Выделение грайанотоксина III из листьев рододендрона желтого Российский патент 2024 года по МПК A61K36/45 B01D11/02 A61K127/00 

Изобретение относится к фармации, в частности к химико-фармацевтической отрасли, касается способа выделения грайанотоксина III из листьев рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet, Azaleaflava Hoffmanns., Azaleapontica L., Rhododendron flavum G. Don) и может использоваться для получения стандартных образцов и лекарственных препаратов на основе этого соединения.

Растения рода Rhododendron характеризуются широким перечнем видов фармакологической активности, которые связывают с их вторичными метаболитами. Например, с простыми фенольными соединениями и их гликозидам, к которым относят арбутин. Так, в рододендроне желтом по данным из литературы содержание арбутина колеблется от 0,9 до 2% [Жаворонкова М.Е. Сравнительное фармакогностическое изучение европейских и азиатских видов рода Rhododendron L. флоры России. Дис. … кандид. фармац. наук - Пермская государственная фармацевтическая академия, Пермь, 2012; Жаворонкова, M. Е. Содержание арбутина в листьях некоторых видов рода рододендрон / M. Е. Жаворонкова, Н. С. Фурса, М. В. Белоусов // Российский медико-биологический вестник им. академика И. П. Павлова. - 2008. - №2. - С. 91-94.]. Наиболее изученной группой вторичных метаболитов представителей рода рододендрон являются флавоноиды - более 65 соединений [Rakesh Jaiswal, Lalith Jayasingheb, Nikolai Kuhnert. Identification and characterization of proanthocyanidins of 16 members of the Rhododendron genus (Ericaceae) by tandem LC-MS //J. Mass. Spectrom. 2012, 47, 502-515. DOI 10.1002/jms.2954. Lin Liu, Liang-Ying Zhang, Shu-Li Wang, Xin-Yu Niu. Analysis of anthocyanins and flavonols in petals of 10 Rhododendron species from the Sygera Mountains in Southeast Tibet// Plant Physiology and Biochemistry. Tibet.2016. Pp.250-256. Е.А.Карпова, А.В. Каракулов. Флаваноиды некоторых видов рода Рододендрон флоры Сибири и Дальнего Востока// Химия растительного сырья. 2013. - №2. - С. 119-126; В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Г.И. Бочарова, А.В. Чепогузова. Динамика содержания флавоноидов и дубильных веществ В надземных органах рододендрона даурского // Экспериментальные исследования. Иркутск. - 2005. - №6. - С. 149-152]. Из рододендрона желтого было выделено пять флавоноидов: кверцетин, азалеатин, гиперозид, гваяверин и мирицетин, определены их структуры и характер гликозидной связи. Содержание флавоноидов в рододендроне желтом достигает 8% [Флавонолы Rhododendronluteum и Rh. Dauricum / Оганесян Э.Т., Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л. // Химия природных соединений. - 1967. - № 4. - С. 279].

Из 98 видов рододендронов были получены фенолкарбоновые, гидроксикоричные кислоты, в частности, 69 производных гидроксикоричных кислот [Yuhua Caoa, Qingcui Chub, Jiannong Yeb. Chromatographic and electrophoretic methods for pharmaceutically active compounds in Rhododendron dauricum / Y. Cao et al. // J. Chromatogr. B 812 (2004). Shanghai. Pp. 231-240; Е.А. Карпова, А.В. Каракулов. Фенольные соединения близкородственных видов рода Рододендрон // Хромосомные числа и хемосистематика. 2011,14(3). С. 145-149; Ю.А. Морозова, М.А. Суботялов. Биологическая активность и компонентный состав некоторых видов рода Рододендрон флоры России // Растительный Ресурсы. Новосибирск. 2018. 54(3). С. 347-360]. Кроме того, из рододендронов были выделены и другие вторичные метаболиты, а именно, кумарины, хромоны, из эфирного масла - терпеновые производные [Abhinan dan Shrestha, Inamullah Hakeem Said, Anne Grimbs, Naika Thielen, Lucas Lansing, Hartwig Schepker, Nikolai Kuhnert; Determination of hydroxycinnamic acids presentin Rhododendron species // Phytochemistry. Bremen.2017. Pp. 216-225. DOI: 10.1016/j.phytochem.2017.09.018; Zhaoxin Zhang, Huimin Yan, Yuxun Zhu, Huanping Zhang, Lisha Chai, Li Li, Xiaojing Wang, Yunbao Liu, Yong Li. New lignans, sesquiterpenes and other constituents from twigs and leaves of Rhododendron micranthum // Fitoterapia. Beijing. 2019. Pp. 15-21. DOI: 10.1016/j.fitote.2019.03.025; И.В. Лапко, Ю. Баксенова, О.В. Кузнецова, С.В. Василевский, А.В. Аксенов, В.Ф. Таранченко, А. Мантохин, А.А. Ихалайнен. Эфирные масла: методы определения подлинности и выявления фальсификации. Обзор // Аналитика и контроль. Москва. 2019. Т.23 № 4. С. 444-475].

