Пинановые C,N-палладациклы, содержащие L-аминокислоты, и их применение в качестве средств, обладающих противоопухолевой активностью Российский патент 2023 года по МПК C07F15/00 A61K31/28 A61K31/555 A61P35/00 

Изобретение относится к синтезу новых химических соединений - пинановых C,N-палладациклов, содержащих в качестве хелатного солиганда L-аминокислоты (тирозин, пролин, серин, изолейцин), обладающих противоопухолевой активностью.

Комплексы палладия с органическими лигандами различного типа активно исследуются в качестве противоопухолевых препаратов [Kapdi A.R., Fairlamb I.J.S. Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 4751; Alam Md N., Huq F.  Coord. Chem. Rev., 2016, 316, 36; Fanelli M., Formica M. et al. Coord. Chem. Rev., 2016, 310, 41]. Во многих работах отмечается, что комплексы Pd(II) проявляют удовлетворительную цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток, причем значительно превосходящую активность исходных лигандов. Среди огромного структурного разнообразия можно выделить палладациклы (ПЦ), в которых хелатное кольцо содержит прочную связь углерод-металл [Alam Md N., Huq F.  Coord. Chem. Rev., 2016, 316, 36; Albert J., Bosque R. et al. Eur. J. Med. Chem., 2014, 84, 530;  Karami K., Hosseini-Kharat M. et al. Polyhedron, 2012, 50, 187]. Следует отметить, что в ряде работ на фоне высокой противоопухолевой активности отмечается низкая токсичность ПЦ в отношении нормальных клеток человека [Abedanzadeh S., Karami K. et al. Dalton Trans., 2020, 49, 14891; Hashemi S., Karami K. et al. J. Biomolec. Struct. and Dynam., 2022, 40, 5000].

Ранее нами была исследована противоопухолевая активность циклопалладированных пинановых производных бензиламина [Zalevskaya O.A., Gur'eva Y.A. et al. Inorg. Chim. Acta, 2021, 527, 120593]. В частности, установлено, что на клетках SH-SY5Y (нейробластома) и Hela (карцинома шейки матки) величина IC₅₀ цитотоксического эффекта биядерного ПЦ 1 (схема 1) составляла 22.5 и 34.1 соответственно (таблица 1). Биядерный комплекс 1 мы выбрали в качестве стартового соединения для синтеза на его основе серии смешаннолигандных моноядерных производных 2a-d, содержащих, кроме C,N-палладацикла, аминокислоту в качестве второго N,O-донорного хелатного лиганда (схема 1). Биядерные ПЦ легко вступают в реакцию с дополнительными лигандами (как монодентатными, так и бидентатными) за счет раскрытия хлоридных (или ацетатных) мостиков с образованием соответствующих моноядерных комплексов [Hashemi S., Karami K. et al. J. Biomolec. Struct. and Dynam., 2022, 40, 5000; Abedanzadeh S., Karami K. et al. Dalton Trans., 2020, 49, 14891]. В таблице 1 приведены сравнительные литературные данные по цитотоксической активности ПЦ Ia-d, содержащих C,N-донорный бензиламинный фрагмент [Karami K., Hosseini-Kharat M. et al. Polyhedron, 2012, 50, 187; Albert J., Bosque R. et al. Eur. J. Med. Chem., 2014, 84, 530]. В работах иранских ученых [Hashemi S., Karami K. et al. J. Biomolec. Struct. and Dynam., 2022, 40, 5000; Abedanzadeh S., Karami K. et al. Dalton Trans., 2020, 49, 14891] описан синтез фосфорсодержащих ПЦ IIa-e с дополнительными аминокислотными лигандами. Цитотоксическую активность IIa-e оценивали на линии раковых клеток лейкемии K562 с помощью анализа МТТ [Abedanzadeh S., Karami K. et al. Dalton Trans., 2020, 49, 14891]. Установлена четкая зависимость активности ПЦ от природы аминокислотного фрагмента - комплексы IIe и IIc показали значения IC₅₀ 15.1 и 16.5 мкг/мл соответственно, что сравнимо с таковым для цисплатина (19.4 мкг/мл).

