ИНДУЦИРОВАНИЕ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ БЕТА-КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ РНК Российский патент 2024 года по МПК C12N5/71 A61K35/39 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки на патент США No. 62/423120, поданной 16 ноября 2016 г., которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее изобретение относится к регуляции индуцирования панкреатических бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток посредством кинетически регулируемых процессов роста клеток с использованием специфических комбинаций и различных интервалов плотности клеток, концентраций реагентов и конкретных комбинаций мРНК.

Предпосылки создания изобретения

[0003] В последнее время, попытки продуцировать человеческие стволовые клетки с последующей их дифференцировкой позволили пересмотреть парадигмы в отношении изменчивости статуса клеток, моделей человеческих заболеваний и клинической терапии. Эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из соматических клеток, могут быть дифференцированы в клетки конкретных типов, список которых все возрастает, и которые не отличаются от соответствующих первичных клеток. В результате, стволовые клетки являются весьма перспективными для разработки новых методов клеточной терапии для лечения человека. iPSC открывают большие возможности в области персонализированной медицины благодаря неограниченной доступности клеток, неинвазивности процедур получения клеток и возможности проводить иммуносовместимую терапию для каждого конкретного пациента, что позволяет отказаться от иммунодепрессантов.

[0004] На разработку клеточно-заместительной терапии для лечения или профилактики различных заболеваний у человека затрачиваются большие суммы в долларах, выделяемые на исследования. Так, например, аутоиммунные заболевания вызывают у пациентов с диабетом типа 1 (T1D) потерю панкреатических бета- клеток, а следовательно, их способности реагировать на уровни глюкозы в крови и продуцировать инсулин в организме. Таким образом, у пациентов с T1D может наблюдаться заметный эффект при замене их инсулин-продуцирующих бета-клеток на внешний источник. Трансплантация островковых человеческих клеток, содержащих инсулин-продуцирующие бета-клетки, а также другие эндокринные клетки, давала некоторый успех, но проблема, связанная с поиском подходящего донора поджелудочной железы, так и осталась нерешенной. В настоящее время, многие группы ученых-теоретиков и специалистов в области промышленных технологий разработали способы превращения ESC или iPSC в панкреатические клетки-предшественники, и создания инсулин-секретирующих бета-клеток в надежде, в конце концов, проводить терапию с использованием стволовых клеток вместе с производными инсулин-продуцирующих и реагирующих на глюкозу клеток. Однако, большинство из этих методов, имеющихся в общедоступных компьютерных программах на время их составления, не позволяют осуществлять продуцирование полностью функциональных или зрелых инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток.

[0005] Для снижения бремени расходов и их неоправданности, специалисты в данной области часто прибегают к поиску небольших молекул, которые могут влиять на сигнальные пути в качестве агонистов или антагонистов рецепторов факторов роста, и таким образом, они могут быть использованы для замены факторов роста. Небольшие молекулы обычно намного дешевле, чем факторы роста. Тем не менее, одним из основных недостатков небольших молекул являются неспецифические эффекты, которые могут влиять на нецелевые мишени, такие как рецепторы, связанные с клеточной мембраной, внутриклеточные органеллы или геномные компоненты и т.п.

[0006] Еще одним ключевым компонентом типичного протокола дифференцировки является среда для культивирования клеток, которая может состоять из питательных веществ (липидов, аминокислот, углеводов, витаминов и т.п.), солей в соответствующих концентрациях, рН-забуферивающих агентов, необходимых элементов и общих белковых факторов, таких как инсулин или сывороточный альбумин. Клетки различных типов имеют различные потребности в питательных веществах и компонентах среды, что создает дополнительные трудности при использовании факторов роста, специфичных к клеткам конкретного типа, и небольших молекул для передачи сигнала. Таким образом, специальная «среда для дифференцировки» часто тщательно анализируется путем одновременного удаления или добавления одного компонента.

[0007] При клинических применениях клеток ткани, полученных из стволовых клеток, большинство компонентов установленной среды для дифференцировки требуют индивидуальной сертификации в соответствии с современной технологической практикой (cGMP), осуществляемой под контролем Регуляторных Органов; например, факторы роста должны быть получены с помощью специальных процедур и требуют индивидуальной сертификации. Аналогичным образом, некоторые небольшие молекулы, добавленные в конкретную среду для дифференцировки, получают специальными методами химического синтеза, которые различаются по степени оценки чистоты, стабильности и токсичности. Что касается культур стволовых клеток, то некоторые ранее опубликованные протоколы также опираются на продукты животного происхождения, такие как сыворотка или Матригель.

Сущность изобретения

[0008] Несмотря на недавние успехи в получении панкреатических бета-клеток, происходящих от iPSC, эффективные способы последовательного генерирования инсулин-продуцирующих бета-клеток пока еще находятся на стадии разработки. Многие современные протоколы требуют использования комбинации факторов роста, гормонов, цитокинов, сигнальных пептидов и других межклеточных сигнальных молекул (в данном описании, для простоты, эти молекулы будут называться общим термином «факторы роста») в каждой стадии каскада дифференцировки для получения инсулин-продуцирующих бета-клеток. К сожалению, факторы роста, если они поставляются в виде очищенных полипептидов, обычно являются дорогостоящими, нестабильными и меняются от партии к партии, что создает трудности в их применении. Кроме того, поскольку факторы роста действуют по высокоспецифическому комбинаторному механизму, то для каждой стадии дифференцировки требуются различные серии факторов роста, что создает определенные трудности и повышает затраты на оптимизацию. Одна из целей настоящего изобретения заключается в абсолютном исключении необходимости использования факторов роста для продуцирования панкреатических бета-клеток.

[0009] Настоящее изобретение относится к способам индуцирования дифференцировки стволовых клеток путем модуляции кинетики роста клеток и связанных с ними параметров, и тем самым, специфической комбинации клеточной плотности, концентрации реагентов и комбинаций мРНК, используемых для регуляции направления дифференцировки/индукции.

[0010] Для достижения этой цели и в соответствии с целью настоящего изобретения, осуществляемой и широко раскрываемой в настоящей заявке, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0011] В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная первая комбинация мРНК включает мРНК FoxA2.

[0012] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная первая комбинация мРНК включает мРНК Sox17.

[0013] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная первая комбинация мРНК включает мРНК FoxA2 и Sox17.

[0014] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная первая комбинация мРНК включает мРНК FoxA2, Sox17, GATA4 и GATA6.

[0015] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная вторая комбинация мРНК включает по меньшей мере одну из мРНК PDX1, Hlxb9, Ptf1a, ixl1 HNF1a и b, и Sox9.

[0016] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанная первая комбинация мРНК включает по меньшей мере одну из мРНК PDX1, NKX6.1, NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9 и Ngn3.

[0017] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где мРНК влияет на коммитирование панкреатических бета-клеток и включает по меньшей мере одну из мРНК NKX6.1, MAFA или MAFA.

[0018] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; ((b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанные исходные клетки собирают из физиологической жидкости или ткани.

[0019] Один из аспектов изобретения относится к клетке, полученной способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0020] Один из аспектов изобретения относится к композиции для лечения заболевания, расстройства или синдрома, содержащей клетку, полученную способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0021] Один из аспектов изобретения относится к способу лечения заболевания, расстройства или синдрома, включающему стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одной клетки, полученной способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, и композиции для лечения заболевания, расстройства или синдрома, содержащей клетку, полученную способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0022] В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, расстройства или синдрома, включающему стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одной клетки, полученной способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу; и композиции для лечения заболевания, расстройства или синдрома, содержащей клетку, полученную способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанную клетку берут у индивидуума-реципиента.

[0023] В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, расстройства или синдрома, включающему стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одной клетки, полученной способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу; и композиции для лечения заболевания, расстройства или синдрома, содержащей клетку, полученную способом индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе и инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу, где указанные исходные клетки берут у реципиента.

[0024] Способ продуцирования индуцированных чувствительных к глюкозе и инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток включает стадии: (а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки; (b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительного превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК; (e) дополнительного созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК; и (f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0025] В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к новым способам определения статуса клеток без использования небольших молекул или с использованием этих молекул в незначительных количествах. Основным преимуществом настоящего изобретения является простота приготовления среды для дифференцировки с использованием соответствующим образом доставляемых мРНК генов регуляции дифференцировки. Однако, оптимальная комбинация мРНК и соответствующей среды может еще больше усовершенствовать этот способ и является неотъемлемой частью настоящего изобретения. Помимо настоящего изобретения, имеется еще один стимул разработки нового способа, который основан, главным образом, на использовании молекулы одного типа, подходящей для унифицированной сертификации и контроля качества.

[0026] В настоящем описании раскрываются новые способы, позволяющие определить каким образом должны регулироваться плотность клеток и скорость их деления, чтобы достичь желаемых результатов дифференцировки. В настоящей заявке также описываются оптимизация по времени, порядок добавления, дозы РНК и соотношения между различными РНК в процессе трансфекции РНК, а также их продолжительность и число повторений. Кроме того, настоящее изобретение относится к выбору поверхности сосудов для культивирования и условий окружающей среды, таких как концентрация кислорода. Настоящее изобретение также включает способы и методы отбора нужных клеток или повышение их процента в общей популяции, а также способы криоконсервации и повторного культивирования дифференцированных клеток.

