комплексов пробиотики-SIgA. Для этого провели лабораторные испытания на ассоциирование с постоянным соотношением SIgA и BL818 (34 нг SIgA/2E7 КОЕ BL818), постоянным общим содержанием твердых веществ и постоянными условиями ассоциирования, которые были определены как наилучшие в примере 4 (30 минут при 37°C), но с концентрациями BL818 5,4E10, 5,4E9 и 5,4E8 КОЕ/мл соответственно. Тестируемые образцы получали, как описано в таблице 3.
Таблица 3. Состав образцов, использованных для тестирования влияния концентрации BL818 на образование и биоактивность комплексов SIgA-BL818
* Обезжиренное методом RO молоко, термообработанное при 145°С в течение 6 секунд, что приводит к отсутствию обнаруживаемых сигналов SIgA как на уровне ИФА, так и на уровне биоанализа.
После инкубации образцы центрифугировали для остановки процесса ассоциирования, как описано в примере 4, и проводили для них биологический анализ экскреции TSLP (образцы нормализовали для получения 2E07 КОЕ в биоанализе). Биоактивность полученных таким образом комплексов отражала эффективность образования комплексов.
Представленные на фиг. 6 результаты показывают, что концентрация BL818 в течение стадии ассоциирования влияет на эффективность образования комплексов, с тенденцией к ее повышению с уменьшением концентрации BL818. Действительно, наилучшая биоактивность наблюдалась при концентрации BL818 5,4E8 КОЕ/мл (142 ± 4 пг/мл TSLP), затем при концентрации 5,4E9 (135 ± 5 пг/мл TSLP) и затем при 5,4E10 КОЕ/мл (126 ± 3 пг/мл TSLP). Однако было обнаружено, что все концентрации BL818 позволяли получить существенно возросшую биоактивность комплексов BL818-SIgA по сравнению с содержащими только BL818 контрольными образцами.
Пример 6. Влияние используемой формы BL818 (жидкая биомасса или высушенная распылительной сушкой культура) на образование и биоактивность комплексов SIgA-BL818
Для сравнения влияния формы пробиотика на эффективность образования комплексов пробиотики-SIgA провели лабораторные испытания на ассоциирование с постоянным соотношением SIgA и BL818 (34 нг SIgA/2E7 КОЕ BL818), постоянным общим содержанием твердых веществ и постоянными условиями ассоциирования, которые были определены как наилучшие в примерах 4 и 5 (30 минут при 37°C, 5,4E08 КОЕ BL818/мл), но используя BL818 либо из жидкой формы биомассы, либо из порошковой формы (высушенной распылительной сушкой на распылительной сушилке Mini spray-drier B-290, Büchi, г. Флавиль, Швейцария). Образцы получали, как описано в таблице 4.
Таблица 4. Состав образцов, использованных для тестирования влияния используемой формы BL818 (жидкая биомасса или высушенная распылительной сушкой культура) на образование и биоактивность комплексов SIgA-BL818
После инкубации образцы центрифугировали для остановки процесса ассоциирования, как описано в примере 4, и проводили для них биологический анализ экскреции TSLP (образцы нормализовали для получения 2E07 КОЕ в биоанализе). Биоактивность полученных таким образом комплексов отражала эффективность образования комплексов.
Представленные на фиг. 7 результаты показывают, что используемая для стадии ассоциирования форма BL818 влияет на эффективность образования комплексов, с тенденцией к ее снижению при использовании BL818 в форме порошка распылительной сушки. Однако было обнаружено, что все обе формы BL818 приводили к существенно возросшей биоактивности комплексов BL818-SIgA по сравнению с содержащими только BL818 контрольными образцами.
Пример 7. Эффект in vivo композиций настоящего изобретения, оказываемый на профилактику и лечение инфекций и воспаления
Физиологический эффект начальной детской смеси, содержащей комплексы BL818-SIgA, полученные с использованием способа настоящего изобретения по сравнению с начальной детской смесью только с пробиотиками протестировали in vivo на мышиной модели формирования иммунной системы у новорожденных.