ПЦ Ia-d и IIa-e можно рассматривать в качестве структурных аналогов синтезированных нами ПЦ 2a-d.

Сравнительные данные по цитотоксической активности ПЦ в отношении клеток опухолевого происхождения - карциномы шейки матки (Hela) и лёгочной аденокарциномы (A549) представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Соединение IC₅₀ (мкM) IC₅₀ (мкг/мл) HeLa A549 К562 Цисплатин 9.0 ± 0.7 19.2 ± 2.3 - 1 22.5 ± 2.7 34.1 ± 0.7 - Ia 7.5±0.6 - - Ib 7.7±0.4 - - Iс - 40.0±8.7 - Id - 43.7±11.0 - IIe 15.1 IIc 16.5

Изобретение направлено на расширение арсенала и получение новых мультимодальных палладациклов, которые могут быть использованы в качестве средств, обладающих противоопухолевой активностью, в том числе, в отношении штаммов нейробластомы (SH-SY5Y), лёгочной аденокарциномы (A549), эпидермоидной карциномы гортани (Hep-2) и карциномы шейки матки (HeLa). Особенностью новых соединений является тот факт, что они сочетают в своем составе три важных биоактивных фрагмента. Это ион палладия и хиральные лиганды – терпеновый и аминокислотный. Представленные соединения 2a-d одни из первых металлсодержащих веществ среди соединений подобной структуры. В этом состоит технический результат.

Технический результат достигается тем, что пинановые C,N-палладациклы содержат в качестве хелатного солиганда L-аминокислоту: пролин или тирозин или серин или изолейцин и получены в виде индивидуальных диастереомеров 2a-d:

Соединения 2a или 2b или 2c или 2d применины в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью. В частном случае, соединения 2a или 2b или 2c или 2d могут быть использованы в отношении штаммов нейробластомы (SH-SY5Y), лёгочной аденокарциномы (A549), эпидермоидной карциномы гортани (Hep-2) и карциномы шейки матки (HeLa).

Способ получения осуществляется следующим образом.

Новые хиральные комплексы палладия с терпеновыми производными получены в виде индивидуальных диастереомеров 2a-d.

Для синтеза комплексов 2a-d использовали в качестве стартового соединения комплекс 1, полученный по описанной методике [Zalevskaya O.A., Gur'eva Y.A. et al. Inorg. Chim. Acta, 2021, 527, 120593]. В качестве солигандов использовали L-аминокислоты пролин (Pro), тирозин (Tyr), серин (Ser), изолейцин (Ile) (схема 1). Реакцию расщепления хлоридных мостиков проводили путем перемешивания биядерного комплекса 1 с эквимолярным количеством соответствующей аминокислоты в слабощелочной водно-спиртовой среде (метанол-вода 5:1) при 50 °С в течение 24-72 часов. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ. Продукт реакции экстрагировали CH₂Cl₂, после удаления растворителя маслообразный остаток растворяли в хлороформе и комплекс осаждали гексаном. Соединения 2a-d получали в виде аморфных белых порошков. Препаративный выход составил от 57 до 74 %.

Схема 1

Состав всех полученных смешаннолигандных комплексов палладия 2a-d подтвержден данными элементного анализа. Предложенное строение не противоречит данным спектроскопии ИК и ЯМР. Для свободных аминокислот, которые существуют в виде биполярных ионов, в ИК-спектрах наблюдаются полосы в области 1610-1660 см^-1, соответствующие асимметричным валентным колебаниям связей COO^- группы и деформационным колебаниям N-H связей аминогруппы, и в области 1395-1430 см^-1, соответствующие симметричным валентным колебаниям группы COO^-. Эти полосы сохраняются в спектрах комплексов 2a-d с небольшими смещениями. В спектрах ЯМР ¹H и ¹³C полученных комплексов 2a-d присутствуют все сигналы, соответствующие двум хелатным лигандам – циклопалладированному аминопинановому и аминокислотному. Стабильность комплексов 2a-d в растворе ДМСО подтверждается тем фактом, что в спектрах ЯМР не наблюдается изменений в течение времени (до трех суток). Мы предполагаем транс-N,N-геометрию комплексов 2a-d наиболее характерную для моноядерных комплексов палладия подобного типа. В частности, для комплекса 2a с пролинатным лигандом этот факт подтверждается тем, что в спектрах NOESY выявлено кросс-взаимодействие протонов Н19 пирролидинового цикла с ароматическими протонами бензиламинного фрагмента пинанового лиганда.