[0027] Настоящее изобретение относится к способам индуцирования и/или продуцирования стволовых клеток и их дифференцировки путем модуляции кинетики роста клеток и связанных с ними параметров, и тем самым, специфической комбинации клеточной плотности, концентрации реагентов и комбинаций мРНК, используемых для регуляции направления дифференцировки/индукции. В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к только что разработанному протоколу получения функциональных и более зрелых бета-клеток, которые функционируют in vivo, и к способам применения этих клеток в терапии для лечения различных заболеваний, включая диабет типа I и типа II.

[0028] В некоторых вариантах осуществления изобретения, репрезентативный протокол индуцирования стволовых клеток может быть представлен в виде схем и стадий, описанных и проиллюстрированных ниже в примерах. В некоторых аспектах изобретения, очень высокая эффективность была достигнута и при меньших затратах, без использования большого количества факторов роста, путем контактирования мРНК со стволовыми клетками в основные моменты изменения статуса клеток в нужных дозах и в соответствующих условиях доставки. Поскольку мРНК являются более специфичными в отношении регуляции клеточных и эволюционных событий благодаря кодированию функциональных белков, то раскрытый здесь способ, как было неожиданно обнаружено, является более надежным, чем любые известные методы получения функциональных панкреатических бета-клеток, что таким образом открывает путь для лечения диабета и других состояний, ассоциированных с диабетом у человека или млекопитающих.

[0029] Настоящее изобретение относится к способам дифференцировки, в которых используется высокоэффективная и хорошо регулируемая экспрессия основных регуляторных генов или ключевых факторов транскрипции при тканеспецифической дифференцировке. Более конкретно, эти факторы вводят в плюрипотентные стволовые клетки в форме соответствующим образом модифицированных и очищенных молекул мРНК, продемонстрированных в качестве примера.

[0030] В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования дифференцировки клеток, включающему: использование ключевых факторов статуса клеток и гибридов между обычными факторами транскрипции (TF) с трансактивирующими доменами, оптимизированными для превращения стволовых клеток в клетки различных типов; введение этих факторов в виде синтетический матричной РНК (мРНК) в культивируемые плюрипотентные стволовые клетки с предпочтительной плотностью с применением методов, обеспечивающих соответствующие уровни экспрессии трансгена; поддержание клеток в оптимальных условиях для достижения высокой эффективности специфической дифференцировки и, тем самым, индуцирование плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток-предшественников или клеток-предшественников в целях их превращения в клетки специфической линии дифференцировки или в клеточную ткань такого типа.

[0031] В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу продуцирования плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток-предшественников или клеток-предшественников в целях их превращения в клетки специфической линии дифференцировки или в клеточную ткань этого типа с применением такого метода индуцирования клеток, включающего: использование ключевых факторов статуса клеток и гибридов между обычными факторами транскрипции (TF) с трансактивирующими доменами, оптимизированными для превращения стволовых клеток в клетки различных типов; введение этих факторов в виде синтетической матричной РНК (мРНК) в культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, имеющие предпочтительную плотность, с применением методов, обеспечивающих соответствующие уровни экспрессии трансгена; поддержание клеток в оптимальных условиях для достижения высокой эффективности специфической дифференцировки.

[0032] В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу продуцирования индуцированных чувствительных к глюкозе и инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток, где указанный способ включает: (а) культивирование iPSC в качестве исходных клеток в экспериментально подтвержденных условиях, описанных в настоящей заявке, и получение клеток в качестве исходных клеток для дифференцировки; (b) индуцирование указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму; (c) направление дифференцировки клеток в клетки эндодермы с использованием мРНК генов, специфичных к эндодерме посредством трансфекции клеточной культуры в описанной дозе и в пределах конкретных временных окон; (d) дополнительное превращение клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники с использованием дополнительных молекул мРНК-генов или их комбинаций посредством трансфекции; (e) дополнительное созревание панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием еще одной мРНК или комбинаций генов; и (f) сбор кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу.

[0033] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам превращения плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток-предшественников или клеток-предшественников в клетки специфической линии дифференцировки или в клеточную ткань такого типа, где указанные способы включают по меньшей мере одну из стадий: получения стволовых клеток, экспрессирующих ключевые гены, ответственные за статус клетки (называемых общим термином «стволовые клетки»), включая ключевые факторы статуса клеток и гибриды между обычными факторами транскрипции (TF) с трансактивирующими доменами, оптимизированными для превращения стволовых клеток в клетки различных типов; введения этих факторов в виде синтетической матричной РНК (мРНК) в культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, имеющие предпочтительную плотность, с применением методов, обеспечивающих соответствующие уровни экспрессии трансгена; поддержания клеток в оптимальных условиях для достижения высокой эффективности специфической дифференцировки.

[0034] Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения будут частично изложены в описании изобретения, и частично будут очевидны из описания, либо они могут быть поняты в ходе практического применения изобретения. Цели и преимущества изобретения будут реализованы и достигнуты с использованием элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

[0035] Следует отметить, что приведенное выше общее описание и последующее подробное описание приводятся лишь в иллюстративных и пояснительных целях, и не должны рассматриваться как ограничение заявленного изобретения.

[0036] Прилагаемые чертежи, которые включены в настоящее описание и составляют часть этого описания, иллюстрируют несколько вариантов осуществления изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

[0037] Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации патентной заявки с цветным(и) чертежом(ами) будут предоставлены Управлением по запросу и после уплаты необходимой пошлины.

[0038] Вышеизложенные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из последующего подробного описания изобретения со ссылками на прилагаемые чертежи, где:

[0039] На фиг. 1А показаны клетки эндодермы, происходящие от исходных клеток различной плотности, и проиллюстрирован репрезентативный вариант индуцирования эндодермы.

[0040] На фиг. 1В показаны клетки эндодермы, индуцированные из iPSC с использованием мРНКа Sox 17 с различными плотностями (например, от низкой до высокой плотности, как описано в Примерах) и проиллюстрирован репрезентативный вариант индуцирования эндодермы.

[0041] На фиг. 2 показано, что панкреатические клетки-предшественники происходят от клеток эндодермы с различными плотностями, и проиллюстрирован репрезентативный вариант индуцирования панкреатических клеток-предшественников. На фиг. 2A показано одно изображение репрезентативной плотности клеток в процессе индуцирования. На фиг. 2B показано одно изображение репрезентативной плотности клеток в процессе индуцирования. На фиг. 2С показано одно изображение репрезентативной плотности клеток в процессе индуцирования. На фиг. 2D показано одно изображение репрезентативной плотности клеток в процессе индуцирования.

[0042] На фиг. 3 показаны панкреатические эндокринные клетки, происходящие от клеток эндодермы с различными плотностями, образующих кластеры, и проиллюстрован репрезентативный вариант индуцирования панкреатических эндокринных клеток. На фиг. 3А показано одно изображение репрезентативной плотности клеток/кластеризации в процессе индуцирования. На фиг. 3B показано одно изображение репрезентативной плотности клеток/кластеризации в процессе индуцирования. На фиг. 3C показано одно изображение репрезентативной плотности клеток/кластеризации в процессе индуцирования.

[0043] На фиг. 4 показаны панкреатические эндокринные клетки, созревшие в культуре и образующие кластеры, которые подвергались флотации, и проиллюстрован репрезентативный вариант созревания панкреатических эндокринных клеток. На фиг. 4A показано одно изображение репрезентативного созревания клеток в процессе индуцирования. На фиг. 4B показано одно изображение репрезентативного созревания клеток в процессе индуцирования. На фиг. 4C показано одно изображение репрезентативного созревания клеток в процессе индуцирования.

[0044] На фиг. 5А показана морфология кластера бета-клеток, определенная посредством фазово-контрастного окрашивания, и проиллюстрован репрезентативный вариант образования кластера, подобного панкреатическим островковым бета-клеткам.

[0045] На фиг. 5B показано окрашивание бета-клеток инсулином (зеленый) через 10 дней после дифференцировки (DAPI показаны синим цветом), и проиллюстрован репрезентативный вариант образования кластера, подобного панкреатическим островковым бета-клеткам.

[0046] На фиг. 6 показаны клетки эндодермы и бета-клетки, происходящие от человеческих iPSC, на что указывают специфические клеточные маркеры. На фиг. 6A показаны клетки эндодермы, окрашенные зеленым: CXCR4, и синим: DAPI, эталонный ядерный краситель. На фиг. 6B показаны клетки эндодермы, окрашенные зеленым: FOXA1; синим: DAPI; красным: фаллоидиновая клеточная мембрана. На фиг. 6C показана дифференцировка бета-клеток на день 10, зеленый: инсулин; синий: ядерный DAPI. На фиг. 6D показана дифференцировка бета-клеток на день 8, зеленый: ядерный NKX6.1: красный: фаллоидиновая клеточная мембрана.