Однако наиболее многочисленной и распространенной для растений семейства Вересковые (Ericaceae) группой вторичных метаболитов, насчитывающей порядка 290 соединений, являются дитерпеноиды грайанового типа (грайанотоксины - GTX). Они признаны вторичными метаболитами, характерными для родов Pieris, Kalmia, Craibiodendron, Leucothoe и Rhododendron. Наибольшее число GTX в виде индивидуальных соединений выделено из растений рода Rhododendron [Chun-HuanLi , Jia-Yao Zhang, Xiu-Yun Zhang, Sheng-Hong Li, Jin-Ming Gao. An overview of grayanane diterpenoids and their biological activities from the Ericaceae family in the last seven years // European Journal of Medicinal Chemistry. 166 Kunming. (2019). Pp. 400-416. DOI: 10.1016/j.ejmech.2019.01.079]. Эта группа вторичных метаболитов семейства вересковые заслуживает отдельного внимания, т.к. именно грайановые дитерпеноиды связывают с антиноцицептивным, в эксперименте превосходящим морфин, противовоспалительным, причем при отсутствии гастро-ульцерогенного эффекта, кардиотоническим, противовирусным и цитотоксическим действием рододендронов [Yin Qianga., Baoshi Zhoub., Kun Gao.. Chemical Constituents of Plants from the Genus Rhododendron // Chemistry & biodiversity. Lanzhou. 2010. Pp. 792-815. DOI:10.1002/cbdv.201000046; Yong-Qing, Jian-Hui, Qin jie , SUN Tao, LI Xiao-Li. Rhododendron Molle (Ericaceae): phytochemistry, pharmacology, andtoxicology // Chinese Journal of Natural Medicin. Chin. J. Nat. Med. 2018. - 16(6):P. 401-410. doi: 10.1016/S1875-5364(18)30073-6.]

Несмотря на то, что некоторые из GTX были получены химическим синтезом, основным методом их получения является извлечение из растительных объектов, поскольку в ходе химического синтеза образуется значительное число побочных продуктов, которые затрудняют очистку целевого соединения. Необходимо отметить, что так называемые «кавказские виды» - рододендроны кавказский, понтийский и желтый, произрастающие на территории РФ, а именно, листья рододендрона желтого как источники получения индивидуальных GTX в нашей стране ранее не рассматривались. Лишь, в 1971 г. Н.В. Беловой из отходов эфирномасличного производства - цветочной массы рододендрона желтого - был выделен GTX I (андромедотоксин, ацетиландромедол), автором сделал вывод о перспективности этого шрота эфирномасличного производства для промышленного получения GTX I в СССР [Белова Н.В. Андромедотоксин и его получение из Rhododendron L. // Растительные ресурсы. 1971. Т. 7. № 4. С. 574].

В работе [An Investigation of the Antiproliferative Effect of Rhododendron luteum Extract on Cervical Cancer (HeLa) Cells via Nrf2 Signaling Pathway / Ibrahim Turan, Selim Demir, Serap Ozer Yaman, Deniz Canbolat, Ahmet Mentese, Yuksel Aliyazicioglu // Nutrition and Cancer, 2021, https://doi.org/10.1080/01635581.2021.1955287] было проведено изучение антипролиферативного действия экстракта рододендрона желтого (R. luteum) на клетки рака шейки матки человека. С этой целью авторы получали экстракты образцов растений R. luteum, которые были собраны в сельской местности - район Восточного Причерноморья, Турции (Чайкара, Трабзон). Для получения экстракта листовые части растения отделяли, сушили при комнатной температуре в течение 20 дней. Высушенные образцы превращали в порошок с помощью лабораторного измельчителя. Далее 1 г сырья смешивали с 20 мл диметилсульфоксида (ДМСО), смесь инкубировали при непрерывном встряхивании при 150 об/мин при 45°С, в течение 24 часов, полученный супернатант отфильтровывали через бумажный фильтр, полученный суммарный экстракт использовали для фармакологических исследований.