В этой модели для исследования брали мышат, рожденных в 3-дневном временном окне от синхронизованных лишенных бактериальной флоры самок мышей линии C3H-HEN. На 5-й день жизни пометы выравнивали в отношении размера, а также пола и даты рождения детенышей. Детенышей содержали в стерильных условиях со их самками до возраста одна неделя. Затем весь помет переносили в условия свободного от патогенов содержания и обрабатывали фекальным материалом мышей, содержащим кишечные бактерии, для запуска естественной микробиологической колонизации. В это же время детенышам начинали давать через пероральную инстилляцию по 20 мкл в день одного из тестируемых составов детской смеси (подробности см. в приведенной ниже таблице 5) в течение 14 дней вплоть до отнятия от матери на 21 день жизни. Следует отметить, что содержание пометов в стерильных условиях до дня 7 перед началом микробиологической колонизации и подкормки преследовало две цели. Во-первых, это максимально полно имитировало иммунный статус человека после рождения. Действительно, младенцы человека рождаются с несколько более зрелой иммунной системой, чем мышата, но исследования показали, что это различие нивелируется через неделю жизни мышат. Во-вторых, лишенные бактериальной флоры животные имеют недоразвитую иммунную систему, частично характеризуемую отсутствием продукции мукозального IgA, поскольку такой IgA входит в состав молочной секреции самок. Поэтому максимально возможное по длительности поддерживание самок мыши в стерильных условиях позволило обеспечить минимальное побочное влияние эндогенного SIgA молока по сравнению с SIgA, присутствующим в комплексах пробиотики-SIgA, позволяя провести неискаженное сравнение между только пробиотиками и пробиотиками, предварительно ассоциированными с SIgA.
Таблица 5. Тестовые группы для экспериментов in vivo
(1E4 КОЕ/день)
1) Дозировки SIgA относятся к биоактивному SIgA; количества SIgA определяют с использованием биоанализа TSLP в коровьем молоке, прошедшем термообработку при 83°C в течение 6 с, а требуемую дозировку биоактивного SIgA получают с использованием соответствующего количества такого молока в прототипе детской смеси (см. приведенную ниже таблицу 6).
Для получения прототипов ДС описанные в приведенной ниже таблице 6 композиции смешивали в сухом виде в лаборатории. Прототипы ДС, содержащие только BL818 или BL818 в комбинации с биоактивным SIgA [группы 5), 6) и 7)], ориентировались на содержание BL818 2E7 КОЕ BL818/г смеси, что является стандартной целевой концентрацией пробиотика в детской смеси, содержащей пробиотики BL818.
Таблица 6. Композиции прототипов ДС 4)–8)
1,4E9 КОЕ BL818 на грамм порошка)
Саму порошковую начальную смесь для младенцев готовили следующим образом. Использовали все типичные ингредиенты для негидролизованной, не содержащей пробиотиков начальной смеси для младенцев, большую часть которой составляет сыворотка.
Таблица 7. Основа начальной смеси для младенцев для экспериментов in vivo
Все тестируемые составы детских смесей восстанавливали путем тщательного перемешивания до полного растворения порошка. Их разбавляли в 40 раз подогретой до 37°C водой для получения эквивалента 1E4 КОЕ пробиотика в 20 мкл ежедневной дозировки (дозировка пробиотика, адаптированная для новорожденных мышат). Тестируемые детские смеси давали мышатам не позднее чем через 5 минут после восстановления из порошка, чтобы, во-первых, имитировать реальную практику кормления из бутылки и, во-вторых, чтобы не допустить ассоциирования пробиотиков и SIgA до введения в тестируемой детской смеси 4.
На 21 день жизни подкормку смесью прекращали и детенышей отнимали от матери, помещая самцов и самок в раздельные клетки. Затем детенышей содержали в нормальных условиях и на 54 день жизни умерщвляли. Для оценки дифференциальных эффектов подкормки детской смесью до отъема от матери на формирование мукозальной и системной иммунной системы, отбирали Пейеровы бляшки (ПБ, сайты индукции кишечной иммунной системы) и кровь в ледяную среду DMEM (PAA Laboratory, cat. no. E15-883), содержащую 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Amimed 2-01F10-I), и в гепаринизированные пробирки (Milian, cat no. HEP-75PP) соответственно и хранили при 4°C до дальнейшего применения.