[0047] На фиг. 7 показано стимулированное глюкозой продуцирование инсулина бета-клетками посредством химического синтеза (в соответствии с протоколом Милтона) по сравнению с бета-клетками, происходящими от мРНК (в соответствии с аллельным протоколом) (клетки были стимулированы партиями глюкозы через каждый час) и проиллюстрированы панкреатические бета-островки, полученные in vitro и секретирующие инсулин в ответ на глюкозу.

[0048] На фиг. 8 показаны два миллиона iPSC в исходной популяции, которые были трансфецированы с использованием устройства MaxCyte STX, установленного на режим Оптимизации 2, на блоке обработки OC-100. Фотографии были сделаны через 24 часа после трансфекции с использованием системы визуализации EVOS с увеличением 10×. На фиг. 8А показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции. На фиг. 8В показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции. На фиг. 8С показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции. На фиг. 8D показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции. На фиг. 8Е показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции. На фиг. 8F показано репрезентативное изображение iPSC в процессе проведения репрезентативного протокола трансфекции.

[0049] На фиг. 9 показаны большие островки бета-клеток, преобразованные в 3D из 2D-культуры по оконачании мРНК-опосредованной дифференцировки панкреатических бета-клеток. На фиг. 9A показано репрезентативное изображение бета-клеток, ассоциированных с дифференцировкой. На фиг. 9В показано репрезентативное изображение бета-клеток, ассоциированных с дифференцировкой.

Подробное описание изобретения

[0050] При описании настоящего изобретения, все термины, не определенные в настоящей заявке, имеют свои общепринятые значения, известные специалистам. Нижеследующее описание, в той степени, в которой оно относится к конкретному варианту осуществления изобретения или к конкретному применению настоящего изобретения, приводится лишь в иллюстративных целях и не ограничивает объема заявленного изобретения. Нижеследующее описание охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые не выходят за пределы существа и объема изобретения.

[0051] Концепция «основного регуляторного гена», то есть одного ключевого гена (обычно, гена фактора транскрипции, иногда называемого общим термином «небольшое число рабочих генов»), который может определять статус клеток и тканей и, в конечном счете, образование целого органа в процессе развития, была, по существу, основана на исследованиях мышц (MyoD), глаз (Pax6), и в других областях организма в соответствии с биологией развития. Открытие Shinya Yamanaka состоит в том, что дифференцированные клетки могут быть возвращены в плюрипотентное состояние посредством экспрессии отобранной группы факторов транскрипции, экспрессируемых в стволовых клетках, и продемонстрировало эффективность небольшого числа ключевых факторов транскрипции в индуцировании развития клеток посредством длительного, многостадийного изменения их статуса. Исследования других групп специалистов по генерированию iPSC расширили выбор факторов перепрограммирования и показали, что при выборе фактора транскрипции в целях перепрограммирования могут быть допустимы некоторые изменения. В оригинальной работе Yamanaka, экспрессия факторов перепрограммирования была достигнута за счет применения вирусных векторов, которые интегрируются в геном, поскольку для эффективной трансформации клеток необходима длительная экспрессия этих факторов. Сопутствующая модификация генома представляет собой важный барьер для терапевтического применения iPSC, а возможность реактивации экспрессии из интегрированных вирусных кластеров является проблемой даже для исследований in vitro. Применение трансфекции мРНК для перепрограммирования, совсем недавно описанное группой авторов настоящего изобретения, является особенно привлекательным, поскольку эта система позволяет осуществлять экспрессию смесей факторов перепрограммирования и даже их отдельных компонентов, которые будут модулированы в короткие сроки просто путем изменения, которые вносят транскрипты, добавленные в клеточную культуральную среду. После завершения трансфекции конкретного фактора, эктопическая экспрессия в клетках-мишенях быстро прекращается из-за быстрого разложения мРНК в цитоплазме. Даже несмотря на то, что мРНК не сохраняется в клетке-мишени, она способна непосредственно транслироваться в цитоплазме без какой-либо скорость-ограничивающей транслокации в ядро, как и в случае трансфецированной ДНК и интегрирующихся вирусных векторов, что значительно компенсирует короткое время полужизни мРНК и приводит к высокоэффективной экспрессии, а также в пределах небольшого временного окна, которое имеет важное значение для определения статуса клетки.

[0052] Для уменьшения риска случайной геномной интеграции следует отказаться от долгодействующих ДНК-векторов, таких как эписомные плазмиды, если они используются для изменения клеточного статуса. РНК-вирусы или их производные, такие как вирус Сендай или вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE), даже после их «раздевания» с образованием модифицированного неинфекционного РНК-репликона, все еще несут вирусные элементы, которые имеют тенденцию к рекомбинации с вирусными элементами, скрытыми в геноме хозяина. Никогда нет полной уверенности в том, что клетки будут лишены вирусных векторов без трудоемкого поиска доказательств в форме негативных данных. В настоящем изобретении раскрывается множество изобретательских шагов, целью которых является применение преимуществ определения клеточного статуса на основе мРНК для направленной дифференцировки. В итоге, в настоящем изобретении раскрывается один или множество раундов эктопической экспрессии фактора транскрипции в основном способе регуляции дифференцировки клеток.

[0053] Тем не менее, существуют технические барьеры для дифференцировки стволовых клеток на основе мРНК. Не все типы стволовых клеток и культуральных сред в равной степени способствуют эффективной доставке мРНК, и в настоящее время являются препятствием для дифференцировки на основе мРНК. Также широко известно, что стволовые клетки, а в частности, большинство человеческих линий стволовых клеток, довольно трудно культивировать без образования пэтчей, резистентных к трансфекции. Частью настоящего изобретения является гипотеза, что плюрипотентные стволовые клетки могут быть культивированы в условиях, при которых большинство клеток могут быть трансфецированы модифицированными мРНК. В другом варианте осуществления изобретения, дозу РНК и реагента для трансфекции (которые обладают ассоциированной токсичностью) вводят в клетки на уровнях, способных влиять на эффекты основных регуляторных генов, поддерживающих жизнеспособность клеток-мишеней в условиях действия проапоптотических и цитостатических сил, которые возникают в процессе изменения клеточного статуса.

[0054] В соответствии с этим, с учетом проблем, связанных с ранее известными процедурами дифференцировки стволовых клеток, были разработаны описанные здесь новые методы, материалы и протоколы, позволяющие продуцировать клетки различных типов из iPSC или ESC с повышенной эффективностью и качеством полученных клеток. В настоящем изобретении достигается значительное улучшение посредством потенцирования мРНК TF, введенной в стволовые клетки-мишени. Настоящее изобретение также относится к новым протоколам осуществления продуцирования клеток ткани без футпринтинга из человеческих стволовых клеток без использования клеток-фидеров или любых других потенциальных ксеноконтаминированных реагентов. Новые протоколы расширяют преимущества модифицированной мРНК и помогают устранить остальные препятствия на пути к терапевтическому применению технологии дериватизации стволовых клеток.

[0055] Если учесть, что дифференцировка из плюрипотентных клеток в клетки в конечной стадии дифференцировки часто требует проведения множества стадий и занимает несколько недель и даже месяцев, то постадийная стратегия на основе фактора роста является по своей природе неэффективной и трудоемкой. В соответствии с этим, варианты осуществления настоящего изобретения позволяют полностью устранить необходимость в факторах роста для регуляции продуцирования панкреатических бета-клеток.

[0056] Более конкретно, настоящее изобретение относится к превращению плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток-предшественников или клеток-предшественников в клетки специфической линии дифференцировки или в клеточную ткань такого типа путем экспрессии ключевых генов, ответственных за статус клеток (называемых общим термином «стволовые клетки»), включая ключевые факторы статуса клеток и гибриды между обычными факторами транскрипции (TF) с трансактивирующими доменами, оптимизированными для превращения стволовых клеток в клетки различных типов; введения этих факторов в виде синтетической матричной РНК (мРНК) в культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, имеющие предпочтительную плотность, с применением методов, обеспечивающих соответствующие уровни экспрессии трансгена; поддержания клеток в оптимальных условиях для достижения эффективности специфической дифференцировки, которая не могла быть достигнута ранее. Факторами, экспрессируемыми посредством введения мРНК, могут быть также факторы роста, цитокины, гормоны, сигнальные пептиды и другие секретированные факторы или модифицирующие ферменты, влияющие на статус клеток. С применением аналогичной процедуры, микроРНК (миРНК) или другие РНК, не кодирующие белок, могут быть введены в клетки на переходном состоянии для регуляции дифференцировки. Способы согласно изобретению, по сравнению с другими известными способами, позволяют значительно сократить время, расходы и усилия, затрачиваемые на дифференцировку стволовых клеток в бета-клетки.

[0057] В настоящем изобретении описан способ превращения плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток-предшественников или клеток-предшественников в клетки специфической линии дифференцировки или в клеточную ткань такого типа, где указанные способы включают по меньшей мере одну из стадий: экспрессии ключевых генов, ответственных за статус клеток, включая ключевые факторы статуса клеток, оптимизированные для превращения стволовых клеток в клетки различных типов; введения этих факторов в виде синтетической матричной РНК (мРНК) в культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, имеющие предпочтительную плотность, с применением методов, обеспечивающих соответствующие уровни экспрессии трансгена; поддержания клеток в оптимальных условиях для достижения высокой эффективности специфической дифференцировки.