GTX III был идентифицирован методом ТСХ в экстракте рододендрона понтийского (Rhododendron ponticum L.), полученного следующим образом: 50 г сухих листьев мелко измельчали, экстрагировали 250 мл метанола при частом перемешивании в течение 8 дней при комнатной температуре, далее под вакуумом при 40°С концентрировали извлечение до 200 мл. [Von Kürten, S., auf dem Keller, S., Pachaly, P., Zymalkowski, F., Tauberger, G., & Moussawi, M. (1971). Über Inhaltsstoffe verschiedener Rhododendron-Arten und ihre Kreislaufwirkung. Archiv Der Pharmazie, 304(10), 753-762. doi:10.1002/ardp.19713041007]

GTX III был получен из цветков Rhododendron molle G. Don, собранных в провинции Сычуань, Китай. Сырье измельчали в порошок, точную навеску этого порошка (0,3 г) трижды экстрагировали 40 мл 95% (об./об.) этанола методом ультразвуковой экстракции в течение 30 минут каждый раз. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, супернатант выпаривали при 40°С при пониженном давлении до полного удаления этанола. Далее проводили разделение компонентов методом тандемной твердофазной экстракции на картриджах, заполненных полиамидом (РА) и C18E. Перед твердофазной экстракцией оба картриджа предварительно обрабатывали 2 мл метанола и 2 мл воды последовательно. После очистки вышеуказанный экстракт (19,7 мг) растворяли в 1 мл этанола и загружали в тот же картридж PA, который затем элюировали 4 мл воды, и последующий фильтрат загружали в картридж С18, который затем элюировали 4 мл метанола. Элюат с картриджа С18 выпаривали досуха в слабом потоке газообразного азота. Остаток ресуспендировали в 500 мкл метанола. После центрифугирования при 25000 об/мин в течение 20 мин в аликвоте (10 мкл)проводили разделение соединений препаративной ВЭЖХ с масс-детектором [Zou, H.-Y., Luo, J., Xu, D.-R., Kong, L.-Y. (2014). Tandem Solid-Phase Extraction Followed by HPLC-ESI/QTOF/MS/MS for Rapid Screening and Structural Identification of Trace Diterpenoids in Flowers of Rhododendron molle. Phytochemical Analysis, 25(3), 255-265. doi:10.1002/pca.2501]

В статьях [CAI Yong-Qing, HU Jian-Hui, QIN Jie, SUN Tao, LI Xiao-Li. Rhododendron Molle (Ericaceae): phytochemistry, pharmacology, and toxicology // Chinese Journal of Natural Medicines. 2018. 16(6). Chongqing. Pp. 401-410. Yuxun Zhu, Huimin Yan, Xiaojing Wang, Zhaoxin Zhang, Huanping Zhang, Lisha Chai, Li Li, Jing Qu, Yong Li. Micranthanosides I and II, two novel 1,10- secograyanane diterpenoids and their antinociceptive analogues from the leaves and twigs of Rhododendron micranthum //2019 DOI: 10.1039/c9ra01736d] упоминается, что GTX III выделен из цветков рододендрона Молле (Rhododendron molle G. Don), и рододендрона мелкоцветкового (Rhododendron micranthum Turcz.).

За прототип были приняты работы [High field 'H- and I3C-NMR assignments of grayanotoxins I, IV, and XIV isolated from Kalmia Angustifolia / Jocelyn W. Burke, Raymond W. Doskotch // Journal of Natural Products. - 1989. Vol. 53. №1. - Р. 131 - 137; El-Naggar S. F., Doskotch R. W., Odell T. M., Girard L. Antifeedant diterpenes for the gypsy moth larvae from Kalmia latifolia: Isolation and characterization of ten grayanoids // Journal of Natural Products. 1980. 43 (5). Pp. 617 - 630.doi:10.1021/np50011a016.].

