Бромсодержащие пространственно-затрудненные фенолы, обладающие противоопухолевой активностью Российский патент 2024 года по МПК C07C39/06 A61K31/05 A61K31/167 A61K31/662 A61P35/00 

Группа изобретений относится к области органической химии и фармацевтике, в частности, к новым бромсодержащим пространственно-затрудненным фенолам, которые могут найти применение в качестве противоопухолевых средств в фармацевтике, медицине и ветеринарии.

Рак продолжает оставаться одной из наиболее серьезных проблем, стоящих перед современной наукой и медициной. Онкологические заболевания стабильно занимают второе место в списке причин смертности человека. По данным Всемирной организации здравоохранения, к 2030 году от данного заболевания в мире ежегодно будут умирать 15 миллионов человек [Wild CP, Weiderpass E, Stewart BW, editors (2020). World Cancer Report: Cancer Research for Cancer Prevention. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer]. Задача разработки противоопухолевых препаратов заключается в достижении избирательной гибели опухолевых клеток без токсического воздействия на нормальные ткани.

Пространственно-затрудненные фенолы (ПЗФ) представляют собой класс известных фенольных антиоксидантов, обладающих в то же время высокой противораковой активностью [Shatokhin, S.S.; Tuskaev, V.A.; Gagieva, S.Ch.; Markova, A.A.; Pozdnyakov, D.I.; Denisov, G.L.; Melnikova, E.K.; Bulychev, B.M.; Oganesyan, E.T. Synthesis, Cytotoxicity and Antioxidant Activity of New 1,3-Dimethyl-8-(Chromon-3-Yl)-Xanthine Derivatives Containing 2,6-Di-Tert-Butylphenol Fragments. New Journal of Chemistry 2022, 46, 621-631, doi:10.1039/D1NJ03726A; Burger, A.M.; Kaur, G.; Alley, M.C.; Supko, J.G.; Malspeis, L.; Grever, M.R.; Sausville, E.A. Tyrphostin AG17, [(3,5-Di-Tert-Butyl-4-Hydroxybenzylidene)-Malononitrile], Inhibits Cell Growth by Disrupting Mitochondria. Cancer Res 1995, 55; Kotieva, I.M.; Dodokhova, M.A.; Safronenko, A.V.; Alkhuseyn-Kulyaginova, M.S.; Milaeva, E.R.; Nikitin, E.A.; Shpakovsky, D.B.; Kotieva, E.М.; Kotieva, V.М.; Starostin, S.I. Antitumor Effectiveness of Combination Therapy with Platinum and Hybrid Organotin Compound on the Lewis Epidermoid Carcinoma Model with Metronomic Administration. Journal of Clinical Oncology 2022, 40, doi:10.1200/jco.2022.40.16_suppl.e15080; Jiang, X.; Hu, C.; Ferchen, K.; Nie, J.; Cui, X.; Chen, C.H.; Cheng, L.; Zuo, Z.; Seibel, W.; He, C.; et al. Targeted Inhibition of STAT/TET1 Axis as a Therapeutic Strategy for Acute Myeloid Leukemia. Nat Commun 2017, 8, doi:10.1038/s41467-017-02290-w], а также активностью против других заболеваний, связанных с окислительным стрессом [Gnanaguru, G.; Mackey, A.; Choi, E.Y.; Arta, A.; Rossato, F.A.; Gero, T.W.; Urquhart, A.J.; Scott, D.A.; D'Amore, P.A.; Ng, Y.S.E. Discovery of Sterically-Hindered Phenol Compounds with Potent Cytoprotective Activities against Ox-LDL-Induced Retinal Pigment Epithelial Cell Death as a Potential Pharmacotherapy. Free Radic Biol Med 2022, 178, 360-368, doi:https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2021.11.026]. Такие соединения имеют двойственный характер: в нормальных условиях они эффективно защищают клеточные мембраны от повреждающего действия активных форм кислорода (АФК) и способны снижать токсический эффект лекарственной терапии. Ситуация меняется в состоянии окислительного стресса, наблюдаемого в опухолевых клетках, когда образуются многочисленные АФК и различные металлы, главным образом железо и медь, которые накапливаются в несвязанном состоянии [Gonzalez, F.J. Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1. Mutat. Res. 2005, 569, 101-110; Halliwell, B. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem. J. 2007, 401, 1-11; Policastro, L.L.; Ibañez, I.L.; Notcovich, C.; Duran, H.A.; Podhajcer, O.L. The Tumor Microenvironment: Characterization, Redox Considerations, and Novel Approaches for Reactive Oxygen Species-Targeted Gene Therapy. Antioxid. Redox Signal. 2013, 19, 854-895; Sotgia, F.; Martinez-Outschoorn, U.E.; Lisanti, M.P. Mitochondrial oxidative stress drives tumor progression and metastasis: should we use antioxidants as a key component of cancer treatment and prevention? BMC Med. 2011, 9, 62; Popovici, V.; Musuc, A.M.; Matei, E.; Karampelas, O.; Ozon, E.A.; Cozaru, G.C.; Schröder, V.; Bucur, L.; Aricov, L.; Anastasescu, M.; и др. ROS-Induced DNA-Damage and Autophagy in Oral Squamous Cell Carcinoma by Usnea barbata Oil Extract-An In Vitro Study. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23]. В этих условиях фенолы трансформируются в высокореактивные метиленхиноны, которые оказывают разрушительное действие на липиды, белки и ДНК, тем самым приводя к гибели опухолевых клеток [Kupfer, R.; Dwyer-Nield, L.D.; Malkinson, A.M.; Thompson, J.A. Lung Toxicity and Tumor Promotion by Hydroxylated Derivatives of 2,6-Di-Tert-Butyl-4-Methylphenol (BHT) and 2-Tert-Butyl-4-Methyl-6-Iso-Propylphenol: Correlation with Quinone Methide Reactivity. Chem Res Toxicol 2002, 15, 1106-1112;Catalano, A.; Iacopetta, D.; Sinicropi, M.S.; Franchini, C. Diarylureas as Antitumor Agents. Applied Sciences (Switzerland) 2021, 11, 1-17; Lalitha Naishima, N.; Faizan, S.; Raju, R.M.; Satya, A.; Sruthi, V.L.; Ng, V.; Kumar Sharma, G.; Vasanth, K.S.; Kumar Shivaraju, V.; Ramu, R.; et al. Design, Synthesis, Analysis, Evaluation of Cytotoxicity Against MCF-7 Breast Cancer Cells, 3D QSAR Studies and EGFR, HER2 Inhibition Studies on Novel Biginelli 1,4-Dihydropyrimidines. J Mol Struct 2023, 1277, 84-92]. Двойственность ПЗФ кажется идеальной для разработки новых биологически активных соединений, но, чтобы использовать высокую реакционную способность метиленхинонов и избежать нежелательного воздействия на здоровые клетки, необходимо добиться пространственно-временного контроля их локализации и активации.