[0058] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к полностью стабилизированным размноженным iPSC.

[0059] В некоторых вариантах осуществления изобретения не требуется удаления эписом или РНК-вирусов (например, вируса Сендай), которые могут появляться через 10 пассажей после выделения iPSC.

[0060] В некоторых вариантах осуществления изобретения, этот способ осуществляют без фидеров.

[0061] В некоторых вариантах осуществления изобретения, этот способ является не ксеногенным и включает введение всех синтетических или человеческих реагентов, но не включает ни одного компонента животного происхождения.

[0062] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ проводят без футпринтинга, что исключает случайную интергацию ДНК в геном (как это часто бывает с эписомами).

[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения, этот способ дает полностью скорректированный генетический фон благодаря использованию исходной ткани, специфичной для пациента, и/или редактированию генома.

[0064] В другом эксперименте, в качестве альтернативы способу, описанному в таблице 1, клетки iPSC, культивированные в виде сфер в суспензии, непосредственно трансфецировали путем электропорации (например, с использованием электропоратора MaxCyte STX) без нанесения покрытия на поверхность планшета. В одном варианте осуществления изобретения, 2 миллиона исходных iPSC в виде сфер трансфицировали в суспензии другими мРНК, например, Sох 17 или Рах6, или подвергали ложному трансфецированию. Количество тестируемой мРНК, как показано на фигуре 8, составляло 2500 нг. Затем клетки культивировали в NBM в случае Soxl7-трансфекции, или MEM-альфа с KSR, в случае Рах6-трансфекции. Трансфекция может быть проведена повторно 1, 2, 3, 4, 5 или даже более раз, если транзиция занимает более длительный период времени. В результате, после 1-й трансфекции мРНК Sox 17, клеточные кластеры становились значительно меньше и представляли собой менее компактные сферы, теряя определенный «край» или внешнюю границу. В противоположность этому, ложнотрансфецированные сферы сохраняли четко определенные, и хорошо видимые внешние «края» на 2D-фотографиях. Более мелкие сферы нетрансфецированных или ложнотрансфецированных iPSC имели прозрачный внешний вид, тогда как более крупные сферы выглядяли менее прозрачными и имели толстые клеточные слои. Для сравнения, сферы iPSC, трансфецированные мРНК Рах6 (нейронная дифференцировка TF) продвигались в сторону эктодермы, то есть нервных клеток-предшественников, из-за которых сферы становились темнее и имели менее острый «край», чем ложнотрансфецированные сферы, но имели больший размер и более четкие границы, чем Sox 17-трансфецированные сферы.

[0065] Промежуточные клетки, специфичные для зародышевого слоя, такие как клетки эндодермы, и последующие промежуточные клетки, такие как клетки-предшественники гепатоцитов, панкреатических клеток-предшественников и т.п., могут быть также трансфецированы дополнительными мРНК TF в сферах по тому же принципу и теми же самыми методами. Клетки, трансфецированные таким образом, являются более устойчивыми к токсичности, вызываемой небольшими молекулами, факторами роста или другими элементами в клеточных культурах, и в основном, должны дифференцироваться более эффективно, чем клетки, подвергнутые 2D-трансфекции с использованием химических реагентов. Это наблюдение, которое осталось незамеченным в научной публикации, было сделано случайно во время тестирования оборудования для электропорации, и послужило в качестве стимулирующего метода в ходе раскрытия настоящего изобретения.

Определения

[0066] Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже приводится определение ряда терминов. Термины, определенные в настоящем документе, имеют общепринятые значения, обычно понятные специалисту в области, к которой относится изобретение. Служебные слова, такие как «а», «an» и «the» могут употребляться с существительным, определяемым не только какой-либо отдельный предмет, но и с существительным, под которым подразумевается весь класс этих предметов, конкретный пример которых может быть использован для иллюстрации. Терминология, используемая в настоящем изобретении, употребляется для описания конкретных вариантов осуществления изобретения, но ее использование не ограничивает настоящее изобретение, если это не выходит за рамки сформулированной формулы изобретения.

[0067] Термин «клетки, подобные бета-клеткам» означает клетки, имеющие общие признаки с панкреатическими бета-клетками. Клетки, подобные бета-клеткам, дополнительно определяются по их морфологическими свойствам, а также по специфическим маркерным свойствам. Поскольку клетки, подобные бета-клеткам, происходящим от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, имеют общие свойства (включая маркерные и гормональные свойства) с панкреатическими бета-клетками, то клетки, подобные бета-клеткам, происходящим от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, могут быть использованы как синоним термина «бета-клетки, происходящие от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток».

[0068] Термин «эмбриоидное тело» означает агрегат клеток, происходящих от плюрипотентных клеток, где агрегация клеток может быть инициирована любым методом, который предотвращает прилипание клеток к поверхности для формирования роста типичных колоний. Используемый здесь термин «эмбриоидное тело» означает трехмерный сфероидный агрегат плюрипотентных стволовых клеток, включая, но не ограничиваясь ими, эмбриональные стволовые клетки, образующиеся после стадии формирования бластоцистов эмбрионов млекопитающих. Эмбриоидное тело может быть образовано из эмбриональных стволовых клеток, полученных с применением любой технологии, в основном, известной специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, перенос ядер соматических клеток или перепрограммирование соматических клеток с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

[0069] Используемый здесь термин «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» означает плюрипотентные стволовые клетки, полученные из соматических клеток (например, соматических клеток взрослых). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки подобны эмбриональным стволовым клеткам по их способности дифференцироваться с образованием клеток взрослых любых типов, но не происходящих от эмбриона.

[0070] Используемые здесь термины «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» включают потомство. Следует также отметить, что все потомство не может быть полностью идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Этот термин также включает вариант потомства, который имеет такую же функцию или биологическое свойство, как и исходная трансформированная клетка как было оценено путем скрининга.

[0071] Используемый здесь термин «композиция» означает комбинацию активного агента и по меньшей мере одного другого соединения или молекулы, которые являются инертными (например, детектируемый агент или метка) или активными, такие как адъювант.

[0072] Используемый здесь термин «культивирование» означает поддержание клеток в условиях, при которых они могут размножаться и избежать старения как группы клеток. «Культивирование» может также включать условия, при которых клетки так же или альтернативно дифференцируются.

[0073] Используемый здесь термин «дифференциально экспрессированные» относится к дифференциальному продуцированию РНК, включая, но не ограничиваясь ими, мРНК, тРНК, миРНК, киРНК, мяРНК и пиРНК, транскрибируемые из гена или регуляторной области генома или белкового продукта, кодируемого геном, по сравнению с уровнем продуцирования РНК тем же самым геном или регуляторной областью в нормальной или контрольной клетке. В другом контексте, термин «дифференцированно экспрессированные» также относится к нуклеотидным последовательностям или белкам в клетке или в ткани, которые имеют различные временные и/или пространственные профили экспрессии по сравнению с нормальной или контрольной клеткой.

[0074] Используемый здесь термин «сверхэкспрессированный» или «сверхэкспрессия» относится к повышению уровня экспрессии продукта РНК или белка, кодируемого геном, по сравнению с уровнем экспрессии продукта РНК или белка в нормальной или контрольной клетке.

[0075] Используемый здесь термин «недостаточно экспрессированный» или «недостаточная экспрессия» относится к снижению уровня экспрессии продукта РНК или белка, кодируемого геном, по сравнению с уровнем экспрессии продукта РНК или белка в нормальной или контрольной клетке.

[0076] Используемый здесь термин «дифференцировать» или «дифференцировка» означает процесс, посредством которого предшественники или клетки-предшественники (то есть, панкреатические клетки-предшественники) дифференцируются в клетки специфических типов, например, в панкреатические бета-клетки.

[0077] Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для осуществления благоприятной или желаемой биологической, эмоциональной, терапевтической или клинической реакции клетки, ткани, системы, животного или человека. Эффективное количество может быть введено за один или более приемов, одно или более нанесений или в одной или более дозах. Этот термин также включает, в пределах его объема, количество, эффективное для усиления нормальной физиологической функции.

[0078] Используемый здесь термин «размножение» или «размноженный», если он относится к клеткам, указывает на увеличение числа клеток характерных типов или типов клеток, происходящих от исходной популяции клеток, которые могут быть, а могут и не быть, идентичными. Исходные клетки, используемые для размножения, необязательно должны быть такими же, как и клетки, полученные после размножения. Так, например, размноженные клетки могут быть получены путем культивирования ex vivo или in vitro и дифференцировки исходной популяции клеток.

[0079] Используемый здесь термин «экспрессия» означает процесс транскрипции полинуклеотидов в РНК-транскрипты. При описании мРНК и других транслированных молекул РНК, термин «экспрессия» также означает процесс или процессы последовательной трансляции транскрибированной РНК в пептиды, полипептиды или белки.

[0080] Используемые здесь термины «индуцированная плюрипотентная стволовая клетка» или «iPS-клетка» или «iPSC» означают клетки, способные дифференцироваться в клетки множества типов, которые были искусственно получены (неприродные) из не-плюрипотентных клеток.