Общая методика синтеза комплексов палладия 2a-d

В 6 мл смеси MeOH-H₂O (5:1) растворяли ПЦ 1 (0.1 ммоль), соответствующую L-аминокислоту (0.2 ммоль) и NaHCO₃ (0.2 ммоль). Раствор нагревали при 50 °С в течение 24-48 часов до завершения реакции по данным ТСХ. Реакционную смесь разбавляли H₂O (10 мл) и продукт экстрагировали CH₂Cl₂ (3×5 мл). Объединенный органический экстракт сушили над безводным MgSO₄. После удаления растворителя маслообразный остаток растворяли в хлороформе и комплекс осаждали гексаном. Соединения 2a-d получали в виде аморфных порошков.

Физико-химические и спектральные характеристики комплексов 2a-d

[(S)-Пирролидин-2-карбоксилато-N,O]{(1R,2R,3R,5R)-3-(бензиламино)-2,6,6-триметилбицикло[3.1.1]гептан-2-ол-C,N}палладий(ii) (2a). Порошок белого цвета, растворимый в хлороформе, ацетоне, ДМСО. Выход 73%, т.пл. 154-155 ºC (с разл.). [α]_D²³ +115.3 (с 0.4, aцетон). ИК-спектр, ν/см^-1: 3341 (уш.с, OH); 3188 (уш.с, NH, NH₂); 1609 (уш.с, асим. CОО^-); 1371 (уш.с, сим. CОО^-). Спектр ЯMР ¹H (CDCl₃, δ, м.д.): 0.88 (с, 3 H, С(9)Ме); 1.22 (с, 3 H, С(8)Ме); 1.52-1.65 (м, 2 Н, Н(4)_e, Н(4)_n); 1.68-1.70 (м, 5 Н, С(10)Ме, Н(7)_n, Н(7)_e ); 1.83-1.85 (м, 1 Н, Н(5)); 1.86-1.91 (м, 4 Н, С(12)Ме, Н(1)); 2.04-2.08 (м, 2 Н, Н(20)); 2.26-2.28 (м, 2 Н, Н(21)); 3.19-3.49 (м, 2 Н, Н(19)); 3.82-3.83 (м, 1 Н, Н(22)); 4.21-4.22 (м, 2 Н, Н(3), Н(11)); 4.63 (уш.с, 1 Н, NH); 5.32 (уш.с, 1 Н, NH); 5.59 (уш.с, 1 Н, OH), 6.89-7.00 (м, 4 Н, Н_аром.). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м.д.): 22.94 (С(9)), 24.23 (С(7)), 24.30 (С(10)), 26.28 (С(20)), 26.92 (С(12)), 28.07 (С(8)), 29.59 (С(4)), 30.46 (С(21)), 39.60 (С(6)), 40.39 (С(5)), 53.06 (С(19)), 55.02 (С(1)), 62.98 (С(11)), 65.42 (С(3)), 67.12 (С(22)), 77.45 (С(2)), 120.31 (С(15)), 124.07 (С(16)), 124.97 (С(17)), 133.02 (С(18)), 146.73 (С(13)), 156.60 (С(14)), 184.10 (С(23)). Найдено (%): C, 56.24; H, 7.29; N, 5.74. C₂₃H₃₄N₂O₃Pd. Вычислено (%): C, 55.92; H, 7.14; N, 5.67.