В частности, в исследовании [High field 'H- and I3C-NMR assignments of grayanotoxins I, IV, and XIV isolated from Kalmia Angustifolia / Jocelyn W. Burke, Raymond W. Doskotch // Journal of Natural Products. - 1989. Vol. 53. №1. - Р. 131 - 137] описано получение нескольких GTX, в частности, GTXI, IV, XIV (фиг. 1). Авторы в качестве источника получения GTX использовали надземные части Kalmia Angustifolia var. Carohiana, собранные на севере Каролины, США. Листья воздушно-сухих растений отделяли от стеблей и веток, измельчали вручную и просеивали через сито с размером пор 5 мм. Далее получали суммарную фракцию дитеперноидов: измельченные листья (5,4 кг) непрерывно экстрагировали перколяцией при комнатной температуре 95% спиртом этиловым, выпаривали экстракт при 40°С при пониженном давлении, получая остаток (2,4 кг), который растворяли в смеси хлороформ - вода. При этом водную фазу последовательно экстрагировали этилацетатом и н-бутанолом. Растворители использовали в равных объемах, а остаток поддерживали на уровне 10% или менее (мас./об.) от объединенного объема растворителя. Высушенную фракцию, полученную этилацетатом, порциями по 30-40 г хроматографировали на колонке, заполненной Sephadex LH-20 (250 г) с метанолом, это позволило отделить терпены от фенолов с образованием комбинированной терпеновой фракции - 48 г. Далее выделяли грайанотоксины I, IV и XIV. Для этого хроматографировали по 45 г терпеноидной фракции на колонке с 1,76 кг силикагеля (102 см х 6,6 см), элюирование проводили хлороформом и метанолом, меняя количество метанола в системе от 0 до 20%, получали девять объединенных фракций. Из четвертой фракции смесью метанола и хлороформа кристаллизовали грайанотоксина I. Вторую объединенную фракцию повторно хроматографировали на 23 г силикагеля(33 см х 1,4 см) и элюировали смесью хлороформа с 0,5% метанола и хлороформа с 1% метанола. Менее полярная фракция содержала грайанотоксин IV, а более полярная фракция - грайанотоксин XIV, далее вещества перекристаллизовывали.

Данная работа представляет для нас интерес, т.к. грайанотоксин III (GTX III) - это не этерифицированный остатком уксусной кислоты грайанотоксин I (GTXI) (фиг. 2).

Авторы статьи [El-Naggar S. F., Doskotch R. W., Odell T. M., Girard L. Antifeedant diterpenes for the gypsy moth larvae from Kalmia latifolia: Isolation and characterization of ten grayanoids // Journal of Natural Products. 1980. 43 (5). Pp. 617 - 630.doi:10.1021/np50011a016.], применив систематическое фракционирование этанольного экстракта листьев К. latifolia, полученного перколяцией при комнатной температуре 95% спиртом этиловым, на колонке с SephadexLH-20 или с кремниевой кислоты, активированной при 120°С в течение 24 часов, со следующими растворителями: хлороформ, гексан, этилацетат, н-бутанол, метанол, смесь хлороформ-метанол-вода, получили 13 фракций, из который выделили грайанотоксины XVIII, III , II и еще 6 кальмитоксинов. Грайанотоксин XVIII выделен из фракции В; грайанотоксин III, грайанотоксин II изфракции F-1. В частности, грайанотоксин III, грайанотоксин II были получены из этилацетатной фракции спиртового экстракта листьев К. latifolia, на колонке, заполненной кремниевой кислотой, активированной при 120°С в течение 24 часов, системой растворителей метанол-хлороформ, для которой меняли в пять приемов их соотношения в сторону увеличения содержания хлороформа, т.е. уменьшения полярности элюента. Идентификацию соединений во фракциях проводили методом ТСХ.

Заявляемое изобретение ставит своей целью получить грайанотоксин III из листьев рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet,), произрастающего на территории Российской Федерации.