Для отделения иммунных клеток от собранных ПБ последние сначала инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°C в 1 мл среды DMEM, содержащей 5 ммоль CaCl2 (Merck, cat. no. 1.02382.0250) и 2 ед/мл Liberase™ Research Grade (Roche, cat. no. 05401127001). ПБ и инкубационную среду переносили в коническую пробирку объемом 15 мл и промывали 12 мл DMEM. После центрифугирования при 400 g в течение 4 минут при 4°C супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 500 мкл ледяной среды DMEM и переносили на 70 мкм клеточное сито (Becton Dickinson, cat. no. 352350), заранее установленное над конической пробиркой объемом 50 мл. Ткани растирали по клеточному ситу, используя поршень от шприца (черную часть). Сито и поршень промывали 10 мл ледяной среды DMEM. Затем суспензию клеток пропускали через 40 мкм клеточное сито (Becton Dickinson, cat. no. 352340), заранее установленное над другой конической пробиркой объемом 50 мл. Клеточное сито снова промывали 5 мл ледяной среды DMEM. Суспензию клеток переносили в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугировали при 400 g в течение 5 минут при 4°C. Супернатант отбрасывали, а осадок выделенных клеток ресуспендировали в 1 мл ледяной среды DMEM / 10% FCS, как описано выше. Количество клеток и их жизнеспособность (обычно > 80%) определяли с помощью окрашивания трипановым синим, используя микроскопию. Клетки хранили при 4°C до дальнейшего применения.
Для выделения лейкоцитов образцы крови центрифугировали при 700 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант (плазму) отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (NH4Cl 0,15 моль/л (Sigma, cat. no. A 9434), KHCo3 10 ммоль (Sigma Aldrich, cat. no. 431583) и EDTA 0,1 ммоль (Promega, cat. no. V4231)). Затем раствор с клетками непосредственно переносили в коническую пробирку объемом 15 мл и инкубировали в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем реакцию лизиса останавливали заполнением пробирки средой DMEM / 10% FCS и перемешиванием. Суспензию клеток центрифугировали в течение пяти минут при 400 g и отбрасывали супернатант. Если клеточный осадок все еще имел красный цвет, этап лизиса повторяли до тех пор, пока осадок не становился белым, поскольку состоял в основном из лейкоцитов. Наконец, клетки ресуспендировали в среде DMEM / 10% FCS, определяли количество клеток и их жизнеспособность, как описано для клеток ПБ выше, и хранили при 4°C до дальнейшего применения.
Использовали измерение продукции эндогенного IgA в качестве общепринятого маркера для контроля формирования иммунной системы (Macpherson AJ, Mc Coy KD, Johansen FE, Brandtzaeg P.; The immune geography of IgA induction and function; Mucosal Immunol 2008; 1:11–22). В настоящем исследовании для этого использовали методику ELISPOT для IgA, что позволило точно подсчитать количество секретирующих IgA клеток в препаратах из ПБ и клеток крови. Лунки 96-луночных целлюлозных стерильных планшетов «multi-Screen-HA» (Millipore, cat. no. MAHA S45 10) инкубировали 2 ч при 37°C (сухой инкубатор) со 100 мкл разведения 1 : 200 антисыворотки козьих антимышиных IgA (специфичных к альфа-цепи) (Sigma, cat. no. 8769) в стерильном PBS. После 4-кратного промывания лунок стерильным PBS в объеме 200 мкл/лунку лунки заполняли 200 мкл культуральной среды RPMI-1640 (Invitrogen, cat. no. 61870-010) с добавкой 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Amimed 2-01F10-I) и снова инкубировали 2 ч при 37°C во влажном инкубаторе для клеточных культур. Приготовленные ранее суспензии ПБ и клеток крови центрифугировали (400 g в течение 5 минут при 4°C), супернатант отбрасывали, а клеточный осадок ресуспендировали в подогретой до 37°C среде RPMI / 5% FCS до концентрации 2x1E6 клеток/мл. Лунки 96-луночного планшета опорожняли и заполняли свежеприготовленными суспензиями