[0081] Используемый здесь термин «неинтегрирующаяся iPS-клетка» означает iPS-клетки, которые не содержат экзогенного трансгена, интегрированного в геном не-плюрипотентных клеток.

[0082] Используемый здесь термин «выделенный» относится к компонентам, отделенным от других компонентов клеток и т.п., с которыми полинуклеотид, пептид, полипептид, белок, антитело или его фрагменты обычно ассоциируются в природе. Неприродные полинуклеотиды, пептиды, полипептиды, белки, антитела или их фрагменты не требуют «выделения» для того, чтобы отличить их от природного аналога.

[0083] Используемый здесь термин «концентрированный» относится к молекуле, включая, но не ограничиваясь ими, полинуклеотид, пептид, полипептид, белок, антитело или их фрагменты, которые отличаются от своего природного аналога тем, что концентрация или число молекул в данном объеме больше, чем у его природного аналога.

[0084] Используемый здесь термин «разведенный» относится к молекуле, включая, но не ограничиваясь ими, полинуклеотид, пептид, полипептид, белок, антитело или их фрагменты, которые отличаются от своего природного аналога тем, что концентрация или число молекул в данном объеме меньше, чем у его природного аналога.

[0085] Используемый здесь термин «разделенный» относится к состоянию объекта, физически отделенного от исходного источника или популяции таким образом, что отделенные соединения, агенты, частицы или молекулы уже не могут рассматриваться как часть исходного источника или популяции.

[0086] Используемый здесь термин «млекопитающее», подвергаемое лечению, означает любое животное, относящееся к классу млекопитающих, включая человека, домашних животных и сельскохозяйственных животных, приматов, не являющихся человеком, а также животных, содержащихся в зоопарке, животных, участвующих в спортивных состязаниях или домашних питомцев, таких как, но не ограничивающихся ими, собаки, лошади, кошки и коровы.

[0087] Используемый здесь термин «стволовые клетки» означает любые самообновляющиеся тотипотентные, плюрипотентные или мультипотентные клетки или их клетки-предшественники или клетки-предшественники, которые способны дифференцироваться в клетки различных типов.

[0088] Используемый здесь термин «тотипотентный» относится к клеткам, которые могут дифференцироваться и превращаться в клетки всех типов в организме, а также во внеэмбриональные клетки или клетки плаценты.

[0089] Используемый здесь термин «плюрипотентный» относится к клеткам, которые могут дифференцироваться и превращаться в клетки всех типов, которые составляют организм, включая любые клетки плода или взрослых, за исключением внеэмбриональных клеток или клеток плаценты.

[0090] Используемый здесь термин «мультипотентный» относится к клеткам, которые могут развиваться в клетки более, чем одного типа, но, в отличие от плюрипотентных клеток, они более ограничены по типам, в которые они могут развиваться.

[0091] Используемые здесь термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» являются синонимами и относятся к позвоночному организму.

[0092] Используемый здесь термин «по существу, чистая клеточная популяция» означает популяцию клеток, имеющих конкретные свойства клеточных маркеров и способность к дифференцировке, где указанная популяция составляет приблизительно 50%, предпочтительно приблизительно 75-80%, более предпочтительно приблизительно 85-90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95% от клеток, составляющих общую популяцию клеток. Таким образом, «по существу чистая клеточная популяция» означает популяцию клеток, которая содержит менее, чем приблизительно 50%, предпочтительно менее, чем приблизительно 20-25%, более предпочтительно менее, чем приблизительно 10-15%, а наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% клеток, которые имеют конкретные свойства клеточных маркеров и способность к дифференцировке в указанных условиях проведения анализа.

[0093] Используемый здесь термин «предварительная дифференцировка» означает процесс, посредством которого клетки-предшественники или клетки-предшественники (например, плюрипотентные стволовые клетки) дифференцируются в клетки промежуточных типов, например, в панкреатические клетки-предшественники, обладающие способностью дополнительно дифференцироваться в конечные эффекторные клетки (например, бета-клетки).

[0094] Используемый здесь термин «терапевтический» относится к лечению, терапии и/или облегчению симптомов заболевания, расстройства, состояния или побочного эффекта или к снижению скорости прогрессирования заболевания, расстройства, состояния или побочного эффекта. Этот термин также включает улучшение нормальной физиологической функции, паллиативное лечение и частичное ослабление заболевания, расстройства или состояния или побочного эффекта.

[0095] Используемые здесь термины «лечение» и «терапия», относятся, в основном, к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Этот эффект может быть профилактическим, то есть, направленным на предотвращение или частичное предотвращение заболевания, симптома или состояния, и/или может быть терапевтическим, направленным на частичное или полное излечение заболевания, состояния, симптома или побочного эффекта, ассоциированного с таким заболеванием. Используемый здесь термин «лечение» охватывает любое лечение млекопитающего, а в частности, человека, и включает: (а) профилактику заболевания у индивидуума, который может быть предрасположен к данному заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) подавление заболевания, то есть, прекращение его развития; или (с) ослабление заболевания, то есть, смягчение или облегчение течения заболевания и/или его симптомов или состояний. Используемый здесь термин «лечение» означает терапевтическое лечение и профилактические или превентивные меры. Индивидуумами, нуждающимися в лечении, являются индивидуумы, уже страдающие таким расстройством, а также индивидуумы, нуждающиеся в его профилактике.

[0096] Используемый здесь термин «профилактический» относится к замедлению или прекращению развития заболевания или состояния, прежде чем это происходит, даже если оно не было диагностировано, или если это заболевание или состояние находится в субклинической фазе.

[0097] Используемый здесь термин «активный агент» означает вещество, соединение или молекулу, которые являются биологически активными или как либо иначе индуцируют биологический или физиологический эффект у индивидуума, которому их вводят.

[0098] Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает разбавитель, адъювант, наполнитель или носитель, вместе с которым активный агент, хондроциты согласно изобретению или композицию, содержащую хондроциты согласно изобретению, вводят в комбинации, где такое введение одобрено Регуляторными Органами Федерального Правительства или Правительства штата, или где указанные носители перечислены в Фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях как разрешенные для применения в лечении животных и/или человека.

[0099] Если это не оговорено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют свои общепринятые значения, известные специалисту в данной области.

Типы клеток

[00100] Репрезентативными типами клеток могут быть, например, клетки эндодермы, панкреатические клетки-предшественники, панкреатические эндокринные клетки и бета-клетки.

[00101] Примерами подходящих поверхностей для культуральных сосудов являются, но не ограничивается ими, витронектин, E-кадгерин, Corning® Synthemax® II или Матригель для iPSC, который включает, но не ограничивается ими, Матригель для эндодермы, который, в свою очередь, включает, но не ограничиваются ими, Матригель или коллаген для панкреатических клеток-предшественников и панкреатических эндокринных клеток.

[00102] В одном из аспектов изобретения, репрезентативный способ блокирования дифференцировки или перепрограммирования соматических клеток может включать применение любого одного или более из синтетических факторов перепрограммирования мРНК, выбранных из Oct4, Sox2, Klf4, CMYC, Nanog и Lin28 и доменов трансактивации в целях перепрограммирования или блокирования дифференцировки соматических клеток. Способы и композиции для модуляции IPSC описаны в патентах США NN 13/893166 и 14/292317, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.

[00103] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к протоколам по применению суспензионных клеточных культур и культуральных планшетов и сосудов с низкой клеточной адгезией для приготовления таких суспензионных культур.

[00104] В некоторых вариантах осуществления, условия окружающей среды, такие как концентрация кислорода, могут быть модулированы для создания оптимальных условий индуцирования.

[00105] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам и методам отбора нужных клеток или повышения процента их конфлюэнтности или плотности в общей популяции клеточных культур.

[00106] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам получения криоконсервированных и дифференцированных клеток, подобных бета-клеткам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дифференцированные клетки подвергают криоконсервации для достижения оптимальной жизнеспособности клеток во время или после хранения, например, путем получения культуральной среды, содержащей HSA и/или DMSA. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть получена культуральная среда, содержащая, например, 2,5% HSA и 10% ДМСО в культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления изобретения, число клеток может быть оптимизировано для дальнейшего повышения жизнеспособности во время или после хранения.

[00107] Настоящее изобретение также относится к способам повторного культивирования дифференцированных клеток. Клетки могут быть повторно культивированы в большинстве сосудов для культивирования: например, в колбе T75, в колбе Т25, в 6-луночном планшете, в 96-луночном планшете. Клетки могут быть повторно культивированы при различных плотностях для различных применений.

[00108] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение также относится к способам снижения физической нагрузки на клетки во время обработки в течение всего процесса дифференцировки, и, тем самым, повышения их жизнеспособности. Клетки определенных типов во время дифференцировки являются очень мелкими, подобно iPSC. Эти небольшие клетки очень чувствительны к центробежной силе. iPSC очень чувствительны к избыточной центробежной силе. Клетки некоторых типов в процессе дифференцировки являются очень липкими, подобно iPSC и клеткам на стадии эндодермы. Эти клетки очень чувствительны к сдвиговым усилиям. При обработке этих клеток используют 10 мл-пипетку без применения каких-либо небольших наконечников для повторного пипетирования вверх и вниз. Для хранения, эти клетки могут быть культивированы как колонии, а затем подвергнуты диссоциации в виде кластеров, а не отдельных клеток. Для дифференцировки, если необходимо использовать отдельные клетки, диссоциацию можно завершить еще до их отслоения с последующим удалением диссоциирующего раствора и последующей диссоциацией клеток в остаточном диссоциирующем растворе. Этот протокол обычно применяется для культивирования клеток.