[(S)-2-Амино-3-(4-гидроксифенил)пропанато-N,O]{(1R,2R,3R,5R)-3-(бензиламино)-2,6,6-триметилбицикло[3.1.1]гептан-2-ол-C,N}палладий(ii) (2b). Порошок белого цвета, растворимый в ацетоне, ДМСО. Выход 57%, т.пл. 123-124 ºC (с разл.). [α]_D²³ -31.7 (с 0.3, aцетон). ИК-спектр, ν/см^-1: 3308 (уш.с, OH); 3235 (уш.с, NH, NH₂); 1614 (уш.с, асим. CОО^-); 1375 (с, сим. CОО^-). Спектр ЯMР ¹H (ацетон-d₆, δ, м.д.): 0.98 (с, 3 H, С(9)Ме); 1.21 (с, 3H, С(8)Ме); 1.65 (с, 3 Н, С(10)Ме); 1.79-1.81 (м, 1 Н, Н(5)); 1.81-1.84 (м, 5 Н, С(12)Ме, Н(7)_n, Н(7)_e); 1.86-1.87 (м, 1 Н, Н(1)); 2.42-2.45 (м, 2 Н, Н(4)_e, Н(4)_n), 3.21-3.31 (м, 2 Н, Н(20)); 3.72-3.75 (м, 1 Н, Н(19)); 3.99-4.00 (м, 1 Н, Н(3)); 4.30-4.31 (м, 1 Н, Н(11)); 5.33 (уш.с, 1 Н, NH); 5.58 (уш.с, 2 Н, NH₂); 5.89 (уш.с, 1 Н, OH); 6.61-7.19 (м, 8 Н, Н_аром.); 8.7 (уш.с, 1 Н, OH_фен.). Спектр ЯМР ¹³С (ацетон-d₆, δ, м.д.): 22.28 (С(9)), 24.31 (С(7)), 24.63 (С(10)), 24.70 (С(12)), 25.99 (С(8)), 28.18 (С(4)), 39.24 (С(20)), 40.35 (С(5)), 40.41 (С(6)), 54.88 (С(1)), 60.47 (С(19)), 62.98 (С(11)), 67.25 (С(3)), 76.35 (С(2)), 115.65 (С(15)), 120.21 (С(16)), 123.86 (С(17)), 124.23 (С(18)), 128.12 (С(21)), 130.41 (С(23)), 132.14 (С(22)), 144.23 (С(13)), 156.50 (С(14)), 158.36 (С(24)), 181.97 (С(25)). Найдено (%): C, 57.52; H, 6.42; N, 5.26. C₂₇H₃₆N₂O₄Pd. Вычислено (%): C, 58.01; H, 6.49; N, 5.01.

[(S)-2-Амино-3-гидроксипропанато-N,O]{(1R,2R,3R,5R)-3-(бензиламино)-2,6,6-триметилбицикло[3.1.1]гептан-2-ол-C,N}палладий(ii) (2c). Порошок белого цвета, растворимый в ацетоне, ДМСО. Выход 71%, т.пл. 131-132 ºC (с разл.). [α]_D²³ +31.9 (с 0.2, aцетон). ИК-спектр, ν/см^-1: 3381-3236 (уш.с, OH, NH, NH₂); 1618 (уш.с, асим. CОО^-); 1381 (с, сим. CОО^-). Спектр ЯMР ¹H (DMSO-d₆, δ, м.д.): 0.89 (с, 3 H, С(9)Ме); 1.15 (с, 3 H, С(8)Ме); 1.49 (с, 3 Н, С(10)Ме); 1.50-1.51 (м, 1 Н, Н(7)_n); 1.53 (д, 3 H, С(12)Ме, J = 6.5 Гц); 1.62-1.63 (м, 1 Н, Н(4)_n); 1.69-1.70 (м, 1 Н, Н(1)); 1.81-1.82 (м, 1 Н, Н(5)); 2.01-2.02 (м, 1 Н, Н(7)_e); 2.32-2.33 (м, 1 Н, Н(4)_e); 3.28-3.29 (м, 1 Н, Н(19)); 3.61-3.62 (м, 1 Н, Н(3)); 3.68-3.69 (м, 2 Н, Н(20)); 4.21-4.22 (м, 1 Н, Н(11)); 4.67 (уш.с, 1 Н, OH); 5.11-5.13 (м, 2 Н, NH₂); 5.61 (уш.с, 1 Н, OH); 6.73-6.89 (м, 4 Н, Н_аром.). Спектр ЯМР ¹³С (DMSO-d₆, δ, м.д.): 23.19 (С(9)), 24.51 (С(7)), 25.27 (С(10)), 26.11 (С(12)), 28.44 (С(8)), 29.77 (С(4)), 40.17 (С(5)), 40.83 (С(6)), 55.45 (С(1)), 60.96 (С(19)), 63.05 (С(11)), 63.30 (С(20)), 66.45 (С(3)), 75.91 (С(2)), 120.81 (С(15)), 124.02 (С(16)), 124.37 (С(17)), 132.87 (С(18)), 145.13 (С(13)), 158.61 (С(14)), 178.57 (С(21)). Найдено (%): C, 52.60; H, 6.72; N, 5.78. C₂₁H₃₂N₂O₄Pd. Вычислено (%): C, 52.23; H, 6.68; N, 5.80.