Существенными отличительными признаками изобретения являются следующие особенности:

А - получение экстракта из листьев рододендрона желтого:

1) сырье - листья рододендрона желтого (Rhododendron luteumSweet,), произрастающего на подножии Джинальского хребта в окрестностях г. Кисловодска (Российская Федерация, Ставропольский край);

2) сырье сушат воздушно-теневым способом до остаточной влажности около 10%;

3) измельчение сырья проводят до размера 1 мм;

4) навеска сырья составляет около 5,0 г;

5) объем экстрагента - 50 мл на каждой ступени;

6) гидромодуль - 1:10;

7) число ступеней экстракции - 2;

8) время экстракции на каждой ступени - 2 часа с обратным холодильником;

9) температура экстракции - 80°С;

Б. - выделение грайанотоксина III из полученного экстракта:

1) объем вносимого в колонку экстракта - 0,4 мл;

2) колонку заполняют с силикагелем 60;

3) масса силикагеля в колонке - 10 г;

4) подвижная фаза для элюирования - хлороформ - метанол (9:1) объемные доли;

5) объем каждой фракции - 10 мл;

6) перекристаллизация GTX III из фракций 3 и 4 в морозильнике при температуре 10°С;

7) время перекристаллизация - 24 часа;

8) полученный GTX III запаивают в стеклянные ампулы.

Чистоту получаемых при элюлировании фракции контролируют методом ВЭЖХ. Критерием выделения индивидуального GTX служит профиль ВЭЖХ-хроматограммы - один основной пик со временем удерживания в интервале времен от 36 минут до 120 минут .На фиг. 3 представлена хроматограмма спиртового раствора перекристаллизованного вещества фракций 3 и 4 (предположительно GTX III), выход целевого продукта - около 48 минут (фиг. 3).

Для идентификации выделенного соединения проводят его анализ методом ИК-спектрометрии. ИК спектр имеет следующие полосы: 3676, 2955, 2917, 1463, 1425, 1124, 1034, 865 (ν, см-¹) Поскольку экспериментальные данные коррелируют с материалами, опубликованными в статье [El-Naggar S. F., Doskotch R. W., Odell T. M., Girard L. Antifeedant diterpenes for thegyp symothlarvae from Kalmia latifolia: Isolation and characterization of tengrayanoids // Journal of Natural Products. 1980. 43 (5). Pp. 617 - 630.doi:10.1021/np50011a016.] - основные полосы ИК-спектра GTX III: 3280; 1453;1373; 1030; 870;710 ± 10см^-1 и [L. Kong, H. Yu, M. Deng, F. Wu, Z. Jiang, T. Luo. Enantioselective Total Syntheses of Grayanane Diterpenoids: (-)-Grayanotoxin III, (+)-PrincipinolE, (-)-Rhodomollein XX // J Am Chem Soc. 144(12). Pp. 5268-5273] - основные полосы ИК-спектра GTX III: 3339; 2920 1466;1410; 1121; 1044; 933;876 ± 10см^-1(фиг. 4) вещество было идентифицировано как GTX III.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом:

А - получение экстракта из листьев рододендрона желтого: листья рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet,), произрастающего на подножии Джинальского хребта в окрестностях г. Кисловодска (Российская Федерация, Ставропольский край), сушат воздушно-теневым способом до остаточной влажности около 10%. Сырье измельчают до размера частиц 1 мм. Для получения экстракта используют точную навеску сырья около 5,0 г, экстрагент - спирт этиловый 95%, объем экстрагента - 50 мл на каждой ступени, т.е. гидромодуль на каждой ступени экстракции составил 1:10. Навеску помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 50 мл экстрагента. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане до 80°С в течение 2 часов, периодически встряхивая. Горячее извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Экстрагирование повторяют еще раз в описанных выше условиях. Полученные извлечения объединяют.

Стадия Б. - выделение грайанотоксина III из полученного экстракта. В колонку, заполненную 10 г силикагеля 60, вводят по 0,4 мл экстракта, последовательно элюируют подвижной фазой - хлороформ - метанол (9:1, объемные доли), объем каждой фракции - 10 мл, количество фракций - 9. Для каждой фракции регистрируют спектры поглощения в интервале длин волн от 190 до 700 нм. Фракции 3 и 4, содержащие GTXIII, помещают в морозильник при температуре 10°С на 24 часа. Сливают надосадочную жидкость, осадки фракций 3 и 4 объединяют, переносят в фарфоровую чашку, растворяют в спирте этиловом 95%, выпаривают для улетучивания паров хлороформ-метанол. Кристаллы GTX III переносят в ампулы и запаивают.

