Питательная среда для культивирования штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к способам безотходного получения бактериальной массы пробиотической кормовой добавки. Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 являются основой пробиотического препарата «Сахабатисубтил». Для изготовления препарата «Сахабактисубтил», штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, выращивают на мясопептонном агаре в течение 5 суток при 37°С, затем суспензируют в физиологическом растворе хлористого натрия в концентрации 5×10⁹ КОЕ/см³ (RU 2 218 924 C2, 20.12.2003). Отличие изобретения в том, что штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 впервые будут выращены на жидкой зерновой среде (3% отвар овса) с добавлением 1% NaCl для изготовления кормовой добавки.

Известна основная жидкая среда для культивирования Bacillus subtilis - мясопептонный бульон (МПБ). Среда состоит из мясной воды к которому добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl [1]. Недостатком данной среды является дороговизна и трудоемкий способ приготовления. В промышленных масштабах для получения кормовой добавки использование данной среды не технологично.

Известны питательные среды для культивирования Bacillus subtilis с использованием разнообразных компонентов. Например: Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, карбонат кальция, фосфат калия и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.(RU 2 722 071 C1, 26.05.2020), Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 40%-ный спиртовой экстракт кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. (RU 2 668 178 C1, 26.09.2018), Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 96%-ный спиртовой экстракт кофе арабика и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов (RU 2 668 173 C1, 26.09.2018), Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, сульфат аммония и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов (RU 2 680 702 C1, 25.02.2019) и др. При вышеуказанных питательных средах для культивирования Bacillus subtilis применяют натуральные и минеральные составные, однако в компонентах не используется отвар овса и не культивируются штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3, Bacillus subtilis ТНП-5.

Наиболее близким аналогом жидкой питательной среды для культивирования Bacillus subtilis является непророщенное зерно овса голозерного сорта Немчиновский из расчета 100г измельченного сырья на 3л воды [2]. Недостатком данной среды является не достаточное накопление бактериальной массы Bacillus subtilis до 10⁷ КОЕ/см³

Целью работы является создание безотходной питательной среды для Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, обеспечивающий высокий титр микробной биомассы выше 10⁹КОЕ/см³ для изготовления кормовой добавки.

В работе использовали штаммы бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ ВГНКИ (Справка о депонировании от 08.08.2022г. №320П, Справка о депонировании от 08.08.2022г. №321П).

Поставленная цель достигается следующим образом. Приготовление среды: семена овса промывают водопроводной водой, высушивают и размалывают на крупорушке до фракции 0,3мм. На 100мл водопроводной воды берут навес размолотого зерна овса 3г. Кипятят на водяной бане 15-20 мин, затем фильтруют через сито. После среду заливают в колбу Эрленмейера, добавляют 1г NaCl. Определяют pH, доводят до показателей 6,8-7,0. Стерилизация производится при 1,1 атм. в течении 15-20 мин. Готовая среда представляет собой мутную жидкость кремово-серого или желтоватого цвета; допускается наличие на дне колбы небольшого количества осадка, легко разбивающихся при встряхивании.

После охлаждения до +37°С колбы со средой переносят в настольную бактерицидную камеру и засевают свежеприготовленной суспензией с содержанием 5×10⁹ КОЕ/см³ штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 из расчета 0,1мл суспензии каждой культуры на 100мл среды. Культивирование производят в шейкер - инкубаторе «ES-20» при вращении со скоростью 230об/мин, при температуре 37°C в течении 120 часов. Учет роста штаммов бактерий Bacillus subtilis проводят по характерному росту споровых аэробных бацилл на жидких средах и микроскопией с окраской по Граму. В качестве контроля используют среду МПБ. В ходе опытов измеряют pH сред с помощью прибора Mettler Toledo Seven Easy.

Для определения количества штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 в 3%-ном отваре овса с добавлением 1 % NaCl используют чашечный метод (ОФС.1.7.2.0008.15 - Определение концентрации микробных клеток).

Таблица 1 - Динамика роста штаммов бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5 (в КОЕ/см³) на 3%-ном овсяном отваре с добавлением 1% NaCl.

Часы культивирования Количество бактерий, КОЕ/см³ Культивирование в 3%-ном отваре овса с добавлением 1%NaCl Контроль (МПБ) B.subtilis ТНП-3 B.subtilis ТНП-5 B.subtilis ТНП-3 B.subtilis ТНП-5 24 8,1×10⁹ 7×10⁹ 6,1×10⁹ 4,8×10⁹ 72 6,7×10⁹ 2,1×10⁹ 2,6×10⁹ 3×10⁹ 120 1×10¹¹ 1,2×10¹¹ 8,1×10¹⁰ 2,2×10¹⁰

Таблица 2 - Динамика pH среды при культивировании штаммов бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5

Час роста Культивирование в 3%-ном отваре овса с добавлением 1% NaCl Контроль (МПБ) B.subtilis ТНП-3(M±m) B.subtilis ТНП-5(M±m) B.subtilis ТНП-3(M±m) B.subtilis ТНП-5(M±m) 24 7,0±0,05 7,1±0,04 7,1±0,04 7,1±0,04 72 7,4±0,04 7,0±0,05 7,6±0,05 7,6±0,05 120 7,0±0,04 7,1±0,04 7,7±0,05 7,0±0,04

Из приведенных данных таблицы 1 и 2 видно, что максимальное количества штаммов бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5 достигается при культивировании на 3%-ом отваре овса с добавлением 1%NaCl на 120 час культивирования до 10¹¹КОЕ/см³ при pH среды - 7,0-7,1 (соответственно), в сравнении с выращиванием штаммов бактерий в МПБ (10¹⁰ КОЕ/см³) .

Также проведены исследования по изучению физиолого-биохимических свойств штаммов бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5, выращенных на 3%-ном овсяном отваре с добавлением 1% NaCl. В качестве контроля использовали среду МПБ.

Таблица 2 - Результаты физиолого-биохимических свойств штаммов бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5 в среде на основе 3%-ного отвара овса с добавлением 1% NaCl

№ Признак Контроль (МПБ) Исследуемые штаммы B.subtilis ТНП-3 B.subtilis ТНП-5 1 Подвижность + + + 2 Наличие каталазы + + + 3 Разложение казеина + + ± 4 Гидролиз крахмала + + + 5 Образование кислоты из: мальтозы + + + маннита + + + глюкозы + + + лактозы ± + ± дульцита - - - сорбита - - ± Примечание: «-» - отрицательная реакция, «+» - положительная реакция, «±» - сомнительная реакция.

Из приведенных данных видно, что штаммы бактерий B.subtilis ТНП-3 и B.subtilis ТНП-5, культивируемые на 3%-ном отваре овса с добавлением 1%NaCl, обладают типичными свойствами бактерий рода Bacillus: аэробы, образуют споры, грамположительны, подвижны, каталазоположительны, не разлагают казеин, гидролизуют крахмал.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования Bacillus subtilis предусматривает безотходную технологию получения кормовой добавки с высоким содержанием бактериальной массы штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 до 10¹¹КОЕ/см³.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5. Среда для культивирования штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 содержит 3%-ный отвар семян овса и 1%-ный хлористый натрий. Изобретение позволяет повысить выход биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 до 10¹¹ КОЕ/см³ и обеспечивает безотходность изготовления кормовой добавки. 3 табл.

Питательная среда для культивирования штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, содержащая зерновую основу в виде 3%-ного отвара семян овса с добавлением 1%-ного NaCl до pH 7,0-7,1.