[(2S,3S)-2-Амино-3-метилпентанато-N,O]{(1R,2R,3R,5R)-3-(бензиламино)-2,6,6-триметилбицикло[3.1.1]гептан-2-ол-C,N}палладий(ii) (2d). Порошок белого цвета, растворимый в хлороформе, ацетоне, ДМСО. Выход 74%, т.пл. 144-145 ºC (с разл.). [α]_D²³ -18.5 (с 0.8, aцетон). ИК-спектр, ν/см^-1: 3339 (уш.с, OH); 3231, 3182 (уш.с, NH, NH₂), 1620 (уш.с, асим. CОО^-); 1377 (с, сим. CОО^-). Спектр ЯMР ¹H (CDCl₃, δ, м.д.): 0.81 (т, 3 H, С(23)Ме, J = 7.2 Гц); 0.93 (с, 3 H, С(9)Ме); 1.13 (д, 3 H, С(21)Ме, J = 7.2 Гц); 1.22 (с, 3 H, С(8)Ме); 1.27-1.29 (м, 2 Н, Н(4)_e, Н(4)_n); 1.58-1.60 (м, 2 Н, Н(22)); 1.61-1.81 (м, 5 Н, С(10)Ме, Н(7)_n, Н(7)_e); 1.88-1.90 (м, 2 Н, Н(1), Н(5)); 1.91 (д, 3 H, С(12)Ме, J = 6.5 Гц); 2.02-2.09 (м, 4 Н, Н-20, Н(4)_n, Н(4)_e), 2.26-2.28 (м, 2 Н, Н(22)); 3.70-3.72 (м, 2 Н, Н(19)); 3.81-3.83 (м, 1 Н, Н(3)); 4.28-4.29 (м, 1 Н, Н(11)); 4.61-4.74 (м, 3 Н, NH); 5.51 (уш.с, 1 Н, OH); 6.79-6.98 (м, 4 Н, Н_аром.). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м.д.): 11.99 (С(23)), 16.08 (С(21)), 22.95 (С(9)), 23.22 (С(10)), 24.14 (С(7)), 24.26 (С(4)), 27.07 (С(12)), 27.30 (С(8)), 29.71 (С(22)), 38.11 (С(20)), 38.34 (С(6)), 40.33 (С(5)), 55.01 (С(1)), 62.65 (С(11)), 64.62 (С(19)), 66.50 (С(3)), 77.45 (С(2)), 120.59 (С(15)), 124.18 (С(16)), 124.79 (С(17)), 131.71 (С(18)), 144.73 (С(13)), 156.65 (С(14)), 181.81 (С(24)). Найдено (%): C, 56.77; H, 7.63; N, 5.75. C₂₄H₃₈N₂O₃Pd. Вычислено, %: C, 56.63; H, 7.52; N, 5.50.