Предлагаемый способ выделения субстанции грайанотоксина III позволяет выделять это вещество из листьев рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet, Azaleaflava Hoffmanns., Azaleapontica L., Rhododendron flavum G.Don). Полученная субстанция может в дальнейшем быть использована как стандартный образец в аналитических, токсикологических и фармакологических исследованиях, а также для разработки новых оригинальных отечественных лекарственных средств.

Краткое описание чертежей

Выделение грайанотоксина III из листьев рододендрона желтого

Фиг. 1, на которой приведена структурная формула грайанотоксина I (GTXI) его синонимы - андромедотоксин, родотоксин, асеботоксин I.

Фиг. 2, на которой приведена структурная формула грайанотоксина III (GTX III).

Фиг. 3, на которой представлена ВЭЖХ хроматограмма спиртового раствора соединения, полученного из фракций 3 и 4, предположительно - грайанотоксин III (GTX III).

Фиг. 4, на которой представлен ИК-спектр полученного соединения, идентифицированного как грайанотоксин III (GTX III).

Изобретение относится к химико-фармацевтической отрасли, касается способа выделения грайанотоксина III (GTX III) из листьев рододендрона желтого. Выделение грайанотоксина III (GTX III) с помощью экстракции спиртом этиловым 95% из листьев рододендрона желтого, при котором на этапе А - получение экстракта из листьев рододендрона желтого используют сырье - листья рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet, Azaleaflava Hoffmanns., Azaleapontica L., Rhododendronflavum G. Don), произрастающего на подножии Джинальского хребта в окрестностях г. Кисловодска (Российская Федерация, Ставропольский край), сырье сушат воздушно-теневым способом до остаточной влажности около 10%, измельчают до размера 1 мм, для экстракции используют точную навеску сырья около 5,0 г, объем экстрагента - 50 мл на каждой ступени, гидромодуль - 1:10, число ступеней экстракции - 2, время экстракции на каждой ступени - 2 часа с обратным холодильником, температура экстракции - 80°С, полученные извлечения объединяют, далее реализуют этап Б - выделение грайанотоксина III, помещая 0,4 мл полученного экстракта в колонку, заполненную 10 г силикагеля 60, элюируют фракции подвижной фазой, состоящей из объемных долей - хлороформ - метанол 9:1, объем каждой фракции - 10 мл, из фракций 3 и 4 перекристаллизовывают GTX III при температуре 10°С в течение 24 часов, затем помещают GTX III в стеклянные ампулы и запаивают. Вышеописанный способ позволяет выделить грайанотоксина III (GTX III) из листьев рододендрона желтого, который в дальнейшем может быть использован как стандартный образец в аналитических, токсикологических и фармакологических исследованиях, а также для разработки новых оригинальных отечественных лекарственных средств. 4 ил.

Выделение грайанотоксина III (GTX III) с помощью экстракции спиртом этиловым 95% из листьев рододендрона желтого, при котором на этапе А - получение экстракта из листьев рододендрона желтого используют сырье - листья рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet, Azaleaflava Hoffmanns., Azaleapontica L., Rhododendron flavum G. Don), произрастающего на подножии Джинальского хребта в окрестностях г. Кисловодска (Российская Федерация, Ставропольский край), сырье сушат воздушно-теневым способом до остаточной влажности около 10%, измельчают до размера 1 мм, для экстракции используют точную навеску сырья около 5,0 г, объем экстрагента - 50 мл на каждой ступени, гидромодуль - 1:10, число ступеней экстракции - 2, время экстракции на каждой ступени - 2 часа с обратным холодильником, температура экстракции - 80°С, полученные извлечения объединяют, далее реализуют этап Б - выделение грайанотоксина III, помещая 0,4 мл полученного экстракта в колонку, заполненную 10 г силикагеля 60, элюируют фракции подвижной фазой, состоящей из объемных долей - хлороформ - метанол 9:1, объем каждой фракции - 10 мл, из фракций 3 и 4 перекристаллизовывают GTX III при температуре 10°С в течение 24 часов, затем помещают GTX III в стеклянные ампулы и запаивают.