ПБ и клеток крови в объеме 100 мкл. Каждый образец суспензии клеток тестировали в трех повторах. Затем планшет инкубировали в течение 18 часов при 37°C во влажном инкубаторе для клеточных культур. После 4-кратного промывания лунок стерильным PBS в объеме 200 мкл/лунку лунки заполняли 100 мкл свежеприготовленного разведения 1 : 500 антисыворотки козьих антимышиных IgA (специфичных к альфа-цепи), конъюгированных с биотином (KPL, cat, no. 16-18-01), в PBS с добавлением 0,05% Tween 20 (Bio-Rad, cat. no. 170-6531) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при комнатной температуре. После еще одного 4-кратного промывания лунок стерильным PBS в объеме 200 мкл/лунку лунки заполняли 100 мкл свежеприготовленного разведения 1 : 500 стрептавидин-щелочной фосфатазы (Sigma, cat. no. E-2636) в PBS с добавлением 0,05% Tween 20 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После еще одной стадии промывки, как описано выше, лунки заполняли 100 мкл свежеприготовленного разведения одной таблетки субстрата BCIP/NBT (Sigma, cat. no. B-5655) в дистиллированной воде и инкубировали ≤ 5 минут при комнатной температуре. Затем планшет промывали дистиллированной водой. Затем пластиковое дно планшета снимали и давали высохнуть при комнатной температуре в течение по меньшей мере 6 часов в темноте. Затем для каждой лунки автоматически подсчитывали количество пятен (1 пятно = 1 секретирующая IgA клетка) с использованием системы считывания AID ELISPOT (Autoimmun Diagnostika GmbH) и приводили их как количество секретирующих IgA клеток на 1E6 общего количества клеток.
Результаты анализа IgA ELISPOT (представленные на фиг. 8) показали, что подкормка новорожденных детенышей детской смесью, содержащей предварительно ассоциированные комплексы пробиотик-SIgA (группа 5), давала максимальное усиление формирования иммунной системы среди всех тестируемых групп. Это имело место и на уровне слизистой оболочки (ПБ, фиг. 8A), и на системном уровне (кровь, фиг. 8B). Предварительное ассоциирование пробиотиков и SIgA в соответствии со способом настоящего изобретения оказалось более эффективным, чем одновременно даваемые пробиотики и SIgA, но не в предварительно ассоциированной форме (группа 4). Далее предварительное ассоциирование пробиотиков и SIgA в детской смеси оказало синергетический эффект на продукцию эндогенного IgA по сравнению с соответствующими эффектами только пробиотиков или SIgA, добавляемых к матрице детской смеси (группы 2 и 3 соответственно) с использованием в качестве стандартного образца базовой детской смеси (группа 1).
Эти данные in vivo подтверждают ценность настоящего промышленного способа для получения нового биологически активного ингредиента для детской смеси.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ФЕРМЕНТИРОВАННАЯ МОЛОЧНАЯ СМЕСЬ С НЕПЕРЕВАРИВАЕМЫМИ ОЛИГОСАХАРИДАМИ | 2016 |
|
RU2724536C2 |
| СМЕСЬ ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ С ПРОБИОТИКАМИ И КОМПОНЕНТАМИ ОБОЛОЧЕК ЖИРОВЫХ ШАРИКОВ МОЛОКА | 2010 |
|
RU2563355C2 |
| СПОСОБ ГУМАНИЗИРОВАНИЯ ОБЕЗЖИРЕННОГО МОЛОКА ЖИВОТНЫХ | 2014 |
|
RU2732833C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ МОНОГИДРАТ СУЛЬФАТА ЖЕЛЕЗА (II) И ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫЕ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ | 2018 |
|
RU2812108C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ, ПОДХОДЯЩАЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ | 2016 |
|
RU2732480C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ БЕЛКИ МОЛОКА, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 2011 |
|
RU2575178C2 |
| МОЛОЧНАЯ ОЛИГОСАХАРИДНО-ГАЛАКТООЛИГОСАХАРИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ДЕТСКОЙ СМЕСИ, СОДЕРЖАЩАЯ РАСТВОРИМУЮ ОЛИГОСАХАРИДНУЮ ФРАКЦИЮ, ПРИСУТСТВУЮЩУЮ В МОЛОКЕ, И ИМЕЮЩАЯ НИЗКОЕ СОДЕРЖАНИЕ МОНОСАХАРИДОВ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ | 2012 |