[00109] Описание изобретения будет более понятным со ссылкой на документы, цитируемые в настоящей заявке. Варианты осуществления изобретения приводятся лишь в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Каждому специалисту в данной области хорошо известно, что в объем настоящего изобретения входят и многие другие варианты его осуществления. Все публикации и патенты, цитируемые в настоящей заявке, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Если материал, включенный в качестве ссылки, противоречит или не соответствует описанию настоящей заявки, то такой материал может быть заменен любым другим материалом. Цитирование любых докуменов в настоящей заявке никоим образом не должно указывать на то, что такие документы относятся к предшествующему уровню техники.

[00110] Если это не оговорено особо, то все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.п., используемые в описании, включая формулу изобретения, во всех случаях следует понимать как числа, имеющие отклонения от указанной величины и определяемые термином «приблизительно». В соответствии с этим, если это не оговорено особо, то численные параметры являются приблизительными и могут изменяться в зависимости от нужных свойств, которые должны быть достигнуты в настоящем изобретении. Ни в малейшей степени и без всякой попытки ограничить применение доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, следует отметить, что каждый числовой параметр должен быть представлен как число значащих цифр, округленное по обычным правилам округления.

[00111] Употребление артиклей «а» или «an», если они используется в сочетании со словом «содержащий» в формуле изобретения и/или в описании изобретения, может означать «один», но, при этом также допускаются значения «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более, чем один». Использование слова «или» в формуле изобретения означает «и/или», если это явно не указано лишь на альтернативное значение, или если альтернативные значения являюся взаимоисключающими, хотя в раскрытие настоящего изобретения поддерживается определение, которое относится только к альтернативам и «и/или».

[00112] Если это не оговорено особо, то словосочетание «по меньшей мере», если оно стоит до перечисления ряда элементов, следует понимать как относящееся к каждому элементу в этом ряду. Специалистам в данной области будет понятно или они могут самостоятельно определить с помощью не более, чем рутинных экспериментов множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления описанного здесь изобретения. Такие эквиваленты входят в объем нижеследующей формулы изобретения.

[00113] Если это не оговорено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют свои общепринятые значения, известные специалисту в области, к которой относится изобретение. Хотя для практического осуществления изобретения или проведения тестов в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, однако, в данном описании приводятся предпочтительные способы и материалы.

[00114] Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны для специалиста в данной области исходя из приведенного здесь описания и практического применения раскрытого здесь изобретения. При этом следует отметить, что описание и примеры приводятся лишь в иллюстративных целях, однако, истинный объем и сущность изобретения сформулированы лишь в прилагаемой формуле изобретения.

Примеры

[00115] Настоящее изобретение описано со ссылкой на нижеследующие примеры. Эти примеры приводятся в целях иллюстрации, однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами, а, скорее, охватывает все варианты, которые будут очевидны из приведенного здесь описания.

Пример 1: Продуцирование клеток эндодермы из iPSC

[00116] iPSC высевали в 6-луночные планшеты стандартного размера для культивирования клеток (площадь культивирования приблизительно 9,5 см²/лунку) или в 12-луночные планшеты стандартного размера для культивирования клеток (площадь культивирования приблизительно 3,8 см²/лунку) для инициации дифференцировки. Таким же образом, но необязательно, могут быть использованы сосуды для культивирования другого размера, а иногда могут оказаться более предпочтительными планшеты, имеющие большее число лунок, чем 6- или 12-луночные планшеты, поскольку они обеспечивают большую эффективность использования реагентов и сокращение времени. Репрезентативные условия проведения высокоэффективного протокола получения функциональных дифференцированных бета-клеток представлены ниже в Таблице «Дифференцировка бета-клеток», где указаны начальная клеточная стадия, сосуды для культивирования, покрытия, диссоциирующие агенты, название среды и основные компоненты, плотность посева для репрезентативного 6-луночного планшета и уровень кислорода.

Таблица 1: Дифференцировка бета-клеток

2-6 дней 1-3 дня 1-3 дня 3-6 дней Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Исходные клетки iPSCs Эндодерма Панкреатические клетки-предшественники Панкреатические эндокринные клетки Сосуды для культивирования Планшет/колба со сверхнизкой адгезией Планшет/колба для культивирования Планшет/колба для культивирования а Планшет/колба для культивирования Покрытие Нет Матригель Матригельl/Коллаген I Матригельl/Коллаген I Диссоциация EDTA TypLE TypLE TypLE Названия среды и главные компоненты MEMa, DMEM/F12, DMEM B27
10-50 мкМ инсулина
5% KSR
Трансфекция мРНК SOX17 DMEM/F12, MCDB131+8 мМ D- глюкоза
Трансфекция мРНК PDX1 DMEM/F12, MCDB131+20 мМ D-глюкоза
Трансфекция мРНК PDX1 и NKX6.1 CMRL
Трансфекция мРНК NKX6.1 и MAFA Плотность посева
(для 6-луночного планшета) 1×10⁵- 4×10⁵ клеток на лунку 1×10⁵- 3×10⁵ клеток на лунку 3×10⁵ клеток на лунку 3×10⁵ клеток на лунку l Кислород Нормальный кислород Нормальный кислород Нормальный кислород Нормальный кислород

[00117] В 6-луночном планшете были успешно использованы популяции клеток размером от 1 × 10 ⁵ до 4 × 10 ⁵ на лунку. iPSC рассматривались как готовые к дифференцировке, если достаточное число типичных колоний iPSC имели хорошо очерченные края, клетки были компактными, а рост колоний не был избыточным. Качество iPSC согласно изобретению, полученных в соответствии с этими критериями, играет главную роль для дифференцировки, как было подтверждено при сравнении линий iPSC согласно изобретению с линиями Ipsc, которые были получены другими методами.

[00118] На этой стадии, iPSC индуцировали для дифференцировки в клетки линии мезоэндодермы. Неожиданно было обнаружено, что суспензионные клеточные системы являются наиболее подходящими для масштабирования на этой стадии, даже несмотря на то, что для использования прикрепленных клеточных монослоев обычно предпочитают использовать большинство современных протоколов для дифференцировки. Более конкретно, iPSC, выращенные в суспензии для индуцирования, были более резистентными к химической токсичности и их было легче повторно культивировать на более поздних стадиях. Планшеты со сверхнизкой адгезией (Sigma-Aldrich) или другие планшеты с низкой адгезией были использованы для стимуляции роста клеточной суспензии iPSC.

[00119] Если iPS-клетки должны быть пассированы, то важно провести диссоциацию колоний iPSC в соответствии с протоколом, обеспечивающим низкую цитотоксичность и позволяющим получить еще более мелкие кластеры iPSC, которые могут быстро образовывать сферы, если желательно получить суспензионную культуру. iPSC диссоциировали с использованием TripLE^TM (ThermoFisher), аккутазы (Life Technology) или EDTA путем диссоциации под действием EDTA в концентрации 0,1 мМ, а иногда 0,5 мМ или 1 мМ в DPBS (Fisher Scientific), при 37°C в течение 5 минут. Эту стадию успешно проводили в различные периоды времени диссоциации, включая, в некоторых вариантах осуществления изобретения, от 1 до 2 минут, а иногда от 10 до 20 минут. В некоторых аспектах изобретения, время диссоциации может составлять 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 минут.

[00120] Для получения среды были протестированы MEMA, DMEM/F12 и DMEM В27 с использованием 10-50 мкМ инсулина и 5% KSR, и эти среды оказались подходящими для получения результатов, желательных на этой стадии дифференцировки. Затем iPSC были индуцированы для терминации плюрипотентной стадии клеток и их дифференцировки в мезоэндодерму в присутствии ингибиторов GSK3, таких CHIR99021, CHIR98014, BIO или ингибитор GSK IX и SB-216763, которые осуществляют активацию функций генов пути Wnt, BMP4 и активина А. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсулин присутствует в концентрации например, приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мкМ, или в интервалах между любыми перечисленными выше значениями. Ингибиторы GSK3 вводили с временными окнами в 1, 2, 3 дня, и используемые здесь FoxА2-, CXCR4-позитивные клетки подсчитывали в анализе контроля качества в течение определенного периода времени и при концентрации ингибиторов, например, 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибиторы присутствуют в концентрациях 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ, или в интервалах между любыми перечисленными выше значениями.

[00121] В одном эксперименте, клетки затем трансфецировали мРНК FoxА2 и/или Sох17 в дозе 20 нг на лунку с использованием реагента для трансфекции Stemgent (Stemgent). Эта трансфекция также была проведена с использованием мРНК GATA4 и/или мРНК GATA6, и ее повторяли 3, 4, 5 и 6 раз, иногда в 10 раз более высокой дозе мРНК с использованием реагента для трансфекции Stemgent или других коммерчески доступных реагентов для трансфекции. Клетки на этой стадии имели морфологию, более близкую к морфологии эпителиальных клеток, чем мезенхимальные клетки, происходящие от iPSC в различные периоды времени трансфекции мРНК и с различными начальными плотностями (фиг. 1).