Показано, что такая фенол-опосредованная редокс-переориентация перспективна для разработки таргетных противоопухолевых средств, инициирующих митохондриальный путь апоптоза раковых клеток. Спектр биологической противоопухолевой активности ПЗФ включает: ингибирование метастазирования меланомы и рака легкого Lewis [Milaeva, E.R.; Shpakovsky, D.B.; Gracheva, Y.A.; Antonenko, T.A.; Osolodkin, D.I.; Palyulin, V.A.; Shevtsov, P.N.; Neganova, M.E.; Vinogradova, D.V.; Shevtsova, E.F. Some insight into the mode of cytotoxic action of organotin compounds with protective 2,6-di-tert-butylphenol fragments. J. Organomet. Chem. 2015, 782, 96-102, doi:10.1016/j.jorganchem.2014.12.013; RU2762730, опубл. 22.12.2021; RU 2765955, опубл. 07.02.2022], лейкемии, рака толстой кишки, печени, яичников, молочной железы [Edwards, C.M.; Mueller, G.; Roelofs, A.J.; et al. Apomine™, an inhibitor of HMG-CoA-reductase, promotes apoptosis of myeloma cells in vitro and is associated with a modulation of myeloma in vivo. Int. J. Cancer. 2007, 120, 1657], саркомы 37, карциномы [Миль, Е.М.; Ерохин, В.Н.; Бинюков, В.И.; Албантова, А.А.; Володькин, А.А.; Голощапов, А.Н. Апоптотическое действие антиоксиданта анфена натрия в сочетании с H₂O₂ на опухолевые клетки карциномы Льюис. Известия Академии наук. Серия химическая 2019, №12, 2359].

Из уровня техники известны соединения, расширяющие арсенал противоопухолевых средств - новые фосфорсодержащие пространственно-затрудненные фенолы с фрагментами бензофуроксана [RU 2796810, опубл. 29.05.2023]. Предложенные соединения не обладают гемолитической активностью, менее токсичны в отношении линии нормальных клеток эмбриона легкого человека WI38, проявляют селективность против линий раковых клеток различного генеза и превосходят по селективности препараты сравнения Доксорубицин и Сорафениб.

Таким образом, предшествующий уровень техники показывает, что соединения, содержащие в своей структуре бромсодержащие пространственно-затрудненные фенолы, являются перспективными в качестве противоопухолевых средств, инициирующих митохондриальный путь апоптоза раковых клеток.

Соединения, содержащие в своей структуре атомы брома и фрагмент фосфорсодержащего пространственно-затрудненного фенола, обладающие противоопухолевой активностью, не известны заявителю из уровня техники.

Техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, состоит в расширении ассортимента противоопухолевых средств, инициирующих и реализующих апоптоз по митохондриальному пути.

Техническим результатом являются новые противоопухолевые соединения, расширяющие арсенал средств указанного назначения, способные эффективно приводить к апоптозу по внутреннему митохондриальному пути, тем самым подавляя рост раковых клеток.

Указанная техническая проблема решается, и технический результат достигается новыми соединениями - заявляемыми бромсодержащими пространственно-затрудненными фенолами общей формулы I

,

где R=Me (a), Et (b), Ph (c).

Техническая проблема также решается, и технический результат достигается применением заявляемых бромсодержащих пространственно-затрудненных фенолов общей формулы I в качестве соединений, обладающих противоопухолевой активностью.