Исследование биологической активности. При изучении противоопухолевого потенциала новых ПЦ 2a-d, содержащих L-аминокислоты, был проведен анализ степени влияния исследуемых соединений на выживаемость клеток опухолевого происхождения нейробластомы (SH-SY5Y), лёгочной аденокарциномы (A549), эпидермоидной карциномы гортани (Hep-2) и карциномы шейки матки (HeLa). Определение жизнеспособности клеток проводили с помощью МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток восстанавливать МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до кристаллов нерастворимого формазана. Для валидирования метода в наших условиях в качестве референсного вещества использовали известный противоопухолевый препарат Цисплатин. В качестве препаратов сравнения исследованы соответствующие аминокислоты Pro, Tyr, Ser и Ile.

Данные по цитотоксической активности представлены в таблице 2. Установлено, что все смешаннолигандные металлокомплексы 2a-d оказывали умеренное влияние на выживаемость клеток использованных линий. Наиболее выраженным цитотоксическим эффектом обладали соединения 2b и 2d в отношении клеточной линии SH-SY5Y, IC₅₀ для которых составили 28.65 ± 0.36 и 23.66 ± 0.41 мкмоль _* л^-1, соответственно. Однако, эти значения оказались выше, чем IC₅₀ исходного биядерного комплекса 1 (6.27 ± 0.14 мкмоль _* л^-1). Только для соединения 2с в отношении Нер-2 токсический эффект более чем в 3 раза превышал таковое у исходного соединения 1. Для исходных лигандов значения IC₅₀ в отношении всех опухолевых линий превышало 100 мкмоль _* л^-1.

Полученные данные позволяют считать предложенный вариант модификации ПЦ весьма перспективным с точки зрения поиска эффективных противоопухолевых препаратов целевого назначения.

Цитотоксичность (in vitro) комплексов палладия и исходных лигандов в отношении клеточных линий опухолевого происхождения представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Вещества IC₅₀, мкмоль _* л^-1 SH-SY5Y HeLa A549 Hep-2 Цисплатин 11.31±0.92 9.56±1.01 17.65±1.28 6.07±0.04 1 6.27±0.14 22.45±2.65 34.08±0.71 53.94±1.99 2a 53.36±0.31 47.32±0.29 95.99±1.91 77.20±0.97 2b 28.65±0.36 60.03±0.42 73.83±0.02 70.01±1.65 2c 58.08±0.27 52.97±0.05 58.74±0.01 15.80±0.71 2d 23.66±0.41 57.09±0.29 61.13±0.78 65.20±0.04 Pro ≥100 ≥100 ≥100 ≥100 Tyr ≥100 ≥100 ≥100 ≥100 Ser ≥100 ≥100 ≥100 ≥100 Ile ≥100 ≥100 ≥100 ≥100

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к пинановым C,N-палладациклам, содержащим в качестве хелатного солиганда L-аминокислоту: пролин, или тирозин, или серин, или изолейцин, полученным в виде индивидуальных диастереомеров 2a-d. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала и получение новых мультимодальных палладациклов, которые могут быть использованы в качестве средств, обладающих противоопухолевой активностью, в частности, в отношении штаммов нейробластомы (SH-SY5Y), лёгочной аденокарциномы (A549), эпидермоидной карциномы гортани (Hep-2) и карциномы шейки матки (HeLa). 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Пинановые C,N-палладациклы, содержащие в качестве хелатного солиганда L-аминокислоту: пролин, или тирозин, или серин, или изолейцин, полученные в виде индивидуальных диастереомеров 2a-d:

2. Применение соединения 2a, или 2b, или 2c, или 2d по п. 1 в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

3. Применение соединения 2a, или 2b, или 2c, или 2d по п. 2 в отношении штаммов нейробластомы (SH-SY5Y), лёгочной аденокарциномы (A549), эпидермоидной карциномы гортани (Hep-2) и карциномы шейки матки (HeLa).