[00122] В другом эксперименте, в качестве альтернативы способу, описанному в таблице 1, клетки iPSC, культивированные в виде сфер в суспензии, непосредственно трансфецировали путем электропорации (например, с использованием электропоратора MaxCyte STX) без нанесения покрытия на поверхность планшета. В одном варианте осуществления изобретения, 2 миллиона исходных iPSC в виде сфер трансфецировали в суспензии другими мРНК, например, Sох17 или Рах6, или подвергали ложному трансфецированию. Количество тестируемой мРНК, как показано на фигуре 8, составляло 2500 нг. Затем клетки культивировали в NBM в случае Soxl7-трансфекции, или MEM-альфа с KSR, в случае Рах6-трансфекции. Трансфекция может быть проведена повторно 1, 2, 3, 4, 5 или даже более раз, если транзиция занимает более длительный период времени. В результате, после 1-й трансфекции мРНК Sox17, клеточные кластеры становились значительно меньше и представляли собой менее компактные сферы, теряя определенный «край» или внешнюю границу. В противоположность этому, ложнотрансфецированные сферы сохраняли четко определенные и хорошо видимые внешние «края» на 2D-фотографиях. Более мелкие сферы нетрансфецированных или ложнотрансфецированных iPSC имели прозрачный внешний вид, тогда как более крупные сферы выглядяли менее прозрачными и имели толстые клеточные слои. Для сравнения, сферы iPSC, трансфецированные мРНК Рах6 (нейронная дифференцировка TF), продвигались в сторону эктодермы, то есть нервных клеток-предшественников, из-за которых сферы становились темнее и имели менее острый «край», чем ложнотрансфецированные сферы, но по размеру они были больше и имели более четкие границы, чем Sox17-трансфецированные сферы.

[00123] По тому же принципу и теми же самыми методами промежуточные клетки, специфичные для зародышевого слоя, такие как клетки эндодермы, и последующие промежуточные клетки, такие как клетки-предшественники гепатоцитов, панкреатических клеток-предшественников и т.п., могут быть также трансфецированы дополнительными мРНК TF в сферах. Клетки, трансфецированные таким образом, являются более устойчивыми к токсичности, вызываемой небольшими молекулами, факторами роста или другими элементами в клеточных культурах, и в основном, должны дифференцироваться более эффективно, чем клетки, подвергнутые 2D-трансфекции с использованием химических реагентов. Это наблюдение, которое осталось незамеченным в научной публикации, было сделано случайно во время тестирования оборудования для электропорации, и послужило в качестве стимулирующего метода в ходе раскрытия настоящего изобретения.

Пример 2: Продуцирование панкреатических клеток-предшественников из клеток эндодермы

[00124] Клетки эндодермы высевали в коммерчески доступные сосуды для культивирования клеток. 6-луночные планшеты были использованы в экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 2, но при этом, могут быть также использованы и другие стандартные коммерчески доступные планшеты с подходящими размерами лунок. Планшеты были предварительно покрыты Матригелем (BD Biosciences), а затем 1×10^5-1×10⁶ клеток высевали в среду DMEM/F12 или MCDB131 с добавлением 8 мМ D-глюкозы.

[00125] В одном эксперименте, клетки затем трансфецировали мРНК PDX1. Кроме того, клетки были трансфецированы или котрансфецированы мРНК Hlxb9, Ptf1a, ixl1, HNF1a и b и Sox9 в дозе приблизительно 50 нг на лунку для достижения более сильных эффектов с использованием реагента для трансфекции Stemgent (Stemgent) в культуральной среде, и эту трансфекцию повторяли 2, 3 или более раз в дозах в пределах по меньшей мере от 10 нг и максимум до 200 нг на лунку с использованием реагента для трансфекции Stemgent или других коммерчески доступных реагентов для трансфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, начальная или повторная доза Stemgent может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 1120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 нг на лунку или любое значение в интервалах между любыми перечисленными выше значениями. Клетки на этой стадии являются более темными, чем клетки эндодермы, и, как правило, имеют тенденцию к образованию кластеров (фиг. 2).

Пример 3: Продуцирование панкреатических эндокринных клеток из панкреатических клеток-предшественников

[00126] Панкреатические клетки-предшественники культивировали в 6-луночных планшетах или в других планшетах, предварительно покрытых Матригелем (BD Biosciences) или коллагеном I (Sigma) в среде DMEM/F12 или MCDB131 с добавлением 8 мМ D-глюкозы. Для использования в этих целях, подходящей также является и другая подобная культуральная среда для адгезии клеток.

[00127] Панкреатические клетки-предшественники трансфецировали мРНК PDX1, NKX6.1 и/или NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9 Ngn3 в дозе 10-200 нг на лунку с использованием реагента для трансфекции Stemgent (Stemgent) в культуральной среде с добавлением 200 нг/мл B18R. В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза Stemgent может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 1120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, или 200 нг на лунку или любое значение в интервале между любым из указанных выше указанных значений.начальная или повторная доза Stemgent может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 нг на лунку, или в интервалах между любыми перечисленными выше значениями. Также может быть использовано большинство коммерчески доступных реагентов для трансфекции.

[00128] На этой стадии, панкреатические клетки-предшественники обрабатывают, но необязательно, рядом факторов роста для последующей дифференцировки. Клетки культивировали в среде S5, содержащей MCDB131+20 мМ D-глюкозы+1,754 г/л NaHCО₃+2% FAF-ВSА+ITS-Х 1:200+2 мМ Glutamax+0,25 мМ витамина С+1% пенициллина/стрептомицина+10 мкг/мл гепарина (Sigma; H3149). Клетки обрабатывали средой S5, содержащей 0,25 мкМ Sant 1+100 нМ RA+1 мкМ XXI (EMD Millipore)+10 мкМ Alk5i II (Axxora)+1 мкМ Т3 (EMD Millipore)+20 нг/мл бета-целлюлина (Thermo Fisher Scientific) каждый день в течение четырех дней. На пятый день, клетки обрабатывали средой S5, содержащей 25 нМ RA+1 мкМ XXI+10 мкМ Alk5i II+1 мкМ T3+20 нг/мл бета-целлюлина каждый день в течение четырех дней.

[00129] На этой стадии, клетки дополнительно кластеризовали и инициировали флотацию из монослоя, которая является ранним признаком дифференцировки и образования панкреатических эндокринных клеток (фиг. 3).

Пример 4: Созревание панкреатических эндокринных клеток

[00130] Панкреатические эндокринные клетки культивировали в коммерческих доступных сосудах для культивирования клеток. В этих экспериментах использовали 6-луночные планшеты, но могут быть также использованы планшеты и всех других типов. Планшеты предварительно покрывали Матригелем (BD Biosciences) или коллагеном I (Sigma) в CMRL (Mediatech). После сбора кластеров использовали планшеты или колбы со сверхнизкой адгезией.

[00131] Затем эти клетки трансфецировали мРНК KX6.1/MAFA или MAFA в дозе 10-200 нг на лунку с использованием реагента для трансфекции Stemgent (Stemgent) в культуральной среде с добавлением 200 нг/мл B18R. Повторные трансфекции проводили 3 раза, при этом, если необходимо, могут быть проведены необязательные дополнительные трансфекции. Могут быть также использованы и другие коммерчески доступные реагенты для трансфекции.

[00132] Панкреатические эндокринные клетки также обрабатывают, но необязательно, рядом факторов роста для последующего созревания. Клетки культивировали в среде S6, содержащей среду с добавкой CMRL 1066 (Mediatech; 99-603-CV)+10% FBS (HyClone, VWR; 16777)+1% пенициллина/стрептомицина. Клетки обрабатывали средой S6, содержащей 10 мкМ Alk5i II+1 мкМ T3, каждый день в течение 14 дней.

[00133] На этой стадии, кластеры панкреатических эндокринных клеток, таких как бета-клетки, образуют кластеры размера от нескольких десятков до нескольких тысяч клеток, которые самостоятельно отделялись от монослоя созревших панкреатических эндокринных клеток. На этой стадии, клеточные культуры были представлены в качестве примеров на фиг. 4. Эти клетки окрашивали антителами против белковых маркеров, специфичных к этой клеточной стадии, таких как KX6.1 и инсулин, и результаты такого окрашивания подтвердили, что некоторые из этих клеток действительно являются панкреатическими бета-клетками (фиг. 5). Эти клетки также продемонстрировали специфические маркеры статуса клеток по всему этому искусственно индуцированному пути дифференцировки в клетки, подобные бета-клеткам (фиг. 6). Кроме того, в культуральную среду добавляли кластеры бета-клеток, отвечающие на глюкозу, и бета-клетки секретировали инсулин в ответ на глюкозу (фиг. 7).