Заявляемые соединения общей формулы I получают по методике, аналогичной описанной в диссертации [Синтез и свойства функциональнозамещенных фосфорилированных пространственно-затрудненных фенолов / Нгуен Тхи Тху. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Казань, 2021 г.], взаимодействием пространственно-затрудненного фенола (IIa-с) с восьмикратным избытком бромацетамида бромуксусной кислоты (III) и K₂CO₃ в хлористом метилене при комнатной температуре при постоянном перемешивании по схеме:

.

Далее продукт выделяют способом, описанным в работе [Синтез и свойства функциональнозамещенных фосфорилированных пространственно-затрудненных фенолов / Нгуен Тхи Тху. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Казань, 2021 г.]. Получают продукт в виде порошка белого цвета с выходом 68-73%. Контроль прохождения реакции проверяют методом тонкослойной хроматографии, элюент толуол-этилацетат, 2:1.

Характеристики новых соединений формулы I приведены в соответствующих примерах, иллюстрирующих группу изобретений.

Исходные производные пространственно-затрудненного фенола (IIa-с) получают по методике [E. Gibadullina, T.T. Nguyen, A. Strelnik, A. Sapunova, A. Voloshina, I. Sudakov, A. Vyshtakalyuk, J. Voronina, M. Pudovik, A. Burilov, New 2,6-diaminopyridines containing a sterically hindered benzylphosphonate moiety in the aromatic core as potential antioxidant and anti-cancer drugs, Eur. J. Med. Chem. 184 (2019) 1117352].

При получении и выделении заявляемых соединений используют коммерчески доступные растворители: хлористый метилен (База №1 ООО «Химреактив», Москва, Россия, чистота >99,5%), K₂CO₃ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, США, чистота >97%), бромацетамид бромуксусной кислоты (Acros Organics, Бельгия, чистота 98%), Р₂О₅ (АО «Вектон», Санкт-Петербург, Россия, чистота >97%), дистиллированная вода (полученная методом дистилляции на дистилляторе ДЭ-10, модель 789, соответствующая ФС 42-2619-97 «Вода очищенная» и ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная»).

Заявленные соединения исследованы на цитотоксичность в отношении нормальных клеток линии печени человека (Chang liver) и в отношении раковых клеточных линий (Таблица).

Предлагаемые соединения проявляют активность в отношении раковых линий:

М-HeLa клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния HeLa, клон M-HeLa);

T 98G - глиобластома человека;

PANC-1 - карцинома поджелудочной железы человека;

HuTu 80 - аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека;

MCF7 - аденокарцинома молочной железы человека (плевральная жидкость);

A549 - карцинома легкого человека;

PC3 - клеточная линия аденокарцинома предстательной железы;

Du-145 - клеточная линия рака простаты человека;

Hep G2 - клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека.

Цитотоксическое действие заявляемых соединений в отношении раковых и нормальных клеточных линий оценивают в сравнении с действием известных, применяемых в настоящее время, противоопухолевых препаратов Доксорубицин и Сорафениб по значению IC₅₀ - концентрации полумаксимального ингибирования исследуемого соединения, которая вызывает гибель 50% клеток в тестируемой популяции [Smolobochkin A.V., Gazizov A.S., Yakhshilikova L.J., Bekrenev D.D., Burilov A.R., Pudovik M.A., Lyubina A.P., Amerhanova S. K. and Voloshina A.D. Synthesis and Biological Evaluation of Taurine-Derived Diarylmethane and Dibenzoxanthene Derivatives as Possible Cytotoxic and Antimicrobial Agents. // Chem. Biodiversity. 2022. Vol. 19. e202100970. 10.1002/-cbdv.202100970]. Расчет IC₅₀, концентрации тестируемого соединения, вызывающей подавление роста клеток на 50%, производился с помощью программы: MLA «Quest Graph™ IC50 Calculator». AAT Bioquest, Inc, 23 December, 2022, https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator, дата обращения 20.03.2023. Данные по цитотоксической активности (IC₅₀) и селективности (SI) заявляемых средств и препаратов сравнения представлены в таблице.

Цитотоксическая активность заявляемых соединений продемонстрирована на культурах опухолевых и условно нормальных клеток, полученных из Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт цитологии Российской академии наук»:

М-HeLa клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния HeLa, клон M-HeLa);

T 98G - глиобластома человека;

PANC-1 - карцинома поджелудочной железы человека;

HuTu 80 - аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека;

MCF7 - аденокарцинома молочной железы человека (плевральная жидкость);

A549 - карцинома легкого человека;

Hep G2 - клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека;

PC3 - клеточная линия аденокарцинома предстательной железы из ATCC (American Type Cell Collection, USA; CRL 1435);

Du-145 - клеточная линия рака простаты человека из клеточного репозитория CLS Cell Lines Service, Германия;

Chang liver - линия гепатоцит-подобных клеток печени человека из коллекции и НИИ вирусологии РАМН (Москва).

Значения таблицы свидетельствуют, что заявленные соединения проявляют цитотоксичность в отношении всех вышеуказанных опухолевых и условно нормальных клеток.