|
RU2607457C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАЩИХ ЛАКТОФЕРРИН ПИТАТЕЛЬНЫХ КОМПОЗИЦИЙ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННЫХ КЛЕТОК | 2011 |
|
RU2575776C2 |
| КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ С ВЫСОКОЙ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКОЙ С КАЗЕИНОМ | 2018 |
|
RU2815764C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ТРЕВОЖНОСТИ И/ИЛИ СТРЕССА | 2020 |
|
RU2815833C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения композиции, содержащей секреторный IgA и пробиотик, включающий: a) обеспечение источника SIgA в форме молока, которое не подвергают воздействию температуры выше 70°C после сцеживания, или его фракции; b) необязательно микрофильтрацию молока; c) пастеризацию молока при 61–200°C в течение 0,1–200 с; d) необязательно распылительную сушку при температуре жидкого концентрата менее 70°C; e) смешивание с пробиотиком при 12–45°C в течение 10–360 мин; и f) необязательно распылительную сушку при температуре жидкого концентрата менее 70°C. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения SIgA, имеющего требуемый уровень стерильности для детского питания, с сохранением его биоактивности и способности усиливать полезный для здоровья эффект пробиотиков после ассоциирования с ними. 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 7 пр.
1. Способ получения композиции, содержащей секреторный IgA и пробиотик, включающий стадии:
(a) обеспечения источника SIgA в форме молока или его фракции, причём молоко, обеспеченное на стадии (a), не подвергают воздействию температуры выше 70°C, предпочтительно 58°C, более предпочтительно 15°C после сцеживания;
(b) необязательно микрофильтрации молока;
(c) пастеризации молока при температуре 61–200°C, причём пастеризацию на стадии (c) выполняют в течение 0,1–200 с, предпочтительно 5–15 с;
(d) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C;
(e) смешивания с пробиотиком, причем смешивание выполняют при температуре 12–45°C в течение 10–360 мин; и
(f) необязательно распылительной сушки при температуре жидкого концентрата менее 70°C.
2. Способ по п. 1, в котором пастеризацию на стадии (c) выполняют при температуре 82–84°C в течение 5–7 с.
3. Способ по любому предшествующему пункту, в котором смешивание на стадии (e) выполняют при температуре 36–38°C в течение 28–32 мин.
4. Способ по любому предшествующему пункту, в котором количество секреторного IgA на 2E7 КОЕ пробиотика в смеси на стадии (e) составляет от 0,34 нг до 20 мкг, предпочтительно от 3,4 нг до 2 мкг.
5. Способ по любому предшествующему пункту, в котором концентрация пробиотика в смеси на стадии (e) составляет 1E6–1E11 КОЕ/мл, предпочтительно 1E8–1E10 КОЕ/мл.
6. Способ по п. 5, в котором пробиотик, если Bifidobacterium lactis или Bifidobacterium longum подвид infantis.
7. Способ по любому предшествующему пункту, в котором секреторный IgA и пробиотик по меньшей мере частично ассоциированы в композиции.
8. Способ по любому предшествующему пункту, в котором композиция содержит 0,0001–10 мг секреторного IgA на суточную дозу.
9. Способ по любому предшествующему пункту, в котором композиция содержит от 1E2 до 1E12, предпочтительно от 1E2 до 1E10 клеток пробиотиков на суточную дозу.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗАЛКОГОЛЬНОГО ОСВЕЖАЮЩЕГО НАПИТКА "ГАМДЮ" | 1998 |
|
RU2138186C1 |
| ЗАПРАВЛЯЕМАЯ ЕМКОСТЬ ДЛЯ ОТДАЧИ МАЖУЩЕЙСЯ МАССЫ, В ЧАСТНОСТИ КЛЕЯЩЕЙ МАССЫ | 1995 |
|
RU2138187C1 |
| RU 2010151414 A, 06.08.2014 | |||
| DIANA ESCUDER -VIECO et al | |||
| "Effect of HTST and Holder pasteurization on the concentration of immunoglobulings, growth factors, and hormones in donor human milk"; Frontiers in immunology, 2018, v.9, article 2222, abstract, p.2-3, conclusion. | |||