Пример 5: Бета-клетки, происходящие от iPSC, реагируют на глюкозу in vitro

[00134] Кластеры клеток, образованные в виде 3-мерных структур из монослойных панкреатических эндокринных клеток, как показано на фиг. 4, собирали и переносили в 15 мл-пробирки, 2×10^5-1×10⁶ клеток на пробирку, и культуральную среду удаляли путем центрифугирования (300× g в течение 2 минут) и два раза промывали 1 мл буфера Кребса на образец (публикация Милтона 2014). К клеткам добавляли 3 мл среды Кребса с низкой концентрацией глюкозы (2 мМ) и инкубировали в течение 2 часов. Среду удаляли путем центрифугирования, и клетки 2 раза промывали 1 мл буфера Кребса на образец. В каждую пробирку добавляли 1 мл буфера Кребса с низкой концентрацией глюкозы и инкубировали в течение 30 минут при 37°C в инкубаторе, крышку которого закрывали неплотно для обеспечения воздушного обмена. После этого, супернатант собирали для анализа путем центрифугирования, а затем клетки один раз промывали 1 мл буфера Кребса, инкубировали в буфере Кребса с высоким содержанием глюкозы (20 мМ) в течение 30 минут, а затем центрифугировали для сбора супернатанта для анализа. Клетки два раза промывали, а затем повторяли цикл с низкой-высокой концентрацией глюкозы, и эту процедуру проводили всего 3 раза. Супернатанты собирали в каждой стадии, объединяли после 4-6 независимых повторов и анализировали на уровень инсулина с использованием коммерчески доступного набора для ELISA (ALPCO) и планшет-ридера (Tecan или SpectroMax). Для сравнения, анализ также проводили с бета-клетками, полученными, в основном, в соответствии с протоколом Милтона (2014), и результаты показали, что бета-клетки, полученные способом согласно изобретению, имели более низкий базовый уровень экспрессии инсулина и более высокий уровень инсулина в ответ на увеличение концентрации глюкозы в среде по сравнению с методом Милтона (фиг. 7), что указывает на неожиданные и удивительные преимущественные свойства вариантов настоящего изобретения.

Пример 6: Бета-клетки, происходящие от iPSC, реагируют на глюкозу у животных-моделей

[00135] Для дополнительного подтверждения функций репрезентативныхх зрелых панкреатических бета-клеток, полученных в соответствии с настоящим изобретением, функцию восприимчивых к глюкозе и инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток, происходящих от iPSC, тестировали на мышах с моделью диабета, таких как: 1) мышь NOD со спонтанной моделью диабета типа I; 2) модель STZ-индуцированного диабета типа I; 3) модель ob/ob или db/db с диабетом типа II; или на приматах, не являющихся человеком, таких как: макаки/зеленые мартышки или павианы с моделью STZ-индуцированного диабета типа I; или макаки/зеленые мартышки или павианы с моделью диабета типа II, индуцированного спонтанно или после употребления корма с высоким содержанием жира.

[00136] Способ доставки: репрезентативные сферы панкреатических бета-клеток вводили путем инфузии в печеночную или в почечную капсулы или в сальник. Тестирование: измеряли уровень инсулина в сыворотке без стимуляции глюкозой (неделя 2, 4, 8, 12, 16, 24); проводили измерение уровня инсулина в сыворотке без стимуляции глюкозой (недели 2, 4, 8, 12, 16, 24); проводили оценку уровня глюкозы в крови у животных натощак (неделя 2, 4, 8, 12, 16, 24); проводили ИГХ-анализ участка трансплантации на инсулин, и проводили окрашивание на С-пептид и глюкагон. Результаты продемонстрировали устранение или ослабление симптомов диабета, таких как высокое содержание глюкозы в крови и связанные с ним воздействия на органы.

Пример 7: Бета-клетки, происходящие от iPSC, реагируют на глюкозу при лечении пациентов с диабетом

[00137] Клинические испытания с использованием человеческих панкреатических бета-клеток, происходящих от iPSC, проводимые в соответствии с описанными протоколами, адаптированными для проведения процедур cGMP, осуществляли путем введения доз в исследованиях на животных по сравнению с другими видами клеточной терапии, и даже если в настоящее время не проводится терапия с использованием панкреатических бета-клеток, происходящих от iPSC, то панкреатические клетки-предшественники, происходящие от человеческих ESC, на данный момент используются в клинических испытаниях, целью которых является лечение диабета типа I. Аутологичные, предпочтительного типа, или аллогенные бета-клетки, происходящие от iPS-клеток, вводили через воротную вену для лечения, например, индуцированного диабета типа I, диабета типа II «тощих», диабета на поздней стадии, если собственные бета-клетки человека не функционируют или истощаются, или диабета другого типа, ассоциированного с нарушением функции бета-клеток. Репрезентативные специально созданные бета-клетки, полученные способами согласно изобретению, описанными в настоящей заявке, вводили в другие органы человеческого организма, такие как мышцы, соединительные ткани, части поджелудочной железы или в некоторые участки других органов.

Группа изобретений относится к области клеточной биологии и клеточной терапии. Предложен способ индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки. Способ предусматривает превращение плюрипотентных клеток стволовых клеток в мезоэндодерму, а затем в эндодерму, в панкреатические эндокринные клетки и, наконец, в панкреатические бета-клетки с использованием определенных комбинаций мРНК. Способ позволяет получать функциональные панкреатические бета-клетки без использования факторов роста для их продуцирования. Также предложены способ продуцирования индуцированных чувствительных к глюкозе инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток и способ устранения или ослабления симптомов диабета у индивидуума введением субъекту полученных чувствительных к глюкозе инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Способ индуцирования дифференцировки стволовых клеток в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие панкреатические бета-клетки, где указанный способ включает стадии:

(а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки;

(b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму;

(c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и периоде времени, где первая комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК FoxA2 и мРНК Sox17;

(d) превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК, где вторая комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, Hlxb9, Ptf1a, ixl1, HNF1a и b и Sox9;

(e) созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК, где третья комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, NKX6.1, NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9 и Ngn3; и

(f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу,

где индуцированные плюрипотентные стволовые клетки не выделяют из эмбриона человека.

2. Способ по п.1, где указанная первая комбинация мРНК содержит мРНК FoxA2.

3. Способ по п.1, где указанная первая комбинация мРНК содержит мРНК Soxl7.

4. Способ по п.1, где указанная первая комбинация мРНК содержит мРНК FoxA2 и Soxl7.

5. Способ по п.1, где указанная первая комбинация мРНК содержит мРНК FoxA2, Sox17, GATA4 и GATA6.

6. Способ по п.1, где указанная вторая комбинация мРНК содержит по меньшей мере мРНК PDX1.

7. Способ по п.1, где указанная третья комбинация мРНК содержит по меньшей мере мРНК PDX1 и NKX6.1.

8. Способ по п.1, включающий созревание панкреатических эндокринных клеток со стадии (е) в панкреатические бета-клетки с использованием четвертой комбинации мРНК, где четвертая комбинация мРНК содержит мРНК NKX6.1 и MAFA или мРНК MAFA.

9. Способ по п.1, где указанные iPSCs выделяют из физиологической жидкости или ткани индивидуума.

10. Способ устранения или ослабления симптомов диабета у индивидуума, который включает

(а) культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки;

(b) индуцирование указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму;

(c) направление дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и периоде времени, где первая комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК FoxA2 и мРНК Sox17;

(d) превращение указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК, где вторая комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, Hlxb9, Ptf1a, ixl1, HNF1a и b и Sox9;

(e) созревание указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК, где третья комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, NKX6.1, NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9 и Ngn3;

(f) сбор кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу; и

(g) введение чувствительных к глюкозе инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток субъекту;

где iPSCs не выделяют из эмбрионов человека.

11. Способ по п.10, где указанные iPSCs выделяют из индивидуума-реципиента.

12. Способ продуцирования индуцированных чувствительных к глюкозе инсулин-секретирующих панкреатических бета-клеток, где указанный способ включает стадии:

(а) культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходных клеток в условиях дифференцировки;

(b) индуцирования указанных исходных клеток для перехода из плюрипотентного состояния в состояние линии дифференцировки в мезоэндодерму;

(c) направления дифференцировки клеток в клетки эндодермы посредством трансфекции клеточной культуры первой комбинацией мРНК в эффективной дозе и периоде времени, где первая комбинация мРНК содержит по меньшем мере одну из мРНК FoxA2 и мРНК Sox17;

(d) превращения указанных клеток эндодермы в панкреатические клетки-предшественники путем трансфекции второй комбинацией мРНК, где вторая комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, Hlxb9, Ptf1a, ixl1, HNF1a и b и Sox9;

(e) созревания указанных панкреатических клеток-предшественников в панкреатические эндокринные клетки с использованием третьей комбинации мРНК, где третья комбинация мРНК содержит по меньшей мере одну из мРНК PDX1, NKX6.1, NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9 и Ngn3; и

(f) сбора кластеров, обогащенных панкреатическими бета-клетками, которые являются восприимчивыми к глюкозе окружающей среды и способны секретировать инсулин в ответ на глюкозу,

где индуцированные плюрипотентные стволовые клетки не выделяют из эмбриона человека.