Так, значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) составили в отношении:

- аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80 для Ia - 4,5 μМ, Ib - 5,8 μМ, Ic - 4,3 μМ; для препаратов сравнения Доксорубицина (DOX) и Сорафениба (SF) - 0,2 и 6,2 μМ соответственно,

- клеточной линии аденокарциномы предстательной железы человека PC3 для Ia - 2,3 μМ, Ib - 2.6 μМ, Ic - 3,6 μМ, для DOX и SF - 1,4 и 11,3 μМ соответственно,

- клеточной линии рака поджелудочной железы человека PANC-1 для Ia - 1,8 μМ, для Ib - 1,8 μМ, для Ic - 2,1 μМ, для DOX и SF - 2,2 μМ и 12,0 μМ соответственно,

- культуры клеток линии аденокарциномы молочной железы MCF-7 для Ia - 1,4 μМ, для Ib - 1,2 μМ, для Ic - 2,0 μМ, для DOX и SF - 0,4 μМ и 27,5 μМ соответственно,

- карциномы шейки матки М-HeLa для Ia - 0,9 μМ, для Ib - 1,9 μМ, для Ic - 2,3 μМ, для DOX и SF - 2,1 μМ и 25,0 μМ соответственно,

- клеточной линии глиобластомы T98G для Ia - 3,1 μМ, для Ib - 4,5 μМ, для Ic - 3,8 μМ, для DOX и SF - 2,0 μМ и 8,6 μМ соответственно,

- аденокарциномы клеточной линии альвеолярного базального эпителия человека A549 для Ia - 5,6 μМ, для Ib - 5,1 μМ, для Ic - 7,8 μМ, для DOX и SF - 0,7 μМ и 25,2 μМ соответственно,

- клеточной линии рака простаты человека Du-145 для Ia - 3,4 μМ, для Ib - 2,4 μМ, для Ic - 2,7 μМ, для DOX и SF - 0,3 μМ, и 14,9 μМ соответственно,

- клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 для Ia - 2,7 μМ, для Ib - 3,7 μМ, для Ic - 5,1 μМ, для DOX и SF - 0,2 μМ, и 14,7 μМ соответственно.

Данные таблицы свидетельствуют, что все заявляемые соединения обладают цитотоксичностью, значительно превосходящей препарат сравнения Сорафениб.

Среди заявляемых соединений выявлено соединение Ia - соединение-лидер, продемонстрировавшее в отношении ряда линий клеток - рака поджелудочной железы человека (PANC-1) и карциномы шейки матки человека (M-HeLa) - активность на уровне и превосходящую препараты сравнения Доксорубицин и Сорафениб.

Селективность соединений в отношении раковых клеток является важным критерием оценки цитотоксического действия. Для ее оценки рассчитывают индекс селективности (SI) как отношение между значением IC₅₀ для нормальных клеток и значением IC₅₀ для раковых клеток. Соединения с SI≥3 можно считать селективными [M. Ayoup, Y. Wahby, H. Abdel-Hamid, E. Ramadan, M. Teleb, M. Abu-Serie, A. Noby, Design, synthesis and biological evaluation of novel a-acyloxy carboxamides via Passerini reaction as caspase 3/7 activators, Eur. J. Med. Chem. 168 (2019) 340-356. DOI: 10.1016/j.ejmech.2019.02.051].

Значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) нормальных клеток печени человека Chang liver составили для Ia - 5,2 μМ, для Ib - 4.5 μМ, для Ic - 2,8 μМ, для препаратов сравнения DOX и SF - 0,5 μМ, и 21,7 μМ соответственно.

Значения селективности (SI) для заявленных соединений составили в отношении:

- аденокарциномы двенадцатиперстной кишки (HuTu-80) для Ia - 1,2, для DOX и SF - 2,5, и 3,5 соответственно, для остальных - ниже единицы (<1),

- клеточной линии аденокарциномы предстательной железы человека (PC3) для Ia - 2,3, для Ib - 1,7, для SF - 1,9, для остальных - ниже единицы (<1),

- клеточной линии рака поджелудочной железы человека (PANC-1) для Ia - 2,9, для Ib - 2,5, для Ic - 1,3, для DOX - ниже единицы (<1), для SF - 1,8,

- аденокарциномы молочной железы (MCF-7) для Ia - 3,7, для Ib - 3,8, для Ic - 1,4, для DOX - 1,3, для SF - ниже единицы (<1),

- карциномы шейки матки (М-HeLa) для Ia - 5,8, для Ib - 2,4, для Ic - 1,2, для остальных - ниже единицы (<1),

- культуры клеток линии глиобластомы (T98G) для Ia - 1,7, для Ib - 1,0, для SF - 2,5, для остальных - ниже единицы (<1),

- аденокарциномы клеточной линии альвеолярного базального эпителия человека (A549) для всех - ниже единицы (<1),

- культуры клеток линии рака простаты человека (Du-145) для Ia - 1,5, для Ib - 1,9, для Ic - 1,0, для DOX - 1,7, для SF - 1,5,

- культуры клеток линии гепатоцеллюлярной карциномы человека (Hep G2) для Ia - 1,9, для Ib - 1,2, для Ic - ниже единицы (<1), для DOX - 2,5, для SF - 1,5.

Значения таблицы свидетельствуют, что заявляемые соединения проявляют селективность и в отношении некоторых опухолевых линий превосходят препараты сравнения Доксорубицин и Сорафениб. Соединение-лидер Ia показал наилучшую селективность по отношению к клеточным линиям PC3, PANC-1, MCF-7 и M-HeLa. Значения SI для этих линий составили (2-6). Препараты сравнения Доксорурицин и Сорафениб значительно уступают по селективности ведущему соединению в отношении клеточной линии M-HeLa.

Заявляемые соединения вызывают апоптоз опухолевых клеток, что подтверждено методом проточной цитометрии с использованием протокола окрашивания аннексином V-Alexa Fluor 647. На фигуре 1 на примере клеток линии M-HeLa показано распределение живых, мертвых, а также клеток в раннем и позднем апоптозе после 48-часовой инкубации с соединением Ic (в концентрациях 0,45 μМ (средняя гистограмма) и в концентрации 0,9 μМ (правая гистограмма) в сравнении с контролем - опухолевые клетки без обработки (левая гистограмма). Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=3), L - живые клетки; D - мертвые клетки; Ea - клетки в раннем апоптозе; La - клетки в позднем апоптозе [Voloshina AD, Sapunova AS, Kulik NV, Belenok MG, Strobykina IYu, Lyubina A, et al. Antimicrobial and cytotoxic effects of ammonium derivatives of diterpenoids steviol and isosteviol // Bioorg. Med. Chem. 2021. 32. 115974. DOI: 10.1016/j.bmc.2020.115974].

На фигуре 1 проиллюстрировано, что после контакта соединения Ia с клетками линии M-HeLa, увеличивается доля мертвых клеток (L - 93,47%, D - 4,34% в контроле, L - 71,73%, D - 16,77% для концентрации 0,45 μМ и L - 48,97%, D - 21,23% для концентрации 0,9 μМ), а также апоптотических клеток (Ea - 1,26%, La - 0,93 0,94% в контроле, Ea - 5,21%, La - 6,30% для концентрации 0,45 μМ, Ea - 9,46%, La - 20,34% для концентрации 0,9 μМ).

Механизм апоптоза заявляемых соединений протекает по внутреннему митохондриальному пути, что подтверждается данными проточной цитометрии с использованием флуоресцентного красителя JC-10 (в наборе Mitochondria Membrane Potential Kit) (SIGMA). Цитометрию осуществляют на цитометре (Guava easy Cyte, MERCK, USA). В нормальных клетках JC-10 накапливается в митохондриальном матриксе, где образует агрегаты с красной флуоресценцией, в апоптотических клетках JC-10 диффундирует из митохондрий, превращается в мономерную форму и испускает зеленую флуоресценцию, которую регистрирует прибор.

На фигуре 2 на примере клеток линии M-HeLa показан митохондриальный мембранный потенциал опухолевых клеток после 48-часовой инкубации с соединением Ia (в концентрациях 0,45 μМ (средняя гистограмма) и в концентрации 0,9 μМ (правая гистограмма) в сравнении с контролем - опухолевые клетки без обработки (левая гистограмма). Как видно на фигуре 2, взаимодействие раковых клеток с соединением Ia приводит к снижению митохондриального мембранного потенциала клеток M-HeLa, количество красных агрегатов в контроле составляет 68,42% (левая гистограмма), для клеток M-HeLa, обработанных соединением Ia в концентрации 0,45 μМ - 60,77%, (средняя гистограмма) в концентрации 0,9 μМ - 29,43% (правая гистограмма). При этом количество зеленых мономеров составляет 39,23% (при 0,45 μМ) и 70,57% (при 0,9 μМ), по сравнению с контролем 31,58%.

Увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) является одним из основных проявлений митохондриальных дисфункций. Таким образом, оценка продукции АФК соединением Ia может дополнить данные по его воздействию на мембранный потенциал митохондрий и также характеризует индукцию апоптоза по митохондриальному пути. Поэтому было исследовано влияние соединения Ia в концентрациях IC50/2 и IC50 на продукцию АФК в клетках M-HeLa, для чего клетки M-HeLa обрабатывали соединением Ia соответствующей концентрации в течение 48 часов, с использованием анализа проточной цитометрии и набора для проточной цитометрии CellROX® Deep Red. Данные, представленные на фигуре 3, показывают увеличение интенсивности флуоресценции CellROX® Deep Red после обработки тестируемым соединением в концентрациях IC50/2 - 0,45 μМ и IC50 - 0,9 μМ по сравнению с контролем (неокрашенные клетки). Видно, что клетки M-HeLa начинают активно продуцировать АФК в присутствии соединения Ia.

Соединения, продуцирующие АФК и индуцирующие митохондриальный апоптоз в раковых клетках, могут вызывать нарушение прохождения фаз клеточного цикла и приводить к замедлению пролиферации популяции быстро размножающихся клеток [Mamedov V.A., Zhukova N.A., Voloshina A.D., Syakaev V.V., Beschastnova T.N., Lyubina A.P., Amerhanova S.K., Samigullina A.I., Gubaidullin A.T., Buzyurova D.N., Rizvanov I.Kh. and Sinyashin O.G. Synthesis of Morpholine-, Piperidine-, and N-Substituted Piperazine-Coupled 2-(Benzimidazol-2-yl)-3-arylquinoxalines as Novel Potent Antitumor Agents. // ACS Pharmacol. Transl. Sci. - https://doi.org/202210.1021/acsptsci.2c00118; A.S. Agarkov, A.A. Nefedova, E.R. Gabitova, D.O. Mingazhetdinova, A.S. Ovsyannikov, D.R. Islamov, S.K. Amerhanova, A.P. Lyubina, A.D. Voloshina, I.A. Litvinov, S.E. Solovieva and I.S. Antipin (2-Hydroxy-3-Methoxybenzylidene)thiazolo[3,2-a]pyrimidines: Synthesis, Self-Assembly in the Crystalline Phase and Cytotoxic Activity // Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 2084. https://doi.org/10.3390/ijms24032084]. Поэтому было исследовано влияние соединения Ia на прохождение клетками M-HeLa клеточного цикла стандартным флуоресцентным методом, позволяющим определить на какой фазе клеточный цикл был остановлен. Исследования проводили при помощи флуоресцентного красителя пропидия иодида, который связывается пропорционально количеству ДНК, присутствующей в клетке. Диаграмма на фигуре 4 показывает количество клеток на каждой фазе клеточного цикла, а именно количественное распределения клеток в (%) в фазах G0/G1, S и G2/M клеточного цикла M-HeLa; данные представлены как среднее ± SD трех независимых экспериментов. Результаты анализа клеточного цикла с использованием соединения-лидера Ia против клеточной линии M-HeLa методом проточной цитометрии показали достоверную остановку фазы G2/М, достигающую пика через 48 часов. Установлено, что Ia вызывает дозозависимое увеличение количества клеток (%) в фазе G2/М, составляющее в концентрации IC₅₀/2 (0.45 мкМ) - 13.4%; в концентрации IC₅₀ (0.9 мкМ) - 25% по сравнению с контролем (8.7%). Анализ клеточного цикла линии M-HeLa после обработки Ia в концентрациях IC₅₀/2 и IC₅₀ в течение 48 часов выявил полную достоверную задержку клеток в фазе G2/М, по сравнению с контролем (необработанные клетки), что приводит к ингибированию пролиферации клеток M-HeLa и индукции апоптоза.

Изобретение иллюстрируется примерами получения заявляемых соединений Ia-с.

Пример 1. Синтез диметил[(2,4-бис(2-бромоацетамидо)фенил)(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метил]фосфоната (Ia).

К раствору 1 ммоль соответствующего диалкил/дифенил[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)(2,4-фенил)метил]фосфоната в 5 мл CH₂Cl₂ добавляют медленно (8 ммоль) бромацетамида бромуксусной кислоты в 1 мл CH₂Cl₂ и 8 ммоль K₂CO₃. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 часов. Отфильтровывают выпавшую неорганическую соль. Удаляют растворитель из маточника. В полученный маслообразный продукт добавляют дистиллированную воду и перемешивают при комнатной температуре в течение 1-2 суток до образования осадка. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат в вакуумном эксикаторе над Р₂О₅ (4 ч, 20°C, 20 мм рт.ст.). Выход продукта Ia 70%. Порошок белого цвета, Т.пл. 146-167°C. ИК спектр (KBr, ν/см^-1): 565 (С-Br), 768 (P-C), 1035, 1055 (P-O-C_alk), 1212 (P=O), 1608 (C=C_arom), 1684 (C=O), 3268 (NH), 3632 (OH). Спектр ЯМР ¹H (600.13 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.41 [с, 18H, C(CH₃)₃], 3.59 (д, 3H, OCH₃, ³J_PH 10.7), 3.69 (д, 3H, OCH₃, ³J_PH 10.8), 3.86(c, 2H, CH₂Br), 3.96 (c, 2H, CH₂Br), 4.61 (д, 1H, CHP, ²J_PH 26.6), 4.78 (с, 1H, OH), 7.19 [с, 2H, CHCC(CH₃)₃], 7.34 (д, 1H, CH_arom, ³J_HH8.5), 7.67 (c, 1H, CH_arom), 7.72 (д, 1H, CH_arom, ³J_HH 8.5), 8.50 (c, 1H, NH), 9.70 (c, 1H, NH). Спектр ЯМР ¹³C (100.57 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 29.7 (CH₂Br), 29.8 (CH₂Br), 30.8 [C(CH₃)₃], 34.9 [C(CH₃)₃], 42.2 (д, CHP, ¹J_PC 140.4), 54.3 (д, OCH₃, ²J_PC9.1), 54.4 (д, OCH₃, ²J_PC9.1), 117.8 (CH_arom), 118.4 (CH_arom), 125.3 (CCHP), 126.2 (C_arom), 126.6 [д, CHCC(CH₃)₃, ³J_PC 6.8], 132.1 (д, CH_arom, ³J_PC 2.0), 136.2 (д, C_arom, ³J_PC8.1), 136.8 [CC(CH₃)₃], 137.7 (C_arom), 153.7 (COH), 164.8 (C=O), 165.6 (C=O). Спектр ЯМР ³¹P (242.94 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 29.2. Найдено (%): C, 47.95; H, 5.50; Br, 23.64; N, 4.17; P, 4.60. C₂₇H₃₇Br₂N₂O₆P. Вычислено (%): C, 47.95; H, 5.51; Br, 23.63; N, 4.14; P, 4.58. Масс-спектр (ESI), m/z: 677.2 [M+H]⁺, 699.5 [M+Na]⁺.

Пример 2. Синтез диэтил[(2,4-бис(2-бромоацетамидо)фенил)(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метил]фосфоната (Ib).

Аналогично примеру 1 из 1 ммоль диэтил-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)(2,6-диаминопиридин-3-ил)метил)фосфоната, 8 ммоль бромацетамида бромуксусной кислоты и 8 ммоль K₂CO₃ получают соединение Ib, порошок белого цвета с выходом 73%. Т.пл. 110-111°C. ИК спектр (KBr, ν/см^-1): 562 (С-Br), 771 (P-C), 1025, 1049 (P-O-C_alk), 1210 (P=O), 1607 (C=C_arom), 1680 (C=O), 3409 (NH), 3627 (OH). Спектр ЯМР ¹H (600.13 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 1.02 (т, 3H, OCH₂CH₃, ³J_HH7.0), 1.03 (т, 3H, OCH₂CH₃, ³J_HH 7.0), 1.32 [с, 18H, C(CH₃)₃], 3.73 (м, 1H, OCH₂CH₃), 3.80 (м, 1H, OCH₂CH₃), 3.85 (м, 2H, OCH₂CH₃), 4.02(c, 2H, CH₂Br), 4.05 (кв, 2H, CH₂Br, ²J_PH 26.1), 4.76 (д, 1H, CHP, ²J_PH 26.3), 6.82 (с, 1H, OH), 7.19 [с, 2H, CHCC(CH₃)₃], 7.46 (дд, 1H, CH_arom, ³J_HH 9.0, 1.9), 7.68 (c, 1H, CH_arom), 7.73 (д, 1H, CH_arom, ³J_HH 8.0), 9.84 (c, 1H, NH), 10.42 (c, 1H, NH). Спектр ЯМР ¹³C (100.57 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 16.7 (д, OCH₂CH₃, ³J_PC 5.1), 16.8 (д, OCH₂CH₃, ³J_PC6.1), 29.7 (CH₂Br), 29.88 (CH₂Br), 30.8 [C(CH₃)₃], 34.9 [C(CH₃)₃], 46.8 (д, CHP, ¹J_PC138.4), 63.9 (д, OCH₂CH₃, ²J_PC6.1), 64.0 (д, OCH₂CH₃, ²J_PC 7.1), 117.8 (CH_arom), 118.4 (CH_arom), 125.5 (д, C_arom, ³J_PC 4.0), 126.5 (д, CCHP, ²J_PC6.1), 126.7 [CHCC(CH₃)₃], 126.8 [CHCC(CH₃)₃], 131.9 (д, CH_arom, ³J_PC8.1), 136.0 (д, C_arom, ³J_PC7.2), 136.7 [CC(CH₃)₃], 137.6 (C_arom), 153.7 (COH), 164.9 (C=O), 165.9 (C=O). Спектр ЯМР ³¹P (242.94 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 26.3. Найдено (%): C, 55.75; H, 6.64; Br, 12.78; N, 4.50; P, 4.97. C₂₉H₄₁Br₂N₂O₆P. Вычислено (%): C, 55.77; H, 6.62; Br, 12.79; N, 4.49; P, 4.96. Масс-спектр (ESI), m/z: 705.2 [M+H]⁺.

Пример 3. Синтез дифенил[(2,4-бис(2бромоацетамидо)фенил)(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метил]фосфоната (Ic).

Аналогично примеру 1, из 1 ммоль дифенил-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)(2,6-диаминопиридин-3-ил)метил)-фосфоната, 8 ммоль бромацетамида бромуксусной кислоты и 8 ммоль K₂CO₃ получают соединение Ic, порошок белого цвета с выходом 68%. Т.пл. 93-94°C. ИК спектр (KBr, ν/см^-1): 584 (С-Br), 764 (P-C), 938 (P-O-C_arom), 1239 (P=O), 1598 (C=C_arom), 1679 (C=O), 3269 (NH), 3628 (OH). Спектр ЯМР ¹H (600.13 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 1.29 [с, 18H, C(CH₃)₃], 4.01 (c, 2H, CH₂Br), 4.10 (кв, 2H, CH₂Br, ²J_PH 26.1), 5.25 (д, 1H, CHP, ²J_PH 27.3), 6.59 (д, 2H, OC₆H₅, ³J_HH 8.1), 6.96 (д, 2H, OC₆H₅, ³J_HH6.9), 7.08 (т, 1H, OC₆H₅, ³J_HH 7.4), 7.15 (т, 1H, OC₆H₅, ³J_HH 7.4), 7.18 (т, 1H, OC₆H₅, ³J_HH 7.5), 7.30 [м, 4H, OC₆H₅ и CHCC(CH₃)₃], 7.50 (д, 1H, CH_arom, ³J_HH 10.0), 7.72 (c, 1H, CH_arom), 7.90 (д, 1H, CH_arom, ³J_HH 8.9), 9.97 (c, 1H, NH), 10.47 (c, 1H, NH). Спектр ЯМР ¹³C (101.57 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 29.8 (CH₂Br), 29.9 (CH₂Br), 30.8 [C(CH₃)₃], 34.9 [C(CH₃)₃], 46.4 (д, CHP, ¹J_PC 138.4), 117.9 (CH_arom), 118.7 (CH_arom), 120.9 (д, OC₆H₅, ³J_PC4.0), 121.1 (д, OC₆H₅, ³J_PC4.0), 124.5 (д, C_arom, ³J_PC 5.1), 125.8 (д, CCHP, ³J_PC 5.1), 125.9 (OC₆H₅), 126.0 (OC₆H₅), 127.3 [CHCC(CH₃)₃], 127.4 [CHCC(CH₃)₃], 130.2 (OC₆H₅), 131.7 (д, CH_arom, ³J_PC 5.1), 135.9 (д, C_arom, ³J_PC8.1), 137.1 [CC(CH₃)₃], 138.1 (C_arom), 150.5 (д, OC₆H₅, ²J_PC 9.1), 150.8 (д, OC₆H₅, ²J_PC 9.1), 154.1 (COH), 164.9 (C=O), 165.6 (C=O). Спектр ЯМР ³¹P (242.94 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 19.87. Найдено (%): C, 55.52; H, 5.14; Br, 19.98; N, 3.51; P, 3.89. C₃₇H₄₁Br₂N₂O₆P. Вычислено (%): C, 55.51; H, 5.16; Br, 19.96; N, 3.50; P, 3.87. Масс-спектр (ESI), m/z: 801.4 [M+H]⁺.

Таким образом, предложены соединения, расширяющие арсенал противоопухолевых средств - новые бромсодержащие пространственно-затрудненные фенолы. Соединения проявляют селективность и в отношении некоторых опухолевых линий превосходят препараты сравнения Доксорубицин и Сорафениб. Соединение-лидер - бромсодержащий пространственно-затрудненный фенол с метильным заместителем Ia по противоопухолевой активности по отношению к клеточной линии M-HeLa превосходит препарат сравнения Доксорубицин в 2,3 раза и Сорафениб в 27,8 раз, при этом является более селективным в отношении раковой клеточной линии M-HeLa (IS= 5,8), по сравнению с нормальной клеточной линией Chang liver. Механизм действия протестированных соединений может быть связан с индукцией апоптоза, протекающего по внутреннему митохондриальному пути. Все вышесказанное делает их перспективными в качестве противоопухолевых агентов нового поколения.

Таблица

Цитотоксическая активность и селективность заявляемых соединений

Соединения Опухолевые линии Нормальные клеточные линии ^aHuTu 80 ^bPC3 ^cPANC-1 ^dMCF-7 ^eM-HeLa ^fT98G ^gA549 ^hDu-145 ⁱHep G2 ^jChang liver
IC_50, μМ IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI IC_50, μМ SI Ia 4.5±0.4 1.2 2.3±0.1 2.3 1.8±0.1 2.9 1.4±0.1 3.7 0.9±0.08 5.8 3.1±0.2 1.7 5.6±0.4 - 3.4±0.3 1.5 2.7±0.2 1.9 5.2±0.4 Ib 5.8±0.5 - 2.6±0.2 1.7 1.8±0.1 2.5 1.2±0.1 3.8 1.9±0.1 2.4 4.5±0.4 1.0 5.1±0.4 - 2.4±0.2 1.9 3.7±0.3 1.2 4.5±0.4 Ic 4.3±0.4 - 3.6±0.3 - 2.1±0.1 1.3 2.0±0.2 1.4 2.3±0.2 1.2 3.8±0.3 - 7.8±0.7 - 2.7±0.2 1.0 5.1±0.4 - 2.8±0.3 DOX 0.2±0.01 2.5 1.4±0.1 - 2.2±0.1 - 0.4±0.03 1.3 2.1±0.1 - 2.0±0.1 - 0.7±0.05 - 0.3±0.02 1.7 0.2±0.01 2.5 0.5±0.04 SF 6.2±0.5 3.5 11.3±0.9 1.9 12.0±1.1 1.8 27.5±2.3 - 25.0±1.9 - 8.6±0.7 2.5 25.2±2.2 - 14.9±0.7 1.5 14.7±9.0 1.5 21.7±1.7 ^aHuTu-80 - аденокарцинома двенадцатиперстной кишки; ^bPC3 - аденокарцинома предстательной железы человека; ^cPANC-1 - клеточная линия рака поджелудочной железы человека; ^dMCF-7 - аденокарцинома молочной железы человека (плевральная жидкость); ^eM-HeLa - эпителиоидная карцинома шейки матки человека; ^fT98G - клеточная линия глиобластомы; ^gA549 - аденокарциномная клеточная линия альвеолярного базального эпителия человека; ^hDu-145 - клеточная линия рака простаты человека; ⁱHep G2 - клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека ; ^jChang liver - клеточная линия печени человека; DOX - доксорубицин, SF - сорафениб.

Изобретение относится к области органической химии и фармацевтике, а именно к бромсодержащим пространственно-затрудненным фенолам формулы Ia, Ib и Ic, где R выбран из (а) Me, (b) Et и (c) Ph. Также изобретение относится к применению соединения формулы I в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью. Технический результат - противоопухолевые соединения формулы I, способные эффективно приводить к апоптозу по внутреннему митохондриальному пути, тем самым подавляя рост раковых клеток. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Бромсодержащий пространственно-затрудненный фенол общей формулы I

,

где R = Me (a), Et (b), Ph (c).

2. Применение бромсодержащего пространственно-затрудненного фенола общей формулы I

,

где R = Me (a), Et (b), Ph (c),

в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.